CS200258B1 - Činidlo pro analytické stanoveni aldosových sacharidů - Google Patents

Description

Vynález se týká činidla pro analytické stanoveni aldosových sacharidů metodou, založenou na kondenzaci reakční zplodiny sacharidů při zahříváni v kyselém prostředí s aromatickým aminem nebo jeho derivátem, za vzniká zbarvení roztoku, přičemž intenzita zbarvení je úměrná kvantu stanoveného sacharidu.

Ku přípravě činidel tohoto typu byly dosud použity různé aromatické aminy a jejich deriváty, jako anilin, p-bromanilin, o-toluidin, benzidin, difenylamin, 2-aminodifenyl, m-aminofenol, kyselina p-aminobenzoová a kyselina p-aminosalicylová. Reakce se provádí bud přímo zahříváním roztoku sacharidu s činidlem v kyselém prostředí, nejčastěji v roztoku kyseliny octové, nebo - u pentos - po převedení sacharidu na furfural, jeho oddělení destilací a smísením destilátu s činidlem.

Nevýhodou dosud používaných činidel je citlivost aromatických aminoderivátů /v substanci i roztoku/ vůči vzdušné oxidaci, přičemž vznikají rušivá zbarveni. Z toho vyplývá vysoká náročnost na čistotu jednak samotných aromatických aminoderivátů, jednak i používaných rozpustidel a kyselin, zejména co do obsahu nečistot, katalyzujících oxidační změny. Proto jsou nutné v těchto případech dodatečné purufukace, jako redestilace a rekrystalizace používaných látek a ještě i přidáváni stabilizačních látek do reakčního roztoku. Některé z používaných aminů, jako o-toluidin, jsou těkavé, zapáchající a jejich používáni je rizikové po zdravotnické stránce.

200 258

200 2S0

Orto-toluidin je potenciálně kancerogenní. Intenzita zbarveni u reakce s o-toluidinem poměr ně rychle slábne, takže fotometrické měřeni je nutno provést během 30 min po provedení reakce.

Uvedené nedostatky odstraňuje činidle podle vynálezu, jehož podstata je v tom, že jako aktivní látku obsahuje etylester kyseliny para-aminóbenzoové v množství 2 až 8 % hmot., , který při kondenzaci s reakčnlmi produkty aldosových sacharidů dává vznik intenzivnímu, žlutooranžovému zbarveni roztoku. Tato reakce probíhá při zahříváni v roztoku kyseliny octové nebo i v roztoku organických kyselin v organickém rozpustidle. Intenzita zbarvení roztoku je při použiti etylesteru kyseliny para-aminobenzoové lineárně úměrná koncentraci *

sacharidu v rozmetl, vhodném pro ultramikroanalytické fotometrické měření a citlivost této barevné reakce je vyěěí, nežli při použití o«toluidinu i anilinu. Intenzita zbarveni - na rozdíl od použití o-toluidinu - neklesá ani během 24 hod. Etylestsr kyseliny para-aminobenzoové je látkou v substanci i v roztoku stabilnější vůči vzdušné oxidaci nežli dosud používané aromatické aminoderiváty.a je možné jej používat již v čistotě, která odpovídá požadavkům československého lékopisu 2, aniž by vznikala rušivá zbarveni roztoku. Ku přípravě reakčních roztoků je možno použít kyselinu octovou koncentrovanou v čistotě, odpovídající československému lékopisu 3. K reakčním roztokům etylesteru kyseliny para-aminobenzoové není nutno přidávat látky inhibujlcl oxidaci. Tyto reakčni roztoky je možno uchovávat při pokojové teplotě. Obchodní cena etylesteru kyseliny para-aminobenzoové je nižší, nežli kyseliny para-aminobenzoové vyhovující čistoty. Vlastnosti etylesteru kyseliny para-aminibenzoové jsou dobře známy, jelikož je tato sloučenina již nakolik desetiletí používána ▼ lékařství a farmacii.

Činidla pro analytické stanoveni sacharidů s použitím etylesteru kyseliny para-aminobenzoové se připraví rozpuštěním této sloučeniny buá v kyselině octové nebo ve směsi kyseliny octové s organickým rozpustidlem neutrální povahy, jako například etylenglykolmonoetyléterem. Je možno připravit i činidlo bez kyseliny octové, a to rozpuštěním etylesteru kyseliny para-aminobenzoové v organickém rozpustidle, obsahujícím rozpuštěnou organickou hydroxykyselinu, jako kyselinu citrónovou nebo glykolovou nebo mléčnou nebo jablečnou.

Bylo zjištěno, že pro dosaženi maximální intenzity zbarvení roztoku při reakci s aldosovými sacharidy má být koncentrace etylesteru kyseliny para-aminobenzoové v použitém činidle nejméně 5 % (vyjádřeno ve hmotnostních dílech této látky ve 100 objemových dílech roztoku/.

Příklad 1 g etylesteru kyseliny para-aminóbenzoové čistoty podle československého lékopisu 2 (synonymum Benzocainum) se rozpustí v kyselině octové koncentrace 98 % a čistoty pro analysy, roztok se doplní do 1 litru a po promíchání se zfiltruje skelným filtrem. Místo kyseliny octové 99 % p.a. je možno použít i kys linu octovou koncentrovanou čistoty podle č skoslovenského lékopisu 3.

200 2S8

Příklad 2

Postupuje so jako v příkladu 1, ale část kyseliny octové se nahradí neutrálním organickým rozpustidlem, jako etylenglykolmonometyléterem. Při obsahu do 30 objemových procent etylenglykolmonometyléteru je citlivost reakce stejná, jako v samotné kyselině octové, se stoupající koncentrací etylenglykolmonometyléteru citlivost reakce klesá. Při obsahu 50 % etylenglykolmonometyléteru je věak intenzita barevné reakce vyěěi než činí polovina absormance s Činidlem v koncentrované 'kyselině octové.

Přiklad 3

300 g etylesteru kyseliny para-aminobenzoové čistoty podle če koslovenského lékopisu 2 se rozpustí v 600 mililitrech čistého etylenglykolmonometyléteru a roztok se zfiltruje skelným filtrem. Tento trvanlivý roztok slouží s výhodou k přípravě reakčních roztoků v kyselině octově, které pak není nutno již filtrovat. Například 150 mililitrů výěe uvedeného roztoku etylesteru kyseliny para-aminobenzoové v etylenglykolmonometyléteru se doplní za promícháni kyselinou octovou čistoty podle československého lékopisu 3 na objem 1 litru,čímž je připraveno činidlo k použití.

Příklad 4

V tomto přikladu se popisuje příprava činidla bez obsahu kyseliny octové : V čistém etylenglykolmonometyléteru se rozpustí etylester kyseliny para-aminobenzoové čistoty podle československého lékopisu 2 a kyselina citrónová čistoty p.a tak, aby výsledná koncentrace (v hmotnostních dílech na celkový objem roztoku), byla 6 % u etylesteru kyseliny para-aminobenzoové a 25 % u kyseliny citrónové. Místo kyseliny citrónové nebo jeji části lze použít i kyselinu glykolovou nebo kyselinu mléčnou nebo kyselinu jablečnou. Část etylenglykolmonometyléteru je možno nahradit některým nižěím alifatickým alkoholem (např. metylalkoholem) ke snížení viskozity roztoku.

Aldosovó sacharidy je možno stanovit činidly, obsahujícími etylester kyseliny para-aminobenzoové tak, že 1 objemový díl roztoku sacharidu se zahřívá s 8 až 15 objemovými díly činidla po dobu 15 až 45 min ve vrouci vodní lázni. Vzniklé zbarvení roztoku se měří spektrofotometricky. Takto je možno stanovit aldosové sacharidy již v koncentracích řádově 10 mg na 1 litr roztoku při měřeni ve viditelné části spektra - např. při 420 nm, při měření v ultrafialové části spektra - a to při 340 až 350 nm - i v nižších koncentracích.

Přitom ketosové sacharidy dávají neměřitelné zbarvení.

Přiklad 5

V tomto odstavci je uveden příklad stanovení tzv. krevního cukru. 0,05 mililitru krve se smísí s 0,50 mililitru 5 % roztoku kyseliny trichloroctové a vysrážené bílkovony se odstředí. Oo vysoké zkumavky se odměří 0,20 mililitru čirého supernatantu a přidá se 2,0 mililitru činidla, obsahujícího etylester kyseliny para-aminobenzoové, připraveného podle příkladu 1 nebo 2 nebo 3. Zkumavka se zahřívá 15 min ve vroucí lázni vodni. Stejným způsobem se zpracuje slepá zkouěka a standardní rofctok, například roztok obsahující 5 milimolů glukosy v 1 litru. Po ochlazeni obsahu zkumavek na 20 °C se intenzita zbarveni roztoku

200 290 měří spektrofofeemetricky při 420 nm vlnové délky v kyvetách šířky vrstvy 1 cm. Stabilita zbarvení roztoku je podstatně vyšší, nežli při použití orto-toluidinového činidla. Fotometrické měření je možno provést i po několika hodinách po reakci. Výpočet koncentrace se provede známým způsobem.

Příklad β

V tomto odstavci je uveden příklad stanovení tzv krevního cukru s použitím činidla, obsahujícího etylester kyseliny para-aminobenzoové, připraveného podle příkladu 4-činidlo bez kyseliny octové. Deproteinace krve se provede stejně jako v příkladu 5. Do reakce se odměří 0,25 mililitru deproteinátu a přidá se 2,0 mililitru činidla, připraveného podle příkladu 4. Zkumavka s roztokem se zahřívá] 30 min ve vroucí vodní lázni. Dále se postupuje stejně, jako v příkladu 5.

Při stanovení péntosových aldos a pentosanů v biologickém materiálu je možno tyto sacharidy převést na furfural, tento oddělit destilací a stanovit barevnou reakcí po smíšení s činidlem, obsahujícím etylester kyseliny para-aminobenzoové. K měření je možno použít spektrofotometrického maxima v ultrafialové oblasti při 340 nm nebo maxima při 500 nm v prostředí kyseliny octové.

Při analýze roztoku směsí aldohexos a aldopentos činidlem etylesteru kyseliny para-aminobenzoové v kyselině octové je možno fotometrickým měřením při 2 vlnových délkách světla, a to 42 a 500 nm, stanovit poněr hexos a pentos v roztoku.

Činidel s etylesterem kyseliny para-aminobenzoové je možno použít v tenkovrstevnó chromatografií k detekci rozdělených aldosových sacharidů*

Činidlo obsahující jako účinnou látku etylester kyseliny para-aminobenzoové je možno použít v klinické chemii, biochemii, farmacii, kvasné chemii, potravinářské chemii, například k analýze sacharidů v obili, ovoci a zelenině a v chemii dřeva a celulózy. Výhodou použití etylesteru kyseliny para-aminobenzoové je to,že jde o látku průmyslově vyráběnou k hojnému použití v.e farmacii, lékařství, a to v dostatečné čistotě.

Claims (1)

1. Činidlo pro analytické stanovení aldosových sacharidů, obsahující aktivní látku a kyselé rozpustidlo, například kyselinu octovou nebo směs kyseliny octové a etylenglykolmonometyléteru nebo roztok kyseliny citrónové v etylenglykolmonometyléteru, vyznačené tím, že jako aktivní látku obsahuje etylester kyseliny para-aminobenzoové v množství 2 až 8 % hmot

   Vytiskly Moravské tiskařské závody,