CS201614B1

CS201614B1 - Method of executing the radioimmunological analysis

Info

Publication number: CS201614B1
Application number: CS168477A
Authority: CS
Inventors: Pavel Dvorak; Marie Chrpova
Original assignee: Pavel Dvorak; Marie Chrpova
Priority date: 1977-03-14
Filing date: 1977-03-14
Publication date: 1980-11-28

Description

Vynález se týká způsobu provádění všech radioimunologických analýz, při nichž se používá druhá protilátka.The invention relates to a method for carrying out all radioimmunoassays using a second antibody.

Radioimunologická analýza je založena na imunologické reakci látky s protilátkou a na radioindikátorové detekci látky. Látka je sloučenina, která, zavedena při určitých podmínkách do živočišného organismu, je schopna vyvolat v něm obrannou imunologickou reakci. Protilátka je produkt žádoucí imunologické reakce organismu. S látkou vytváří komplex látka—protilátka. Nositelem protilátky je globulinová frakce krevního séra, tzv. antiséra.Radioimmunological analysis is based on the immunological reaction of the substance with the antibody and on the radio-indicator detection of the substance. A substance is a compound which, when introduced into an animal organism under certain conditions, is capable of eliciting a defensive immunological response therein. An antibody is the product of a desired immunological reaction of an organism. It forms a substance-antibody complex with the substance. The antibody is carried by the globulin fraction of blood serum, the so-called antiserum.

Při radioimunologické analýze je nejprve přidáno ke vzorkům obsahujícím neznámé množství sledované látky nadbytečné množství protilátky ve formě zředěného antiséra. Část protilátky vytvoří komplex látka—protilátka a zbývající část protilátky zůstává nezreagovaná v reakční směsi. Po ustavení reakční rovnováhy je k reakční směsi přidána sledovaná látka značená radionuklidem. V reakční směsi je potom přítomna značená látka jednak vázaná ve formě komplexu značená látka—protilátka, jednak volná — představovaná nezreagovaným podílem. Vzhledem k tomu, že reakce probíhá v podmínkách, kdy vzniklá mikromnožství komplexu jsou rozpuštěna, je nutno komplex značená látka— protilátka separovat z roztoku.For radioimmunoassay, excess antibody in the form of diluted antiserum is first added to samples containing an unknown amount of the test substance. A portion of the antibody forms a substance-antibody complex and the remaining portion of the antibody remains unreacted in the reaction mixture. After equilibration of the reaction mixture, a radionuclide-labeled substance of interest is added to the reaction mixture. In the reaction mixture, the labeled substance is present, both bound in the form of a labeled antibody-antibody complex, and free, represented by the unreacted moiety. Since the reaction proceeds under conditions where the resulting micro-amounts of the complex are dissolved, the labeled antibody-antibody complex must be separated from the solution.

Jedním ze způsobů separace je použití druhé protilátky. Spočívá v tom, že na jiném živočišném druhu je imunizací připravena druhá protilátka vůči globulinům toho živočišného druhu, na němž byla připravena protilátka. Tato druhá protilátka vytváří s komplexem látka—protilátka separovatelný produkt.One method of separation is to use a second antibody. It consists in that on another animal species, a second antibody to globulins of the animal species in which the antibody has been prepared is immunized. This second antibody forms a separable product with the substance-antibody complex.

Jedná-li se například o radioimunoanalýzu proteohormonů, provádí se separace volného a vázaného značeného hormonu tak, že druhá protilátka je přidávána do reakční směsi 4. den analýzy. Po inkubaci trvající 12 až 24 hodin je vzniklá sraženina odstředěna, určena radioaktivita vázaného a volného hormonu a z nich výsledné hodnoty analýzy. (Schams, D.: Untersuchungen uber Prolaktin beim Rind., Z. fůr Tierphysiologie, Tiemáhrung und Futtermittelkunde, Suppl, I. 1974, 1-125).For example, for radioimmunoassay of proteohormones, separation of free and bound labeled hormone is performed by adding the second antibody to the reaction mixture on day 4 of analysis. After incubation for 12 to 24 hours, the resulting precipitate is centrifuged, bound and free hormone radioactivity and the resulting assay values are determined. (Schams, D .: Untersuchungen uber Prolactin beim Rind., Z. fur Tierphysiologie, Tiemahrung und Futtermittelkunde, Suppl, I. 1974, 1-125).

V současné době je například stanovení bovinního růstového hormonu prováděno takto: (Dvořák, P., Bečka, S., Krejčí, P., Chrpová, M.: Radioimunnoassay of bovine growth hormone., Radiochem. Radioanal. Letters 34, 1978,155-160):For example, at present, the determination of bovine growth hormone is performed as follows: (Dvorak, P., Becka, S., Krejci, P., Chrpova, M .: Radioimmunoassay of bovine growth hormone., Radiochem. Radioanal. Letters 34, 1978,155 -160):

Do zkumavky jsou v uvedeném pořadí a množství pipetovány následující látky a zpracovány jak níže uvedeno:The following substances are pipetted into the test tube in the following order and quantity and processed as follows:

vzorek — 50 μΐ krevního séra nebo plazmy, nosič — 100 al plazmy králíka zředěnésample - 50 μΐ of blood serum or plasma, carrier - 100 al rabbit plasma diluted

300 X, protilátka — 100 iA králičího antiséra zředěného 9000 X, směs promíchána, inkubována přes noc značený hormon — 100 μΐ ¹²⁵I- bovinní růstový hormon, směs promíchána inkubována 48 hodin druhá protilátka — 100 μΐ kozího antiséra zředěného 24 X, směs promíchána, inkubována přes noc odstředění sedimentu určení radioaktivity sedimentu výpočet300 X, antibody - 100 iA rabbit antiserum diluted 9000 X, mixed, incubated overnight with labeled hormone - 100 μΐ ¹²⁵ l- bovine growth hormone, mixed incubated 48 hours second antibody - 100 μ 24 of 24 X diluted goat antiserum, mixed, incubated overnight sediment centrifugation determination of sediment radioactivity calculation

Reagencia jsou ředěny pufrem, inkubace probíhají při teplotě přibližně 4 °C. Při zkrácení 2. inkubace z 48 hodin na 24 nastává významný pokles procenta vazby — o 15 až 25 %. 'Reagents are diluted with buffer, incubated at approximately 4 ° C. When the second incubation is shortened from 48 hours to 24, there is a significant decrease in binding percentage - by 15 to 25%. '

Hlavní nevýhodou tohoto postupu je jeho zdlouhavost. Celý trvá 5 dní, tj. v pracovním týdnu lze celé stanovení provést pouze jednou. Další nevýhodou je nutnost manipulovat 1., 2., 4. a 5. den se vzorky. V praxi to znamená, že první den musí připadnout na pondělí. Takto prováděná analýza je pracná co do manipulace. K jedné analýze je nutno pětkrát pipetovat a třikrát míchat, což je zvláště při analýze velkého počtu vzorků současně, zdrojem chyb.·The main drawback of this procedure is its lengthyness. The whole duration is 5 days, ie in the working week the whole determination can be done only once. Another disadvantage is the need to handle samples on day 1, 2, 4 and 5. In practice, this means that the first day must fall on Monday. This analysis is laborious in terms of manipulation. For one analysis, pipette five times and mix three times, which is a source of error, especially when analyzing a large number of samples simultaneously.

Uvedené nedostatky jsou odstraněny způsobem provádění radioimunologických analýz, při nichž se používá druhé protilátky, použitelným pro kvantitativní analýzu všech látek, vůči nimž existuje protilátka. Podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že nejprve je 1/4 až 6 hodinovou precipitační reakcí mezi antisérem obsahujícím druhou protilátku a sérem živočišného druhu, na němž byla připravena protilátka, při teplotě 0 až 37 °C, vysráženo makromnožství nosičové suspenze — v podmínkách 1 až 100 násobného přebytku antiséra, než činí množství potřebné pro 80 % precipitaci séra — a poté je přidáním antiséra s protilátkou připraveno, při teplotě 0 až 37 °C reakcí trvající nejméně 1/4 hodiny, na tomto nosiči mikromnožství precipitované protilátky vázané na pevné fázi, přičemž množství a zředění antiséra musí být takové, aby se na pevnou fázi navázalo 0,1 až 100% protilátky obsažené v antiséru. Pro precipitační reakci je výhodná teplota 4 °C a doba trvání 2 hodiny. Při přípravě mikromnožství precipitované protilátky vázané na pevné fázi je výhodnou reakční teplota 4 °C, přičemž množství a zředění antiséra je takové, aby se na pevnou fázi vázalo 50 % protilátky obsažené v antiséru. Místo sér a antisér je možno při tomto provádění analýz použít krevní plazmy.These drawbacks are overcome by a method of radioimmunoassay using a second antibody useful for the quantitative analysis of all substances to which an antibody exists. According to the invention, the first step is to precipitate a macro-amount of the carrier suspension - at a temperature of 0 to 37 ° C - between 1 and 6 hours between the antiserum containing the second antibody and the serum of the animal species on which the antibody has been prepared. conditions of 1 to 100 fold excess of antiserum than the amount required for 80% serum precipitation - and then by adding an antiserum with the antibody at 0 to 37 ° C for at least 1/4 hour reaction, a micro-amount of precipitated antibody bound to the amount and dilution of the antiserum must be such that 0.1-100% of the antibody contained in the antiserum is bound to the solid phase. For the precipitation reaction, a temperature of 4 ° C and a duration of 2 hours is preferred. In preparing a micro-amount of precipitated solid phase-bound antibody, a reaction temperature of 4 ° C is preferred, wherein the amount and dilution of the antiserum is such that 50% of the antibody contained in the antiserum binds to the solid phase. Blood plasma can be used instead of sera and antisera.

Použitím způsobu provádění radioimunologických analýz podle vynálezu se podstatně zkracuje doba nutná k provedení analýzy. Analýza proteohormonů trvá 3 dny oproti 5 při dřívějším způsobu. Za předpokladu, že protilátka vázaná na pevnou fázi je připravena do zásoby, lze analýzu zahájit v pondělí a ukončit ve středu, kdy je zároveň zahájena další analýza, která je ukončena v pátek. Týdenní analyzované množství vzorků je dvojnásobné. Analýzu je možno zahájit rovněž v úterý. Zdvojnásobuje až ztrojnásobuje se tedy počet dní, kdy je možno analýzu zahájit. Snižuje se manipulační pracnost, k jedné analýze je nutno pipetovat třikrát, dříve pětkrát a míchat dvakrát, dříve třikrát. Celkový počet manipulací se snižuje z osmi na pět. Suspenzi lze pipetovat, což zachovává všechny přednosti tohoto způsobu dávkování.By using the method of performing the radioimmunoassays according to the invention, the time required for the analysis is substantially reduced. Proteohormone analysis takes 3 days versus 5 in the previous method. Assuming that the solid phase bound antibody is ready to stock, the assay can be started on Monday and completed on Wednesday, at the same time starting another assay that ends on Friday. The weekly amount of samples analyzed is doubled. The analysis can also be started on Tuesday. It doubles to triple the number of days to start the analysis. Handling is reduced, pipetting three times, previously five times and mixing twice, previously three times for one analysis. The total number of manipulations is reduced from eight to five. The suspension can be pipetted, maintaining all the advantages of this dosing method.

Vynález lze využít ke zkrácení a zjednodušení radioimunologických metod, zvláště ve zdravotnictví, farmakologii, zemědělství a dalších biologických vědách. Je možno jej uplatnit v komerčních kitech.The invention can be used to shorten and simplify radioimmunological methods, particularly in health care, pharmacology, agriculture and other biological sciences. It can be used in commercial kits.

Příklad 1Example 1

Radioimunologické stanovení růstového hormonu. První protilátka je králičí, druhá kozí. Reagencie jsou ředěny do fosfátového pufru, inkubace probíhají přibližně při teplotě 4 °C.Radioimmunological determination of growth hormone. The first antibody is rabbit, the second goat. Reagents are diluted into phosphate buffer, incubated at approximately 4 ° C.

Příprava suspenze precipitované protilátky:, v baňce je smíchán jeden díl kozího antiséra zředěného 8 krát, což odpovídá minimálně 95 % vazbě s jedním dílem séra králíka zředěného 100 krát. Směs je promíchána a inkubována 2 hodiny. Poté je přidán jeden díl králičího antiséra, obsahujícího protilátku vůči bovinnímu růstovému hormonu, zředěného 3000 krát. Toto zředění odpovídá 50 % vazbě. Směs je inkubována 12 hodin. Vzniklá suspenze je stabilní a lze ji připravit do zásoby na několik dnů. Před použitím při vlastní analýze nutno suspenzi promíchat.Preparation of the precipitated antibody suspension: One part of goat antiserum diluted 8 times, corresponding to at least 95% binding with one part of rabbit serum diluted 100 times, is mixed in the flask. The mixture is mixed and incubated for 2 hours. Then, one part of a rabbit antiserum containing antibody to bovine growth hormone diluted 3000-fold is added. This dilution corresponds to 50% binding. The mixture is incubated for 12 hours. The resulting suspension is stable and can be prepared for several days. The suspension should be mixed prior to use in the assay.

Vlastní radioimunoanalýza: do zkumavek se pipetuje 50 μΐ analyzované tekutiny, 100 ,ul suspenze precipitované protilátky, směs se promíchá a inkubuje přes noc. Poté se přidá 100 ,ul roztoku ¹²⁵I-bovinního růstového hormonu, směs se promíchá a inkubuje přes noc. Sediment se odstředí, kapalná fáze oddělí a po změření radioaktivity sedimentu gama spektrometrem, provede výpočet výsledků podle FELDMAN, H., RODBARD, D.: Mathematical theory of radioimmunoassay. In: Principles of competitive protein binding assays, Edt: ODELL, W. D., DAUGHADAY, W. H., str. 158—203, Lippincott, Philadelphia —Toronto, 1971.Self-immunoassay: Pipette 50 μΐ of the assay liquid, 100 µl of precipitated antibody suspension into the tubes, mix and incubate overnight. Then, 100 µl of ¹²⁵ I-bovine growth hormone solution is added, mixed and incubated overnight. The sediment is centrifuged, the liquid phase is separated and, after measuring the radioactivity of the sediment by a gamma spectrometer, calculating the results according to FELDMAN, H., RODBARD, D .: Mathematical theory of radioimmunoassay. In: Principles of Competitive Protein Binding Assays, Edt: ODELL, WD, DAUGHADAY, WH, pp. 158-203, Lippincott, Philadelphia — Toronto, 1971.

Příklad 2Example 2

Radioimunologické stanovení testosteronu. První protilátka jé králičí, druhá ovčí. Reagencie jsou ředěny do fosfátového pufru, inkubace probíhají přibližně při teplotě 4 °C.Radioimmunological determination of testosterone. The first antibody is rabbit, the second sheep. Reagents are diluted into phosphate buffer, incubated at approximately 4 ° C.

Příprava suspenze precipitované protilátky: v baňce je smíchán jeden díl ovčího antiséra zředěného 15 krát — toto zředění odpovídá minimálně 95 % vazbě — s jedním dílem plazmy králíka zředěné 100 krát. Směs je promíchána a inkubována 1 hodinu. Poté je přidán jeden díl králičího antiséra, obsahujícího protilátku vůči testosteronu, zředěného 8000 krát. Toto zředění odpovídá 50 % vazbě. Směs je inkubována přes noc při teplotě 4 °C a lze ji připravit do zásoby na několik dnů.Preparation of the precipitated antibody suspension: one part of sheep antiserum diluted 15-fold - this dilution corresponds to at least 95% binding - is mixed in one flask of rabbit plasma 100-fold. The mixture is mixed and incubated for 1 hour. One part of a rabbit antiserum containing testosterone antibody diluted 8000 times is then added. This dilution corresponds to 50% binding. The mixture is incubated overnight at 4 ° C and can be prepared for several days.

Vlastní radioimunoanalýza: do zkumavek se pipetuje 100 μ! analyzované tekutiny, 100 //1 suspenze precipitované protilátky a směs se promíchá a inkubuje 6 hodin. Poté se přidá 100 μΐ roztoku ³H-testostero.nu, směs se promíchá a inkubuje přes noc. Sediment se odstředí, radioaktivita kapalné fáze změří na kapalinovém scintilačním spektrometru a výpočet provede podle citace uvedené v příkladu 1.Self-radioimmunoassay: Pipette 100 μl into tubes! of the assay fluid, 100 µl of the precipitated antibody suspension, and the mixture is mixed and incubated for 6 hours. Then add 100 μΐ of ³ H-Testosterone solution, mix and incubate overnight. The sediment is centrifuged, the liquid phase radioactivity is measured on a liquid scintillation spectrometer, and the calculation is performed according to the reference given in Example 1.

Příklad 3Example 3

Radioimunologické stanovení humánního prolaktinu. První protilátka je králičí, druhá kozí. Reagencie jsou ředěny do fosfátového pufru, inkubace probíhají při teplotě přibližně 4 °C.Radioimmunological determination of human prolactin. The first antibody is rabbit, the second goat. Reagents are diluted into phosphate buffer, incubated at approximately 4 ° C.

Příprava suspenze precipitované protilátky: ve skleněné baňce je smíchán jeden díl kozí plazmy obsahující druhou protilátku zředěné 25 krát s jedním dílem séra králíka zředěného 100 krát. Zředění kozí plazmy odpovídá minimálně 95 % vazbě. Směs je promíchána a inkubována 3/4 hodiny. Poté je přidán jeden díl králičího antiséra, obsahujícího protilátku vůči humánnímu prolaktinu. Toto antisérum je zředěno 27 000 krát, což odpovídá 50 % vazbě. Směs je inkubována 16 hodin, vzniklá suspenze je stabilní a lze uchovávat několik dnů. Před upotřebením je nutno ji promíchat.Preparation of precipitated antibody suspension: one part of goat plasma containing the second antibody diluted 25 times with one part of rabbit serum diluted 100 times is mixed in a glass flask. The dilution of goat plasma corresponds to at least 95% binding. The mixture is mixed and incubated for 3/4 hours. One part of a rabbit antiserum containing an antibody to human prolactin is then added. This antiserum is diluted 27,000 times, which corresponds to 50% binding. The mixture is incubated for 16 hours, the resulting suspension is stable and can be stored for several days. It must be mixed before use.

Vlastní radioimunoanalýza: do zkumavek se pipetuje 20 μΐ analyzované tekutiny a 100 μΐ suspenze precipitované protilátky. Směs se promíchá a inkubuje přes noc. Poté se přidá 100 μΐ roztoku ¹²⁵I-humánního prolaktinu a po promíchání inkubuje přes noc. Sediment se odstředí, kapalná fáze oddělí a po změření radioaktivity sedimentu provede výpočet podle citace uvedené v příkladu 1.Self-immunoassay: Pipette 20 μΐ of the analyzed liquid and 100 μΐ of the precipitated antibody suspension into the tubes. Mix and incubate overnight. Then add 100 μΐ of ¹²⁵ I-human prolactin solution and incubate overnight after mixing. The sediment is centrifuged, the liquid phase is separated and, after the sediment radioactivity is measured, it is calculated according to the reference given in Example 1.

Změření radioaktivity a výpočet výsledných hodnot jsou běžné rutinní metody obecného charakteru.Measurement of radioactivity and calculation of the resulting values are common routine methods of a general nature.

Claims

A method for preparing a precipitated antibody for performing radioimmunoassays using a second antibody useful for the quantitative analysis of all substances to which an antibody can be prepared, characterized in that it is first a 1/4 to 6 hour precipitation reaction between the antiserum containing the second at 0 to 37 ° C, the macromolecule of the carrier suspension is precipitated in conditions of a 1 to 100-fold excess of antiserum than the amount required for 80% precipitations of serum, and is then prepared by adding the antiserum with the antibody at a temperature of 0 to 37 ° C by a reaction lasting at least 1/4 hour, on this carrier a micro-amount of precipitated solid phase bound antibody, the amount and dilution of the antiserum must be such that 0.1-100% of the antibody contained in the antiserum .

2. A method according to claim 1, wherein the precipitation reaction is carried out at 4 DEG C. for two hours.

3. The method of performing radioimmunoassays according to claim 1, wherein in preparing a micro-amount of precipitated solid phase bound antibody, the reaction is performed at 4 ° C and the amount and dilution of the antiserum must be such that 50% of the antibody binds to the solid phase. contained in the actress.

4. A method according to claim 1, wherein blood plasma is used instead of sera or antisera.