CS208172B2

CS208172B2 - Method of making the yeast product with contents of the nucleic acid in the range from the weight 0,5 to 9%

Info

Publication number: CS208172B2
Application number: CS75417A
Authority: CS
Inventors: Ernest A Robbins
Original assignee: Anheuser Busch
Priority date: 1974-02-11
Filing date: 1975-01-21
Publication date: 1981-08-31
Also published as: IE40431B1; ES434474A1; AT344493B; NO750291L; FI53716B; NO140851C; FR2260295B1; US3991215A; ZA747691B; GB1486330A; IE40431L; DE2500565A1; BE824352A; CA1015204A; FI53716C; CH601487A5; FR2260295A1; IT1040564B; LU71797A1; AU7633274A

Description

Autor vynálezu ROBBINS ERNEST ALECK, HIGH RIDGE, MISSOURI (Sp. st. a.) (73)

Majitel patentu ANHEUSER-BUSCH, INCORPORATED, ST. LOUIS, MISSOURI (Sp. st. a.) (54 J Způsob výroby kvasnicového bílkovinného produktu s obsahem kyselinynukleové v rozmezí od 0,5 do 9 % hmotnostních 1

Vyináleiz se týká způsobu výroby kvasni-cového bílkovinného produktu s obsahemkyseliny nukleové v rozmezí od 0,5 do 9 %hmotnostních, jakož i výrobku získávaného·tímto· způsobem.

Vynález skýtá způsob výroby kvasnicové-ho bílkovinného produktu s obsahem: nukleo-vé kyseliny v rozmezí od 0,5 do 9 % hmot-nostních, ,při němž se rozruší buňky kvas-nic, rozrušené kvasinkové buňky se zahří-vají k oddělení nukleové kyseliny od bíl-koviny a nerozpustný bílkovinný produkts nízkým obsahem kyseliny nukleové se od-dělí od rozpustného podílu, obsahujícíhokyselinu nukleovou.

Podle vynálezu se tedy získá kvasnicovýbílkovinný produkt, obsahující a!si od 45 asido· 65 % hmotnostních surové bílkoviny aod 0,5 do 9,0 o/o hmotnostních nukleové ky-seliny, vztaženo na sušinu.

Literatura týkající se bílkovin produko-vaných mikroorganismy je značně rozsáhlá.Pod pojmem bílkovin produkovaných mi-kroorganismy se rozumí jednak celá buň-ka, kde bílkovina je obsažena v oblasti vy-mezené buněčnou stěnou a je proto poměr-ně nefunkční. V druhém významu tohotopojmu jde Q bílkovinu, isolovanou jako od-dělená látka z mikrobu. V obou případechse píro· účely lidisiké výživy muisí obsah nu- 2 fcleové kyseliny v bílkovinném produktusnížit pod 9 %, pokud by podstatná částkvasnicové bílkoviny byla určena k použitípro· lidskou výživu. Doporučená denní dáv-ka bílkovin (The Food and Nutriticn Board,National Research Ccuncil) je 65 g denněpro· dospělého muže o· hmotnosti 70 kg;Sekce pro· bílkoviny při Organizaci spoje-ných národů (The Protein Advisory Group)doporučuje, aby denní příjem nukleové ky-seliny, požité za den ze zdrojů bílkovin pro-dukovaných mikroorganismy, byl -nižší než2 g. Obsah nukleové kyseliny v bílkovině-musí tedy být nižší -než 3 %, pokud se mávyhovět těmto požadavkům- a pokud bykvasnicová bílkovina byla jediným zdrojembílkoviny v. přijímané potravě. Obsah nukleo-vé kyseliny má být nižší než 6 %, pokudkvasiTcová bílkovina tvoří 50 % bílkovinyv přijímané potravě.

Obsah nukleové kyseliny v buňkách kva-sinek, jako je druh Candida utiliis a S-acha-romyces Cerevisiae, je asi 12 až 15 g nu-kleové kyseliny na 100' g surové bílkovinySurová bílkovina se zde uvažuje jako obsah dusíku násobený faktorem 6,25. Bíl/kovina i-solovaná z těchto buněk tedy obsa-huje 12 až 15 g nukleové kyseliny na 100 gsurové bílkoviny. Obsah nukleové kyselinymusí tedy být -podstatně snížen, až čtyř-ine- 208172 208172 bo pětinásobně, dříve než lze bílkovinupokládSt za vhodnou jako jediný zdroj bíl-kovin pro''' lidskou výživu. Nukleovou kyse-linou v kvasinkách je hlavně kyselina ri-bonukleová (v dalším! jen RNAJ a tyto poj-my se v tomto popisu používají jako zamě-nitelné.

Snížení obsahu nukleové Kylselimy se mů-že dosáhnout hydrolýzou nukleové kyseli-ny v buňce rozrušené do takové míry, abyzlomky nukleové kyseliny mohly difundo-vat z buněk pryč od bílkovin. Je známo, žev některých kvasinkových buňkách je pří-tomen emizyím nukleáza, který hydrolyzujenebo štěpí molekuly nukleové kyseliny namenší zlomky. Je také známo, že hydrolýzynulkleových kyselin uvnitř buňky se můžedoisáhnout několikastupňovým zahřívánímtak, aby se aktivovala endogenní nukleázaa tími vznikly buňky obsahující 2 až 3 gnukleové kyseliny na 100 g bílkovin. Nu-kleová kyselina se může také hydrolyizovattak, že se buňky vystaví působení nukleá-zy vnějšího původu. Dále je známo, že kextrahování nukleové kyseliny z buněk lzepoužít alkálií. Při každém z těchto postupů se získajídvě frakce. Jednou frakcí jsou buňky obsa-hující snížený obsah nukleové kyseliny.Druhou frakcí je okolní prostředí, obsahu-jící zlomky nukleové kyseliny a jiný mate-riál schopný difúze. Jednou z nevýhod to-hoto způsobu je, že bílkovina zůstává vbuňce v nefunkční formě pro- použití jakopotravina. Jinou nevýhodou je, že postupy,jimiž se buněčná stěna stává prostupnoupro zlomky kyseliny nukleové, rovněž vel-mi značně snižují schopnost buňky k její-mu rozrušení, aby se tak umožnilo· získá-vání bílkoviny. Další nevýhodou je obtíž-nost ovládání endogenní. proteáizy, jež hyd-rolyzuje bílkovinu, čímž se získávání bíl-kovin stává obtížnějším. V případě, že se buňky kvasinek, ze kte-rých nebyla RNA oddělena, rozruší jakým-koliv jiným postupem, získá se frakce tvo-řená zbytky rozrušených buněk a frakce,kterou tvoří rozpustná cytoplasmická slož-ka. Tyto frakce se mohou od seibe oddělitodstředěním nebo filtrací. Částí rozpust-ných cytopLasmickýich složek jsou nuklebvákyselina a bílkovina, a to buď saimqtné, ne-bo vzájemně spojené. Ať tak, nebo onak,získáni bílkoviny isoelektrickým sráženímvede k bílkovinnému produktu, který mánežádoucí obsah nukleové kyseliny. Zpra-cování kvasinkových buněk postupem, po-užívajícím, alkálie je popsáno v patento-vých spisech USA č. 3 775 393 a 3 867 ,255.'Při zpracování postupy podle těchto· paten-tových spisů se však pracuje za vyšších tep-lot, což má za následek zhoršení jakostiZískaného produktu, pokud jde o zbarvení,chuť a výživnou hodnotu. Při těchto postu-pech dochází též k hydrolýze nukleové ky-seliny, na rozdíl od způsobu podle vynále-zu, při němž se kvasinkové buňky podrobí zahřívání při prakticky neutrálním pH, čímžse· neporušená RNA převede do roztoku aoddělí od nerozpustné bílkoviny se sníže-‘ným obsahem RNA. Při hydrolýze RNA po-dle uvedených patentových spisů USA seRNA rozštěpí na zlomky, zatímlco· způsobpodle vynálezu umožňuje získat neporuše-né molekuly RNA.

Nyní byl objeven způsob, při němž lzepůsobením tepla získat v dobrém, výtěžkuz kvasnic bílkovinný produkt se sníženýmobsahem nukleové kyseliny.

Způsob podle vynálezu k výrobě kvaisni-cevého· bílkovinného produktu s obsahemkyseliny nukleové v rozmezí od 0,5 do 9,0 %hmotnostních se tedy vyznačuje tím·, že Sekvasinkové buňky, s výhodou kvasinek kme-nů Sacharomyceis cerevisiae a Canidida uti-,lis rozruší, s výhodou homogenizováním přiteplotě v rozmeizí od 0 do· 60 °C, popřípaděse rozrušené kvasnicové buňky extrahujía vzniklý homogenizát se rozdělí na alká-liový extrakt, obsahující kyselinu nukleo-vou a bílkovinu, a na frakci zahrnující ne-rozpustné buněčné stěny, popřípadě se bíl-kovina učiní nerozpustnou přidáváním, ky-seliny až do dosažení nej,menší rozpustnostibílkoviny s následnou izolací nerozpustnébílkoviny rozrušené kvasinkové buňky, al-káliový extrakt nebo izolovaná nerozpustnábílkovina se zahřívají k oddělení nukleovékyseliny od bílkoviny při teplotě v rozmezíod 100 do 150 °C po dobu 10 s až 60 minut,s výhodou 1 až 5 minut, při hodnotě pHv rozmeizí od 6 do 8, s výhodou od 6,5 do7,5, nerozpustná bílkovina se oddělí od roz-pustné nedotčené nukleové kylselimy a zís-ká se kvasnicový bílkovinný produkt, obsa-hující 0,5 až 9 o/o hmotnostních, s výhodou0 až 3 °/o hmotnostní kyseliny nukleové. Získaný bílkovinný produkt má rovněžžádoucí funkční vlastnosti. Tepelné zpraco-vání se může aplikovat v kterémkoliv úse-ku pracovního postupu podle vynálezu po-užívaného· k získávání bílkovin z kvalsnic.možno účinně podrobit rozrušené buňkykvasinek, rozpustnou cytoplaizmickou frak-ci z rozrušených kvasinkových buněk nebozískaný izolovaný bílkovinný produkt. Vkaždém, z těchto případů se RNA účinně od-dělí od bílkoviny.

Další výhodou tohoto postupu je, že sebílkovina může získávat bez další úpravy.Rovněž je výhodné, že se buněčné stěnykvasinek mohou získávat jako oddělenýcenný produkt. Jinou další výhodou je, žeje možno izolovat nebílkovinné rozpustnécytoiplazmické složky a zpracovat je na cen-ný produkt. Vzhledem! na výši teploty a do-bu tepelného zpracování je další výhodoutohoto vynálezu, že bílkovina a rozpustnésložky ise získávají prosté mikroorganismů,tj. že jsou sterilní.

Způsob ve výhodném, provedení zahrnuje tyto stupně: pěstování kvasnic, rozrušení klvasinkových buněk, oddělení ineroizpust- 208172 ných zloímiků buněčných stěn ad rozpustnécytoplazmické frakce, tepelné zpracovánírozpustné fralkce, izolaci bílkoviny is níz-kým, obsahem nuikleové kyseliny odstředě-ním;, vakuovou koncentrací, a sušení.

Tepelnému zpracování se mohou podro-bit přímo· rozrušené kvasinkové buňky, cožvede k získání těchto výsledných produktů: 1. kyselé syrovátky nebo· kvasnicového' vý-tažku, který obsahuje RNA, 2. bílkoviny s nízkým obsahem RNA, spo-lu s buněčnými stěnami nebo zlomky bu-něčných stěn (glykan). Při jiném, výhodném' provedení se tepelnězpracuje alkalický extrakt, získaný po od-stranění zlomiků buněčných stěn. Když setepelné zpracování provede v tomto· stupni,jsou výslednými produkty 1. zloimky buněčných, stěn, 2. kyselá syrovátka, obsahující RNA, 3. bílkovina s nízkým obsahem RNA. Třeltí provedení spočívá v tom, že se vy-srážejí bílkoviny s veškerým; obsahem RNAz alkáliového extraktu a pak se tepelnězpralcují bílkoviny s veškerým obsahemRNA. Tento postup vede ke čtyřem výsled-ným produktům, jsou to: 1. zlomky buněčných stěn, 2. kyselá syrovátka (extrakt), 3. čistá RNA, 4. bílkovina s nízkým obsahem RNA. Při všech těchto provedeních se RNAzíská v poměrně nedotčené formě, tj. jejímolekula není odbourána.

Kvasinkové buňky (biomasa) se produku-jí známými postupy. S výhodou se používábioimasy z kmenů Saccharoimyces a, Candi-da, pěstovaných na potravinových živnýchpůdách vsázkovou nebo nepřetržitou fer-mentaicí. Důležitým faktorem; je, aby kvasin-ky měly potravinářskou jakost a aby bylyzískávány v dobrém výtěžku.

Biomasa se sklízí odstředěním nebo filt-rací, načež se propírá vodou. Pokud je tonutné, je možno do prací vody přidat zře-děnou alkálii, aby se odstranily zbarvujíeía chuť ovlivňující látky. Kvasinkové buňkyse rozruší jakýmkoliv ze známých postupů,například homogenizací za vysokého· tlaku,roztíráním v pískovém nebo· koloidním mlý-ně, rozrušením ultrazvukem, opakovanýmzmrazením, a roztaním, enzymatickou lýzí•aipoid.

Hlavním cíleim je rozrušení většiny bu-něk za takových podmínek, aby většina lá-tek netvořících buněčné stěny zůstala v roz-pustném stavu k usnadnění jejich odděleníod buněčných stěn. Soustava zahrnující roz-rušené buněčné stěny (hotnogenizát se mů-že zředit, zahřát a její pH upravit pro zlep-šení zpracovatelnosti.

Homogenizát se odstředěním, a/nebo filt- rací rozdělí na zbytek buněčných stěn a na extrakt obvykle označovaný jako alkáliovýextrakt. Zbytek buněčných stěn se dále zpra-cuje na glykan.

Alkáliový extrakt se upraví na pH v roz-mezí od 6 až 8 a rychle zahřeje na teplotun,ad 100 °C během až 60 minut, s výhodou10 sekund až 5 minut. Při tomto zahříváníse oddělí podíl nukleové kyseliny od bílko-viny nukleoproteinu a většina bílkoviny sestane nerozpustnou, zatímco podíl zahrnu-jící nuikleovou kyselinu zůstává rozpustný.Tím se také sterilizuje rozpustná frakce,stejně jako frakce, která se stala nerozpust-nou. Nerozpustná bílkovina se .získá odstře-děním a/nebo filtrací, načež se piromyje vo-dou a vysuší. Suspenze nerozpustné bílkovi-ny se před sušením může zahustit za sní-ženého tlaku. Získaná sterilní bílkovina má nízký ob-sah RNA. Její složení je: 75 až 92 % hmot-nostních surové bílkoviny, 0,5 až 5,0 %hmotnostních RNA, 10 až 15 % hmotnost-ních lipidů, 1 a,ž 5 % hmotnostních popelo-vim a 3 až 10 o/o hmotnostních glycidů.

Rozpustné složky získané odstraněním, ne-rozpustné bílkoviny se označují jako kyse-lá syrovátka nebo kvasfniční extrakt. Tytorozpustné složky obsahují malé množství bu-něčné bílkoviny, většinu nedotčené nukleo-vé kyseliny, část glycidů a všechny složkymetabolieké soustavy. Kvaisničiní extrakt sezpracuje na chutné kvasnicové výrobky.

Rozrušení buněk, extrahování rozpustnýchsložek a zpracovatelnost jsou ovlivněny hod-notou pH, teplotou, dobou, koncentrací tu-hých látek a účinností homogenizátoru. Zdepoužívanou metodou pro· zjištění rozsahurozrušení buněčných stěn je stanovení množ-ství dusíku, .který zůstává rozpustlný, podlevztahu: % extra,hovatelného 100 . g N v superna- , „ tantu po odstředění dusíku = --—r--r-zz— g N v homoigenizátupřed odstředěním RNA se zjišťuje takto·:

Asi 50 mg bílkoviny se sníženým, obsa-hem; RNA se 30 minut digeruje při teplotě100 °C s 5 ml 0,2 N KOH. Dige,rováný pro-dukt se okyselí 5 ml činidla (0,4 M roztokcitrátovéiho pufru o pH 2,2, obsahující 1,7 ml70% HC1O4 ve 100 ml). Zbytek se odstraníodstředěním;. Měří se A26O Vhodně zředěné-ho supernatantu. Při výpočtu RNA se použi-je extinkčního koeficientu 31,7 A26O ml/mg.Obsah RNA se opraví s přihlédnutím k ovliv-nění A26O podíly bílkovin v hydrolyzátu, mě-řeno Lowryho metodou.

Obsah surové bílkoviny se vypočte z ob-sahu dusíku stanoveného podle Kjeldahla,za předpokladu, že surová bílkovina obsa-huje 16,0 % dusíku. Stanoví se úhrnný ob-sah dusíku v bílkovině s nízkým obsahemRNA a ten se násobí faktorem 6,25. Před-pokládá se, že nuikleová kyselina obsahuje 2 O 8172 16,3 o/θ dusíku. Proto obsah RNA dělený čís-lem 6,13 udává obsah dusíku nukleové ky-seliny.

Tak například, je-li podle měření RNA == 8,5 a úhrnné množství dusíku = 13,92,provede se výpočet takto: surová bílkovina = 13,92 x 6,25 = 87,0

duisík v RNA RNA = 8,56,13 ” 6,13 1,36 bílkovina po opravě = 6,25 x [13,92 —— 1,36) = 78,4 %.

Kvasnicová biomasa po promytí má pH 4.5 až 6,5. Biomasa se obvykle ochladí, pakprojde homogenizátorem (typ Manton-Gau-lin) do chlazené nádoby. Tento postup setřikrát opakuje. Je třeba nejméně tří prů-chodů homogenizátorem, aby se 'dosáhlomaximálního rozrušení buněk. V praxi sebiomasa homogenizuje za běžné hodnoty pHkvasnic, tj. v rozmezí od 4,5 do 6,5. Rozru-šení buněk se může dosáhnout také při vyš-ší hodnotě pH až do alespoň pH 9,5, avšaknásledující oddělení zbytků buněčných stěnod rozpustných složek je pak obtížnější.

Vliv hodnoty pH, koncentrace tuhých po-dílů a účinnosti homogenizátoru na extra-hovatelnoist dusíku u kmene Candida utilisa u Saccharomyces cervisiaie je uveden vnásledujících tabulkách I a II. Údaje v tabulkách I a II ukazují, že ex-trahování rozpustného dusíkatého materiáluse může provádět v rozmezí pH alespoň od

5.5 do 11. Praktické podmínky při zpraco-vání omezují hodnotu pH při extrakci narozmezí asi od 7 asi do 10, přičemž se pH 9.5 pokládá za optimální pro rovnováhu me-zi extrakcí a následným' oddělováním zbyt-ků buněčných stěn od rozpustných složek.Extrakce je nejlepší při nízkém obsahu tu-hých podílů, avšak opět ohled na optimální rychlost zpracování vede k tornu, aby sepracovalo s obsahem tuhých podílů v roz-mezí asi od 2,5 asi do 4 %. Doba extrakcemůže být proměnlivá asi od 5 sekund asido 60 minut při extrakční teplotě asi od 0°asi do 60 °C, s výhodou od 25 do 60 CC. Nej-lepší rychlosti zpracování pro následné od-dělování zbytků buněčných stěn od rozpust-ných složek se dosáhne, když se extrahová-ní provádí při teplotě 60'QC po dobu cd 5 do20 minut při pH 9,5. U kmenů Candida uti-lis a Saccharomyces cerevisiae každý odjednoho do pěti průchodů homiogenizátoremzlepšuje extrahovatelnost dusíku, pravdě-podobně následkem rozrušení většího počtubuněk. Souhrn tří průchodů byl přijat jakodobrá rovnováha mezi účinností zpracová-ní a velikostí nákladů. Používá se přetlakuod 34,32 do; 103,8 MPa. Teplota je v rozmezíod 0 do 60 °C a pH v rozmezí od 4,5 do 6,5.

Když se berou v úvahu extrahovatelnostdusíku a požadavky zpracování, pak opti-mální postup k získání nerozpustného ma-teriálu buněčných stěn je tento: 1. kultivace kvasinek potravinové jakostina živné půdě, 2. sklizení a promytí buněk kvasinek, 3. rozrušení buněčných stěn při teplotě od 0 do-10 2C, 4. zpracování rozrušených buněk při pH 9,5a teplotě 60 °C po dobu 20 minut a 5. odstranění nerozpustných složek při tep-lotě přibližně 60 QC.

Extrakt, obsahující rozpustné podíly kva-sinek, se nazývá alkáliový extrakt. Za opti-málních podmínek se v alkáliovém extraktuzíská 85 až 90 % dusíku podle Kjeldahla zhomiogenizátu. Ne jvyšší . extrahovatelnost.du-síku vede k nejnižštau obsahu bílkovin .vglykanu a k ňejvyššímu podílu bílkovin valkáliovém extraktu. TABULKA 1

Vliv hodnoty pH ,při extrahování, množstvítuhých podílů a účinnosti homogenizátoruna extrahovatelnost dusíku u kmene Candi-da utilis

Ochlazené suspenze kvasinek kmene Can-dida utilis při pH 5,0 až 5,5, s obsahejm 7 až10 % tuhých podílů se homogenizují na ho- mogenizátoru Manton-Gaulin. Ochlazený 'ho·mogenizát se opakovaně jednou, dvakrát,třikrát nebo čtyřikrát vede znovu homoge-nizátoreim. Homogemizát se zředí až 2,0 dílyvody a upraví se hodnota pH. Zředěné ho-mogenizáty se inkubují 30 minu při Teplotě50 °C, načež se odstředí. Obsah dusíku zře-děných homogénizátů a supernatantu sestanoví podle Kjeldahla. Vypočtou se pro-centní množství extrahovaného dusíku. 208172 9 10 při extrakci Obsah tuhých podílů Počet průchodůh omeg etn i:z á-t o-r e m % extrahovanéhoduisí-ku 7 2,5 3 76* 8 2,5 3 74* 9 2,5 3 84* 10 2.5 3 82** 11 2,5 3 80** 9 5 2,5 1 70* 9,5 2,5 2 83* 9,5 2,4 3 89* 9,5 2,5 4 91* 9 2,4 3 83* 10 2,4 3 8-2** 11 2,4 3 78** 12 2,4 3 85** 9 6,9 3 64** 10 6,9 3 59*** 11 6,9 3 54* * * 12 6,9 3 41*** * značí dobrou, ** průměrnou, *** špatnou způsobilost zbytků buněčných stěnk oddělování od ro-zpustnýoh složek TABULKA 2

Vliv hodnoity pH při extrahování, teploty,doby, obsahu tuhých podílů a účinnosti ho-mogebizátorů na extrahovatelnost dusíkuu kvasinek temene Saocharomyceis cerevisiae

Ochlazená suspenze běžného- pekařskéhodroždí se při pH 6 až 6,5, obisahu tuhýchpodílů 7 až 10 °/o, hcwnogenizují v homogeini-záto-ru Manton-Gauli-n. Ochlazený homoge-ni-zát se vede jednou, dvakrát nebo třikrát pH % tuhých Doba, podílů min. zno-vu homogenizáto-rem. Homogenizáty sezředí až dvěma objemy vody a upraví sehodnota pH. Zředěné homogenizáty se in-kubují po dobu 5 až 60 minut při teplotě2-5 až 60 CC, načež se odstředí. Obsah dusí-ku hom-ogenizátů a supernatantů po odstře-dění se stanoví podle Kje-dahla. Vypočte seprocento extrakce dusíku.

°C

Počet průchodůhomogeinizáto-rem ’/o extraho-vatelnéhodusíku 9,5 9,1 30 2-5 3 83 9,5 4,8 3-0 26 3 84 9,5 3,1 30 25 3 92 9,5 3,1 30 26 2 80 9,5 3,1 30 2-5 1 63 9,5 3—4 5 50 3 91 9,5 3-4 20 50 3 93 9,5 3—4 30 50 3 96 9,5 3—4 6-0 50 3 9-6 9,5 3—4 5 60 3 93 9,5 3—4 2-0 60 3 94 9,5 3—4 30 60 3 91 9,5 3—4 6-0 60 3 90 4,0 3—4 30 25 3 33 5,0 3—4 30 25 3 36 6,0 3—4 30 25 3 79 7,0 3—4 30 25 3 93 8,5 3—4 30 25 3 9-3 9,5 3—4 30 25 3 9-6 6,0 3—4 60 60 3 42 6,5 3—4 60 60 3 33 7,5 3—4 60 60 3 30 8,5 3—4 60 60 3 73 9,5 3-4 60 00 3 90 208172 11 12

Alkáliový extrakt obsahuje veškeré množ-ství buněčných složek, s výjimkou složkytvořící buněčnou stěnu. To znamená, že al-kaliový extrakt obsahuje bílkovinu o vysokémolekulové hmotnosti, nukleovou kyselinu,tuk a glycidy, stejně jako nízkomolekulár-ní sloižky metaibolické soustavy, jako jsouaminokyseliny, peptidy, nukleotidy, nukleo-zidy, dusíkaté báze, meziprodukty glykotic-ké cesty, vitaminy, minerální látky apod.Bílkovina a nukleová kyselina jsou z většíčásti kombinovány jako nuikleoproitein. V případě, že se bílkovina získává iso-elektricikým srážením, pak izolovaná bílko-vina má poměrně vysoký obsah nukleovékyseliny a označuje se zde jako kvasnicovábílkovina s plným obsahem RNA.

Jestliže se však alkáliový extrakt zpracu- je tepelně v souhlasu s vynálezem, předizolováním bílkoviny, pak získaný bílkovin-ný produkt má nízký obsah nukleové kyse-liny a označujie se jako kvasnicový produkts nízkým obsahem: RNA. V případě, že sealkáliový extrakt zpracuje postupem podlevynálezu, pak se bílkovinný produkt s níz-kým obsahem RNA stává nerozpustným amůže se izolovat buď s úpravou pH, nebo·bez ní.

Faktory, které ovlivňují použití tepla kzískání kvasnicového produktu s nízkýmobsahem RNA, jsou teplota, doba zahřívání,pH a obsah tuhých složek v alkalickém ex-traktu. Údaje vztahující se k vlivu těchto'faktorů, jsou uvedeny v tabulkách III ažVII. 208172

>CD

P op >·

Hd <p> 733 >CD\P P 'a 'Ctí 'a 'a 'a 'a e! P > > > 0 S ε o P cá F~i ω ω (a -3 oo °tí ipri CMo

Xl

O 2Í

O >

P

O ω a ~ ~p., p ppa >a >ω >F^ ω §>CD ^p >CD 2 2 p a P \a <a £ 'S 2 ω

COrP PH O « Pω ó na >ω >,P ω rt Ρνω > 2 3> P CD ωo cd 73 03 £

Pd cd o

> "Pcd P 3 acd s p 'cd na • ř-l

>ÍH P<

\ 73 fP I Q P « £P > ctí O<73 O" CM 33cdO NCD _ .—- ctí CD ·ς±Γ. ω

a CD a >> Γ-ι a m cd cd 'a 2 3 Έ> P 73 CD 3 >.)N3 p cd í~l 73 3 'a > a a 4-1 na > 'cda ;Pgxa 'a > a ε 'a 2 CD CD ω CD ω 'a co &0 00 00 oo P ω '£>> '> 'a P do P P P >N r-4 > > > O CD ω cD CD · > n< P« P< Pu -4—>

rP

Q ctí jp a x 3“7e lK. S-4

'03>O '3 Q) o

<C Μ ΰ m < Η

P čd >tSí o Λί Φ

>N >0) 4-* > p > a ř-l P. p s-i

O

M >

CD ω > OPΰ 3 °po naa ω '2'

N ř£* a a a 2

Ýl ppP sQ p >

O ""Ϊ 3p 2 a d Pa ωP > MP >—t > r-l \>-H k> í-i -xdCD o £>%a

O

Q -+-J L-J a ^a p

PQ

P

CD

>iM

O ω

>P

CD

N co m caoo oo co co ío ío o caco oo co cp co _o o" Λ1 Φ

>CD co^co co co co^eq rH cac\f -x^r m' co' c\T ’Φ' co H rl rl COcO^COt^CMTHíOCO [>, t>. co co có co co

lA 2 3 f-4

P 4-> ,*} p 4-> ω cd '3 tSi 3 73 a

' >CJ -* Pi Φ[ na• 03 > aa £~í .pad > 0 o nj

CD c/á ,P'<DPnčio ow inin lo Lrojjaj-O in m•φ' ’φ' ’φ' Έφ' CO" 'šj" r}T <φ 232 rP 3 X) ω g 'cd Φ CD 5w 5

o- O ~Si a p o na o o o co o ca o ιο CO CO CO CO CO co CO r-l

P >a > o o cd t-4 Λ sr

; £ £ 5 N

>N >M 1 č>

MXÍ, CD' >O

ri *^naP N CD ω čň

o P,

O O O O O O O Ocm oj cd cm řq óq č\i čorH rM t—1 tH r-l tP rP >F—IPh £ á >

rP > P «,Ρa ra N s

r. ř-| pP-Μ OPÍ P O íp a x O CDP & 73 na

O

CD 73

>N

CD

P > o o a F-i

P

Ph LC^ 1.0 ÍO 1.0 CO m LO LOca ccf bC cor' co lo ca

K >PS >N J

P CD P y w >o\>m pΛ P p > >C_>i C0

CD E-i < m trifiniocDMOft ιό in m m m m in in 208172 13 14

Test č. 59 v tabulce III vykazuje vysokýobsah RNA produjktu s plhýlin obsahem RNA.Testy č. 53 až 58 (s výjimkou 56B) ukazují,že zvyšující se hodnota pH při varu vyvolávápokles obsahu RNA oproti bílkovině získa-né ipři pH 4,5. Při pH 9,5, .a do určité mírypři 8,5, je úprava ,pH na hodnotu 4,5 nezbyt-ná k dosažení nerozpustnosti bílkoviny. PřipH pod 8,5 se při varu tvoří pevný gel.Ovšem test č. 56B ukazuje, žie při varu připH 6,5 má bílkovina získaná bez úpravypH nízký obsah RNA. Dále je bílkovina zís-kaná při testu č. 56B bílá a má téměř pří-jemnou vůni. Při vyšších pH (8,5 a 9,5) apři nižších pH (5,5 a 4,5) ukazuje zápachpo síře na rozklad aminokyselin obsahují-cích síru. Poněvadž aminokyseliny obsahu- jící síru jsou určujícím faktorem kvasnico-vých bílkovin, snižuje jakýkoliv pokles je-jich obsahu jakost bílkoviny.

Vliv délky doby zahřívání ukazuje příklad2. V tomto příkladu obsah RNA téměř do-sáhl minimální hodnoty za 13 minut, jichžbylo třeba k dosažení teploty 118 °C. Dalšízkoumání vlivu délky doby zahřívání byloumožněno použitím! kontinuálního režimuzahřívání, jak je popsán v příkladu 3. Tentorežim ukazuje, že při setrvání po 2 minuty,na teplotě 110 až 115 °C při pH 6,5 poklesneobsah RNA ve sklizené bílkovině na 2,0 %.Doba zahřívání v délce 5,3 min. dále snížíobsah RNA na 1,6 %.

Vlive teploty na pracovní postup zachy-cuje tabulka IV.

TABULKA IV

Vliv pracovní teploty na Skladbu a výtěžek bílkovin

Alkáliový extrakt pekařského droždí se zahřívá kontinuálním režimem, popsanýmv příkladu 3, jen teplota inkubace se během jpokuisu mění.

Postup Bílkovina test č. složení výtěžek, °C % RNA surová bílkovina, % 61 45 8,5 87 36 62 57 3,3 89 57 63 65 6,5 88 64 64 74 7,7 86 68 65 82 6,9 89 68 '66 88 7,4 90 71 67 94 6,9 91 65 68 101 4,9 89 62 69 109 4,9 88 63 70 115 3,6 87 62 71 126 3,4 87 60 60(1) 2 X 11,3' 83 59 (1) kvasnicová bílkovina obsahující plný podíl RNA, získaná upravením pH části alkálio-vého extraktu na 4,5 a izolováním bílkoviny i?\ , η/ g dusíku získaného v produktu (2) výtěžek, % = 100 x ——-— --τ-rr—x——- g dusíku alkalioveho extraktu Z testu č. 60 v tabulce IV vyplývá, žekvasnicová bílkovina s plnými obsahem RNAmá 11,3 % RNA. Test č. 62 ukazuje, že in-kubací extraktu při pH 6,5 po dobu 2 mi-nut při teplotě 57 °C se sníží obsah RNAzískané bílkoviny. Toto snížehí je důsledekpůsobení endogenní nukleáizy.

Nukleáíza se rychle stává neaktivní přirůstu telploty, jaik je zřejmé z růstu oibisahuRNA v získané bílkovině. Obsah RNA v iso-lované bílkovině je konstantní, když se tep-lota zvýší nad 65 °C, dokud se nedosáhneteploty vyšší než 100 °C. Obsah RNA v pro-duktu se sníží, když se teplota zlvýší na 126°

Celsia. Surový bílkovinný obsah produktuje konstantní v rozmezí 87 až 90 %. Výtě-žek surové bílkoviny se snižuje, když sezmenšuje obsah RNA v bílkovinném pro-duktu. Avšak oprava na RNA sklizenou sbílkovinou ukazuje, že výtěžek obsahu bíl-koviny je po opravě prakticky konstantní. Údaje v tabulce V ukazují, že přidání ma-lého množství iontů vápníku do· alkáliovéhoextraktu vede ke snížení obsahu RNA v bíl-kovinném produktu. Tyto údaje dále ilustru-jí vliv pracovních teplot vyšších než 100°Celsia. 208172

1S 16

TABULKA V

Vliv pracovní teploty a přídavku iontů vápníku na složení bílkovinného produktu

Alkáliový extrakt se připraví postupempodle příkladu 1. Obsahuje 2,67 % celkové-ho množství tuhých látek. Jeho hcdnoita pHse upraví na 6,5 přidáním1 hydroxidu sod-ného. Odeberou se jednotlivé podíly, které se upraví na 0, 0,001 a 0,006 módami kon-centraci chloridu vápenatého, načež se za-hřívají 1 hodinu při teplotě 100 °C a 120 °C.Vzniklý bílkovinný produkt >se isoluje a ana-lyzuje. test č. počet molů CaClz teplota °C skladba bílkovinného produktu RNA surová bílkovina 72 0 121 2,1 85 73 0,001 121 1,4 85 74 0,005 121 1,0 86 75 0 100 4,2 87 76 0,001 100 4,1 86 77 0,005 100 4,6 85 I když se údaje uvedené v tabulkách I a,ž dí omezen. Jak patrno z tabulky VI, poistup V získají za použití pekařského droždí, ne- podle vynálezu je použitelný s různými dru- ní způsob podle vynálezu na pekařské drož- hy kvasinek.

TABULKA VI

Obsah nulkleové kyseliny v bílkovinnémproduktu získaném z různých typů kvasi-nek

Kvasnicová bio,masa se připraví fermen-tací ,známý|mi postupy. Kvasnicová biomasase Sklidí odstředěním' a dvakrát promyjevodou. Buňky kvasinek se rozruší v homo-genizátoru Manton-Gualin, bílkovina a dalšírozpustné složky se z bomogeniizátu extra-hují mícháním, při pH 9,5 a isolují odstře- děním jakožto alkáliový extrakt. Extrakcea odstředění se provádějí ipři teplotě 25 °C.Část alkáliového extraktu se ihned upravína pH 4,5, aby se vysrážel produkt s plinýmobsahem RNA. Další část alkáliového ex-traktu se okyselí na pH 7 a zahřívá 1 hodi-nu při teplotě 120 °C. Nerozpustná bílkovi-na se isoluje odstředěním. Bílkovinný pro-·dukt se p.rclmyje vodou a analyzuje na ob-sah RNA. test č. typ kvasinek podmínky při pěstování množství RNA v produktu, % bez tepelnéhozpracování s tepelnýmizpracováními 78 Saccharomyces carlsbergensis použité kvasinky získanéz pivovarské mladiny 7,6 2,3 79 Saccharomyces carlsbergensis vsázková fermentacena melase 13,4 0,8 80 Saccharomyceselipsoide us (Montrechet) vsázková fermentacena melase 13,9 0,8 81 Saccharomyces elipsoideus (Steinberg) vsázková fermentacena melase 13,4 0,8 82 Candida utilis(Y 900) vsázková fermentacena melase 12,5 0,9 83 Candida utilis(Y 1084) vsázková fermentacena melase 12,2 1,1 Kvasinky všech těchto· typů a zdrojů vy- produkt s nízkým obsahem RNA a se srov kaizují téměř úplné snížení obsahu RNA vbílkovinném produktu. Kromě toho se z růz-ných kvasinek v přijatelném1 výtěžku získá natelinými skladbami, jak je uvedeno v ta bulce VII. 208172 17 18

TABULKA VII

Složení a výtěžek bílkovinného' produktu, získaného' tepelným zpracováním, z růz-ných výchozích kvasnic v tabulce VI, podle další analýzy produkt složení bílkovinného produktu v % z testu č. bílkovina, RNA popeloviny lipidy výtěžek, surová po korekci % 78 79 89,1 88,3 80 86,2 85,4 81 81,0 80,2 82 78,3 77,4 83 80,4 79,3

Pracovní postup je blíže popsán v dále u-vedených příkladech 1 až 3. Příklad 1 Příprava bílkovinného produktu s nízkým,podílem RNA ze Saicidharomyceis cerevisiae

Rozšleihamý krém z běžného pekařskéhodroždí při pH 5,9 s 9 % sušiny se horno-genizuje 3x po sobě v hoímogenizátoruManton-Gaulin při tlaku 56 MPa. Homoge-nát se zředí vodou na sušinu 3,4 %, upravína pH 9,5, zahřívá se 10 minut na 60 °C aodstředí se při 1400 otáček k získání zbyt-kové frakce buněčných stěn a alkalického'extraktu. Alkalický extrakt obsahuje 79,1 %sušiny a 92,2 % surové bílkoviny Nx6,25],kteréžto množství bylo obsaženo ve výcho-zími droždí.

Do 200 ml alkalického extraktu, obsahu-jícího 5,8 g sušiny včetně 3,92 g surové bíl-koviny a 0,55 g nukleové kyseliny, se při-dá dostatečné množství kyseliny chlorovo-díkové, aby se extrakt neutralizoval na pH

0,8 X X 62 0,8 X X 58 0,8 X X 61 0,9 3,1 15,4 64 1,1 2,9 12,3 66 . Extrakt při p-H 7 se zahřeje n,a 120 °C hodinu, ochladí a rozdělí se na nerozpuště-nou bílíkovinovou frakci a supernatamt ob-sahující většinu nukleových kyselin a men-ší podíl bílkoviny. Výtěžek nerozpustné bílkoviny činil 1,8kilogramu na 45 kg výchozího droždí. Slo-žení bylo 85,1 o/0 surové bílkoviny, 2,2 %nukleové kyseliny. Příklad 2 . -Podle příkladu 1 ,se připraví alkalickýextrakt. 90,08 1 alkalického extraktu se dáv-kuje do ocelového tanku opatřeného' top-nými pláštěm a mícihadleim o otosajhu 135 1,pH se upraví na 7 a přidá se k úpravě pH75 ml koncentrované kyseliny chlorovodí-kové. Topný plášť se rozehřeje a do extrak-tu se vstřikuje pára ke Zdvižení teploty na118 — 120 °C. Postupně se odebírají vzorkya odstřeďují k získání bílkoviny. Bílkovinase promyje a analysuje.

Doba zahřívání v min. 0 13 28 43 58 73 Teplota extraktu °C 40 118 118 118 118 118 Výtěžek bílkovin θ/ο1) 84 59 55 54 52 51 % surové bílkoviny 91 >86 88 87 87 84 % RNA 13,6 2,7 1,6 1,6 1,7 1,3 e N v získané bílkovině 1j výtěžek bílkoviny = 100 x — g Ν' v zahřátém extraktu Příklad 3

Alkalický extrakt se připraví jako v pří- .kladu 1. Upraví se na pH 6,5 a čerpá kovo-vými hadem o rozměrech o délce 12 m av průměru 0,5 cm, ponořeným v zahřívanéolejové lázni. Rychlost čerpání se upravítak, aby se extrakt zahřál na 1,10 až 115 °Cpo dobu 2 minut. Zahřátý extrakt se shro-máždí doi nádoby ponořené do· olejové láz-ně a odstředí se. Získaná bílkovina se ana-lysuje a má složení: 87 % surové bílkoviny, 3,6 % RNA. Výtěžek bílkoviny podle pří-kladu 2 činí 62 %.

Sterilnost získané bílkoviny byla zjištěnaza použití známý,tíh mikrobiologických zku-šebních postupů. Získaná bílkovina neobsa-hovala mikroorganismy. Tepelný postup po-dle vynálezu je také použitelný na snižová-ní obsahu nukleové kyseliny v isolovanýchbílkovinách s vysokým obsahem nukleovékyseliny. Viz dále příklad 4. Příklad 4

Snižování podílu RNA v bílkovinném pro-

duktu plně obsahujícího RNA

Podle příkladu 1 se připraví alkalický ex-

Claims

208172 19 20 traikt z pekařského droždí. Litr alkalického'extraktu s 2,9 % sušiny se upraví na pH 4,5 kyselinou chlorovodíkovou a odstředíse. Zíislkaný produkt se promyje vodou aznovu uvede do suspense, mající aisi 5 %sušiny. Tento produkt má složení 81,5 %surové bílkoviny, 13,9 % RNA, 1,7 % po- Zkouška č. 84 pH při zpracování úplného produktu '5 surová bílkovina % 80,3 RNA % 10,4 upravená bílkovina — % 69,7 popel — % 0,5 lipidy — % 13,& Kapalná frakce z odstředění obsahujezbytek RNA, který se získá okyselením. Tepelný postup podle vynálezu je dálepoužitelný na výrobu bílkovinného produk-tu s nízkým obsahem RNA, obsahujícíhobuněčné stěny. Přitom se (rozrušené buňkytepelně zpracovávají, aniž se předtím, od-stranily buněčné stěny. Bílkovinný produktse sníženým' obisahem' RNA a obsahující bu-něčné Stěny se získá odděleními nerozpust-ných složek od rozpustných po tepelné ú-pravě. Tento postup je vysvětlován v pří-kladu 5. Příklad 5 Snížení obsahu RNA v produktu obsahujícíbílkovinu a buněčné stěny Postupem jako v příkladu 1 se připravíhonrogenát z pekařského droždí a pH seupraví na 7 přidáním hydroxidu sodného.Objsahuje 8,2 % sušiny, z nichž 54,2 % jesurová bílkovina. Část homogenátu se za-hřívá 30 minut při 118 — 120 °C a ochladíse. Nerozpustné složky se získají odstředě-ním a analysují se. Složení ukazuje násle-dující tabulka: pRedmEt

1. Způsoib výroby kvasnicového bílkovin-ného produktu s obsahem kyseliny nulkleo-vé v rozmezí od 0,5 do 9 % hmotnostních,vyznačující se tím, že se kvasnicové buň-ky, s výhodou kvasnic kmenů Saocharomy-ces cerevisiae a Candida utilis, rozruší, svýhodou homogenizováním při teplotě vrozmezí od 0 do 60 CC, popřípadě se rozru-šené kvasnicové buňky extrahují a vzniklýhomogenizát se rozdělí na alkáliový extrakt,obsahující kyselinu nukleovou a bílkovinu,a na frakci zahrnující nerozpustné buněčnéstěny, popřípadě se bílkovina učiní neroz-pustnou přidáváním anorganické kyselinyaž do dosažení nejmenší rozpustnosti bílko-.viny s následnou isolací nerozpustné bílko-viny, rozrušené kvasnicové buňky, alkálio- pele, 13,4 o/0 lipidů a 3,7 i0/o glycidů. Podílypo 200 ml 5% suspense se upraví na pH 5,6, 7 a 8 hydroxidem sodným, zahřívají 30minut při 118 — 120 °C a ochladí. Bílkovi-na se získá odstředěním a analysuje se. 85 86 87 6 7 8 85,2 83,9 78,7 7,7 5,2 4,6 77,3 78,6 74,0 1,4 2,1 3,3 12,1 16,0 . 15,4 surová bílkovina 62,4 % RNA 4,0 % upravená bílkovina 58,3 % popel 2,5 % lipidy 9,1 % glycidy 26,0 % Kvaisničný produkt obsahuje ze sušinyasi 28 % úlomků z buněk o průměrné (ve-likosti úlomku asi 3,8 ± 0,8 x asi 2,4 + 0,7μΰι. Buněčná hmota má 70 — 100 % úlom-ků nepravidelného tvaru a 0—30 % ce-lých buněk, obsahující materiál, který lzebarvit methylenovou modří. Produkt vyplývající z použití tepelnéhopostupu na hmotu rozrušených buněčnýchstěn, z něhož buněčné stěny nebyly od-straněny, má tato složení, vztaženo na su-šinu: RNA 1,5 % až 5,0 % upravená bílkovina 55 % až 65 % popel 1,5 % až 3,5 % lipidy 6,5 % až 9,5 % glycidy 35,5 % až 17 % úlomky buněčných stěn 20 -% až 35 % celé úlomky 0 % až 10 0/0 VYNÁLEZU vý extrakt nebo isolovaná nerozpustná bíl-kovina se zahřívají k oddělení nufcleové ky-seliny od bílkoviny při teplotě v rozmezíod 100 do 150 “C po dobu 10 sekund až 60minut, s výhodou 1 až 5 .minut, při hodno-tě pH v rozmezí od 6 do 8, s výhodou od 6,5 do1 7,5, nerozpustná bílkovina se oddělíod rozpustné nedotčené kyseliny nufcleovéa získá se kvasnicový bílkovinný produkt,obsahující 0,5 až 9 % hmotnostních kyseli-ny nuikleové.
2. Způsob podle bodu 1 vyznačující setím, že se rozrušené kvasnicové buňky předzahříváním extrahují při hodnotě pH v roz-mezí od 5,5 do 11 za teploty v rozmiezí od·25 do 60 °C po dobu 5 až 60 minut. Severojrafla, n. p„ zivod 7, Most