CS201693B1 - Kmen mikroorganizmu Saccharomyces cerevisiae - Google Patents

Description

Vynález sa týká kmeňa Saccharomyóes cerevisae CCY 21-4-2l-e, ktorý produkuje nad 2 % ergosterolu v sušině biomasy.

Kvasinky z rodu Saccharomyces sú najdfiležitejšími producentmi ergosterolu. Hodnoty, ktoré se v staršej literatúre uvádzajú, sú poměrně nízké. Proakurjakov, Popova a Ossipov (Biochimia 3:397, 1938) zistili u krmného droždia Monilia murmanice 0,31 %, u Torula utilis 0,55 % a u pivovarskéj rasy Frohberg 2,36 % v sušině. Preto pokladajú pivovarské kvasinky za zvlášť bohaté ergosterolom, napr. aj kmen 776 mal 2,5 vinné kvasinky mali len 0,4 až 2,19 % ergosterolu v sušině. Appleton a Kleber (Appl. Microbiol. 3:249, 1955) dokázali u Candida krusei 0,3 % u C. parapsilosis dokonce len 0,06 %, avšak u S. cerevisiae až 9 % celkových sterolov. Mitra a Garg (J. Inst. Brew. 64:327, 1958) stanovili u Dharských kvasiniek 0,1 až 0,5 % ergosterolu v sušině, čo pokladajú za rovnocenné s inými stanoveniami u Terula utilia. Viac ako 20 rokov ostal výskům v oblasti vitamínu D v stave relativného pokoje, stúpol až v niekoTkých posledných rokoch. Jeliazjan, Marojan a Arumjunian (Mikrobiologie 44:632, 1975J zisťovali obsah celkových aterolov u kvasiniek a potvrdili, že najvfičšia produkcie je u sacharomycét, od 1,3 do 3,13 % na sušinu biomasy. Dikanskaja a Robyševa (Prikl. Biochim. i Mikrobiol. 11:21, 1975) zisťovali obsah ergosterolii u Candida, Torulopsis a Rhodotorula a zistili, že sa pohybuje medzi 0,4 až 0,6 % na sušinu a len u Saccharomyces carlsbergensis 4228 stanovili 2,4 %. Najnovšie Kosikov, Ljapunová, Rajevskaja a spol. (Mikrobiologie 46:86, 1977) uvádzajú produkeiu ergosterolu U kvasiniek takto:

201 693

201 093 pekárska kvasinka Odesskaja 14 produkuje 2,3 %, ostatně pekáreke kvasinky od 1,8 do 1,9 %, liehovarské rasy od 2,0 do 2,2 % a pivovarská rasa 4228 okolo 1,5 % ergosterolu v sušině.

Z týchto kultúr izolovali monosporické kult liry, haploidné a diploidné a rad hybridov, ktoré produkovali od 1,3 do 2,3 %. Podařilo sa im získat adenín deficitně mutanty, u ktorých bola zvýšená produkcie ergosterolu až do 4,8 % v sušině.

Predmetom vynálezu je kmen Saccharomyces cerevisiae CCY 21-4-21-e, ktorý produkuje velké množstvo ergosterolu. Pfivodný kmen 21-4-21, ktorý tvořil len 10 až 25 % buniek a kvocientom P/0 menším ako 1 alebo rovným 1, sa naočkoval v suspenzi! 10 buniek.ml na povrch sladinového ageru a do středu misky na povrch agaru sa uložil kryštálik gáfru. Pod vplyvom tohto mutagénu prebehla kultivácia v trne pri 28 °C do doby, ke3 sa objevili na povrchu ojedinělé kolo'nie kvasiniek. Opakovaným rozsevom na misky s gáfrom sa vypěstoval mutantný kmen, ktorý vytvářel len buňky s koeficientom povrch/objem menším ako 1 (ku konců exponenciálněj fázy, teda v době maximálněj produkcie ergosterolu). Takto vyšlechtěný kmen sa označil ako CCY 21-4-21-e.

Kmen CCY 21-4-21-e vytvára gulaté, oválné aj pretiahle buňky, ktorých kvocient P/0 je menší ako 1. Obrovské kolo'nie tohto kmeňa sú hladké a prirastajú za 100 hodin asi o 1,7 mm. V tekutom prostředí kmen rýchlo sedimentuje, na povrchu nevytvára kožku, miazdru ani prstenec.

Kmen CCY 21-4-21-e ani po indukcii acetátom nesporuluje. K rastu potřebuje v prostředí vitamíny. Při 5 °C rastie velmi slabo, pri teplote 42 °C rastie dobře, optimálně teplota rastu je však 28 °C. Kvasí glukózu, galaktozu, meltozu, sacharózu a rafinozu. Tieto cukry tiež asimiluje a okrem toho využívá tiež maltotriozu a maltotetraózu, neasimiluje však dusičnan draselná ani lyzín. Sacharózu rozkládá už behom 3 hodin a glukózu a fruktózu a tieto monosecharidy potom kompletně počas 12 hodin utilizuje. V hroznovom raušte, v pivněj sladině a v melasovom prostředí raetie s rovnakou rýchlosťou. Znáša až 12 % etanolu a 5 % kyseliny siričitej. Je citlivý k aktidiónu už v jeho koncentrácii 0,1 pg.2 %-ná kyselina mliečna inhibuje rast kultúry na 60 %, 2 %-ná kyselina vinna na 15 %. Extracelulárne pólysacharidy dávajú jód-škrobovú reakciu.

Kmen CCY 21-4-21-e neaglutinuje so sérom, připraveným proti typickým predstavitelom Saccharomyces cereviciae alebo len při najnižšom zrieůovacom titre. Aglutinuje so sérom proti Candida robusta a Saccharomyces cartilaginpsus ešte při titre riedenia 320. Candida robusta a Saccharomyces cartilaginosus sa dnes počítajú k druhu Saccharomyces cerevisiae a pri numerickéj klasifikácii sa javia ako okrajové varianty tohto druhu.

Kmen CCY 21-4-21-e bol pěstovaný na póde Olson-Jensena umělého zloženia a na indukčnej melasovej p6de na trepačke a kontinuálně. Zloženie p6d a výsledky kultivácie vidno z teb.2.

Ergosterol bol stanovený po kultivácii a ly,of ilizácii alebo priamo s použitím vlhkej biomasy. K stanoveniu sa použila 50 až 100 mg vzorka lyofilizováných kvasiniek, ktorá sa hydrolyzovala v 40 % hydroxide draselnom po dobu 1 hodiny pri 0,196 MPa, vytrepala dietyléterom po dobu 2 hodin na trepačke ppi 4 °C. Po oddálení éterovej vrstvy sa vodná vrstva ešte raz vytrepala éterom a spojené éterové extrakty sa dobré premyli destilovanou vodou.

„ * 201 693

Ciatý éterový extrakt ea odpařil do sucha v rotačnej vákuovej odparke. Odparok sa rozpustil v 0,5 ml chloroformu a doplnil etanolom do 10 ml, príp. zriedil zmesou chloroform : éter 5 : 100. Ddkaz ergoeterolu aa kontroloval registračným spektrofotometrem a množstvo ea počítalo z hodndt pri vlnovej dížke 282 nm.

Tab. 1 ukazuje závislost tvorby ergosterolu od genotypu buniek kolonií, ktorý sa ověřoval proatredhíctvom morfologickej charakteristiky buniek populácie, ako bolo už uvedené. Závislost tvorby ergosterolu na priemernom kvociente P/0 je v určitej oblasti okolo 1 a vyššie priamoúmerná, v oblasti P/0 menšom ako 1 sa už nepřejavuje priamoúmerne, pretože P/O nebývá spravidla menší ako 0,7. Tu potom pdaobia ešte stimulačně vonkajšie vplyvy.

Tak u kmeňa OCX 21-4-21-e bolo zistené mnoho rdznych hodndt obsahu ergosterolu v kvasinkách, ktorých rozpátie bolo od 2,69 do 4,35 (pri priemernom P/0 menšom ako 1), ktorých priemer činil 3,64 % ergosterolu v sušině, smerodajná odchýlka 0,52 a koeficient variancie 14,32 «.

Tabulka 2 ukazuje výsledky pokusu a kultiváciou kmeňa OCX 21-4-2l-e za rdznych podmienok, t.j. na pddach rdzneho zloženia pri statickej aj kontinuálnej kultivácii. Z týchto výsledkov vyplývá, že obsah ergosterolu u vyselektovaného kmeňa 21-4-21-e mdže dokonce převýšit až 6 % v sušině. Přitom prírastky biomasy na melaaovej pdde sú uspokojivé.

Tabulka 3 ukazuje porovnanie vlastností mutanta s divokým kmeňom.

Tabulka 1

Závislost produkcie ergosterolu od morfologického charakteru populácie buniek u kmeňa OCX 21-4-21

číslo populácie	Priemerný kvocient P/0	% ergosterolu v sušině biomasy (priemer 2 až 3 paraleliek)
e/3	1,00	2,69
e/6	1,15	2,24
e/2	1,30	2,23
e/4	1,42	2,15
e/1	1,44	2,12
e/7	1,47	2,10
e/8	1,70	1,85

201 093

Tabulka 2

Produkcia biomasy a ergosterolu za róznych podmienok kultivácie

Pokus δ.	Rast na póde Olson-Jensenx mg sušiny.ml”1 po 24 h	Indukčná melasová p6daXX mg sušiny.ml”1 po 7 2 h	Produkcia ergosterolu v % na sušinu biomasy
na trepaSke pů 48 h po 72 h	kontinuálně po 48 h po 72 h
1	2,9	8,7	5,9 6,2	5,1 6,2
2	2,6	8,8	6,0	5,3

^xZloženie pódy Olson-Jensena: 1,1 g KHgFO*, 0,5 g MgSO₄, 1,5 g esparagín, 0,1 gOaCl?,

1,5 g citren sodný, 1,0 práškový kvasničný extrakt a 20 g glukózy na 1.000 ml deatilovené j vody. Přidává se po 1 ml roztokov A, B, S.

- Roz.tok A: 0,08 g kys. listová, 0,5 g m-inoeitol, 0,44 g tiamín, 0,15 g kys. nikotinová,

0,05 g Ca-pantotenát, 0,120 g pyridoxín na 100 ml destilovanej vody

- Roztok B: 0,25 g ribovlavín, 0,3 g kye. p-aminobenzoová, 0,05 g biotín na 100 ml dest.

vody

- Roztok S: 0,146 ZnSO₄, 0,067 g CuS0₄, 1,18 g Fe(NH₄)₂SO₄ na 100 ml dest. vody.

^Zloženie indukčnej melasovej pódy: 102 g melasy, 10 g corn steepu, 0,06 g (NH^JgHPO^

0,5 g KgHPO^ rozpustit v 0,5 lit. 1 %-ného síranu hlinitého. Mieša aa 20-25 min., neutralizuje NaOH na pH 7, zavaří, sfiltruje a znova upraví pH na 7*

Tabulka 3

Porovnanie niektorých vlastností mutanta a divokým kmeSom

Vlastnost	Divý kmen CCX 21-4-21	Mutant OCX 21-4-21-·
Morfologické parametre na sladině po 3 dňoch, 28 °0: Priemery: dížok buniek	7,39	14,84
dížko-Sirkový poměr	1,16	1,18
povrch/objem buniek	1,15	0,70
Flokulačná schopnost podlá počtu buniek v zMukoch (priemerný počet)	7	1 až 2
Charakter obrovskej kolonie	mastné lesklá,	afikká lesklí,
	drsná, okraj	okraj rovný
Oamofilia	laločnatý 40 %	28 %
(znáša)	sacharózy	sacharózy

201 893

Claims (1)

1. Kmen mikroorganizmu Saccharomyces cereviaiae CCY 2l-4-21-e, produkujúci ergosterol.