CS202929B1 - Způsob selekce kmenů kvasinek transformujících benzaldehyd na B-( —)-l-fenyl-l-hydrexy-2-propanen pro výrobu L-( —)-crythřo- -í-ÍEnyl-2-msthylamino-l-propanolu a produkční kmen mikroorganismu Saccharomyces coreanus CCM 3395 - Google Patents
Způsob selekce kmenů kvasinek transformujících benzaldehyd na B-( —)-l-fenyl-l-hydrexy-2-propanen pro výrobu L-( —)-crythřo- -í-ÍEnyl-2-msthylamino-l-propanolu a produkční kmen mikroorganismu Saccharomyces coreanus CCM 3395 Download PDFInfo
- Publication number
- CS202929B1 CS202929B1 CS159979A CS159979A CS202929B1 CS 202929 B1 CS202929 B1 CS 202929B1 CS 159979 A CS159979 A CS 159979A CS 159979 A CS159979 A CS 159979A CS 202929 B1 CS202929 B1 CS 202929B1
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- benzaldehyde
- phenyl
- strains
- fam
- yeast
- Prior art date
Links
- HUMNYLRZRPPJDN-UHFFFAOYSA-N benzaldehyde Chemical compound O=CC1=CC=CC=C1 HUMNYLRZRPPJDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 74
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 title claims description 48
- QNGNSVIICDLXHT-UHFFFAOYSA-N para-ethylbenzaldehyde Natural products CCC1=CC=C(C=O)C=C1 QNGNSVIICDLXHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 37
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 31
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims description 7
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 1-propanol Substances CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 6
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 title claims description 5
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 title description 10
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 claims description 19
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 6
- 229940044613 1-propanol Drugs 0.000 claims description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 5
- ZBFFNPODXBJBPW-VIFPVBQESA-N (R)-phenylacetylcarbinol Chemical compound CC(=O)[C@H](O)C1=CC=CC=C1 ZBFFNPODXBJBPW-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 4
- IKHGUXGNUITLKF-XPULMUKRSA-N acetaldehyde Chemical compound [14CH]([14CH3])=O IKHGUXGNUITLKF-XPULMUKRSA-N 0.000 claims description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 2
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims 2
- 241000235342 Saccharomycetes Species 0.000 claims 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 38
- IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N Acetaldehyde Chemical compound CC=O IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 28
- KWGRBVOPPLSCSI-WPRPVWTQSA-N (-)-ephedrine Chemical compound CN[C@@H](C)[C@H](O)C1=CC=CC=C1 KWGRBVOPPLSCSI-WPRPVWTQSA-N 0.000 description 18
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 15
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 15
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 14
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 8
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 8
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 6
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 6
- 241001123227 Saccharomyces pastorianus Species 0.000 description 6
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 6
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 6
- KWGRBVOPPLSCSI-UHFFFAOYSA-N d-ephedrine Natural products CNC(C)C(O)C1=CC=CC=C1 KWGRBVOPPLSCSI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 241000316985 Selatosomus coreanus Species 0.000 description 5
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 5
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 5
- 244000286779 Hansenula anomala Species 0.000 description 4
- 108010011939 Pyruvate Decarboxylase Proteins 0.000 description 4
- 235000003534 Saccharomyces carlsbergensis Nutrition 0.000 description 4
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 4
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 4
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 235000014683 Hansenula anomala Nutrition 0.000 description 3
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 3
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 3
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- DKPFZGUDAPQIHT-UHFFFAOYSA-N Butyl acetate Natural products CCCCOC(C)=O DKPFZGUDAPQIHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 2
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 2
- 229960002179 ephedrine Drugs 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N hexanoic acid Chemical compound CCCCCC(O)=O FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000006268 reductive amination reaction Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 241000250507 Gigaspora candida Species 0.000 description 1
- 239000005909 Kieselgur Substances 0.000 description 1
- 239000011865 Pt-based catalyst Substances 0.000 description 1
- 241000235346 Schizosaccharomyces Species 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 1
- YKZQOAOGXBOKCS-UHFFFAOYSA-N acetaldehyde;benzaldehyde Chemical compound CC=O.O=CC1=CC=CC=C1 YKZQOAOGXBOKCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 235000013405 beer Nutrition 0.000 description 1
- 230000003851 biochemical process Effects 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- HUMNYLRZRPPJDN-RAMDWTOOSA-N deuterio(phenyl)methanone Chemical compound [2H]C(=O)C1=CC=CC=C1 HUMNYLRZRPPJDN-RAMDWTOOSA-N 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 description 1
- 238000005984 hydrogenation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 1
- 230000000707 stereoselective effect Effects 0.000 description 1
- 238000012619 stoichiometric conversion Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000003828 vacuum filtration Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
Vynález se týká způsobu selekce kmenů kvasinek transformujících benzaldehyd na D- (1) -1-f enyl-l-hydroxy-2-propanon pro výrobu L- (- }-erythro-l-fenyl-2-methylamino-l-propanolu a produkčního kmene mikroorganismu Saccharomyces coreanus CCM 3395.
• Je známo, že Ď-(-)-l-fenyl-l-hydroxy-2-propanon (D-(-)-fenylacetylmethanol, dále pro stručnost jen FAM] slouží jako výchozí surovina pro výrobu L-(-)-erythro-l-feny.l-2-methylamino-l-propanolu (dále pro stručnost jen L-efedrin). Vedle chemického způsobu přípravy FAM, který poskytuje racemickou směs L a D izomerů FAM, je vzhledem ke své stereospecifitg výhodnější použít biochemického způsobu přípravy D-(-)-FAM tzv. Neubergovou metodou, tj. dávkováním benzaldehydu k suspenzi kvasinek obsahujících cukr, především sacharózu (Neuberg, Biochem. Ztschr., 115, 282, 1921). Od prvních Neubergových poznatků byl tento postup detailně rozpracován a stal se předmětem řady teoretických prací; z poslední doby např. práce Voetse et al. (Ztschr. fůr Allg. Mikrobiol., 13, 355, 1973). Z literárních údajů vyplývá následující představa o biochemickém mechanismu tvorby D-(-)-FAM: Sekvencí enzymových reakcí zvaných glykolýza je konvertován příslušný cukr, převážně sacharoza, na pyrohroznovoukyselinu.
Tato kyselina je dekarboxylována enzymem pyruvát dekarboxylázou za vzniku acetaldehydu a kysličníku uhličitého. Vznikající acetaldehyd v aktivní formě (in státu nascendi) kondenzuje s externě přidaným benzaldehydem za vzniku D-(-)-FAM;xeakce je naprosto stereospecifická. Reakční rychlost pak závisí na poměru vnitrohuněčné koncentrace kyseliny pyrohroznové (substrátu) a enzymu pyruvát dekarboxylázy.
V patentové literatuře je využití kvasinek transformujících benzaldehyd na D-(-)-FAM pro výrobu L-(-)-efedrinu prvně popsáno v roce 1934 v USA v patentovém spisu č. 1 956 950. Z poslední doby pak v NDR v patentovém spisu č. 51 651 z roku 1966.
Odborná i patentová literatura popisuje pro biotransformaci benzaldehydu na D-(-J-FAM pro výrobu L-(-)-efedrinu výhradně použití pekařského nebo pivovarského droždí, tj. kvasinek různých kmenů druhů Saccharomyces cerevisiae nebo Saccharomyces carlsbergensis, respektive podle novějších taxonomických názorů Saccharomyces uvarum. Z uvedeného důvodu různé farmaceutické firmy vyrábějící L-(-)-efedrin buď propagují pro uvedený účel tyto druhy, anebo používají odpadní kvasnice po výrobě piva nebo droždí. V tomto smyslu dokonce převa202929 zují názory, že např. proces výroby piva a tzv. spodní kvašení poskytuje pivovarským kvasinkám vhodné biochemické vlastnosti pro uvedený účel výroby.
Při selekci sbírkových a přírodních kmenů různých druhů kvasinek podle vynálezu, bylo zpočátku postupováno tak, že suspektní kmeny byly vybírány podle specifické aktivity enzymu pyruvát dekarboxylázy; ukázalo se však, že obsah tohoto enzymu v buňkách různých druhů a kmenů kvasinek je jen v nepřímém vztahu k produkci D-(-)-FAM, neboť i když byly nalezeny kmeny s vysokou specifickou aktivitou tohoto enzymu, produkce nejenže nebyla vyšší nebo stejná, nýbrž často nižší ve srovnání s kontrolními kmeny. Z naznačených skutečností bylo uzavřeno, že musí existovat vhodný poměr mezi vnitrobuněčnou koncentrací pyrohroznové kyseliny a množstvím enzymu tak, aby dané množství enzymu v buňkách bylo dostatečně saturováno substrátem a tak mohl vysokou rychlostí vznikat aktivní acetaldehyd schopný kondenzace s externě přidaným benzaldehydem na D-(-)-FAM. Tato pracovní hypotéza byla zpětně dokázána externími přídavky pyrohroznové kyseliny k suspenzím různých kmenů kvasinek s rozdílnou specifickou aktivitou enzymu pyruvát dekarboxylázy spolu s přidáním benzaldehydu; za těchto podmínek byla rychlost tvorby D-(-)-FAM do jisté míry úměrná obsahu enzymu stejně tak jako absolutní výtěžek.
Vzhledem k tomu, že selekce různých kmenů kvasinek nemohla být prováděna ze zcela evidentních důvodů podle individuálních hladin této látky u jednotlivých kmenů (kyselina pyrohroznová je velmi rychle metabolizována, takže stanovení její koncentrace v buňkách by bylo experimentálně i metodicky náročné), byla selekce různých druhů a kmenů kvasinek podle vynálezu prováděna měřením iniciálních rychlostí tvorby D-(-)-FAM po jednorázové dávce benzaldehydu v rozsahu koncentrací 100 až 350 mg/ /100 ml suspenze buněk 20hodinové kultury. Koncentrace D-(-)-FAM byla stanovena v jediném (stejném) časovém intervalu. Různé kmeny sbírkových a z přírody izolovaných kvasinek byly naznačeným způsobem rozděleny do 4 kategorií: I. kmeny s nulovou produkcí D-(-)-FAM, II. kmeny s nízkou produkcí (1 až 40 mg/100 ml), III. kmeny se střední produkcí (40 až 70 mg/100 ml) a IV. kmeny s vysokou produkcí (více než 70 mg/ /100 ml). Většina testovaných kmenů náležela do kategorie I (30 % kmenů) nebo IV (42 °/okmenů); méně kmenů náleželo do kategorie II (18 % kmenů) a III (10 % kmenů).
Kmeny z kategorie I a II byly z dalšího testování vyřazeny a u kmenů z kategorie III a IV byla prováděna biotransformace po dobu 2 hodin. Kmeny, u kterých se již během těchto prvních dvou hodin biotransformace zastavila, byly z dalšího testování opět vyřazeny. U zbývajících kmenů různých druhů kvasinek ze suspektního předscreeningu byla sledována celá biotransformace dávkováním benzaldehydu a acetaldehydu spolu s analytickým vyhodnocením rychlosti tvorby D-(-)-FAM a rychlosti spotřeby benzaldehydu, až do úplného zastavení tvorby D-(-)-FAM, spolu s kontrolními kmeny tradičních kvasinek, tj. Saccharomyces carlsbergensis a Saccharomyces cerevisiae, za jinak stejných (zvolených) podmínek kultivace a; biotransformace.
Nejvyšší rychlosti tvorby D-(-)-FAM a jeho výtěžku bylo dosaženo s některými druhy rodů Candida, Hansenula a Pichia, zejména, druhy Candida macedoniensis a Hansenula anomala (560 až 600 mg/100 ml) a druhem Saccharomyces coreanus sp. (680 mg/100 mililitrů). Kontrolními kmeny tradičních kvasinek S. carlsbergensis a S. cerevisiae bylo dosaženo za jinak stejných podmínek kultivace a biotransformace stejného nebo nižšího výtěžku.
Zjistili jsme tedy, že pro transformaci benzaldehydu na D-(-)-FAM pro výrobu L-(-j-efedrinu podle vynálezu, lze použít jiných druhů kvasinek' jak z taxonomicky velice vzdálených rodů, např. rodů Candida, Hansenula a Pichia, tak jiných druhů z rodu Saccharomyces, nepatřících taxonomicky k druhům Saccharomyces cerevisiae a Saccharomyces carlsbergensis, tedy drožďárenským (pekařským) a pivovarským kvasinkám. Navíc u některých netradičních druhů kvasinek byla nalezena vyšší iniciální rychlost tvorby D-(-)-FAM, vyšší stechiometrické využití konverze benzaldehydu na D-(-)-FAM, kratší generační doba během růstu a nižší množství buněčné hmoty potřebné k stejné nebo vyšší konverzi (výtěžku) ve srovnání s tradičními kmeny drožďárenských nebo pivovarských kvasinek za jinak stejných reakčních podmínek.
Nejlepší izoláty netradičních kmenů kvasinek byly postupem podle vynálezu vystaveny přítomnosti benzaldehydu nebo acetaldehydu Či kombinaci obou látek, s cílem selekce mutant, které by vykazovaly vyšší rezistenci k toxickému účinku obou látek a které by měly z hlediska výrobního procesu výhodnější vlastnosti. Naznačeným způsobem byl získán vysokoprodukční kmen Saccharomyces coreanus CCM 3395, který ve srovnání s tradičním kmenovým materiálem pivovarských a drožďárenských kvasnic a ve srovnání s rodičovským kmenem má následující výhodné vlastnosti pro výrobu L-(-)-efedrinu; výsledky a srovnání jsou uvedeny v následující tabulce.
2029 23
| Kmen | S. carlsbergensis (pivovarské kvas.) | S. cereviviae (drožďár. kvas.) | S. coreanus (rodič, kmen) | CCM 3395 (mut. kmen) |
| Produkce D-(—J-FAM | ' 600—750 | 650—800 | 680—830 | 900—1300 |
| (mg/100 ml) | ||||
| Spotřeba benzaldehydu (% ) | 0,80—0,90 | 0,80—0,95 | 0,85—0,90 | 0,90—1,4 |
| Spotřeba acetaldehydu (°/o) | 0,3-0,4 | 0,3-0,4 | 0,1-0,3 | — |
| Spotřeba sacharózy pro | 6,5-7,1 | 6,5—7,25 | 6,0—6,75 | 6,25—7,25 |
| propagaci a biotransformaci | ||||
| (%) | ||||
| Suchá hmota buněk (%) | 1,6-2,0 | 1,5-2,0 | 0,35-0,4 | . 0,35 |
| Obsah L-( —)-efedrinu ve | 85,0—87,5 | 85,0—88,0 | 87,5—88,5. | 87,5—90,0 |
vodné fázi po hydrogenaci (%)
Předmětem vynálezu je způsob selekce kmenů mikroorganismů, zejména kvasinek, transformujících benzaldehyd na D-(-)-l-fenyl-l-hydroxy-2-propanon pro výrobu L-(-)-erythro-l-fenyl-2-methylamino-l-propanolu, vyznačující se tím; že výchozí produkční kmen mikroorganismu se vystaví pasážování v tekuté nebo na pevné živné půdě obsahující benzaldehyd a/nebo acetaldehyd, přičemž při kultivaci v tekuté živné půdě se vybírají mutanty s konstantní růstovou rychlostí, při kultivaci na pevné živné půdě se vybírají největší kolonie, načež se získané mutanty izolují ve formě monokoloniových izolátů.
Vynález je dále vyznačený tím, že pro výrobu se použije kvasinek rodů Candida, Hansenula a Pichia, zejména druhů Candida macedoniensis a Hansenula anomala a jiných druhů a kmenů rodu Saccharomyces, než jsou druhy a kmeny Saccharomyces cerevisiae a Saccharomyces carlsbergensis.
Předmětem vynálezu je dále kmen mikroorganismu Saccharomyces coreanus CCM 3395, vyznačující se tím, že. produkce D-(-)-l-fenyl-l-hydroxy-2-propanonu se pohybují v rozmezí 900 až 1300 mg/100 ml sterilně nebo nesterilně propagované kultury během biotransformace benzaldehydu v nepřítomnosti acetaldehydu v reakční směsi, přičemž nízký obsah vedlejších produktů biotransformační reakce umožňuje dosáhnout vysoké čistoty výchozího meziproduktu a v důsledku toho vysoké procento konverze při jeho následné reduktivní aminaci s výtěžkem L- (-) -erythro-l-f enyl-2-methylamino-l-propanolu 87 až 90 % teorie.
Dále- je vynález blíže objasněn v příkladech provedení, aniž by se jimi omezoval. Příklady provedení
Příklad 1
Různé kmeny kvasinek náležející většímu počtu druhů zejména z rodů Candida, Hansenula, Pichia, Schizosaccharomyces a Saccharomyces, byly ze šikmých agarů obsahujících 10 % sladiny a 2 °/o agaru postupně očkovány kličkou do 500ml varných baněk, obsahujících 150 ml živné půdy následujícího složení (koncentrace uvedeny v procentech hmota/objemj:
Kukuřičný extrakt 5,0
Sacharóza 3,0
MgSO4.7H2O 0,56 (NH4}2SO4 0,19
KH2PO4 0,06
NH4H2PO4 0,05
Kultivace probíhala při teplotě 28 °C po dobu 24 hodin na rotačním třepacím stroji o počtu otáček 240/min.; pH živné půdy na počátku kultivace bylo 6,1 až 6,3. Po této době vyrostlé suspenze buněk byly přeočkovány (1 objemové procento inokula) do baněk obsahujících živnou půdu stejného složení (II. generace) a kultivace probíhala za uvedených podmínek po dobu 22 hodin.
Po této době bylo do každé z kultur postupně přidáno 2,5 % sacharózy, 0,1 % acetaldehydu a 0,35 % benzaldehydu; kultury byly umístěny na rotační třepací stroj a po uplynutí 30 minut byla v baňkách polarimetricky stanovena koncentrace vytvořeného D-(-)-FAM. U všech testovaných kmenů byly tímto způsobem zjištěny hodnoty produkce D-(-)-FAM ve 30. minutě biotransformace v rozmezí od 0 do 140 mg/100 ml kultury. Kmeny, u kterých byla za popsaných podmínek produkce nulová nebo nižší než 40 mg/100 ml, byly z dalšího testování vyřazeny; šlo asi o 50 % testovaných kmenů.
U kmenů kvasinek, které v předchozích etapách testování vykazovaly střední nebo vysokou produkci D-(-)-FAM, byl sledován celý proces biotransformace. Suspektní kmeny mikroorganismů byly po 2 generace kultivovány v baňkách na rotačním třepacím stroji za uvedených podmínek a ve zmíněné živné půdě. Při vlastní biotransformaci pak byla do baněk s různými kulturami přidávána sacharóza a benzaldehyd, Do kultur byl rovněž přidáván acetaldehyd postupem popsaným pro drožďárenské (pekařské) a pivovarské kvasnice (D. Gróger et al., Zeits. fůr Allg. Mikrobiol., 6, 275, 1966). Uvedené sloučeniny byly v několika dávkách přidávány ke kulturám podle následujícího schématu (koncentrace jsou uvedeny v procentech hmota/objemj:
202
Dávka Sacharóza Benzaldehyd Acetaldehyd
| 1 | 2,5 | 0,35 | 0,1 |
| 2 | 0,5 | 0,15 | 0,075 |
| 3 a další 0,5 | 0,1 | 0,05 | |
| Ve | 30minutových | intervalech | byla póla- |
rograficky měřena koncentrace benzaldehydu a polarimetricky koncentrace D-(-)-FAM. Další dávka byla vždy přidávána tehdy, když koncentrace benzaldehydu v suspenzi poklesla pod 0,05 %. Jako kontrolních kmenů bylo použito drožďárenských (pekařských) a pivovarských kvasinek S. cerevisiae a S. carlsbergensls.
Tímto způsobem bylo z testovaných 83 suspektních kmenů různých druhů kvasinek vybráno několik kmenů, u kterých bylo možno popsaným způsobem dosáhnout produkce D-(-)-FAM kolem 600 mg/100 ml; u většiny ostatních kmenů nepřesahovala produkce D-(-)-FAM 400 mg/100 ml. Po reprodukci měření rychlosti tvorby D-(-)-FAM byly jako nejlepší producenti vybrány 3 kmeny, které taxonomicky patřily k druhům Candida macedoniensis, Hansenula anomala a Saccharomyces coreanus sp. (v The Yeasts, a taxonomie study, edit., J. Lodderová, North Holland Puhl. Comp., Amsterdam, London, 1970). U těchto kmenů byla rychlost tvorby a celkový výtěžek D-(-)-FAM stejná nebo vyšší ve srovnání s kontrolními kmeny pekařských a pivovarských kvasinek a pohybovala se v rozmezí dosažených hodnot mezí 600 až 800 mg/100 ml.
Příklad 2
Kmeny kvasinek druhů C. macedoniensis, H. anomala a S. coreanus sp., byly ze šikmých agarů naočkovány kličkou do 500ml varných baněk obsahujících 150 ml živné půdy následujícího složení (koncentrace uvedeny v procentech hmota/objem):
Yeast extrakt (Oxoid) 2,0
Sacharóza 3,0
MgSCU. 7H2O 0,56 (NHíhSOi 0,19
KH2PO4 0,06
NH4H2PO4 0,05 pH živné půdy se pohybovalo v rozmezí hodnot 6,1 až 6,3. Kultivační podmínky byly jinak stejné, jak je uvedeno v příkladu 1. Po 24 hodinách kultivace byly kmeny přeočkovány do baněk obsahujících tutéž živnou půdu, avšak obsahující navíc benzaldehyd v rozsahu koncentrací 0,07 až 0,2 % nebo acetaldehyd v rozsahu koncentrací 0,1 až 0,3 %, případně byly do baněk přidány obě tyto sloučeniny v různém poměru uvedených koncentrací; množství inokula vnesené do první subkultury činilo 10 objemových procent.
V těchto selektivních živných půdách byly ' kmeny několikrát pasážovány, a to vždy po hodinách kultivace, přičemž každá následující subkUltura byla vždy očkována 10 objemovými procenty inokula ze subkultury předcházející. Současně byl v každé ze subkultur sledován přírůstek optické denzlty — turbidity buněk (dále jen O. D.) a sledována růstová rychlost v ln O. D. V některých subkulturách bylo zjištěno zvýšení růstové rychlosti buněk; tyto buněčné populace byly pasážovány tak dlouho, až se růstová-rychlost neměnila. Z posledních subkultur byla buněčná populace vyseta na pevnou neselektivní živnou půdu o stejném složení, jak je uvedeno výše, doplněnou 2 % agaru. Několik desítek kolonií bylo vyočkováno na šikmé agary a izoláty testovány na produkci D-(-)-FAM způsobem uvedeným v příkladu 1.
Nejlepší z izolátů odvozené od uvedených druhů kvasinek popsaným způsobem, vykazovaly zvýšenou produkci a lepší stechiometrickou konverzi benzaldehydu na D-(-)-FAM a vyšší stupeň resistence k toxickému účinku benzaldehydu. Nejlepší izolát odvozený od kmene S. coreanus sp., dosáhl v laboratorních podmínkách produkcí mezi 800 až 900 mg D-(-)-FAM/100 ml buněčné suspenze.
P ř í k 1 a d 3
Izolát kmene kvasinky S. coreanus sp., získaný, jak je uvedeno v příkladu 2, byl ze šikmého agaru naočkován kličkou do 500ml varné baňky obsahující 150 ml živné půdy, jejíž složení je uvedeno v příkladu 1 s tím rozdílem, že půda obsahovala namísto 5,0 % kukuřičného extraktu pouze 3 % této látky. Podmínky kultivace inokula byly rovněž stejné, jak je uvedeno v příkladu 1. Z této' I. vegetativní generace inokula bylo očkováno 1 objemové procento do další baňky plněné živnou půdou stejného složení. Po 20 hodinách růstu bylo á 40 ml inokula II. vegetativní generace nalito do dvou skleněných nádob o celkovém objemu 5 litrů plněných 4 litry nesterilní živné půdy stejného složení. Kultivace probíhala nesterilním způsobem 22 hodin za nepřetržitého míchání ocelovým vrtulovým míchadlem a nepřetržitého vzdušnění v obou nádobách; rychlost otáček 260/min., vzdušnění 1 litr vzduchu/min. (0,25 pracovního objemu nádoby) při teplotě 28 °C.
Poté byla v obou nádobách provedena blotransíormace benzaldehydu na D-(-)-FAM; do první nádoby byla dávkována pouze sacharóza a benzaldehyd, do druhé nádoby sacharóza, benzaldehyd a acetaldehyd, jak je uvedeno v příkladu 1. Biotransformace byla prováděna při teplotě 28 až 29 °C za nepřetržitého míchání a vzdušnění jako kultivace; podmínky jsou uvedeny výše. Výsled1 ky biotransformace jsou uvedeny v následujících tabulkách (I a II).
Z výsledků uvedených v obou tabulkách vyplývá, že · přídavky acetaldehydu -do reakčrií směsi během biotransformace neovlivňují reakčni rychlost a výtěžek D-(-j-FAM; průměrný výtěžek se pohyboval kolem 1200 mg D-(-)-FAM/l00 ml suspenze/12 hodin při aktuální suché hmotě buněk 6 mg/ /ml. Po skončení biotransformace byly buňky odděleny filtrací a D-(-)-FAM byl převeden z vodné do organické fáze vytřepáním octanem butylnatým v poměru vodná fáze : : organická fáze 3:1. Z organické fáze byla provedena kvalitativní analýza produktu spolu se standardem D-(-j-FAM plynovou chromatografií. Výsledky potvrdily chemickou identitu produktu.
Tabulka I
| Čas (h) | Benzaldehyd | D-( — j-FAM | Sacharóza |
| (mg/100 mlj | (mg/100 mlj | (g/100 ml) | |
| 0 | +350 | — | +2,5 |
| 0,5 | 214 | 82 | — |
| 1,0 | 139 | 153 | 2,1 |
| 1,5 | +200 | — | +0,25 |
| 2,5 | 132 | 328 | 1,65 |
| 3,0 | +150 | — | +0,5 |
| 3,45 | 115 | 476 | — |
| 4,0 | +150 | — | —. |
| 4,5 | 162 | —. | —. |
| 5,0 | 108 | 625 | 1,35 |
| 5,15 | +150 | — | +0,25 |
| 0,0 | 130 | — | — |
| 6,5 | +100 | . — | +0,25 |
| 7,0 | 110 | 869 | 1,1 |
| 7,15 | 100 | — | +0.25 |
| 7,45 | 136 | — | — |
| 8,5 | +100 | — | — |
| 9,15 | 100 | 1050 | 0,95 |
| 9,5 | +100 | — | +0,25 |
| 10,15 | 130 | 1130 | — |
| 11,15 | + 50 | — | — |
| 12,0 | 95 | 1210 | 0,8 |
(+) přídavek benzaldehydu a sacharózy
Tabulka II
| Čas (h) | Benzaldehyd (mg/100 mlj | Acetaldehyd (mg/100 ml) | D-(—-j-FAM (mg/100 mlj | Sacharóza (g/100 ml] |
| 0 | • +350 | +100 | _ | +2,5 |
| 0,5 | 226 | — | 80 | |
| 1,0 | / 156 | — | 172 | 2,05 |
| 1,5 | +200' | +100 | — | +0,25 |
| 2,5 | 168 | — | 354 | 1,75 |
| 3,15 | +150 | +75 | — | +0,5 |
| 4,0 | 136 | — | 536 | |
| 4,5 | +150 | +75 | — | _ |
| 5,0 | 155 | — | 653 | 1,2 |
| 5,5 | 114 | — | — | +0,25 |
| 6,0 | +150 | +75 | — | +0,25 |
| 7,0 | 105 | — | 879 | 1,3 |
| 7,15 | +100 | +50 | _ | |
| 8,0 | 119 | — | _ | |
| 8,5 | +100 | +50 | —, | +0,25 |
| 9,15 | 115 | — | 1050 | 1,1 |
| 9,45 | +100 | +50 | — | +0,25 ” |
| 10,5 | 134 | — | 1130 | |
| 11,5 | + 50 | +50 | — | _ |
| 12,0 | 130' | — | 1190 | 1,1 |
(+) přídavek benzaldehydu, acetaldehydu a sacharózy
202829
Příklad 4
Do nerezového fermentačního tanku o celkovém objemu 100 litrů bylo připraveno 80 litrů nesterilní živné půdy s 3 % sušeného kukuřičného extraktu; ostatní složky živné půdy jsou uvedeny v příkladu 1. 20 baněk II. vegetativní generace inokula izolátu kmene kvasinky S. coreanus sp. bylo připraveno, jak je uvedeno v příkladu 3. Tímto inokulem byl naočkován fermentační tank a kultivace probíhala při teplotě 28 až 29 °C nesterilním způsobem při vzdušnění Ví pracovního objemu fermentoru (20 litrů/min.) za míchání turbinovým míchadlem s šesti lopatkami o průměru 160 mm při 'rychlosti otáček 190/ /min. Fermentační tank byl opatřen jednou zarážkou. Po 22hodinové nesterilní kultivaci byla provedena biotransformace benzaldehydu na D-(-)-FAM dávkováním benzaldehydu a sacharózy bez přídavku acetaldehydu způsobem uvedeným v tabulce I příkladu 3 za nepřetržitého míchání a vzdušnění.
Bylo získáno celkem 1100 mg D-(-)-FAM/ /100 ml kultury za 12 hodin biotransformace při celkové spotřebě cukru na propagaci a biotransformaci 7,25 % a celkové spotřebě benzaldehydu 1,35 °/o. Dále bylo provedeno další zpracování D-(-)-FAM na L-(-)-efedrin následujícím postupem s následující výtěžností:
litrů fermentační půdy bylo separací na odstředivce zbaveno suspenzních podílů, supernatant byl vyčeřen filtrací přes vrstvu křemeliny. 78 litrů čirého filtrátu s obsahem 1100 mg/100 ml, tj. celkem 858 g D-(-)-FAM, bylo extrahováno 39 litry octanu butylnatěho a směs byla gravitačně oddělena. Bylo získáno 37 litrů extraktu s účinností 2180 mg/ /100 ml, tj. celkem 806 g D-(-)-FAM. Extrakt byl po částech zahuštěn za vakua na oběhové odparce na konečných 1300 g tak, aby teplota brýdových par nepřekročila 75 °C. Zahuštěný koncentrát obsahoval celkem 800 g D-(-)-FAM. Po provedení zkopšek zpracovatelnosti byl získaný materiál podroben reduktivní aminaci za použití speciálního katalyzátoru na bázi Pt. Po ukončení reakce a po oddělení katalyzátoru z reakční směsi byla provedena extrakce bází L-aD, L-efedrinu do zředěného roztoku kyseliny chlorovodíkové. Vodný roztok L-aD, L-efedrin.HCl, který obsahoval 960 g L-efedrinu.HCl z úhrnného množství 1020 g efedrinů.HCl, byl po vyčeření filtrací vakuově zahuštěn ke krystalizaci. Po krystalizaci, separaci a promyti bylo získáno 790 g substance s obsahem 98,6 % L-(-j-erythro-l-fenyl-2-methylamino-1-propanolu.HCl, matečné louhy obsahovaly 150 g L-efedrinu.HCl a 45 g D, L-efedrinu. .HC1.
Claims (2)
1. Způsob selekce kmenů mikroorganismů, zejména kvasinek, transformujících benzaldehyd na D-(-)-l-fenyl-l-hydroxy-2-propanon pro výrobu L-(-j-erythro-l-fenyl-2-methylamino-l-propanolu, vyznačující se tím, že výchozí produkční kmen mikroorganismu se vystaví pasážóvání v tekuté nebo na pevné živné půdě obsahující benzaldehyd a/nebo acetaldehyd, přičemž při kultivaci v tekuté živné půdě se vybírají mutanty s konstantní růstovou
VYNÁLEZU rychlostí, při kultivaci na pevné živné půdě se vybírají největší kolonie, načež se získané mutanty izoluji ve formě monokoloniových izolátů.
2. Kmen mikroorganismu Saccharomyceš coreanus CCM 3395, získaný podle bodu 1, produkující D- (-) -1-fenyl-l-hydr oxy-2-propanon v množství 900 až 1300 mg/100 ml sterilně nebo nesterilně propagované kultury během biotransformace benzaldehydu.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS159979A CS202929B1 (cs) | 1979-03-09 | 1979-03-09 | Způsob selekce kmenů kvasinek transformujících benzaldehyd na B-( —)-l-fenyl-l-hydrexy-2-propanen pro výrobu L-( —)-crythřo- -í-ÍEnyl-2-msthylamino-l-propanolu a produkční kmen mikroorganismu Saccharomyces coreanus CCM 3395 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS159979A CS202929B1 (cs) | 1979-03-09 | 1979-03-09 | Způsob selekce kmenů kvasinek transformujících benzaldehyd na B-( —)-l-fenyl-l-hydrexy-2-propanen pro výrobu L-( —)-crythřo- -í-ÍEnyl-2-msthylamino-l-propanolu a produkční kmen mikroorganismu Saccharomyces coreanus CCM 3395 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS202929B1 true CS202929B1 (cs) | 1981-02-27 |
Family
ID=5350770
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS159979A CS202929B1 (cs) | 1979-03-09 | 1979-03-09 | Způsob selekce kmenů kvasinek transformujících benzaldehyd na B-( —)-l-fenyl-l-hydrexy-2-propanen pro výrobu L-( —)-crythřo- -í-ÍEnyl-2-msthylamino-l-propanolu a produkční kmen mikroorganismu Saccharomyces coreanus CCM 3395 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CS (1) | CS202929B1 (cs) |
-
1979
- 1979-03-09 CS CS159979A patent/CS202929B1/cs unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ishizuka et al. | Breeding of a mutant of Aureobasidium sp. with high erythritol production | |
| Shukla et al. | L-Phenylacetylcarbinol (L-PAC): biosynthesis and industrial applications | |
| Beesch | Acetone-butanol fermentation of starches | |
| Dulaney et al. | Studies on ergosterol production by yeasts | |
| Parvez et al. | Citric acid production from sugar cane molasses by 2-deoxyglucose-resistant mutant strain of Aspergillus niger | |
| MX2010013307A (es) | Metodo de produccion de biomasa de levadura. | |
| DK168490B1 (da) | Aureobasidium sp.-mikroorganismer, fremgangsmåde til opnåelse af disse og fremgangsmåde til fremstilling af erythritol ved anvendelse af disse | |
| Hayashida et al. | High concentration-ethanol fermentation of raw ground corn | |
| Ueng et al. | D-Xylulose fermentation in yeasts | |
| Hamilton et al. | The glucose uptake kinetics of some marine bacteria | |
| RU2001949C1 (ru) | Штамм гриба TRICHODERMA REESEI - продуцент целлюлолитических ферментов | |
| EP0344163A1 (en) | Process for the preparation of xylitol from xylose by cultivating candida guilliermondii | |
| US5998181A (en) | Fermentation process for preparing xylitol using Candida tropicalis | |
| US5686277A (en) | Fermentation process for preparing xylitol using mutant cells | |
| CS217986B2 (en) | Method of making the 2-keto-l-gulonic acid | |
| US7479381B1 (en) | Production of itaconic acid by Pseudozyma antarctica | |
| US5079145A (en) | Process for preparing microorganisms used for making phenyl acetyl carlinol (pac) | |
| US6916639B2 (en) | Erythritol-producing moniliella strains | |
| CS202929B1 (cs) | Způsob selekce kmenů kvasinek transformujících benzaldehyd na B-( —)-l-fenyl-l-hydrexy-2-propanen pro výrobu L-( —)-crythřo- -í-ÍEnyl-2-msthylamino-l-propanolu a produkční kmen mikroorganismu Saccharomyces coreanus CCM 3395 | |
| US6270815B1 (en) | Fermentation process for preparing erythritol using mother liquor produced from purification process of palatinose | |
| IL95692A (en) | 5-Decanolide and 5-Dodecanolide are natural and a process for their production | |
| US3669840A (en) | Gluconic acid production | |
| DK171744B1 (da) | Fremgangsmåde til fremstilling af pyrodruesyre | |
| Andersen et al. | d-lactic acid fermentation of Jerusalem artichokes | |
| JP3600803B2 (ja) | マンニトール生成菌株カンジダ・マグノリア及びこれを使用したマンニトールの発酵製造方法 |