CS200258B1

CS200258B1 - Reagent for analytical determination of aldose saccharides

Info

Publication number: CS200258B1
Application number: CS600278A
Authority: CS
Inventors: Stanislav Turek
Original assignee: Stanislav Turek
Priority date: 1978-09-18
Filing date: 1978-09-18
Publication date: 1980-09-15

Description

Vynález se týká činidla pro analytické stanoveni aldosových sacharidů metodou, založenou na kondenzaci reakční zplodiny sacharidů při zahříváni v kyselém prostředí s aromatickým aminem nebo jeho derivátem, za vzniká zbarvení roztoku, přičemž intenzita zbarvení je úměrná kvantu stanoveného sacharidu.The present invention relates to an reagent for the analytical determination of aldose saccharides by a method based on the condensation of the reaction carbohydrate fumes when heated in an acidic medium with an aromatic amine or a derivative thereof to produce a solution color, the color intensity being proportional to the quantity of carbohydrate determined.

Ku přípravě činidel tohoto typu byly dosud použity různé aromatické aminy a jejich deriváty, jako anilin, p-bromanilin, o-toluidin, benzidin, difenylamin, 2-aminodifenyl, m-aminofenol, kyselina p-aminobenzoová a kyselina p-aminosalicylová. Reakce se provádí bud přímo zahříváním roztoku sacharidu s činidlem v kyselém prostředí, nejčastěji v roztoku kyseliny octové, nebo - u pentos - po převedení sacharidu na furfural, jeho oddělení destilací a smísením destilátu s činidlem.Various aromatic amines and derivatives thereof such as aniline, p-bromoaniline, o-toluidine, benzidine, diphenylamine, 2-aminodiphenyl, m-aminophenol, p-aminobenzoic acid and p-aminosalicylic acid have been used to prepare reagents of this type. The reaction is carried out either directly by heating the saccharide solution with the reagent in an acidic medium, most often in acetic acid solution, or - for pentos - after converting the saccharide to furfural, separating it by distillation and mixing the distillate with the reagent.

Nevýhodou dosud používaných činidel je citlivost aromatických aminoderivátů /v substanci i roztoku/ vůči vzdušné oxidaci, přičemž vznikají rušivá zbarveni. Z toho vyplývá vysoká náročnost na čistotu jednak samotných aromatických aminoderivátů, jednak i používaných rozpustidel a kyselin, zejména co do obsahu nečistot, katalyzujících oxidační změny. Proto jsou nutné v těchto případech dodatečné purufukace, jako redestilace a rekrystalizace používaných látek a ještě i přidáváni stabilizačních látek do reakčního roztoku. Některé z používaných aminů, jako o-toluidin, jsou těkavé, zapáchající a jejich používáni je rizikové po zdravotnické stránce.A disadvantage of the reagents used hitherto is the sensitivity of the aromatic amino derivatives (both in the substance and in the solution) to air oxidation, with the resultant disturbing coloration. This results in a high purity of the aromatic amino derivatives themselves, as well as of the solvents and acids used, in particular as regards the content of impurities catalysing oxidative changes. Therefore, additional purufuctions, such as redistillation and recrystallization of the substances used, as well as the addition of stabilizing agents to the reaction solution, are necessary in these cases. Some of the amines used, such as o-toluidine, are volatile, odorous, and their use is hazardous to health.

200 258200 258

200 2S0200 2S0

Orto-toluidin je potenciálně kancerogenní. Intenzita zbarveni u reakce s o-toluidinem poměr ně rychle slábne, takže fotometrické měřeni je nutno provést během 30 min po provedení reakce.Ortho-toluidine is potentially carcinogenic. The color intensity of the reaction with o-toluidine fades relatively rapidly so that photometric measurements must be made within 30 min after the reaction.

Uvedené nedostatky odstraňuje činidle podle vynálezu, jehož podstata je v tom, že jako aktivní látku obsahuje etylester kyseliny para-aminóbenzoové v množství 2 až 8 % hmot., , který při kondenzaci s reakčnlmi produkty aldosových sacharidů dává vznik intenzivnímu, žlutooranžovému zbarveni roztoku. Tato reakce probíhá při zahříváni v roztoku kyseliny octové nebo i v roztoku organických kyselin v organickém rozpustidle. Intenzita zbarvení roztoku je při použiti etylesteru kyseliny para-aminobenzoové lineárně úměrná koncentraci *The above-mentioned drawbacks are eliminated by the agent according to the invention, characterized in that it contains, as active substance, ethyl ester of para-aminobenzoic acid in an amount of 2 to 8% by weight, which gives condensation with reaction products of aldose saccharides. This reaction proceeds with heating in a solution of acetic acid or even in a solution of organic acids in an organic solvent. The color intensity of the solution is linearly proportional to the concentration when using para-aminobenzoate.

sacharidu v rozmetl, vhodném pro ultramikroanalytické fotometrické měření a citlivost této barevné reakce je vyěěí, nežli při použití o«toluidinu i anilinu. Intenzita zbarveni - na rozdíl od použití o-toluidinu - neklesá ani během 24 hod. Etylestsr kyseliny para-aminobenzoové je látkou v substanci i v roztoku stabilnější vůči vzdušné oxidaci nežli dosud používané aromatické aminoderiváty.a je možné jej používat již v čistotě, která odpovídá požadavkům československého lékopisu 2, aniž by vznikala rušivá zbarveni roztoku. Ku přípravě reakčních roztoků je možno použít kyselinu octovou koncentrovanou v čistotě, odpovídající československému lékopisu 3. K reakčním roztokům etylesteru kyseliny para-aminobenzoové není nutno přidávat látky inhibujlcl oxidaci. Tyto reakčni roztoky je možno uchovávat při pokojové teplotě. Obchodní cena etylesteru kyseliny para-aminobenzoové je nižší, nežli kyseliny para-aminobenzoové vyhovující čistoty. Vlastnosti etylesteru kyseliny para-aminibenzoové jsou dobře známy, jelikož je tato sloučenina již nakolik desetiletí používána ▼ lékařství a farmacii.of a carbohydrate in a pulverizer suitable for ultramicroanalytical photometric measurement and the sensitivity of this color reaction is higher than with both toluidine and aniline. Color intensity - unlike the use of o-toluidine - does not decrease within 24 hours. Ethyl ester of para-aminobenzoic acid is a substance in substance and in solution more stable to air oxidation than previously used aromatic amino derivatives and can be used already in the purity corresponding to requirements of the Czechoslovak Pharmacopoeia 2, without causing disturbing coloring of the solution. Acetic acid concentrated in purity corresponding to Czechoslovak Pharmacopoeia 3 can be used for the preparation of the reaction solutions. It is not necessary to add oxidation inhibiting substances to the reaction solutions of para-aminobenzoic acid ethyl ester. These reaction solutions can be stored at room temperature. The commercial price of para-aminobenzoic acid ethyl ester is lower than para-aminobenzoic acid of satisfactory purity. The properties of para-aminibenzoic acid ethyl ester are well known since it has been used for decades in medicine and pharmacy.

Činidla pro analytické stanoveni sacharidů s použitím etylesteru kyseliny para-aminobenzoové se připraví rozpuštěním této sloučeniny buá v kyselině octové nebo ve směsi kyseliny octové s organickým rozpustidlem neutrální povahy, jako například etylenglykolmonoetyléterem. Je možno připravit i činidlo bez kyseliny octové, a to rozpuštěním etylesteru kyseliny para-aminobenzoové v organickém rozpustidle, obsahujícím rozpuštěnou organickou hydroxykyselinu, jako kyselinu citrónovou nebo glykolovou nebo mléčnou nebo jablečnou.Carbohydrate analytical reagents using para-aminobenzoate are prepared by dissolving the compound either in acetic acid or in a mixture of acetic acid with a neutral organic solvent such as ethylene glycol monoethyl ether. An acetic acid-free agent can also be prepared by dissolving para-aminobenzoic acid ethyl ester in an organic solvent containing a dissolved organic hydroxy acid such as citric or glycolic acid or lactic or malic acid.

Bylo zjištěno, že pro dosaženi maximální intenzity zbarvení roztoku při reakci s aldosovými sacharidy má být koncentrace etylesteru kyseliny para-aminobenzoové v použitém činidle nejméně 5 % (vyjádřeno ve hmotnostních dílech této látky ve 100 objemových dílech roztoku/.It has been found that in order to achieve the maximum color intensity of the solution when reacting with aldose carbohydrates, the concentration of para-aminobenzoic acid ethyl ester in the reagent used should be at least 5% (expressed in parts by weight of the substance in 100 parts by volume of solution).

Příklad 1 g etylesteru kyseliny para-aminóbenzoové čistoty podle československého lékopisu 2 (synonymum Benzocainum) se rozpustí v kyselině octové koncentrace 98 % a čistoty pro analysy, roztok se doplní do 1 litru a po promíchání se zfiltruje skelným filtrem. Místo kyseliny octové 99 % p.a. je možno použít i kys linu octovou koncentrovanou čistoty podle č skoslovenského lékopisu 3.Example 1 g of para-aminobenzoic acid ethyl ester of purity according to Czechoslovak Pharmacopoeia 2 (synonymous Benzocainum) is dissolved in acetic acid at a concentration of 98% and purity for analysis, made up to 1 liter and after mixing is filtered through a glass filter. Instead of acetic acid 99% p.a. it is also possible to use acetic acid of concentrated purity according to the Slovak Pharmacopoeia 3.

200 2S8200 2S8

Příklad 2Example 2

Postupuje so jako v příkladu 1, ale část kyseliny octové se nahradí neutrálním organickým rozpustidlem, jako etylenglykolmonometyléterem. Při obsahu do 30 objemových procent etylenglykolmonometyléteru je citlivost reakce stejná, jako v samotné kyselině octové, se stoupající koncentrací etylenglykolmonometyléteru citlivost reakce klesá. Při obsahu 50 % etylenglykolmonometyléteru je věak intenzita barevné reakce vyěěi než činí polovina absormance s Činidlem v koncentrované 'kyselině octové.The procedure is as in Example 1, but part of the acetic acid is replaced with a neutral organic solvent such as ethylene glycol monomethyl ether. With an ethylene glycol monomethyl ether content of up to 30% by volume, the reaction sensitivity is the same as in acetic acid alone, with increasing ethylene glycol monomethyl ether concentration the sensitivity of the reaction decreases. However, at a content of 50% ethylene glycol monomethyl ether, the intensity of the color reaction is greater than half of the reagent absent in concentrated acetic acid.

Přiklad 3Example 3

300 g etylesteru kyseliny para-aminobenzoové čistoty podle če koslovenského lékopisu 2 se rozpustí v 600 mililitrech čistého etylenglykolmonometyléteru a roztok se zfiltruje skelným filtrem. Tento trvanlivý roztok slouží s výhodou k přípravě reakčních roztoků v kyselině octově, které pak není nutno již filtrovat. Například 150 mililitrů výěe uvedeného roztoku etylesteru kyseliny para-aminobenzoové v etylenglykolmonometyléteru se doplní za promícháni kyselinou octovou čistoty podle československého lékopisu 3 na objem 1 litru,čímž je připraveno činidlo k použití.300 g of para-aminobenzoic acid ethyl ester of purity according to Czechoslovak Pharmacopoeia 2 are dissolved in 600 ml of pure ethylene glycol monomethyl ether and the solution is filtered through a glass filter. This durable solution is preferably used to prepare the reaction solutions in acetic acid, which then does not need to be filtered. For example, 150 ml of the above-mentioned solution of para-aminobenzoic acid ethyl ester in ethylene glycol monomethyl ether is made up to 1 liter with mixing with acetic acid of purity according to Czechoslovak Pharmacopoeia 3 to prepare the reagent for use.

Příklad 4Example 4

V tomto přikladu se popisuje příprava činidla bez obsahu kyseliny octové : V čistém etylenglykolmonometyléteru se rozpustí etylester kyseliny para-aminobenzoové čistoty podle československého lékopisu 2 a kyselina citrónová čistoty p.a tak, aby výsledná koncentrace (v hmotnostních dílech na celkový objem roztoku), byla 6 % u etylesteru kyseliny para-aminobenzoové a 25 % u kyseliny citrónové. Místo kyseliny citrónové nebo jeji části lze použít i kyselinu glykolovou nebo kyselinu mléčnou nebo kyselinu jablečnou. Část etylenglykolmonometyléteru je možno nahradit některým nižěím alifatickým alkoholem (např. metylalkoholem) ke snížení viskozity roztoku.This example describes the preparation of an acetic acid-free reagent: Dissolve ethyl-aminobenzoic acid ethyl ester of the purity according to Czechoslovak Pharmacopoeia 2 and citric acid of the purity pa so that the final concentration (in parts by weight of the total solution volume) is dissolved in pure ethylene glycol monomethyl ether. for ethyl para-aminobenzoate and 25% for citric acid. Glycolic acid or lactic acid or malic acid may also be used in place of citric acid or a portion thereof. Some of the ethylene glycol monomethyl ether may be replaced with some lower aliphatic alcohol (e.g., methanol) to reduce the viscosity of the solution.

Aldosovó sacharidy je možno stanovit činidly, obsahujícími etylester kyseliny para-aminobenzoové tak, že 1 objemový díl roztoku sacharidu se zahřívá s 8 až 15 objemovými díly činidla po dobu 15 až 45 min ve vrouci vodní lázni. Vzniklé zbarvení roztoku se měří spektrofotometricky. Takto je možno stanovit aldosové sacharidy již v koncentracích řádově 10 mg na 1 litr roztoku při měřeni ve viditelné části spektra - např. při 420 nm, při měření v ultrafialové části spektra - a to při 340 až 350 nm - i v nižších koncentracích.Aldose saccharides can be determined by reagents containing para-aminobenzoic acid ethyl ester by heating 1 part by volume of the saccharide solution with 8 to 15 parts by volume of the reagent for 15 to 45 minutes in a boiling water bath. The resulting color of the solution is measured spectrophotometrically. Thus, aldose saccharides can be detected at concentrations of the order of 10 mg per liter of solution when measured in the visible part of the spectrum - e.g. at 420 nm, in the ultraviolet part - at 340 to 350 nm - even at lower concentrations.

Přitom ketosové sacharidy dávají neměřitelné zbarvení.The ketose carbohydrates give a non-measurable color.

Přiklad 5Example 5

V tomto odstavci je uveden příklad stanovení tzv. krevního cukru. 0,05 mililitru krve se smísí s 0,50 mililitru 5 % roztoku kyseliny trichloroctové a vysrážené bílkovony se odstředí. Oo vysoké zkumavky se odměří 0,20 mililitru čirého supernatantu a přidá se 2,0 mililitru činidla, obsahujícího etylester kyseliny para-aminobenzoové, připraveného podle příkladu 1 nebo 2 nebo 3. Zkumavka se zahřívá 15 min ve vroucí lázni vodni. Stejným způsobem se zpracuje slepá zkouěka a standardní rofctok, například roztok obsahující 5 milimolů glukosy v 1 litru. Po ochlazeni obsahu zkumavek na 20 °C se intenzita zbarveni roztokuThis paragraph gives an example of the determination of so-called blood sugar. 0.05 ml of blood is mixed with 0.50 ml of 5% trichloroacetic acid solution and the precipitated proteins are centrifuged. Measure 0.20 ml of the clear supernatant into a tall tube and add 2.0 ml of the reagent containing para-aminobenzoic acid ethyl ester prepared according to Example 1 or 2 or 3. Heat the tube in a boiling water bath for 15 min. In the same manner, a blank test and a standard rofctok, for example a solution containing 5 millimoles of glucose per liter, are processed. After cooling the contents of the tubes to 20 ° C, the intensity of coloring of the solution

200 290 měří spektrofofeemetricky při 420 nm vlnové délky v kyvetách šířky vrstvy 1 cm. Stabilita zbarvení roztoku je podstatně vyšší, nežli při použití orto-toluidinového činidla. Fotometrické měření je možno provést i po několika hodinách po reakci. Výpočet koncentrace se provede známým způsobem.200,290 measured spectrophotometrically at 420 nm wavelength in cuvettes of 1 cm layer width. The color stability of the solution is significantly higher than that of the ortho-toluidine reagent. Photometric measurements can be made several hours after the reaction. The concentration calculation is carried out in a known manner.

Příklad βExample β

V tomto odstavci je uveden příklad stanovení tzv krevního cukru s použitím činidla, obsahujícího etylester kyseliny para-aminobenzoové, připraveného podle příkladu 4-činidlo bez kyseliny octové. Deproteinace krve se provede stejně jako v příkladu 5. Do reakce se odměří 0,25 mililitru deproteinátu a přidá se 2,0 mililitru činidla, připraveného podle příkladu 4. Zkumavka s roztokem se zahřívá] 30 min ve vroucí vodní lázni. Dále se postupuje stejně, jako v příkladu 5.This paragraph gives an example of the determination of so-called blood sugar using a reagent comprising para-aminobenzoic acid ethyl ester, prepared according to Example 4, without acetic acid. Blood deproteinization was performed as in Example 5. 0.25 ml of deproteinate was measured into the reaction and 2.0 ml of the reagent prepared according to Example 4 was added. The solution tube was heated in a boiling water bath for 30 min. The procedure was as in Example 5.

Při stanovení péntosových aldos a pentosanů v biologickém materiálu je možno tyto sacharidy převést na furfural, tento oddělit destilací a stanovit barevnou reakcí po smíšení s činidlem, obsahujícím etylester kyseliny para-aminobenzoové. K měření je možno použít spektrofotometrického maxima v ultrafialové oblasti při 340 nm nebo maxima při 500 nm v prostředí kyseliny octové.In the determination of pentose aldoses and pentosanes in a biological material, these saccharides can be converted to furfural, separated by distillation, and determined by color reaction after mixing with a reagent containing para-aminobenzoic acid ethyl ester. A spectrophotometric maximum in the ultraviolet range at 340 nm or a maximum at 500 nm in acetic acid medium can be used for measurement.

Při analýze roztoku směsí aldohexos a aldopentos činidlem etylesteru kyseliny para-aminobenzoové v kyselině octové je možno fotometrickým měřením při 2 vlnových délkách světla, a to 42 a 500 nm, stanovit poněr hexos a pentos v roztoku.When analyzing a solution of the aldohexos and aldopentos mixtures with para-aminobenzoic acid ethyl ester in acetic acid, the hexos and pentos in the solution can be determined by photometric measurement at 2 wavelengths of light at 42 and 500 nm.

Činidel s etylesterem kyseliny para-aminobenzoové je možno použít v tenkovrstevnó chromatografií k detekci rozdělených aldosových sacharidů*Reagents with para-aminobenzoic acid ethyl ester can be used in thin-layer chromatography to detect resolved aldose carbohydrates *

Činidlo obsahující jako účinnou látku etylester kyseliny para-aminobenzoové je možno použít v klinické chemii, biochemii, farmacii, kvasné chemii, potravinářské chemii, například k analýze sacharidů v obili, ovoci a zelenině a v chemii dřeva a celulózy. Výhodou použití etylesteru kyseliny para-aminobenzoové je to,že jde o látku průmyslově vyráběnou k hojnému použití v.e farmacii, lékařství, a to v dostatečné čistotě.The agent containing para-aminobenzoic acid ethyl ester as the active ingredient can be used in clinical chemistry, biochemistry, pharmacy, fermentation chemistry, food chemistry, for example, for analysis of carbohydrates in grain, fruit and vegetables, and in wood and cellulose chemistry. The advantage of using para-aminobenzoic acid ethyl ester is that it is a substance manufactured industrially for abundant use in pharmacy, medicine, in sufficient purity.

Claims

Reagent for the analytical determination of aldose saccharides, containing the active substance and an acidic solvent, for example acetic acid or a mixture of acetic acid and ethylene glycol monomethyl ether or a solution of citric acid in ethylene glycol monomethyl ether, characterized in that

Printed by Moravian Printing Works,