CS204179B1 - Method for determinating activity of amylolytic enzymes - Google Patents

Description

ČESKOSLOVENSKA SOCIALISTICKÁ REPUBLIKA POPIS VYNÁLEZU 204179 (19) K AUTORSKÉMU OSVEDČENIU (11) (Bl) - . (51) Int. Cl.3 C 12 N 9/26 (22] Přihlášené 13 01 78 (21) (PV 255-78] (40} Zverejnené 31 07 80 ÚlAD PRO VYNÁLEZY A OBJEVY (45) Vydané 15 12 83 (75}

Autor vynálezu ZEMEK JURAJ ing. CSc., LEHNICA, KUCÁR ŠTEFAN RNDr. CSc., KUNIAKLUDOVÍT ing. CSc., BRATISLAVA a KOLÍNA JOZEF ing. CSc., PRAHA (54} Sposob stanovenia aktivity amyiolytických enzýmov 1

Vynález sa týká spósobu stanovenia akti-vity amyiolytických enzýmov.

Spofahlivé testy úrovně enzýmových akti-vit v bíologickom materiáli stali sa nepo-stradatelnými pre modernu diagnostickáprax. Tieto testy umožňujú jednoznačné po-tvrdit alebo vylúčiť určitý druh onemocne-nia. K poměrně najrozšírenejším a najčas-tejším onemocneniam, ktoré sa dajú diag-nosticky určit na základe zvýšenej hladinyα-amylázovej aktivity v moči a v krvnomsere patria mimo iných predovšetkýmfunkčně poruchy pankreasu. Nevýhodouvačšiny testovacích metod je, že nie sú do-statočne přesné, vyžadujú objem analyzova-né] vzorky až niekolko 100 ,«1 připadne vý-sledok dosiahnutý týmito metodami vyjad-řuje relatívnu hodnotu enzýmovej aktivitya k zisteniu absolútnej hodnoty aktivity tře-ba ďalšie údaje resp. kalibračný graf alebostandardizované krvné sérum. [Methodender enzymatischen Analyse (III. vydanie},Vyd. H. U. Bergmeyer. Verlag Chemie Men-heim/Bergstr. 1974.] Význam má aj štandardná metoda prestanovenie aktivity amyiolytických enzýmovv priemysle (napr. pri výrobě a-amylázy,glukoamylázy apod. j.

Uvedené nedostatky rieši postup podlávynálezu, ktorého výsledkom je úprava vo- 204179 2 dorozpustného polysacharidu typu «(1-4)glukánu značeného nespecificky rádionukli-dom 14C izolovaného z rádioaktívneho bio-logického materiálu, s výhodou zo zelenýchalebo modrozelených rias, v procese kom-plexného spracovania rádioaktívnej bioma-sy Čsl. patent 121 808, tak, že rádioaktívnya(l - 4) glukán o vhodnej špecifickej rádio-aktivite sa použije ako substrát pri testova-ní úrovně «-amylázovej (a-l,4-glukán 4-glu-kánohydrolázy EC 3.2.1.1. ], a-glukozidázo-vej (a-D-glukozid glukohydroláza EC3.2.1.20], β-amylázovej (a-l,4-glukán malto-hydroláza EC 3.2.1.2] a glukoamylázovej(«-1,4-glukán glukohydroláza EC 3.2.1.3]aktivity v biologických materiáloch.

Podstata vynálezu spočívá v tom, že prestanovenie jedného z amyiolytických enzý-mov ako je α-amyláza, /Ž-amyláza, «-gluko-zidáza alebo glukoamyláza, bez přítomnostispriedcvných amyiolytických aktivit sa po-užije rádioaktívny «(1 — 4) glukán (U-14C)o špecifickej radioaktivitě 1 až 10 kBq/mg,pričom aktivita enzymu je úměrná prírast-ku rádioaktivity chromatograficky separo-vaných reakčných produktov, připadne ů-bytku rádioaktivity východzieho «(1-4)glukánu (U-14C). Výhodou navrhovaného spfisobu stanove- nia aktivity amyiolytických enzýmov je, že:

Claims (1)

1. 3 204179 — umožňuje stanovenie absolútnej aktivi-ty amylolytického enzýmu v případeznačného vodorozpustného substrátu, — uvedená metoda je vysoko citlivá na pří-tomnost amylolytického enzýmu, — k stanoveniu aktivity amylolytického en-zýmu postačuje podstatné menší objemanalyzovanej biologickej tekutiny. Příklad 1 K 10 μ\ roztoku o«(l->4] glukánu (U-14C), (3 mg) o špecifickej rádioaktivite 3,28 kBq//mg (0,01 kBq/Mekvivalent glukózy love jjednotky) v 20 mM fosfátovom pufri o pH7,0 s 10 mM chloridu sodného sa přidá 10 μΐkrvného séra a nechá sa inkubovať po dobu10 min. pri 37 °C. Po 10 minutách sa přidáku vzorke 20 μΐ acetónu, čím sa reakcia za-staví, vzorka sa nanesie na chromatografic-ký papier Whatman 1 a chromatografickáseparácia prebieha v systéme etylacetát-py-ridín-voda po dobu 24 hodin (meriame rá-dioaktivitu v zóně odpovedajúcej maltózo-vým štěpným produktom) alebo v systéme60% vodný roztok etanolu (po dobu 12 ho-din) meriame zvyškovú rádioaktivitu nastarte chromatografického papiera. Aktivita amylázy v séru je: a = celková aktivita amylolytického en-zýmu v analyzovanom objeme [ml] Ar — aktivita odpovedajúca reakčnýmproduktom [kBq] As = Specifická aktivita východzieho sub-strátu _kBq_ /uekv. glukozyl. jednotky t = inkubačná doba [min] K = enzým konštantaK = 0,5 pre ce-amylázu a jS-amylázuK = 1,0 pre glukoamylázu a glukozidázu. Příklad 2 Postup podlá příkladu 1 s tým rozdielom,že namiesto roztoku α-amylázy sa použije kanalýze roztok /3-amylázy a meria sa príras-tok rádioaktivity v zóně odpovedajúcej po-hyblivosťou maltóze. Příklad 3 Postup podlá příkladu 1, s tým rozdielom,že namiesto roztoku α-amylázy sa použijek analýze roztok glukoamylázy a meria saprírastok rádioaktivity v zóně odpovedajú-cej pohyblivosťou D-glukóze. Příklad 4- Postup podlá příkladu 1 s tým rozdielom,že k analýze sa použije roztok a-glukozidá-zy a meria sa prírastok v zóně odpovedajú-cej pohyblivosťou D-glukóze. PREDMET Spósob stanovenia aktivity amylolytic-kých enzýmov, vyznačujúci sa tým, že prestanovenie jedného z amylolytických enzý-mov ako je ce-amyláza, /3-amyláza, a-gluko-zidáza alebo glukoamyláza, bez přítomnostisprievodných amylolytických aktivit sa po-užije rádioaktívny «(1-+4) glukán (U-14C) o špecifickej rádioaktivite 1 až 10 kBq/mg,pričom aktivita enzýmu je úměrná prírast-ku rádioaktivity chromatograficky separo-vaných reakčných produktov, připadne ú-bytku rádioaktivity východzieho of(l->4)glukánu (U-14C). Severograíia, n. p., závod 7, Most