CS201693B1 - Strain of micro-organism saccharomyces cerevisiae - Google Patents

Description

ČESKOSLOVENSKASOCIALISTICKÁREPUBLIKA( 19 )

POPIS VYNÁLEZU

K AUTORSKÉMU OSVEDČENIU 201 693 (n> (Bl)

(61) (23) Výstavná priorita(22) Přihlášené 05 03 79(21) PV 2922-78 (51) IntCl.3 C 12 N 1/14

ÚŘAD PRO VYNÁLEZY

A OBJEVY (40) Zverejnené 31 03 80(45) Vydané Q1 Q2 g3

Autor vynálezu K0CK0VÁ-KRAT0CHVÍL0VÁ ANNA RNDr. DrSc., HRONSKÁ LÝDIA, BRATISLAVA aBEHALOVá BOŽENA ing., PRAHA (54) Kmen mikroorganizmu Saccharomyces cerevisiae 1

Vynález sa týká kmeňa Saccharomyóee cerevisae CCY 21-4-2l-e, ktorý produkuje nad 2 %ergosterolu v sušině biomasy.

Kvasinky z rodu Saccharomyces sú najdfiležitejšími producentmi ergosterolu. Hodnoty,ktoré se v staršej literatúre uvádzajú, sú poměrně nízké. Proskurjakov, Popova a Ossipov(Biochimia 3:397, 1938) zistili u krmného droždia Monilia murmanice 0,31 %, u Torula uti-lis 0,55 % a u pivovarskéj rasy Frohberg 2,36 % v sušině. Preto pokladajú pivovarské kvasin-ky za zvlášť bohaté ergosterolom, napr. aj kmen 776 mal 2,5 vinné kvasinky mali len0,4 až 2,19 % ergosterolu v sušině. Appleton a Kleber (Appl. Microbiol. 3:249, 1955) doká-zali u Candida krušei 0,3 % u C. parapsilosis dokonca len 0,06 %, avšak u S. cerevisiaeaž 9 % celkových sterolov. Mitra a Garg (J. Inst. Brew. 64:327, 1958) stanovili u Dhar-ských kvasiniek 0,1 až 0,5 % ergosterolu v sušině, čo pokladajú za rovnocenné s inými sta-noveniami u Terula utilis. Viac ako 20 rokov ostal výskům v oblasti vitamínu D v stave re-lativného pokoje, stúpol až v niekol’kých posledných rokoch. Jeliazjan, Marojan a Arumjunian(Mikrobiologie 44:632, 1975) zisťovali obsah celkových aterolov u kvasiniek a potvrdili, ženajvfičšia produkcia je u sacharomycét, od 1,3 do 3,13 % na sušinu biomasy. Dikanskaja a Ro-byševa (Prikl. Biochim. i Mikrobiol. 11:21, 1975) zisťovali obsah ergosterolu u Candida,Torulopsis a Rhodotorula a zistili, že sa pohybuje medzi 0,4 až 0,6 % na sušinu a len u Ss-ccharomyces carlsbergensis 4228 stanovili 2,4 %. Najnovšie Kosikov, Ljapunová, Rajevskajaa spol. (Mikrobiologie 46:86, 1977) uvádzajú produkciu ergosterolu U kvasiniek takto: 201 693 2 201 693 pekárska kvasinka Odesskaja 14 produkuje 2,3 %, ostatně pekárske kvasinky od 1,8 do 1,9 %,liehovarské rasy od 2,0 do 2,2 % a pivovarská rasa 4228 okolo 1,3 % ergosterolu v sušině· Z týchto kultúr izolovali monosporické kultúry, haploidné a diploidné a rad hybridov, ktoréprodukovali od 1,3 do 2,3 %. Podařilo sa im získat adenín deficitně mutanty, u ktorých bolazvýšená produkcia ergosterolu až do 4,8 % v sušině.

Predmetom vynálezu je kmen Saccharomyces cerevisiae CCY 21-4-21-e, ktorý produkujevelké množstvo ergosterolu. Pfivodný kmen 21-4-21, ktorý tvořil len 10 až 25 % buniek s kvo-cientom P/0 menším ako 1 alebo rovným 1, sa naočkoval v suspenzi! 10 buniek.ml na povrcbsladinového agaru a do středu misky na povrch agaru sa uložil kryštálik gáfru, Pod vplyvomtohto mutagénu prebehla kultivácia v tme pri 28 °C do doby, ke3 sa objevili na povrchu oje-dinělé kolo'nie kvasiniek. Opakovaným rozsevom na misky s gáfrom sa vypěstoval mutantný kmen,ktorý vytváral len buňky s koeficientom povrch/objem menším ako 1 (ku konců exponenciálnějfázy, teda v době maximálněj produkcie ergosterolu). Takto vyšlechtěný kmen sa označil akoCCY 21-4-21-e.

Kmen CCY 21-4-21-e vytvára gulaté, oválné aj pretiahle buňky, ktorých kvocient P/0je menší ako 1. Obrovské kolo'nie tohto kmeňa sú hladké a prirastajú za 100 hodin asio 1,7 mm. V tekutom prostředí kmen rýchlo sedimentuje, na povrchu nevytvára kožku, miazdruani prstenec.

Kmen CCY 21-4-21-e ani po indukcii acetátom nesporuluje. K rastu potřebuje v prostředívitamíny. Při 5 °C rastie velmi slabo, pri teplotě 42 °C rastie dobře, optimálna teplotarastu je však 28 °C. Kvasí glukózu, galaktozu, meltozu, aacharo'zu a rafinozu. Tieto cukrytiež asimiluje a okrem toho využívá tiež maltotriozu a maltotetraózu, neasimiluje však du-sičnan draselná ani lyzín. Sacharózu rozkládá už behom 3 hodin a glukózu a fruktozu a tie-to monosecharidy potom kompletně počas 12 hodin utilizuje. V hroznovom mušte, v pivněj sla-dině a v melasovom prostředí rastie s rovnakou rýchlosťou. Znáša až 12 % etanolu a 5 % ky-seliny siričitej. Je citlivý k aktidionu už v jeho koncentrácii 0,1 pg.2 %-ná kyselinamliečna inhibuje rast kultúry na 60 %, 2 %-ná kyselina vinna na 15 %· Extracelulárne poly-sacharidy dávajú jód-škrobovú reakciu.

Kmen CCY 21-4-21-e neaglutinuje so sérom, připraveným proti typickým predstavitelomSaccharomyces cereviciae alebo len při najnižšom zrie3ovacom titre. Aglutinuje so séromproti Candióa robusta a Saccharomyces cartilaginpsus ešte při titre riedenia 320. Cendidarobusta a Saccharomyces cartilaginosus sa dnes počítajú k druhu Saccharomyces cerevisiaea pri numerickéj klasifikácii sa javia ako okrajové varianty tohto druhu.

Kmen CCY 21-4-21-e bol pěstovaný na pdde Olson-Jensena umělého zloženia a na indukčnejmelasovej p6de na trepačke a kontinuálně. Zloženie pčd a výsledky kultivácie vidno z tab.2.

Ergosterol bol stanovený po kultivácii a ly,ofilizácii alebo priamo s použitím vlhkejbiomasy. K stanoveniu sa použila 50 až 100 mg vzorka lyofilizováných kvasiniek, ktorá sahydrolyzovala v 40 % hydroxide draselnom po dobu 1 hodiny pri 0,196 MPa, vytrepala dietyl-éterom po dobu 2 hodin na trepačke při 4 °C. Po oddálení éterovej vrstvy sa vodná vrstvaešte raz vytrepala éterom a spojené éterové extrakty sa dobré premyli destilovanou vodou. 3 „ * 201 693 Čistý éterový extrakt aa odpařil do aueha v rotačnej vákuovej odparke. Odparok sa rozpustilv 0,5 ml chloroformu a doplnil etanolom do 10 ml, príp. zriedil zmesou chloroform : éter5 : 100. Dftkaz ergoeterolu aa kontroloval registračným epektrofotometrom a množstvo sa po-čítalo z hodnftt pri vlnovej dížke 282 nm.

Tab. 1 ukazuje závislost tvorby ergosterolu od genotypu buniek kolonií, ktorý sa ově-řoval prostredhíctvom morfologickej charakteristiky buniek populácie, ako bolo už uvedené.Závislost tvorby ergosterolu na priemernom kvociente P/0 je v určitej oblasti okolo 1 avyššie priamoúmerná, v oblasti P/0 menšom ako 1 sa už nepřejavuje priamoúmerne, pretožeP/O nebývá spravidla menší ako 0,7. Tu potom pfisobia ešte stimulačně vonkajšie vplyvy.

Tak u kmena OCX 21-4-21-e bolo zistené mnoho rfiznych hodnfit obsahu ergosterolu v kvasin-kách, ktorých rozpátie bolo od 2,69 do 4,35 (pri priemernom P/0 menšom ako 1), ktorýchpriemer činil 3,64 % ergosterolu v sušině, smerodajná odchýlka 0,52 a koeficient varian-cie 14,32 «.

Tabulka 2 ukazuje výsledky pokusu s kultiváciou kmena OCX 21-4-21-e za rfiznych pod-mienok, t.j. na pfidach rfizneho zloženia pri statickej aj kontinuálnej kultivácii. Z týchtovýsledkov vyplývá, že obsah ergosterolu u vyselektovaného kmena 21-4-21-e mfiže dokonce pře-výšit až 6 % v sušině. Přitom prírastky biomasy na melasovej pfide sú uspokojivé.

Tabulka 3 ukazuje porovnanie vlastností mutanta s divokým kmeňom.

Tabulka 1 Závislost produkcie ergosterolu od morfologického charakteru populácie bunieku kmena OCX 21-4-21 Číslo populácie Priemerný kvocient P/0 % ergosterolu v sušině biomasy (priemer 2 až 3 paraleliek) e/3 1,00 2,69 e/6 1,15 2,24 e/2 1,30 2,23 e/4 1,42 2,15 e/1 1,44 2,12 e/7 1,47 2,10 e/8 1,70 1,85 4 201 093

Tabulka 2

Produkcia biomasy a ergosterolu 2a rčznyoh podffiienok kultivácie

Pokus δ. Rast na pddeOlson-Jensenxmg sušiny.ml”1po 24 h Indukčná mela-sová p6daXXmg sušiny.ml”1po 72 h Produkcia ergosterolu v % na sušinu biomasy na třepačka po 48 h po 72 h kontinuálně po 48 h po 72 h 1 2,9 8,7 5,9 6,2 5,1 6,2 2 2,6 8,8 6,0 5,3 xZloženie pĎdy Olson-Jensena: 1,1 g KHgFO*, 0,5 g MgS04, 1,5 g asparagín, 0,1 gOaCl?, 1,5 g citran sodný, 1,0 práškový kvasničný extrakt a 20 g glukózy na 1.000 ml deatilove-né j vody. Přidává se po 1 ml roztokov A, B, S. - Poz.tok A: 0,08 g kys. listová, 0,5 g m-inoeitol, 0,44 g tiamin, 0,15 g kys. nikotinová, 0,05 g Ca-pantotenát, 0,120 g pyridoxín na 100 ml deetilovanej vody - Roztok B: 0,25 g ribovlavín, 0,3 g kys. p-aminobenzoová, 0,05 g biotín na 100 ml dest. vody - Roztok S: 0,146 ZnSO4, 0,067 g CuS04, 1,18 g Fe(NH4)2S04 na 100 ml dest. vody. X^Zloženie indukčnej melasovej p6dy: 102 g melasy, 10 g corn steepu, 0,06 g (NH4)2HP04, 0,5 g KgHPO^ rozpustit v 0,5 lit. 1 %-ného síranu hlinitého. Uieša Sa 20-25 min., neutra-lizuje NaOH na pH 7, zavaří, sfiltruje a znova upraví pH na 7*

Tabulka 3

Porovnanie niektorých vlastností mutanta a divokým kmenom

Vlastnost Divý kmen CCX 21-4-21 Mutant CCX 21-4-21-e Morfologické parametre na sladině po 3 dnoch, 28 °0:Priemery: dížok buniek 7,39 14,84 dížko-Sirkový poměr 1,16 1,18 povrch/objam buniek 1,15 0,70 Flokulačná schopnost podlá počtu buniek v zMukoch (priemerný počet) 7 1 až 2 Charakter obrovskej kolonie mastné lesklá, mfikká lesklá, dřená, okraj okraj rovný Oamofilia laločnatý 40 % 28 % (znáša) sacharozy sacharozy

Claims (1)

1. 201 893 fR E DB El VYNÁLEZU Kmen mikroorganizmu Saccharomyces cereviaiae CCY 2l-4-21-e, produkujúci ergosterol.