CS208872B1 - Způsob výroby prepurifikované sťingomyelinázy D. - Google Patents

Abstract

Způsob výroby prepurifikované sfingomvelinázy D, Vynález je z oboru mikrobiologie, zejména veterinární a lékařské. Účelem vynálezu je jednoduchá metoda oro získání sfingomyelinázy O kultivací kmene producenta v bujónovém filmu na agarovém podkladu a následná extrakce účinné látky acetonem. Odstředěním získaný koncentrát představuje prepurífikovanou formu sfingomyelinázy D, kterou po zjištěni aktivity lze ředěním upravit do požadované koncentrace. Biopreparát je použitelný k diagnostickým účelům v lékařské a veterinární mikrobiologii.

Description

(54)

(61)
(23) Výstavní priorita
(22) Přihlášeno	31 05 1979
(21)	PV 3740-79

(40) Zveřejněno JO 01 81 (45) Vydáno _{16 Π 83}

SKALKA BORIS doc. MVDr. CSc., BRNO SMOLA JIŘÍ MVDr.. BOSKOVICE

Způsob výroby prepurifikované sťingomyelinázy D.

Anotace

Způsob výroby prepurifikované sfingomvelinázy D, Vynález je z oboru mikrobiologie, zejména veterinární a lékařské. Účelem vynálezu je jednoduchá metoda oro získání sfingomyelinázy O kultivací kmene producenta v bujónovém filmu na agarovém podkladu a následná extrakce účinné látky acetonem. Odstředěním získaný koncentrát představuje prepurífikovanou formu sfingomyelinázy D, kterou po zjištěni aktivity lze ředěním upravit do požadované koncentrace. Biopreparát je použitelný k diagnostickým účelům v lékařské a veterinární mikrobiologii.

•208 8?2 (51) Int. Cl? C 12 N 9/00

Vynález řeší problém výroby prepuriflkované eflngomyelinázy D biopreparátu vhodného pro diagnostické použit l va veterinární i lékařské mikrobiologii.

Exolátka Corynebecterium pseudotuberculosis Je definována jako sfingomyelináze □ β toxickým účinkem PETRIE, G. F. - McCLEAN, D.j Interrelatione of Corynebacteřium ovia, Corynebecterium diphtherlae and certaln diphtherold stralne derived from the human naeopharinge. 0. Pathol. Bacteriol., 39, 1934, a. 635-639, PATOČKA, F, - SOUČEK, A. MÁŘA, M.: New obo®rvátione on blological propertiee and toxlnogenesis of atypical haamolytlc corynebactaria iaolatad from humana. 0. Hyg. Epidem. Microbiol. Immunol., 4, 1960, a. 307-308, SOUČEK, A. - SOUČKOVÁ, A. - MÁŘA, M. - PATOČKA, F._t Obaarvatlone on the blological propartlea of atypical heamolytic corynabacteria iaolatad from man aa compared wlth Cor. haamolyticum, Cor. pyogenaa bovia and Cor, ovia. II. In vitro inveatigatlons,

0. Hyg. Epidem. Microbiol. Immunol., 6, 1962, a. 13-23. DOTY, R. B. - DUNNE, H. W. HOKANSEN, 0. F. - REIO, 3. 3.! A comparlaon of toxlna producad by varloua laolatea of Corynebecterium paedotuberculoais and the davelopment cf a diagnoatic akin test for caaea of lympadanltla of eheep and goata, Am. 3. Vet. Ras., 25, 1964, a. 1679-1685. SOUČKOVÁ, A. - SOUČEK, A.j Inhibition of the hamolytlc actlon of alpha and beta lysina of Staphylococcue pycgenoa by Corynel&cterlum hemolytlcum, C. ovia and C. ulcerana. Toxicon, 10, 1972, a. 501-509. SOUČEK, A. - SOUČKOVÁ,, A,: Toxicity of bacterlal aphlngomyelinaaea D. 3,'· Hyg. Epidem. Microbiol. Immunol., 18, 1974, a. 327-335. Uvedeni autoři používali pro Izolaci této exolátky precipltaci amoniumaulfátam a matylalkoholam. Podobně Jako FRASER, G.f The effect on anlmal arythrocytea of combinatlona of diffuaible aubatancaa producad by bacťerla, 3. Pathol. Bacteriol., 88, 1964, a. 43-53, ae zaměřili na intarakci získané látky a hamolyziny stafylokoků. Nezaměřlli aa na preclzaci Její produkce, na expiraci ani na Jiné dlagnoatické využiti. Uvedenými autory použité preclpltace ja dvoustupňová, metodicky i Časově náročná. Z uvedených důvodů je tato metoda nevýhodná pro produkci větších množství prepuriflkované eflngomyelinázy O.

Uvedené nevýhody jeou odatraněny způsobem výroby prepuriflkované sflngomyellnázy D podle vynálezu. Jehož podstata spočívá v tom, že na agarový podklad se navratvi bujónový film a Inokulem Corynebacteřium psaudotuberculoaie a nechá aa pomnožit 24 až 48 hod. při teplotě 308 K až 311,5 K .a smyty nárůst se odstředí a získaný supernatant ae émichá a 1,5 až 3 objemy acetonu ochlazeného na 258 K až 248 K a nechá ae 1,5 min. až 30 min, působit, potó aa směa_odatřaduja 50 až 70 min., rychle a dokonala ae odstraní supernatant a sediment, který Ja prepurifikovanou formou aflngomyellnázy 0, ee rehydratuja ve sterilní destilované vodě.

Způeob extrakce a prepurifikaca aflngomyellnázy O acetonem ja relativně snadný a nejrychlejši z dosud známých metod získáváni analogických bakteriálních exolátek. Při použiti metody dle vynálezu Je výtěžnost ve srovnáni s dosud popisovaným způsobem několikanásobná a nad to dochází k bezpečné likvidaci zbytku bakterii. Expirace takto získané sfingomyelinázy D'převyšuje jeden rok, zatímco citováni autoři se o expiraci svých preparátů nezmiňuji. Biopreparát získaný podle vynálezu lze výhodně použit jak v detekci stafylokokových hemolyzinů, tak i v novém způeobu určováni streptokoků ekupiny B.

Přiklad výroba prepurifikovaná formy sfIngomyelinázy O je následující (přiklad je uveden na 1000 ml surového produktu):

1. na pevném mádlu ae izoluje nardet v jednotlivých koloniích kultuře Corynebacterium peeudotuberculoele a po 48 hodinách inkubace při 310 K ee v 10 ml tekutého média suspenduje 3 až 5 kolonií.

2. Na petrlho mlsky o 0 15 cm ee naleje 15 ml agarového média a nechá ztuhnout.

3. Suspenze korynebakterlí (1) ee přenese do 1000 ml bujónového média, dobře se promíchá e sterilně ee navretvl a 25 ml na agarová média (2).

4. Takto nakultivované Petrlho mléky ee nechej! inkubovat 48 h. při 310 K nejlépe vložená do igelitových sáčků a po této době ee porost smyje sterilní zahnutou skleněnou tyčinkou a přenese do sterilních centrifugačnich kyvet. Odstřeďuje ee 1 h. při otáčkách 5000 min.¹.

5. Po ukončená centrlfugaci ee sterilně oddělí supernatant od sedimentu. Sediment ee kontroluje kultivačně, izolací na Jednu kolonii, ne čistotu kmene.

6. Získaný supernatant ae považuje za surovou formu korynebakteriálnl exolátky. 3eho aktivita ee titruje proti prepurifikoveně formě stafylokokového beta-toxlnu. připravované známou metodou HAQUE, R. U. - BACOWIN, 3. N,: Purification and propertiea of etephylococcal beta hemolysin. 11. Purification of beta hemolyein. 3. Bacteriol., 100, 1969, e. 751-759.

7. Tltrace surové formy (6):

a) ve zkumavkách Se připraví geometrická řada ředěni surová formy ve fyziologickém roztoku e 0,001 M (finální obsah) MgSO^, v objemu 0,25 mit

b) ke každému ředěni ae přidá 0,5 ml 2 % suspenze 3 x propraných ovčích erytrocytůt

c) tato eměe se inkubuje 1 h. při 310 K. Aby ee zabránilo sedimentaci erytrocytů. Je nutné nměe vždy po 10 min. dobře protřepat;

d) po Inkubaci (c) se do každá zkumavky přidá 0,25 ml stafylokokového beta-toxlnu (6)sobsahem 20 Jednotek aktivity v 1 mit

e) zkumavky ee dobře protřepou a nechají inkubovat 1 h. při 310 K. Zabránění sedimentace Je stejná Jako v bodě c)t

f) po ukončeni inkubace (e) ee zkumavky přemísti do chladničková teploty (cca 277 K), protřepávají ae po 10 minutách po dobu nejméně Jedná hodiny. Potom ee reekce hodnotit

g) pro možnost správného hodnoceni reakce Je nutné udělat tyto kontroly:

i) kontrola surové formy ee provádí tak, že se ve zkumavkách připrav! její ředěni ve fyziologickém roztoku. Do první zkumavky «ιβ dá pouze 0,25 ml surová formy, ve druhé a třeti zkumavce ee připraví v objemu 0,25 ml její ředění It2 a 1:4.

Ke každá zkumavce se přidá 0,25 ml fyziologického roztoku (a) ,a 0,5 ml 2 %.erytrocytů (b). Tak vzniknou konečná ředěni surové formy 1:4, 1*8 e 1:16. ii) Kontrole erytrocytO se provede emiěenim 0,5 ml fyziologického roztoku (a) e 0,5 ml 2 % erytrocytO (b).

iii) Kontrola stafylokokového bete-toxinu (6) ee provédi smichánim 0,25 ml beta-toxinu, obsahujícího 20 jednotek aktivity v 1 ml, 0,25 ml fyziologického roztoku (a) a 0,5 ml 2 % erytrocytO (b).

Kontroly se inkubují stejně. Jako zkumavky titrace surové formy.

8. Hodnocení titrece surové formy: při popsaném postupu je ve zkumavkách ředěni syrové formy 1:4, 1:8, 1:16 .... až 1:2040. V každá zkumavce Je pět jednotek aktivity stafylokokového bete-toxinu a 1 % ovčích erytrocytO, to vše v celkovém objemu 1 ml v každá zkumavce, Za jednotku aktivity ee považuje to poslední ředěni surová formy, která ještě zabráni hemolýze erytrocytO, k níž dochází v důsledku H-C efektu stafylokokového beta-toxinu. Pro hodnocení Je významný výsledek v kontrolách. V kontrole surová formy (1), stejně jako v kontrole erytrocytO (ii) nesmi dojít k hemolýze, V kontrole bete-toxinu (lil), muel být úplná hemolýze.

9, Extrakce a prepuriflkece korynebakteriálni exolátky ee dělá precipitaci acetonem ochlazeným na 253 K tak, že se k Jednomu objemu surová formy (6) přidají dve objemy acetonu. Po dvouminutovám působeni ee teto aměe e vytvořeným preclpitátem centrifuguje při 5000 otáčkách za minutu po dobu Jedná hodiny.

10. Po ukončení centrlfugace ee odetraní supernatant a sediment ee rehydretuje redest. eterll.HgO tak, aby vzhledem k výeledku titrace surové formy (8) odpóvidal finální obsah vee 5000 Jednotek aktivity ne ml.

11. Popsaným způsobem rehydratovená prepurifikovená forma (10) ee titruje ne skutečný obeeh jednotky aktivity. Připraví ee Jeji základni ředěni 1:100 a z tohoto, vždy v objemu 0,25 ml ředěni 1:250, 1:500, 1:750, 1:1000, l:l?50, 1:1500, 1:2000, 1:2500, 1:3000,

1:4000, 1:5000. Dalši poetup je etejný Jako při titracl eurová formy (7.b-7.f). Finální ředěni titrovaná prepurifikovená formy jeou: 1:1000, 1:2000, 1:3000, 1:4000, 1:5000, 1:6000, 1:8000, 1:10.000, 1:12.000, 1:16.000 a 1:20.000. Kontrola prepurifikovaná formy ee dělá e ředěními |:250, 1:500 a 1:750. Dalši poetup podle (7.g.i). Kontrola erytrocytů e kontrole bete-toxinu odpovídá (7.g.ii e 7.g.iii).

12. Hodnoceni titrace prepurifikovaná formy je etejné, Jako hodnocení titrace eurová formy (8). Poslední ředěni bránicí hemolýze se považuje za Jednu jednotku aktivity prepuriflkovená formy. Je tedy obsah Jednotky aktivity v Jednom ml rehydratovanáho precipitátu (10) roven reciproční hodnotě jeho ředěni v titraci.

13. Po vyhodnoceni titrace prepurifikovaná formy ee tato upravi na konečnou hodnotu jednotek aktivity v 1 ml - optimálně ne 5000 - pzneči ee Jako Corex a konzervuje ee zmražením na 253 K nebo lyofillzaci. Před Jeji konzervaci Je nutná provést kontrolu sterility získaného preparátu.

Claims (1)

1. PftEDMĚT VYNÁLEZU

   Způsob výroby prepurifikovaná eflngomyelinázy D, vyznačující ee tím, že ne agarový podklad ee navretví bujónový film e inokulem Corynebacterium peeudotuberculoeie e nechá ee pomnožit 24 až 48 hod, při teplotě 308 K až 311,5 K, smytý nárůst ee odstředí a získaný supernatant ee smíchá e 1,5 ež 3 objemy acetonu ochlazeného na 258 K až 248 K a nechá ee to 1,5 min. ež 30 min. působit, poté ee eměe odetřeďuje 50 ež 70 min,, poté ee rychle a dokonale odstraní supernatant a sediment, který je prepuriflkovanou formou efingomyellnázy D se rehydretuje ve sterilní destilovaná vodě.