CS204208B1 - Způsob výroby prostředku stimulujícího při aplikaci na semena řepy cukrové růst vzcházejících rostlin a chránícího je proti spále - Google Patents

Description

Předmětem Ss. autorského osvědčení č. 199906 prvního ze spoluautorů je prostředek stimulující při aplikaci na semena řepy cukrové růst vzcházejících rostlin a chránící je proti spále. Tento prostředek obsahuje suspenzi oospor mikromycety druhu Pythium oligandrum v kapalině, obsahující živiny a látky podporující klíčení óospor a růst mycelia, jako je kvasniční výtažek.

Přípravek se velmi dobře osvědčil i v polních pokusech, avšak jeho původní způsob výroby stačil jen pro výzkum a vývoj, pro použití ve velkém měřítku byl méně vhodný jak z důvodů ekonomických, tak i technických.

Předmětem vynálezu je nový způsob výroby přípravku stimulujícího při aplikaci na semena řepy cukrové růst vzcházejících rostlin a chránícího je proti spále, obsahujícího jako účinnou složku propagační orgány mikromycety druhu Pythium oligandrum. Při tomto novém způsobu se pomnožené kultury Pythium oligandrum kultivují submerzně za větrání ve sporulační půdě obsahující 1 až 3 % chloridu vápenatého za ozařování viditelným světlem, výhodně světle modrým nebo zeleným, načež se po skončeném větrání pevné látky oddělí, např. tak, že se obsah tanku nechá sedimentovat, supernatant se oddělí a sediment, obsahující propagule, zejména oospory a gemmy, se konzervuje výhodně šetrným odvodněním. To lze provést např. sprayováním, sušením ve vznosu apod., výhodně za přidání práškovitýeh látek vázajících vodu a obsahujících živiny, jako jsou cukry, síran amonný apod.

Takto získaný přípravek je vhodný pro dopravu a distribuci. Těsně před aplikací na semena se převede smíšením s roztoky, obsahujícími živiny a látky podporující adhezi, např. s kvasničným autolyzátem nebo výtažkem za přidání roztoku želatiny, peptonu apod. na suspenzi propagulí mikromycety Pythium oligandrum. Tato suspenze se pak aplikuje na semena vhodným způsobem, např. sprayováním, nebo skrápěním ve vznosu v proudu suchého teplého vzduchu v sušárně. Koncentrace roztoků živin, do nichž se sušený přípravek rozmíchá, se volí podle zamýšleného způsobu aplikace na semena, obvykle v rozmezí asi 0,1 až 5 %.

Postup lze v rámci vynálezu různým způsobem obměňovat. Tak např. lze přidávat chlorid vápenatý buň najednou, na začátku nebo v průběhu kultivace, nebo postupně. Výhodné je přidávat chlorid vápenatý až po skončení hlavní části růstové fáze, na začátku nebo před začátkem sporulace. Výhodné postupy jsou popsány v následujících příkladech provedení.

Na většině obvyklých půd se sporulace Pythium oligandrum daří buňto špatně, nebo se vůbec nedaří. Vhodné půdy obsahují kromě běžných živin především chlorid vápenatý a přiměřený zdroj aminokyselin, např. v podobě kukuřičného výluhu.

Účinnou složkou biopreparátu jsou všechny propagační orgány mykoparazita Pythium oligandrum, hlavně oospory a gemmy. Tyto propagule nanesené na semena zaručuji potřebnou životnost mykoparazita od nanesení prostředku až do zasetí semen do půdy. Živiny obsažené v preparátu umožňují rychlejší rozvoj mykoparazita,než tomu je u jednoduché vodné suspenze, kde propagule jsou suspendovány v destilované vodě. Parazitární vlákna mykoparazita vyrůstají rychle z těchto zárodků a napadají mikromycety, které jsou přítomny jak na osivu řepy, tak i v půdě a jsou zároveň původci spály (Aphanomyces sp., Pythium sp., Rhizoctonia solani, Phoma betae, Alternaria sp., Fusarium sp.). Velmi důležité je, že účinná složka preparátu, tj. propagule Pythium oligandrum,inhibují všechny tyto původce ochoření.

Kromě nich inhibují i širší okruh hostitelských mikromycet, které jsou v rhizosféře řepy přítomny a mohly by svým případným antagonismem znemožnit ochrannou úlohu mykoparazita naneseného na semena Pythium oligandrum po potřebnou dobu šesti týdnů nebo dobu, kterou rostliny potřebují, aby dosáhly růstové fáze 2 až 4 pravých listů, kdy již akutní spála vzcházející řepy neohrožuje. Zjistilo se, že přípravkem jsou inhibovány i houby, které produkují antibiotika, např. Trichoderma viride, T. koningii a T. glaucum.

Protože jsou zárodky P. oligandrum inokulací semen introdukovány do půdy v hojnější míře a mohla by vyvstat námitka, že se tím do určité míry narušuje biologická rovnováha tohoto ekosystému, jsou důležitá zjištění o tom, že P. oligandrum účinně inhibuje Gaeumannomyces graminis, známého původce černáni pat stébel obilnin, zejména ozimé pšenice (DEACON, J. W., 1976: Studies on Pythium oligandrum, an aggressive parasite of other fungi. Trans. Brit. mycol. Soc. 66, 383-391. BENDÍftOVÁ, M. - VESELÝ, D., 1977: Change of Microbial Population' in Wheat Rhizosphere in the Presence of Gaeumannomyces graminis and Pythium oligandrum. Folia Microbiologica. Vol. 22, Mo. 6.

Zásadní význam má však originální zjištění autorů vynálezu o tom, že rhizosféru řepy cukrové osidlují antagonisté, např. Drechslera sp. (konidiové stadium od Cochliobolus sativum) . Tato mikromyceta P. oligandrum v půdě rychle ničí. Osídleni semen řepy druhem Helminthošporium sativum zjistil první GAMBOGI, 1964 (GAMBOGI, P.: Sulia micoflora dei glomeruli di barbabietola. Universitá di Pisa. Estratto da Annali della Spezimentazione Agraria N. S. XVIII, 1964, 56, 815-849).

Autor se však nezmiňuje o antagonistických vlastnostech tohoto organismu. Rovněž tak ani u P. oligandrum, které tento autor také nalezl jako první na semenech řepy, nehovoří o mykoparazitických vlastnostech. Naopak uvádí, že přítomnost P. oligandrum na semenech řepy nemá žádný fytopatologický význam a že je považováno jen za kontaminační houbu. Zjištění hyperparazitickýeh vlastností Drechslera sp. bylo potvrzeno a ověřeno jak mikrobiologickými analýzami půdy, tak i dalšími modelovými pokusy in vitro. V rhizosféře řepy tak vzniká řetězec fytopatogenních a hyperparazitickýeh hub, který uzavírá Drechslera sp. Tuto závislost je možno vyjádřit jednoduchým schématem, kde směr šipek vyznačuje organismus hostitele.

Řepná rostlina 4- patogenní houby <- mykoparazit <- antagonisté (P. oligandrum) (Drechslera sp.)

Uvedená závislot znemožňuje, aby po ošetřeni semen řepy biopreparátem podle vynálezu docházelo v půdě k nadměrnému hromadění na semenech introdukovaných zárodků Pythium oligandrum.

Při technologickém postupu submerzní kultivace P. oligandrum se dosáhne vysokého stupně fruktifikace a vytváření propagačních orgánů, ozařováním v průběhu kultivace v oblasti viditelného záření, přičemž nejlepších výsledků se dosáhne při použití světlemodrého filtru. Bez přítomnosti světla je fruktifikace poměrně malá. Dokazují to srovnávací pokusy. Byl-li počet oospor při kultivaci bez osvětlení považován za 100 %, pak vzrostl při osvětlení denním světlem na 195 %, při osvětleni zeleným světlem na 247 %, při osvětlení tmavěmodrým filtrem na 257 %, při osvětlení světlemodrým světlem na 333 %.

Přiklad 1

500 g loupaného prosa se důkladně promyje tekoucí studenou vodou a přebytek vody se slije.

Ve 200 ml vody se rozpustí: ZnSO4 50 mg

KH₂PO₄ 150 mg

MnSO₄ 50 mg

CaClg 250 mg

Roztok se zahřeje k bodu varu a nalije na promyté proso a za mírného míchání se sporulační médium nechá vstřebat do prosných zrn. Správně připravené proso je nelepivé a každé zrno je jednotlivě oddělené.

Po povaření se nádoba s prosem přikryje a zabalí do izolační vrstvy, kde se ponechá 20 až 30 minut. Po této době se proso rozprostře na filtrační papír v tenké vrstvě a nechá vychladnout a oschnout. Takto připravené proso se rozplnuje po 25 až 30 g (objem 50 ml kádinky) do 500 ml Erlenmayerových baněk. Zátky jsou z buničité vaty a jsou chráněny kalikem nebo gázou.

Sterilizace je provedena v parním autoklávu při teplotě 120 °C po dobu 40 minut. Sterilizace je po 24 hodinách opakována za stejných podmínek. Po každé sterilizaci se proso lehce protřepe.

Vysterilizované proso se očkuje 3 až 4 ml inokula, připraveného z vybrané a ověřené kultury. Je možno očkovat přímo suspenzí oospor nebo vegetativním inokulem.

Kultivace vegetativního inokula je provedena na pomnožovací půdě tohoto složení:

škrob bramborový 30 g síran amonný 1 5 g fosforečnan dras. kys. 5 g síran hořečnatý 0,5 g kvasnice sušené 10 g uhličitan vápenatý 10 g sójová mouka 50 g voda 1 000 ml pH 6,0; sterilizace 120 °C 30 minut

Kultivace je provedena na reciproké třepačce, rozkyv 10,5 cm, 96 kyvů za minutu při teplotě 20 °C, 48 hodin.

Po naočkováni se proso důkladně protřepe a nakonec mírným poklepem vyrovná do stejnoměrné vrstvy.

Kultivace se provádí v termostatu při 18 až 20 °C při relativní vlhkosti vzduchu 80 až 90 % po dobu 10 až 14 dnů. V případě očkování prosa suspenzí oospor je tato připravena z vysporulovaných sporulačních agarů, '2 až 3 kusů smytím do 100 ml sterilní destilované vody.

Po skončené sporulaci prosných konzerv je proveden test sterility a spočítáno množství oospor na 1 g prosa. Prosné konzervy po skončené kultivaci jsou uskladněny při teplotě -10 °c.

Submerzní sporulace:

Pro očkování první vegetativní generace je použita ověřená prosná konzerva, z které byla za aseptických podmínek připravena oosporová suspenze ve 100 ml vody. V očkovacím tanku je připravena pomnožovací půda tohoto složení:

kukuřičný výluh zahuštěný 3 % sacharóza 3 % uhličitan vápenatý 0,5 % ř

pH před sterilizaci 5)5-6,0 sterilizace 120 °C 30 minut

Na každých 100 1 půdy v očkovacím tanku je použito k naočkování 2 až 3 kusů prosných konzerv a kultivace je provedena při 20 °C 48 hodin při vzdušnění 0,8-1 objem. Během kultivace je sledován nárůst a sterilita.

Po dosažení vhodných fyziologických znaků je pomnožená kultura přsočkována do další generace, která obsahuje sporulační půdu tohoto složení:

škrob bramborový 3 % dusičnan sodný 0,6 % fosforečnan dras. prim. 0,15 % chlorid vápenatý 2,5 % síran hořečnatý 0,05 % uhličitan vápenatý 1 % sójová mouka 2 % pH 5,0-5,5 sterilizace 120 °C 30 minut

Půda je očkována 10 až 15 % inokula z očkovacího tanku, kultivace je prováděna při 20 °C 120 hodin při vzdušněni 1 objemem. Obsah reaktoru (tanku) se přitom ozařuje žárovkou 500 W s modrým filtrem propouštějícím paprsky od 435 do 480 nm. Během kultivace je sledována v pravidelných intervalech sterilita a tvorba oospor. Při skončení kultivace a před konzervací je provedeno vyhodnocení počtu oospor ve ,00 ml kultivované kapaliny.

Po sedimentaci byla kapalina oddělena, sediment částečně vysušen při 20 až 30 °C ve vakuové sušárně, smíšen s 20 až 40 % práškovité sacharózy. V takto upraveném stavu podržely oospory klíčivost po několik měsíců. Před aplikací na semena řepy byl přípravek suspendován v jednoprocentním sterilním roztoku želatiny.

Příklad 2

Submerzní sporulaci je možno provést na půdě tohoto složení:

sacharóza 3 % dusičnan sodný 0,6 % fosforečnan dras. prim. 0,15 % síran hořečnatý 0,05 % uhličitan vápenatý 1 % sójová mouka 2 % pH 5,5-6,0 sterilizace 120 °C 30 minut

Inokulace 10 až 15 % pomnožovací půdy, 48hodinová kultivace, vzdušnění 0,8 až 1 objem, kultivační teplota 18 až 20 °C a doba kultivace 96 až 120 hodin. Ozařování žárovkou se zeleným filtrem propouštějícím paprsky od 500 do 560 nm. Jinak bylo postupováno jako v příkladu 1.

Příklad 3

Vhodná submerzní půda s optimálními výsledky ve sporulaci má složení:

kukuřičný výluh zahuštěný 3 % sacharóza 3 % chlorid vápenatý 2,5 % pH 5,5 až 6,0 sterilizace 120 °C 30 minut

Inokulační podmínky jsou stejné jako v předchozích příkladech, kultivační doba je zkrácena na 72 hodin, vzdušnění minimálně 1 objemem. V ostatním bylo postupováno podle příkladu 1.

Příklad 4 kukuřičný výluh zahuštěný 3 % sacharóza 3 % chlorid vápenatý 2,5 % síran zinečnatý 0,05 % síran manganatý 0,02 % pH 5,5 až 6,0 sterilizace 120 °C 30 minut

Inokulace 20 % pomnožovací půdy 48 hodin staré, vzdušnění 0,5 a* 0,8 objemu, kultivační doba 96 až 120 hodin a kultivační teplota v rozmezí 20 až 22 °C. V ostatním byl postup jako v příkladu 1.

Ve všech případech po dosažení maximální tvorby oospor je provedena separace kultivační kapaliny a získaný sediment je konzervován vhodnými způsoby tak, aby byla zachována maximální vitalita biopreparátu. Např.: sušení při -10 až +50 °C, sprayováním, odejmutí vlhkosti cukry nebo anorganickými solemi.

Claims (3)

1. Způsob výroby prostředku stimulujícího při aplikaci na semena řepy cukrové růst vzcházejících rostlin a chránícího je proti spále, obsahujícího jako účinnou složku propagační orgány mikromycety Pythium oligandrum podle autorského osvědčeni č. 199906, vyznačený tím, že se pomnožené kultury Pythium oligandrum kultivují submerzně za větrání ve sporulačni půdě obsahující 1 až 3 % chloridu vápenatého za ozařování viditelným světlem, výhodně světlemodrým nebo zeleným, načež se pevná hmota oddělí, např. tak, že se obsah tanku nechá sedimentovat, supernatant se oddělí a sediment obsahující propagule, zejména oospory a gemmy se konzervuje, výhodně šetrným odvodněním, a takto konzervovaný přípravek se před aplikací na semena smísí s vodným roztokem obsahujícím živiny a látky podporující adhezi, např. kvasničný autolyzát nebo výtažek, želatinu, pepton nebo jejich směsi.

2. Způsob podle bodu 1, vyznačený tím, že se ke sporulaci použije půd obsahujících kromě 2 až 3 Ϊ chloridu vápenatého a minerálních živin zároveň kukuřičný výluh.

3. Způsob podle bodu 1 a 2, vyznačený tím, že se šetrné odvodnění provádí sušením za mírné teploty -10 až +50 °C a za přidání práškovítýoh látek schopných vázat vodu a obsahujících živiny, jako jsou cukry, síran amonný nebo jejich směsi.