CS201621B1 - Způsob semikontinální výroby kyseliny 6-aminopenicilánové - Google Patents

Description

Vynález se týká způsobu semikontinuální výroby kyseliny 6-aminopenicilánové, základního meziproduktu výroby řady klinicky užívaných polosyntetických penicilinů. Jak je známo, získává se kyselina 6-aminopenicilánová (dále pro stručnost 6-APK) chemickým nebo enzymovým štěpením penicilinu, především benzylipenicilinu, a to působením penieilinacylázy produkované různými mikroorganismy, nej častěji Escherichia coli (NSR pat. spis č. 1, 114. 766). Při dosavadních postupech jde téměř výhradně o jednorázové použití nativních buněk při vsádkovém způsobu štěpení penicilinu, což je jejich podstatnou nevýhodou. U nativních buněk je velmi omezená možnost jejich opakovaného použití. Nativní buňky podléhají autolýze, aktivní enzym penicilinacyláza — je z nich vyplavován a s ním i obsah buněk, zejména vnitrobuněčné rozpustné bílkoviny, které pak zčásti doprovázejí vzniklou 6-APK celým procesem izolace a kontaminují konečný produkt. Polosyntetické peniciliny, připravené z takto získané 6-APK, vyvolávají alergické reakce u člověka i zvířete. Rozklad nativních buněk je urychlován vysokou iontovou silou štěpeného roztoku penicilinu, resp. relativně vysokými hodnotami pH, při kterých enzymová hydrolýza probíhá (7,6 až 8,2). Vyplavená peničilináčylása je pak prů opakování enzymového procesu ztracena. V praxi to znamená, že nativní buňky lze použít pouze jednorázově, že je nutno připravovat je vždy novou kultivací v živné půdě, jejíž zbytky se nedají při separaci buněk zcela odstranit. Tyto zbytky přispívají ke kontaminaci konečného produktu, popřípadě komplikují volbu vhodného izolačního postupu 6-APK.

Určitý pokrok představuje příprava 6-APK štěpením penicilinu pomocí penicilinacylázy vázané. Pro vazbu tohoto enzymu na nejrůznější anorganické i umělé organické materiály se užívá čištěných preparátů získaných z buněk mikroorganismů relativně drahými, složitými a hlavně ztrátovými postupy. Tak například v čs. patentu č. 145849 je uveden způsob čištění penicilinacylázy a její vazby na nosič, spočívající v kultivaci buněk E. coli a separaci biomasy, v jejím mechanickém drcení a opakované extrakci enzymu, frakčním srážením koncentrátu, jeho dialýze a případné lyofilizací enzymu. Tato mnohostupňová příprava končí se ziskem asi 30 % původního množství enzymu, o čistotě surového preparátu asi 10%, vztaženo na čistou penicilinacylázu. Takto získaný technický preparát enzymu pak slouží k vazbě na nosič typu póly sacharidových derivátů, po jeho předchozí chemické aktivaci bromkyanem.

Nosiče tohoto a podobných typů jsou však velice drahé přípravky, které zvyšují náklady na vázaný enzym do té míry, že jen asi 200násobné použití vázaného enzymu ve srovnání s jednorázovým použitím nativních buněk je efektivnější. Možnost mnohonásobného použití vázaného enzymu není vždy dána, zejména pracuj e-li se vsádkově v reaktoru za míchání, které působí na vázaný enzym silnými mechanickými vlivy. Umělé materiály s vyšší mechanickou pevností mívají opět nevýhodu v omezené difuzní rychlosti a proces hydrolýzy penicilinu se zpomaluje. Vázaný enzym se při častém opakovaném použití dříve nebo později denaturuje, zvláště tehdy, když se pro hydrolýzu užívá levnějších roztoků surového penicilinu, získávaných při jeho izolaci z vyfermentované kultivační kapaliny.

Bylo zjištěno, že zvláště vysokou produktivitu, výtěžnost a hospodárnost vykazuje způsob semikontinuální výroby kyseliny 6aminopenicilánové štěpením penicilinů, zejména benzylpenicilinu, mikrobiálními buňkami obsahujícími penicilinacylázu, zejména buňkami mikroorganismu Escherichia coli, podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že se štěpení provádí s použitím suspenze mikrobiálních buněk, obsahujících penicilinacylázu, předem chemicky stabilizovaných působením bifunkčního činidla, jako jsou dialdehydy, s výhodou působením glutardialdehydu, a s použitím roztoku penicilinu v koncentraci 1 až 10 % hmot. (objem, s výhodou 4 až 7 % hmot.) objem, při pH 7,2 až 8,2, po ukončeném štěpení a ochlazení reakční směsi na teplotu 0 až 5 °C se suspenze mikrobiálních buněk oddělí a použije ke štěpení čerstvé násady roztoku penicilinu a ze supernatantu, popřípadě z matečného, louhu se po úpravě pH a teploty izoluje 6-aminopenicilánová kyselina, přičemž se štěpení penicilinu a izolace 6-aminopenicilánové kyseliny alespoň dvakrát opakuje.

Na enzymové štěpení způsobem podle vynálezu se účelně používá jako roztoku penicilinu roztoku sodné nebo draselné soli benzylpenicilinu, popřípadě surového roztoku benzylpenicilinu ve formě kyseliny, získávaného při zpracovávání vyfermentované půdy po ukončené kultivaci.

Zásadní význam pro optimální průběh enzymového štěpení penicilinu způsobem podle vynálezu má stabilizace buněk mikroorganismu, zejména Escherichia coli; zvláště výhodné je použití kmenů s vysokým obsahem penicilinacylázy. Stabilizace buněk, resp. jejich vnitrobuněěného obsahu spolu s penicilinacy'lázou, se dosáhne kovalentním zesítěním působením vhodných bifunkóních činidel, s výhodou glutardialdehydem. Touto stabilizací, což je jednoduše realizovatelná reakce, se získá odolnost buněk proti autolýze a fixace penicilinacylázy v buňkách, bez významné ztráty jejich hydrolytické aktivity. Stabilizované buněčné suspenze lze opakovaně používat ke štěpení penicilinu, přičemž pokles účinnosti je mírný a pomalý. Aktivitu zesítěných buněk lze ještě zvýšit ošetřením vhodným organickým rozpouštědlem a vhodným smáčedlem, což má za následek vyplavení nezreagovaných buněčných komponent, především lipidů, které se neúčastní reakce s glutardialdehydem a tím k vyprání buněk a zlepšení jejich difuzních vlastností. Je-li k dispozici kmen s vysokým obsahem penicilinacylázy, lze za vhodných podmínek používat koncentrovanějšího roztoku penicilinu než dosud, přičemž konverze probíhá velmi rychle, v průběhu 2 až 3 hodin, s vysokým výtěžkem velmi čisté 6-aminopenicilánové kyseliny.

Při provedení způsobu semikontinuální výroby 6-aminopenicilánové kyseliny se po prvním štěpení roztoku penicilinu, obvykle v koncentraci 5 až 7 % hmot. (objem, jež probíhá obvyklým postupem za intenzivního míchání, regulace pH a teploty, se chemicky stabilizované buňky oddělí, nejlépe odstředěním, bez jakékoliv další úpravy se přes ně přelije čerstvý roztok penicilinu a probíhá další cyklus enzymové hydrolýzy za stejných podmínek. Tento postup lze mnohonásobně opakovat. Manipulační ztráty buněčné suspenze, vznikající především při odstřeďování, se nahrazují obvykle po pěti cyklech štěpení, doplněním suspenzí zásobních stabilizovaných buněk.

Mimo výhodné možnosti opakovaného používání chemicky stabilizovaných buněk je předností způsobu podle vynálezu jeho rychlost, neboť není nutno dbát na úplnou separaci buněčné hmoty do f ormy pasty a stabilizované buňky není třeba promývat. Zbytkový objem reakční směsi po hydrolýze, který zůstává v sedimentu, se s ním ihned vrací do procesu při zahájení druhého a dalšího cyklu hydrolýzy. Dřívější jednorázový postup se tak mění na opakovaný semikontinuální způsob, kdy po každých 3 hodinách se cyklus opakuje. Supematant rezultující po oddělení stabilizované buněčné suspenze se ihned zpracovává na krystalickou 6-APK, a to buď přímou úpravou pH a teploty nebo po zahuštění. Významné množství produktu lze získat i ze zahuštěných matečných louhů po odstranění fenyloctové kyseliny obvyklým způsobem.

Významné je dále i to, že 6-APK, získaná způsobem podle vynálezu, je podstatně čistší než produkty získávané jednorázovým postupem při použití nativních nestabilizovaných buněk, které se v průběhu štěpení částečně autolyzují a kontaminují 6-APK zplodinami svého rozpadu, především bílkovinami, které provázejí 6-APK v průběhu celé izolace, přičemž jejich dokonalé odstranění je velice obtížné a nákladné. Produkty získané štěpením pomocí chemicky stabilizovaných buněk není třeba pro další použití krystalovat a též jejich rozpustnost, je lepší.

Z uvedeného je zřejmý technický i ekonomický efekt při výrobě základního meziproduktu pro přípravu řady terapeuticky významných polosyntetickýoh penicilinů.

Způsob podle vynálezu je podrobně popsán v následujících příkladech provedení.

Příklad 1

Kultura vysokoprodukóní mutanty kmene Escherichia coli CCM 2843, vypěstovaná v 5 t fermentačním tanku, byla zahuštěna odstředěním na objem asi 300 litrů. Zahuštěná suspenze nativních buněk obsahovala asi 400 mg vlhké hmoty/ml. Tato suspenze byla mícháním zhomogenizována za úpravy pH na hodnotu 7,5 50%ním roztokem hydroxidu sodného. Poté byl za míchání přidán 50%ní vodný roztok glutardialdehydu do výsledné koncentrace v reakční směsi 2 % (hmotnost/ objem). Reakce probíhala 3 hodiny při teplotě 20 až 25 °C. Potom byla reakční směs zředěna 3000 litry pitné vody a suspenze opět odstředěním zahuštěna na objem 300 litrů.

Takto připravená suspenze chemicky stabilizovaných buněk byla použita pro hydrolýzu penicilinu na 6-APK, a to tak, že byla převedena do reaktoru a za míchání zředěna 2100 litry deionizované vody, takže obsahovala přibližně 80 mg vlhké hmoty buněk/ml, tj. přibližně 8 % obj. sedimentu. Teplota suspenze byla nastavena na 37 °C a byla přidána draselná sůl benzylpenicilinu do výsledné koncentrace 7 % (hmotnost/objem).

Enzymová hydrolýza probíhala za míchání při teplotě 37 °C, za kontinuálního udržování pH na hodnotě 7,6 až 8,2 přídavkem zředěného vodného roztoku čpavku. Po 2 hodinách byla enzymová hydrolýza skončena, což se projevilo jak zastavením spotřeby roztoku čpavku tak analyticky zjištěnou hodnotou přeměny benzylpenicilinu na 6-APK (95 % teorie 6-APK za 2 hodiny). Reakční rychlost a výtěžek 6-APK byl sledován spektrofotometricky podle čs. patentu č. 116959.

Po ukončení hydrolýzy byla reakční směs ihned ochlazena na teplotu 0 až —5 °C a suspenze buněk byla odstředěním zahuštěna na 1/9 původního objemu o oddělena od reakční směsi. Supematant o teplotě kolem 2 °C byl koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou okyslen, na pH 4,2, čímž se vyloučila krystalická 6-APK, která byla oddělena filtrací. Filtrát byl okyselen koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou na pH 2,0 a extrahován 30 % (objemovými) chloridu uhličitého. Vodná fáze byla neutralizována na hodnotu pH 7,0 koncentrovaným roztokem čpavku a vakuově azeotropicky zahuštěna při teplotě 35 ⁰ na 1/3 objemu. Poté bylo pH upraveno na hodnotu 4,2 koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou za chlazení na teplotu 0 °C. Vykrystalovaná 6-APK byla odfiltrována. Z extraktu byla regenerována kyselina fenyloctová.

Zahuštěna suspenze buněk byla ihned převedena do dalšího reaktoru, opět zředěna na objem 2400 litrů a za výše popsahých podmínek proveden opakovaný cyklus enzymové hydrolýzy benzylpenicilinu. Uvedeným způsobem bylo semikontinuální štěpení benzylpenicilinu opakováno se stejnou suspenzí buneh 12kral, beZe ztiřál na výtěžnosti hydrolýzy a izolace 6-APK,

Příklad 2

Spojené zahuštěné suspenze nativních buněk E. coli ze dvou 5 t fermetačních tanků, o objemu 600 litrů, byly odstředěny do formy . buněčné pasty, čímž byly odděleny zbytky živné půdy. Buněčná pasta byla suspendována v 1000 litrech deionizované vody a za míchání homogenizována, takže obsahovala 300 mg vlhké hmoty nativních buněk/ml. Za míchání bylo upraveno pH této suspenze na hodnotu 7,0. přídavkem 50%ního (hmotnost/ objem) roztoku hydroxidu sodného a potom přidán 25%ní vodný roztok glutardialdehydu v takovém množství, aby jeho výsledná koncentrace v reakční směsi činila 1% (hmotnost/ objem). Reakce probíhala 3 hodiny při teplotě 25 °C. Po této době byla reakční směs zředěna 4000 litry deionizované vody á zahuštěna na objem 400 litrů.

Takto připravená suspenze chemicky stabilizovaných buněk byla přečerpána do reaktoru, za míchání zředěna 3600 litry deionizované vody a zhomogenizována, takže obsahovala přibližně 60 mg vlhké hmoty buněk/ml, tj. 6% obj. sedimentu. S touto buněčnou suspenzí bylo provedeno 25 cyklů konverzní 4%ního (hmotnost/objem) roztoku sodné soli benzylpenicilinu na 6-APK semikontinuálním způsobem za dobu 125 hodin za stejných podmínek jako v příkladu 1. Po každém pátém cyklu použití byla v případě potřeby reakční směs doplněna zásobní suspenzí chemicky stabilizovaných buněk, čímž byly nahrazeny manipulační ztráty.

Po oddělení buněk byl supematant zpracován na 6-APK tak, že po okyselení na pH 2,0 byl extrahován butylacetátem, vodná fáze byla alkalizována na pH 7,5 a vakuově zahuštěna na 1/2 původního objemu při teplotě 40 °C. Po ochlazení na 0 °C a okyselení na pH 4,2 se vyloučila krystalická 6-APK, která byla odfiltrována a promyta ledovou vodou a acetonem. Z extraktu byla regenerována kyselina fenyloctová obvyklým způsobem.

Průměrná analyticky zjištěná hodnota přeměny benzylpenicilinu na 6-APK činila 90% teorie za 2,5 hodiny, průměrný výtěžek suché 6-APK činil 84,5 % teorie.

Příklad 3

000 litrů kultury kmene Escherichia coli CCM 2843, vypěstované v 15 t fermentačním tanku obsahující přibližně 500 kg vlhké hmoty buněk (120 kg suché hmoty buněk) bylo zahuštěno na objem 1000 litrů pomocí sedimentačních odstředivek. Zahuštěná suspenze buněk byla homogenizována za úpravy pH 25%ním roztokem hydroxidu sodného na hodnotu 7,0. Za stálého míchání při teplotě 25 °C bylo přidáno 40 litrů 25%ního vodného roztoku glutardialdehydu. Reakce probíhala za míchání 3 hodiny při teplotě 25 °C. Směs byla zředěna pilnou vodou na objem 3500 litrů a dále míchána po dobu 15 minut. Reakční směs byla opět zahuštěna na sedimentačních odstředivkách.

400 litrů takto zesítěné buněčné biomasy bylo zředěno pitnou vodou na celkový objem 500 litrů a přidáno 50 litrů butylacetátu. Suspenze byla míchána po dobu 5 hodin při teplotě 25 °C. Po této době byl přidán roztok 10 kg Slovafolu 909 a dále mícháno ještě 15 minut. Po této době byla suspenze zředěna pitnou vodou na celkový objem 4000 litrů a odseparována na sedimentačních odstředivkách. Vypraná buněčná pasta byla suspendována v nádrži s intenzivním mícháním v 3500 litrech pitné vody a po homogenizaci dále míchána po dobu 30 minut. Po této době byla suspenze zahuštěna pomocí sedimentačních odstředivek na celkový objem 400 litrů. Zahuštěná suspenze byla opět přečerpána do míchané nádoby, zředěna na celkový objem 3500 litrů pitnou vodou a zahuštění zesítěných a vypraných buněk z míchané suspenze bylo opakováno ještě jednou popsaným způsobem opět na objem 400 litrů.

Z celkového množství 500 kg vlhké hmoty (120 kg suché hmoty) nativních buněk E. coli bylo popsaným procesem sítění, praní a pro-, mývání získáno 350 kg vlhké hmoty (84 kg suché hmoty) chemicky stabilizovaných buněk, což jest v hmotnostní bilanci 70%ní výtěžek.

300 litrů takto připravené zahuštěné suspenze chemicky stabilizovaných buněk bylo přečerpáno do reaktoru, zředěno na celkový objem 4000 litrů deionizovanou vodou a homogenizováno mícháním. Po rozmíchání činila koncentrace zesítěných buněk 60 mg vlhké hmoty/ml, tj. 17 až 20 mg suché hmoty/ml. Teplota suspenze byla nastavena na 37 °C a byla přidána draselná sůl benzylpenicilinu do výsledné koncentrace 6,5 % (hmotnost/objem), tj. 414 miliard jednotek (268 kg). Enzymová hydrolýza probíhala 2 hodiny za podmínek uvedených v příkladu 1.

Po ukončení hydrolýzy byly chemicky stabilizované buňky pomocí sedimentačních odstředivek zahuštěny na celkový objem 400 litrů a zahuštěná suspenze buněk ochlazena rua 5 °C. Čirá reakční směs po oddělení stabilizovaných buněk byla přečerpána do nádrží, zředěna přidáním 800 litrů metylizobutylketonu, promíchána, ochlazena na 2 °C a reakční směs okyselena na hodnotu pH 4,2 40%ním roztokem (hmotnost/objem) kyseliny sírové. Potom byla směs ponechána 3 až 4 hodiny krystalovat, pak byla zfiltrována, filtrační koláč prokryt 10 litry ledové deionizované vody, krystaly vyjmuty a suspendovány ve 120 litrech ledové deionizované vody a opět zfiltrovány. Potom byl produkt prokryt 10 litry zchlazeného acetonu, vyjmut a suspendován ve 120 litrech zchlazeného acetonu a znovu žfiltrován. Z filtrátu byla regenerována kyselina fenyloctová a metylizobutylketon.

400 litrů zahuštěné suspenze buněk ve zbytku reakční směsi z předcházejícího cyklu enzymové hydrolýzy bylo po 4 hodinách stání při 5 °C přečerpáno zpět do reaktoru, zředěno na objem 4000 litrů deionizovanou vodou a za výše popsaných podmínek proveden opakovaný cyklus enzymové hydrolýzy benzylpenicilinu.

Uvedeným způsobem bylo semikontinuální štěpení benzylpenicilinu na 6-APK opakováno se stejnou suspenzí chemicky stabilizovaných buněk 5krát s časovou prodlevou mezi započetím jednoho a skončením druhého cyklu 6 hodin, při dosažení průměrného stupně konverze uvedené koncentrace benzylpenicilinu na 6-APK 93 % a průměrného výtěžku 6-APK v izolaci 80 % teorie bez zpracování matečných louhů. Kvalita produktu byla posuzována z hlediska 4 kriterií a to čistoty (98,8 %), nerozpustného zbytku trietylaminové soli v diehlormetanu (2,18 %), vlhkosti (0,9 °/o) a tintometrickým měřením barevnosti (0,1/0,1).

Příklad 4

Zahuštění buněk E. coli po kultivaci v 151 fermentoru a jejich chemická stabilizace byla provedena jak je uvedeno v příkladu 3. Praní a promývání stabilizovaných buněk bylo provedeno rovněž stejným způsobem jak je uvedeno v příkladu 3 s tím rozdílem, že místo butylacetátu bylo použito toluenu a místo Slovafolu 909, Slovafolu 910 ve stejných koncentracích.

Semikontinuální hydrolýza 6,5%ního roztoku draselné soli benzylpenicilinu byla provedena rovněž stejným způsobem jak je uvedeno ,v příkladu 3, avšak s tím rozdílem, že bylo provedeno 15 opakovaných cyklů hydrolýzy, přičemž před zahájením pátého, desátého a čtrnáctého cyklu bylo přidáno vždy 27 litrů zahuštěné zásobní suspenze chemicky stabilizovaných buněk, čímž byly nahrazeny manipulační ztráty.

Izolační postup 6-APK byl rovněž stejný jak je uvedeno v příkladu 3 s tím rozdílem, že místo metylizobutylketonu bylo použito 1500 litrů butylacetátu.

Průměrný stupeň konverze 15 semikontinuálních cýkhi štěpení byl 92 %, průměrný výtěžek 6-APK v izolaci 81,6 % teorie bez zpracování matečných louhů. Kvalita 6-APK byla podobná jak je uvedeno v příkladu 3 s tím rozdílem, že průměrná hodnota nerozpustného zbytku činila 4,8 %.

Claims (3)

1. Způsob semikontinuální výroby kyseliny 6-aminopenieilánové štěpením penicilinů, zejména benzylpenicilinu, mikrobiálními buňkami obsahujícími penicilinacylázu, zejména buňkami mikroorganismu Escherjchia coli, vyznačující se tím, že se štěpení provádí s použitím suspenze mikrobiálních buněk, obsahujících penicilinacylázu, předem chemicky stabilizovaných působením bifunkčního činidla, jako jsou dialdehydy, s výhodou působením glutardialdehydu, a s použitím roztoku penicilinu v koncentraci 1 až 10 % hmotnost/objem, s výhodou 4 až 7 % hmotnost/objem, při pH 7,2 až 8,2 po . ukončeném štěpení a ochlazení reakčni směsi na teplotu 0 až 5 °C se suspenze mikrobiálních buněk oddělí, použije ke štěpení čerstvé násady roztoku penicilinu a ze supematantu, popřípadě matečného louhu se po úpravě pH a teploty izoluje 6-aminopenicilánová kyselina, přičemž se štěpení penicilinu a izolace 6-aminopenicilánové kyseliny alespoň dvakrát opakuje.

2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se jako roztoku penicilinu používá roztoku sodné nebo draselné soli benzylpenicilinu.

3. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se jako roztoku penicilinu používá surového roztoku benzylpenicilinu ve formě kyseliny, získaného při zpracování vyfermentované půdy po ukončené kultivaci.