CS209966B1 - Způsob přípravy specifických protilátek použitelných "in vitro" pro imunochemické re akce nebo "in vivo" k snížení koncentrace nebo aktivity některých látek v organismu - Google Patents

Abstract

Vynález řeší přípravu protilátek pro imunochemické reakce "in vitro" nebo pro použití "in vivo" k snížení koncentrace nebo aktivity některých látek v organis mu, s možností jednoduché kontroly tvor by protilátek. Emulgovaný antigen v Al-Span-Oil adjuvans je aplikován kozám v narkóze intradermálně po 0,1 ml na 30 míst opako vaně v třítýdenních intervalech, nejméně třikrát, do dosažení vysoké hladiny pro tilátek. Tvorba protilátek je sledována v průběhu imunizačního procesu turbidi- metricky. Příkladem použití tohoto sché matu je příprava protilátek proti králi čímu gamaglobulinu a sérovému gonadotro pinu ze séra březích klisen a jejich pre- cipitační nebo biologická kontrola.

Description

Vynález se týká způsobu přípravy specifických protilátek použitelných in vitro pro imunochemické reakce nebo in vivo k sníženi koncentrace některých látek v organismu nebo k sníženi jejich aktivity· Postup se osvědčil například při přípravě precipitačni protilátky proti králičím globulinům, používané při radioimunoanalýze k precipitaci specifické protilátky s navázanou radioaktivní látkou nebo při přípravě protilátky proti sérovému gonadotxopinu ze séra březích klisen. Protilátka proti sérovému gonadotropinu může být použita ke sníženi aktivity tohoto hormonu po jeho aplikaci jalovicím, kravám, prasnicím a dalším zvířatům pro stimulaci ovariálni aktivity, dále může být použita k radioimunoanalytickému nebo imunochemickému stanovení gonadotropinu.

Podle běžných způsobů se protilátky nejčastěji připravuji aplikací antigenu s Freundovým adjuvans podkožně na 2 až 4 místa králíkům, ovcím, kozám nebo prasatům. Zejména u králíků se někdy používá aplikace antigenu do kůže na mnoho míst i do tlapek. Naše zku šenoati prokazuji, že vysoce účinným způsobem získání kvalitních protilátek je imunizace koz v narkóze na mnoho míst intradermálně (do kůže) antigenem s Al-Span-Oil adjuvans. Adjuvans je přípravek emulzniho typu dodávaný ve dvou oddělených složkách. Složka 1 je suspenze hydroxidu hlinitého ve vodě, složka II obsahuje parafinový olej a detergens s vhodnou hodnotou hydroíilně-lipofilní rovnováhy. Práce v narkóze má význam nejen pro usnadnění manipulace se zvířetem, ale přispívá i k lepši tvorbě protilátek. Al-Span-Oil adjuvans nahrazuje s výborným výsledkem dovážené nebo individuálně připravované Freundovo adjuvans. Použiti koz k imunizaci je výhodné pro snadnější manipulaci ve srovnáni s ovcemi nebo prasaty, pro větší objem získání protilátky ve srovnáni a králíky nebo krůtami a pro snadnějši provedeni aplikace i sledování reakci organismu.

Způsob přípravy protilátek spočívá v použiti emulze antigenu v Al-Span-Oil adjuvans k opakované intradermální aplikaci kozám v narkóze na více mist, odběru krve za 10-20 dnů po poslední imunizaci a současně prováděném tuřbidimetrickém sledování tvorby protilátek v krvi imunizovaného zvířete.

Příprava antigenu. Příkladem přípravy antigenu k imunizaci je emulgace králičího gamaglobulinu a sérového gonadotropinu. Dva mililitry roztoku králičího gamaglobulinu o koncentraci 1,6 mg globulinu/1 ml fosfátového pufru je smícháno se 2 ml suspenze hydroxidu hlinitého ve vodě (složka I Al-Span-Oil adjuvans). Po 60 minutách inkubace za chladu je suspenze s antigenem převedena ve 4 dávkách do 6 ml olejové složky II adjuvans s důkladným protřepáním po každém přidání k dosaženi dobré emulgace.

Eozpuštěním 5 000 m.j. lyofilizovaného sérového gonadotropinu ve 2 ml vody pro injekce je připraven antigen ke smíchání a emulgaci se složkami Al-Span-Oil adjuvans jak je popsáno výše.

Způsob imunizace. Imunizace koz se provádí v celkové inhalační narkóze celkem třikrát, v intervalech tři týdnů. Při každé imunizaci se aplikuje intradermálně po 0,1 ml emulze, obsahující například 0,J2 mg globulinu v 1 ml nebo 500 m.j. gonadotropinu v 1 ml, do distálních partií předních končetin (15 vpichů), do distálních partií zadních končetin (15 vpichů) a v krajině lumbálni (20 vpichů). Celkem je při každé imunizaci aplikováno 5 ml emulze. V imunizaci je možno pokračovat i po době delší než tři týdny.

209 906

Obvykle pak postačuji dvě aplikace v třítýdenním intervalu k dosaženi kvalitní protilátky, která se získává vždy za 10 až 20 dnů po poslední imunizaci.

Ověření tvorby protilátky. V průběhu imunizace se v týdenních intervalech odebírá krev na sérum a v séru se turbidimetricky sleduje tvorba protilátky'.

K 1 ml séra desetkrát zředěného fyziologickým roztokem se přidá do zkumavek 5« 10« 30« 50» 100 a 200 jíl antigenu (například 0,8 mg globulinu/1 ml nebo 500 m.j. gonadotropinu/1 ml). Po zamíchání a 15 minutách stání při laboratorní teplotě se měří vzniklý zákal při 5Ο6 nm. V průběhu imunizace dochází v souvislosti s tvorbou protilátek k postupně se zvyšujícímu množství precipitátu. Účinná protilátka musí vykázat nejvyšši precipitát s 200 pil antigenu, v druhém případě alespoň se 100 jíl antigenu. Dva týdny po poslední imunizaci se odebere krev do roztoku sodné soli kyseliny etylendiaminotetraoctové c=0, 5*5 mol/1 (0,1 ml na 10 ml krve). Po odstředění se na 100 ml plazmy přidá 1 ml roztoku CaCl₂ c=l mol/1.

Sérum z plazmy se pak získá po 5 hodinách stání při laboratorní teplotě odstředěním vysréženého fibrinu (20 000 m.s“², 3θ min» 4 °C).

Biologické kontrola účinnosti protilátky proti sérovému gonadotropinu (PMSG). Pro kontrolu účinnosti protilátky proti PMSG byly použity infantilní myši samičky, u kterých byl pomoci PUSG stimulován růst folikulů vyvolávající zvětšení dělohy. Skupině myší bylo aplikováno současně s PMSG kozí anti-PMSG sérum. Z výsledku je zřejmé, že 1 jul protilátky proti PMSG neutralizoval biologický účinek 1 m.j. PMSG.

Předpokládaný neutralizační účinek byl ověřen u 4 jalovio, které byly ošetřeny současně PMSG a anti-PMSG sérem. V následující říji kontrolované klinicky a stanovením hormonálních hladin v periferní krvi, byl u všech zvířat zjištěn normální průběh říjových příznaků s jednou ovulací, což prokázalo úplné vyblokování sérového gonadotropinu. Po inseminaci 2 jalovice zahřezly.

Aplikaci anti-PMSG séra 9 jalovicím, stimulovaným pomoci PMSG za účelem vyvoláni superovulace, bylo dosaženo čtyřnásobně většího zisku kvalitníoh, životaschopných raných embryí ve srovnáni se skupinou 9 jalovic bez ošetřeni. Z provedených experimentálních prací vyplývá, že ověřované kozí anti-PMSG sérum mé i po parenterálni aplikaci jalovicím speoifický neutralizační účinek, zjevně nenarušuje řidiči mechanismus pohlavních funkci a při superovulaci poskytuje významný pozitivní efekt.

Claims (2)

1. P fi E D M S T VYNALEZU

   1. Způsob přípravy specifiokýoh protilátek použitelných in vitro pro imunochemické reakce nebo in vivo k snížení končentraoe nebo aktivity některých látek v organismu vyznačený tím, že preparát obsahující antigen, například králičí imunoglohulin nebo gonado tropin ze séra březích klisen, se emulguje dvousložkovým adjuvans, které obsahuje suspenzi hydroxidu hlinitého ve vodě a parafinový olej s detergens, vzniklá emulze se aplikuje kozám v narkóze intradermélně a opakovaně v třítýdenních intervalech, vždy na vioe, například 50 míst, 10 až 20 dnů po poslední imunizaci se odebere krev imunizovaného zvi5

   209 961 řete do antikoagulačního prostředku, například solné soli kyseliny etylendiaminotetraoctbvé, odstředěním so zbaví buněčných elementů a z odstředěné plazmy se antísérum izoluje a upraví do skladovatelné formy.
2. 2. Způsob podle bodu 1 vyznačený tím, že tvorba protilátky v průběhu procesu imunizace se sleduje v krevním séru imunizovaného zvířete turbidimetričky.