BRPI0904246A2 - Extractive-analytical method for determination of tannins in plant inputs and / or products - Google Patents

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Rachel Oliveira Castilho
André Márcio Do Nascimento
Cristina Duarte Vianna Soares
Priscila Tavares Guedes
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Univ Minas Gerais
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Abstract

Método extrativo-analítico para determinação de taninos em insumos e/ou produtos vegetais. A presente invenção diz respeito a um método extrativo-analítico para determinação de taninos em insumos e/ou produtos vegetais. Em seu aspecto mais geral, se refere a determinação analítica de taninos a partir de uma etapa de pré-purificação direcionada para a análise de monômeros, independente da quantidade de fenóis totais. A invenção proporciona melhoramento do perfil cromatográfico, possibilitando a separação e a quantificação de taninos em insumos e produtos vegetais em escala analítica e preparativa.Extractive-analytical method for determination of tannins in inputs and / or plant products. The present invention relates to an extractive-analytical method for the determination of tannins in inputs and / or plant products. In its most general aspect, it refers to the analytical determination of tannins from a pre-purification step directed to the monomer analysis, independent of the amount of total phenols. The invention provides improvement of the chromatographic profile, enabling the separation and quantification of tannins in inputs and plant products on an analytical and preparative scale.

Description

MÉTODO EXTRATIVO-ANALÍTICO PARA DETERMINAÇÃO DE TANINOS EM INSUMOS E PRODUTOS VEGETAISEXTRACTIVE-ANALYTICAL METHOD FOR DETERMINING TANINS IN VEGETABLE PRODUCTS AND PRODUCTS

Campo da Invenção A presente invenção diz respeito a um método extrativo-analítico para determinação de taninos em insumos e produtos vegetais. Em seu aspecto mais geral, se refere a determinação analítica de taninos a partir de uma etapa de pré-purificação direcionada para a análise de monômeros, independente da quantidade de fenóis totais. A invenção proporciona melhoramento do perfil cromatográfico, possibilitando a separação e a quantificação de taninos em insumos e produtos vegetais em escala analítica e preparativa.Field of the Invention The present invention relates to an extractive-analytical method for the determination of tannins in inputs and plant products. In its most general aspect, it refers to the analytical determination of tannins from a pre-purification step directed to the monomer analysis, independent of the amount of total phenols. The invention provides improvement of the chromatographic profile, enabling the separation and quantification of tannins in inputs and plant products on an analytical and preparative scale.

Antecedentes da Invenção Métodos analíticos para determinação de taninos condensados Diversos métodos analíticos podem ser usados para a determinação de taninos condensados. A quantificação é um processo delicado tendo em vista que a extração é difícil de ser alcançada e nem todos os métodos baseados nas características fenólicas destes compostos são específicos (BRUNETON, J. Tannins. In: BRUNETON, J. Pharmacognosy, Phytochemistry, Medicinal Plants. 2. Ed. Paris: Lavoisier Publishing Inc., 1999. Cap. Tannins., 369-403). Essas dificuldades são devido à diversidade estrutural e às propriedades físico-química encontradas nesta classe de substâncias. Vários métodos analíticos têm sido usados para quantificar os taninos em drogas vegetais (SCHOFIELD, P ; MBUGUA, D. M.; PELL, A. N. Analysis of condensed tannins: a review. Animal Feed Science and Technology, v.91, p.21-40, 2001.): a) Métodos que incluem despolimerização oxidativa, como o doseamento com butanol-ácido o qual promove uma reação colorimétrica em que, o tanino condensado se fragmenta formando uma antocianidina de cor vermelha que pode ser determinada por espectrofotometria na região do visível; b) Métodos com reações do anel A com um aldeído aromático, como o doseamento com vanilina que forma um complexo colorido com os taninos condensados, os quais também podem ser quantificados por espectrofotometria na região do visível. Um método por injeção de fluxo, utilizando-se vanilina como reagente, foi proposto para determinação de taninos condensados (FERREIRA, E. C.; NOGUEIRA, A. R. A. Vanillin-condensed tannin study using flow injection spectrophotometry. Talanta, v.51, p. 1-6, 2000); c) Métodos colorimétricos para fenólicos totais, tais como os doseamentos com azul da Prússia, com reagente de Folin-Denis ou com reagente de Folin-Ciocalteu. Estes métodos são baseados em reações de oxi-redução com formação de complexo colorido com máximo de absorção na região do visível. Infante e colaboradores propuseram um sistema de injeção de fluxo para determinação de taninos totais baseado na reação com o reagente de Folin-Denis (INFANTE, C. M. C.; SOARES, V. R. B.; KORN, M.; ROCHA, F. R. P. An improved flow-based procedure for microdetermination of total tannins in beverages with minimized reagent consumption. Microchimica Acta, v.161, p.279—283, 2008); d) Métodos que envolvem reações de divagem ácida, incluindo tiólise e degradação por floroglicinol. Nestas reações, a unidade final da cadeia polimérica dos taninos condensados é liberada permitindo-se determinar a composição e o tamanho do polímero de tanino condensado; e) Métodos gravimétricos utilizando-se sal de itérbio (Yb+3) ou polivinilpirrolidona (PVP) como reagentes; f) Métodos baseados na inibição da atividade enzimática de diversas enzimas; g) Métodos que envolvem precipitação com proteínas, tais como a albumina bovina sérica, ou com polietilenoglicol 4000 (PEG 4000), substâncias que formam complexos insolúveis com os taninos condensados; h) Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) tanto de fase normal quanto de fase reversa; i) Métodos por inibição do crescimento microbiano, em que se avalia o impacto da presença dos taninos no crescimento microbiano ou a formação de ligação entre os taninos com as bactérias de forma similar aos doseamentos por precipitação com proteína, citados previamente.Background of the Invention Analytical Methods for Determination of Condensed Tannins Several analytical methods can be used for the determination of condensed tannins. Quantification is a delicate process since extraction is difficult to achieve and not all methods based on the phenolic characteristics of these compounds are specific (BRUNETON, J. Tannins. In: BRUNETON, J. Pharmacognosy, Phytochemistry, Medicinal Plants. 2. Ed. Paris: Lavoisier Publishing Inc., 1999. Ch. Tannins., 369-403). These difficulties are due to the structural diversity and physicochemical properties found in this class of substances. Several analytical methods have been used to quantify tannins in plant drugs (SCHOFIELD, P; MBUGUA, DM; PELL, AN) Analysis of Condensed Tannins: A Review Animal Feed Science and Technology, v.91, p.21-40, 2001 .): (a) Methods including oxidative depolymerisation such as butanol-acid assay which promotes a colorimetric reaction whereby the condensed tannin breaks down to form a red anthocyanidin which can be determined by spectrophotometry in the visible region; b) Methods with ring A reactions with an aromatic aldehyde, such as vanillin assay that forms a colored complex with condensed tannins, which can also be quantified by visible spectrophotometry. A flow injection method using vanillin as a reagent has been proposed for the determination of condensed tannins (FERREIRA, EC; NOGUEIRA, ARA Vanillin-condensed tannin study using flow injection spectrophotometry. Talanta, v.51, p. 1-6 2000); c) Colorimetric methods for total phenolics, such as Prussian blue, Folin-Denis reagent or Folin-Ciocalteu reagent assays. These methods are based on oxy-reduction reactions with color complex formation with maximum absorption in the visible region. Infante and colleagues proposed a flux injection system for determination of total tannins based on the reaction with Folin-Denis reagent (INFANTE, CMC; SOARES, VRB; KORN, M .; ROCHA, FRP. An improved flow-based procedure for microdetermination. of total tannins in beverages with minimized reagent consumption (Microchimica Acta, v.161, p.279-283, 2008); (d) Methods involving acid diving reactions, including thiolysis and floroglycinol degradation. In these reactions, the final unit of the condensed tannin polymer chain is released allowing the composition and size of the condensed tannin polymer to be determined; e) Gravimetric methods using ytterbium salt (Yb + 3) or polyvinylpyrrolidone (PVP) as reagents; f) Methods based on inhibition of enzymatic activity of several enzymes; (g) methods involving precipitation with proteins such as serum bovine albumin or polyethylene glycol 4000 (PEG 4000), substances which form insoluble complexes with condensed tannins; (h) normal phase and reverse phase high performance liquid chromatography (HPLC); (i) Microbial growth inhibition methods, which assess the impact of the presence of tannins on microbial growth or the formation of binding between tannins and bacteria similar to the protein precipitation assays previously cited.

Na Farmacopéia Brasileira 2a Edição - F. BRAS. II (FARMACOPÉIA brasileira. 2. Ed. São Paulo: Companhia Editora Nacional, 1959) a monografia para o barbatimão especifica um teor de no mínimo 20% de taninos totais. Este valor foi modificado pela publicação mais recente de monografia para a mesma droga vegetal na Farmacopéia Brasileira 4a Edição - F. BRAS. IV (FARMACOPÉIA brasileira, 4. Ed. São Paulo: Atheneu, 2002, pt. 2, 3o fascículo) em que preconiza-se um teor bem menor de taninos totais, de no mínimo 8%, que deve ser determinado pelo método colorimétrico Folin-Denis.In the Brazilian Pharmacopoeia 2nd Edition - F. BRAS. II (Brazilian PHARMACOPÉIA. 2. Ed. São Paulo: Companhia Editora Nacional, 1959) the monograph for barbatimão specifies a content of at least 20% of total tannins. This value was modified by the most recent monograph publication for the same plant drug in the Brazilian Pharmacopoeia 4th Edition - F. BRAS. IV (Brazilian Pharmacopoeia, 4. Ed. São Paulo: Atheneu, 2002, pt. 2, 3rd issue) in which a much lower total tannin content of at least 8% is recommended, which must be determined by the Folin colorimetric method. -Denis.

Os taninos condensados podem ser quantificados por CI_AE. Ambas as colunas de fase normal e fase reversa têm sido aplicadas (CHEYNIER, V.; SOUQUET, J. M.; LE ROUX, E.; GUYOT, S.; RIGAUD, J. Size separation of condensed tannins by normal-phase high performance liquid chromatography. Methods in Enzymology. v. 299, p. 178-184, 1999; LAZARUS, S.A; ADAMSON, G.E.; HAMMERSTONE, J.F.; SCHMITZ, H.H. High-performance liquid chromatography/mass spectrometry analysis of proanthocyanidins in foods and Beverages. Journal of Agricultural and Food Chemistry. v. 47, p.3693-3701, 1999; WATERHOUSE, A. L.; PRICE, S. F.; MACCORD, J. D. Reversed-phase high-performance liquid chromatography methods for analysis of wine polyphenols. Methods in Enzymology. v. 299, p. 113-121, 1999). CLAE de fase reversa foi usada para separação de taninos condensados de baixo peso molecular, mas a ordem de eluição não está relacionada ao grau de polimerização (CHEYNIER et ai, 1999). A separação de grandes polímeros (> tetrâmeros) com este método não é possível. A presença de muitos isômeros com polaridade similar resulta em sobreposição de tempos de retenção (LAZARUS et ai, 1999; WATERHOUSE et ai, 1999). CLAE de fase normal foi usada para separar oligômeros de taninos condensados e polímeros (LAZARUS et ai, 1999) de vários produtos vegetais alimentícios. O tempo de eluição aumenta com o aumento no grau de polimerização. Vários modos de detecção têm sido aplicados conjuntamente com CLAE para determinação de taninos condensados. A detecção por ultravioleta é a mais comumente utilizada (WATERMAN, P. G.; MOLE, S. Analysis of phenolic plant metabolites. Oxford: Blackwell Scientific, 1994). Entretanto, este modo não é específico para os taninos condensados na presença de outros polifenóis (LAZARUS et al., 1999). Métodos alternativos incluem detecção eletroquímica ou fluorescência (WATERMAN & MOLE, 1994; LAZARUS et al., 1999). As informações estruturais para identificação de oligômeros de taninos condensados podem ser obtidas por meio da utilização de espectrometria de massas, ressonância magnética nuclear ou hidrólise química (HAMMERSTONE, J. F.; LAZARUS, S. A. MITCHELL, A. E.; RUCKER, R. SCHMITZ, Η. H. Identification of procyanidins in cocoa (Theobroma cacaó) and chocolate using high-performance liquid chromatography/mass spectrometry. Journal of Agricultural and Food Chemistry. v. 47, p. 490-496, 1999). O uso de CLAE acoplada a vários tipos ou modos de detecção continuará, indubitavelmente, a aumentar e será o mais importante método de elucidação da complexidade da composição de taninos condensados e também de taninos hidrolisáveis (SCHOFIELD et al., 2001). Métodos analíticos para determinação de taninos hidrolisáveis A mistura de taninos hidrolisáveis (galotaninos e elagitaninos) pode ser analisada por métodos gerais para doseamentos de tanino, tais como por precipitação com metais ou proteínas, por métodos colorimétricos para doseamento de fenólicos totais e pelo ensaio do iodato de potássio.Condensed tannins can be quantified by CI_AE. Both normal phase and reverse phase columns have been applied (CHEYNIER, V .; SOUQUET, JM; LE ROUX, E.; GUYOT, S.; RIGAUD, J. Size separation of condensed tannins by normal-phase high performance liquid chromatography. Methods in Enzymology, v. 299, pp. 178-184, 1999; LAZARUS, SA; ADAMSON, GE; HAMMERSTONE, JF; SCHMITZ, HH High-performance liquid chromatography / mass spectrometry analysis of proanthocyanidins in foods and beverages. Agricultural and Food Chemistry, v. 47, pp.3693-3701, 1999; WATERHOUSE, AL; PRICE, SF; MACCORD, JD Reversed-phase high-performance liquid chromatography methods for analysis of wine polyphenols. , pp. 113-121, 1999). Reverse phase HPLC was used for separation of low molecular weight condensed tannins, but the order of elution is not related to the degree of polymerization (CHEYNIER et al, 1999). Separation of large polymers (> tetramers) with this method is not possible. The presence of many isomers with similar polarity results in overlapping retention times (LAZARUS et al, 1999; WATERHOUSE et al, 1999). Normal phase HPLC was used to separate oligomers from condensed tannins and polymers (LAZARUS et al, 1999) from various food crop products. The elution time increases with increasing polymerization degree. Several detection modes have been applied in conjunction with HPLC for the determination of condensed tannins. Ultraviolet detection is the most commonly used (WATERMAN, P. G .; MOLE, S. Analysis of phenolic plant metabolites. Oxford: Blackwell Scientific, 1994). However, this mode is not specific for condensed tannins in the presence of other polyphenols (LAZARUS et al., 1999). Alternative methods include electrochemical detection or fluorescence (WATERMAN & MOLE, 1994; LAZARUS et al., 1999). Structural information for identification of condensed tannin oligomers can be obtained using mass spectrometry, nuclear magnetic resonance or chemical hydrolysis (HAMMERSTONE, JF; LAZARUS, SA MITCHELL, AE; RUCKER, R. SCHMITZ, H.). Identification of procyanidins in cocoa (Theobroma cocoa) and chocolate using high-performance liquid chromatography / mass spectrometry, Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 47, pp. 490-496, 1999). The use of HPLC coupled with various types or modes of detection will undoubtedly continue to increase and will be the most important method of elucidating the complexity of the composition of condensed tannins as well as hydrolysable tannins (SCHOFIELD et al., 2001). Analytical methods for determination of hydrolysable tannins The mixture of hydrolysable tannins (galotanines and elagitanines) can be analyzed by general tannin assay methods, such as precipitation with metals or proteins, colorimetric methods for total phenolic assay and iodate assay. potassium

Um sistema de injeção de fluxo foi proposto para determinação de taninos hidrolisáveis pela reação com o iodato de potássio (BOSSU, C. M.; FERREIRA, E. C.; CHAVES, F. S.; MENEZES, E. A.; NOGUEIRA, A. R. A. Flow injection system for hydrolysable tannin determination. Microchemical Journal, v.84, p.88-92, 2006).A flow injection system has been proposed for the determination of hydrolyzable tannins by reaction with potassium iodate (BOSSU, CM; FERREIRA, EC; KEAVES, FS; MENEZES, EA; NOGUEIRA, ARA Flow injection system for hydrolysable tannin determination. , v.84, p.88-92, 2006).

Alguns taninos hidrolisáveis podem também ser quantificados por métodos colorimétricos mais específicos. Os galotaninos podem ser quantificados após sua hidrólise em meio ácido e complexação do ácido gálico liberado com o corante rodanina, gerando um produto colorido (INOUE, K. H.; HAGERMAN, A. E. Determination of gallotannins with rodanine. Analytical Biochemistry, v. 169, p. 363-369, 1988). Os elagitaninos também são hidrolisados e o ácido elágico liberado forma um complexo colorido com nitrito de sódio (WILSON, T. C.; HAGERMAN, A. E. Quantitative determination of ellagic acid. Journal of Agriculture and Food Chemistry, v. 38, p. 1678-1683, 1990). Embora os métodos colorimétricos sejam largamente utilizados, eles geralmente não fornecem dados quantitativos explícitos, e sim, dados totais com objetivo de comparação (MUELLER-HARVEY, I. Analysis of hidrolysable tannins. Animal Feed Science and Technology, v. 91, p. 3-20, 2001).Some hydrolysable tannins can also be quantified by more specific colorimetric methods. Galotanines can be quantified after hydrolysis in acid medium and complexation of gallic acid released with the rhodanin dye, generating a colored product (INOUE, KH; HAGERMAN, AE Determination of gallotannins with rodan. Analytical Biochemistry, v. 169, p. 363 -369, 1988). Elagitanines are also hydrolyzed and the released ellagic acid forms a colored sodium nitrite complex (WILSON, TC; HAGERMAN, AE Quantitative determination of ellagic acid. Journal of Agriculture and Food Chemistry, v. 38, pp. 1678-1683, 1990 ). Although colorimetric methods are widely used, they generally do not provide explicit quantitative data, but rather total data for comparison (MUELLER-HARVEY, I. Analysis of hydrolysable tannins. Animal Feed Science and Technology, v. 91, p. 3 -20, 2001).

Taninos hidrolisáveis são analisados e quantificados por CLAE usando colunas de fase normal e de fase reversa (MUELLER-HARVEY, 2001). Galotaninos podem ser analisados em coluna de fase reversa C18 utilizando gradiente de acetonitrila e solução aquosa de ácido fórmico a 5% (OSSIPOV, V.; LAPONEN, J.; OSSIPOVA, S.; HAUKIOJA, E.; PIHLAJA, K. Gallotannins of birch Bétula pubescens leaves: HPLC separation and quantification.Hydrolyzable tannins are analyzed and quantified by HPLC using normal phase and reverse phase columns (MUELLER-HARVEY, 2001). Galotanines can be analyzed on a C18 reverse phase column using acetonitrile gradient and 5% aqueous formic acid solution (OSSIPOV, V .; LAPONEN, J .; OSSIPOVA, S .; HAUKIOJA, E .; PIHLAJA, K. Gallotannins of birch Birch pubescens leaves: HPLC separation and quantification.

Biochemistry Systematic and Ecology, v. 25, p. 493-504, 1997). Hagerman propõe o uso de coluna em fase normal, com sistema isocrático de hexano:MeOH:THF:ácido trifluoracético, para separação e análise de ácido tânico (mistura de galotaninos) (HAGERMAN, A. E. Tannin Chemistry. 2002. Disponível em http://www.users.muohio.edu/haqermae/· Acesso em: 09 jul 2009). Para análise de elagitaninos pode-se empregar sistema isocrático em fase normal com hexano:MeOH:THF:ácido fórmico (47:42:10:1; V/V) e, em fase reversa, acetonitrila e tampão fosfato (H3PO4/KH2PO4 0,05 M) (15:42,5:42,5; V/V) (LEE, Μ. H.; CHIOU, J. F.; YEN, K. Y.; YANG, L. L. EBV DNA polymerase inhibition of tannins from Eugenia uniflora. Câncer Letters, v. 154, p. 131-136, 2000).Systematic Biochemistry and Ecology, v. 25, p. 493-504, 1997). Hagerman proposes the use of a normal phase column with an isocratic hexane system: MeOH: THF: trifluoracetic acid for separation and analysis of tannic acid (galotanine mixture) (HAGERMAN, AE Tannin Chemistry. 2002. Available at http: // www.users.muohio.edu/haqermae/· Accessed on: 09 Jul 2009). For elagitanines analysis, normal phase isocratic system with hexane: MeOH: THF: formic acid (47: 42: 10: 1; V / V) and, in reverse phase, acetonitrile and phosphate buffer (H3PO4 / KH2PO4 0) can be employed. 0.05 M) (15: 42.5: 42.5; V / V) (LEE, H.H.; CHIOU, JF; YEN, KY; YANG, LL EBV DNA polymerase inhibition of tannins from Eugenia uniflora. Cancer Letters , v. 154, pp. 131-136, 2000).

Problemas do estado da técnica: Os métodos químicos e colorimétricos atuais (que utilizam ácido-butanol, vanilina, azul da Prússia, Folin-Ciocalteau, Folin-Denis, iodato de potássio, rodanina, nitrito de sódio) são inespecíficos, pois analisam fenóis totais e não somente taninos. Tais métodos ainda apresentam múltiplos interferentes como: tempo de reação e ordem de adição de reagente, temperatura, luz, pH, concentração de taninos e precipitação.State of the art problems: Current chemical and colorimetric methods (using acid-butanol, vanillin, Prussian blue, Folin-Ciocalteau, Folin-Denis, potassium iodate, rhodanine, sodium nitrite) are nonspecific as they analyze total phenols. and not just tannins. Such methods also present multiple interferences such as reaction time and reagent addition order, temperature, light, pH, tannin concentration and precipitation.

Os métodos químicos por tiólise e por utilização do floroglucinol são bons para determinação estrutural, possuem baixo rendimento e necessitam de taninos puros para análise, além de não serem indicados para quantificação. Métodos gravimétricos (por precipitação por itérbio) são inespecíficos, necessitando de calcinação em mufla. Além disso, apresentam baixos rendimentos e podem ser variáveis em relação à razão do complexo Yb:tanino.Chemical methods by thiolysis and floroglucinol use are good for structural determination, have low yield and require pure tannins for analysis and are not indicated for quantification. Gravimetric methods (by ytterbium precipitation) are nonspecific, requiring calcination in muffle. Moreover, they present low yields and can be variable in relation to the Yb: tannin complex ratio.

Os métodos enzimáticos (inibição enzimática) possuem variação devido à diferente suscetibilidade das enzimas utilizadas, além de serem inespecíficos. Métodos de precipitação por proteína refletem a atividade biológica, mas também são inespecíficos e os resultados dependem de muitas variáveis inerentes à proteína. O método de toxicidade (inibição de crescimento microbiológico) também é inespecífico e seus resultados são afetados pelo tipo de microrganismo e a composição do meio de cultura.Enzymatic methods (enzymatic inhibition) vary due to the different susceptibility of the enzymes used and are non-specific. Protein precipitation methods reflect biological activity, but are also nonspecific and the results depend on many inherent protein variables. The toxicity method (inhibition of microbiological growth) is also nonspecific and its results are affected by the type of microorganism and the composition of the culture medium.

Vantagens da invenção A presente invenção permite a análise de taninos utilizando marcadores característicos (monômeros) e não fenóis totais, como apresentado no estado da técnica.Advantages of the Invention The present invention allows for the analysis of tannins using characteristic markers (monomers) and not total phenols as presented in the prior art.

Mais particularmente, o método de purificação de insumos e produtos vegetais contendo taninos para a análise cromatográfica (CLAE) possibilitou a separação, identificação e a quantificação de marcadores químicos específicos de taninos em um tempo de corrida adequado para análises de rotina. O método desenvolvido foi validado e apresentou-se específico, linear, preciso, exato e robusto para análises de insumos e produtos vegetais contendo taninos.More particularly, the tannin-containing inputs and plant products purification method for chromatographic analysis (HPLC) enabled the separation, identification and quantification of tannin-specific chemical markers at a suitable run time for routine analysis. The developed method was validated and was specific, linear, precise, accurate and robust for analysis of inputs and plant products containing tannins.

Em outro aspecto, o método da presente invenção viabiliza a utilização de pequenas quantidades de amostras, na ordem de grandeza de miligramas, o que permite a determinação para o controle de qualidade de insumos e produtos vegetais contendo taninos, tanto em escala analítica quanto em preparativa, ou até o isolamento em escala preparativa.In another aspect, the method of the present invention enables the use of small quantities of samples, in the order of milligrams, which allows the determination for the quality control of inputs and plant products containing tannins, both in analytical and preparative scale. , or even isolation on a preparative scale.

Breve Descrição das Figuras Figura 1 - Cromatograma inicial obtido por eluição em gradiente exploratório amplo: 5% a 95% acetonitrila (ACN), 60 min., para extrato etanólico seco de S. adstríngens 10 mg/mL, em metanol 10% V/V; volume de injeção 10 μΙ_; fase móvel ACNiágua (5:95) ambos acidificados com ácido fosfórico 0,1% (VA/); fluxo 1 mL/min; 40 °C; detecção λ 210 nm.Brief Description of the Figures Figure 1 - Initial chromatogram obtained by elution in wide exploratory gradient: 5% to 95% acetonitrile (ACN), 60 min., For dry ethanolic extract of S. astringens 10 mg / mL, in methanol 10% V / V; injection volume 10 μΙ_; mobile phase ACNiagua (5:95) both acidified with 0.1% phosphoric acid (VA /); flow 1 mL / min; 40 ° C; detection λ 210 nm.

Figura 2 - Cromatograma inicial obtido por eluição em gradiente linear: 5% a 40% acetonitrila (ACN), 60 min., para extrato etanólico seco de S. adstríngens 10 mg/mL, em metanol 10% V/V; volume de injeção 10 μί; fase móvel ACN:água (5:95) ambos acidificados com ácido fosfórico 0,1% (V/V); fluxo 1 mL/min; 40 °C; detecção λ 210 nm.Figure 2 - Initial chromatography obtained by linear gradient elution: 5% to 40% acetonitrile (ACN), 60 min., For dry ethanolic extract of S. astringens 10 mg / mL, in methanol 10% V / V; injection volume 10 μί; ACN mobile phase: water (5:95) both acidified with 0.1% (V / V) phosphoric acid; flow 1 mL / min; 40 ° C; detection λ 210 nm.

Figura 3 - Cromatograma obtido por eluição em gradiente linear: 5% a 40% acetonitrila (ACN), 60 min., para a fração orgânica de S. adstríngens 1 mg/mL, em metanol 10% V/V; volume de injeção 2,5 pL; fase móvel ACN:água (5:95) ambos acidificados com ácido fosfórico 0,1% (V/V); fluxo 1 mL/min; 40 °C; detecção λ 210 nm. Quantidade de partida 250 mg de extrato etanólico seco de S. adstríngens.Figure 3 - Chromatogram obtained by linear gradient elution: 5% to 40% acetonitrile (ACN), 60 min., For the organic fraction of S. astringens 1 mg / mL, in methanol 10% V / V; injection volume 2.5 pL; ACN mobile phase: water (5:95) both acidified with 0.1% (V / V) phosphoric acid; flow 1 mL / min; 40 ° C; detection λ 210 nm. Starting amount 250 mg dry ethanolic extract of S. astringens.

Figura 4 — Cromatograma obtido por eluição em gradiente linear: 5% a 40% acetonitrila (ACN), 60 min., para a fração aquosa de S. adstríngens 1 mg/mL, em metanol 10% V/V; volume de injeção 2,5 μί; fase móvel ACN:água (5:95) ambos acidificados com ácido fosfórico 0,1% (V/V); fluxo 1 mL/min; 40 °C; detecção λ 210 nm. Quantidade de partida 250 mg de extrato etanólico seco de S. adstríngens.Figure 4 - Chromatogram obtained by linear gradient elution: 5% to 40% acetonitrile (ACN), 60 min., For the aqueous fraction of S. astringens 1 mg / mL in 10% V / V methanol; injection volume 2.5 μί; ACN mobile phase: water (5:95) both acidified with 0.1% (V / V) phosphoric acid; flow 1 mL / min; 40 ° C; detection λ 210 nm. Starting amount 250 mg dry ethanolic extract of S. astringens.

Figura 5 - Cromatograma obtido por eluição em gradiente linear: 5% a 40% acetonitrila (ACN), 60 min., para o extrato etanólico seco de S. adstríngens 1 mg/mL, em metanol 10% V/V; fortificado com os padrões: ácido gálico, galocatequina, epigalocatequina, catequina, proantocianidina B2 e gaiato de epigalocatequina; volume de injeção 5 μΐ_; fase móvel ACN:água (5:95) ambos acidificados com ácido fosfórico 0,1% (VA/); fluxo 1 mL/min; 40 °C; detecção λ 210 nm. Quantidade de partida 250 mg de extrato etanólico seco de S. adstríngens.Figure 5 - Chromatogram obtained by linear gradient elution: 5% to 40% acetonitrile (ACN), 60 min., For the dry ethanolic extract of S. astringens 1 mg / mL, in methanol 10% V / V; fortified to the standards: gallic acid, galocatechin, epigallocatechin, catechin, proanthocyanidin B2 and epigallocatechin gallate; injection volume 5 μΐ_; ACN mobile phase: water (5:95) both acidified with 0.1% phosphoric acid (VA /); flow 1 mL / min; 40 ° C; detection λ 210 nm. Starting amount 250 mg dry ethanolic extract of S. astringens.

Figura 6 - Sobreposição dos cromatogramas do extrato etanólico seco de S. adstríngens 1 mg/mL, em metanol 10% V/V; volume de injeção 5 pL; sem adição de padrões (linha cheia) e após adição dos padrões (linha tracejada): (1) ácido gálico, (2) galocatequina, (3) epigalocatequina, (4) catequina, (5) proantocianidina B2 e (6) gaiato de epigalocatequina.Figure 6 - Overlay of chromatograms of the dry ethanolic extract of S. astringens 1 mg / mL in 10% V / V methanol; injection volume 5 pL; without addition of standards (full line) and after addition of standards (dashed line): (1) gallic acid, (2) galocatechin, (3) epigallocatechin, (4) catechin, (5) proanthocyanidin B2 and (6) epigallocatechin.

Figura 7 - Cromatograma dos padrões reunidos em solução 0,1 mg/mL cada, em metanol; volume de injeção 2 μί.Figure 7 - Chromatogram of standards pooled in 0.1 mg / mL solution each in methanol; injection volume 2 μί.

Descrição Detalhada da Invenção A presente invenção tem como conceito inventivo um método extrativo-analítico para determinação de taninos em insumos e produtos vegetais. Em seu aspecto mais geral, se refere à determinação analítica de taninos a partir de uma etapa de pré-purificação direcionada para a análise de monômeros, independente da quantidade de fenóis totais. É também revelada a etapa de pré-purificação da amostra por partição líquido-líquido. A adaptação e a otimização do método extrativo-analítico para determinação de taninos em extratos de barbatimão da espécie S. adstríngens (Martius) Coville foi realizada utilizando soluções de extrato etanólico seco e de substâncias de referência (catequina, ácido gálico, galocatequina, epigalocatequina, proantocianidina B2 e gaiato de epigalocatequina).DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention has an extractive-analytical method for determining tannins in inputs and plant products. In its most general aspect, it refers to the analytical determination of tannins from a pre-purification step directed to the monomer analysis, independent of the amount of total phenols. Also disclosed is the sample pre-purification step by liquid-liquid partition. The adaptation and optimization of the extract-analytical method for the determination of tannins in S. astringens (Martius) Coville barbatimão extracts was performed using solutions of dry ethanolic extract and reference substances (catechin, gallic acid, galocatequine, epigalocatechin, proanthocyanidin B2 and epigallocatechin gallate).

Para estabelecer as melhores condições cromatográficas para a eluição das amostras, realizou-se, inicialmente, um gradiente exploratório amplo. Esta corrida cromatográfica em gradiente linear foi realizada como descrito por Snyder e colaboradores (SNYDER, L. R.; KIRKLAND, J. J.; GLAJCH, J. L. Practical HPLC method development. 2. Ed. New York: Wiley, 1997. 765 p.) utilizando-se condições cromatográficas descritas na Tabela 1. Para se avaliar a influência do perfil de uma solução branco, o procedimento foi realizado com a injeção dos solventes utilizados para a solubilização das soluções de extrato etanólico seco, nas mesmas condições de análise.To establish the best chromatographic conditions for sample elution, a broad exploratory gradient was initially performed. This linear gradient chromatographic run was performed as described by Snyder et al. (SNYDER, LR; KIRKLAND, JJ; GLAJCH, JL Practical HPLC method development. 2. Ed. New York: Wiley, 1997. 765 p.) Using conditions For the evaluation of the influence of the profile of a white solution, the procedure was performed by injecting the solvents used to solubilize the dry ethanolic extract solutions under the same analysis conditions.

Diferentes volumes de injeção de amostras foram testados para otimização da massa ideal de extrato a ser utilizado. Variaram-se ainda o solvente das amostras e padrões, o pH da fase móvel, a temperatura da coluna e o comprimento de onda para detecção.Different sample injection volumes were tested to optimize the ideal extract mass to be used. Sample and standard solvent, mobile phase pH, column temperature and wavelength for detection were also varied.

Para avaliar a eficiência da separação da condição cromatográfica estabelecida, foram avaliados parâmetros de adequação do sistema (resolução, R; fator de retenção, k; fator de cauda, T) e a pureza dos picos para os marcadores químicos. Para determinação do tempo morto (t0), 5 μΙ_ de solução de nitrato de sódio 0,1 % (p/V), solubilizado em fase móvel ACNrágua (5:95), ambos acidificados com 0,1% ácido fosfórico VA/, foram injetados nas mesmas condições de análise.To evaluate the separation efficiency of the established chromatographic condition, system suitability parameters (resolution, R; retention factor, k; tail factor, T) and peak purity for chemical markers were evaluated. For the determination of dead time (t0), 5 μΙ_ of 0,1% (w / v) sodium nitrate solution, solubilized in mobile phase ACNwater (5:95), both acidified with 0,1% phosphoric acid VA /, were injected under the same conditions of analysis.

Os exemplos a seguir ilustram a determinação de taninos nas espécies de barbatimão S. adstríngens e S. obovatum, mas não limitam a estas, as formas de concretizar a invenção.The following examples illustrate the determination of tannins in, but not limited to, barbatimão S. astringens and S. obovatum species embodiments of the invention.

Exemplo 1 - Preparo das amostras Solução estoque de extrato etanólico seco de S. adstríngens e de S. obovatum (10 mq/mL): Pesaram-se com exatidão cerca de 100 mg do extrato etanólico seco bruto, dissolveram-se em aproximadamente 8 mL de metanol. Transferiu-se quantitativamente para balão volumétrico de 10 mL, completou-se o volume com o mesmo solvente e homogeneizou-se. Filtrou-se por meio de dispositivos filtrantes de celulose regenerada de tamanho de poro de 0,45 μιτι diretamente em mini-frascos para CLAE.Example 1 - Preparation of Samples Stock solution of S. astringrens and S. obovatum dry ethanolic extract (10 mq / mL): About 100 mg of the crude dry ethanolic extract was accurately weighed, dissolved in approximately 8 mL. of methanol. It was quantitatively transferred to a 10 ml volumetric flask, made up to volume with the same solvent and homogenized. It was filtered through 0.45 µm pore size regenerated cellulose filter devices directly into HPLC mini-vials.

Solução de extrato etanólico seco de S. adstrinaens e de S. obovatum diluída (1 mq/mü: Pipetou-se 1 ml_ da solução estoque, com auxílio de micropipeta, e transferiu-se para balão volumétrico de 10 ml_. Completou-se o volume com água ultrapura e homogeneizou-se, obtendo-se solução a 1 mg/ml_ em metanol 10% (V/V). Filtrou-se por meio de dispositivos filtrantes de celulose regenerada de tamanho de poro de 0,45 μιτι diretamente em mini-frascos para CLAE.Solution of dry ethanolic extract of S. adstrinaens and diluted S. obovatum (1 mq / mü: 1 ml_ of the stock solution was pipetted with micropipette and transferred to a 10 ml_ volumetric flask. volume with ultrapure water and homogenized to 1 mg / ml solution in 10% (V / V) methanol, filtered through 0.45 µm pore size regenerated cellulose filter mini-bottles for HPLC.

Solução padrão de catequina (substância química de referência. SQR) (1 mq/mü: Pesaram-se com exatidão cerca de 5 mg de catequina que foram transferidos para balão volumétrico de 5 mL. Dissolveu-se em aproximadamente 3 mL de metanol, completou-se o volume com o mesmo solvente e homogeneizou-se. Filtrou-se por meio de dispositivos filtrantes adequados diretamente em mini-frascos para CLAE.Catechin Standard Solution (Reference Chemical. SQR) (1 mq / mü: About 5 mg catechin was accurately weighed and transferred to a 5 mL volumetric flask. Dissolved in approximately 3 mL methanol, completed. The volume was diluted with the same solvent and homogenized, filtered through suitable filter devices directly into HPLC mini-vials.

As soluções de ácido gálico SQR, galocatequina SQR, epigalocatequina SQR, proantocianidina B2 SQR e gaiato de epigalocatequina SQR, todas na concentração 1 mg/mL também foram preparadas da mesma maneira como descrito para a catequina SQR.SQR Gallic Acid, SQR Galocatechin, SQR Epigallocatechin, Proanthocyanidin B2 SQR, and SQR Epigallocatechin Gallate solutions were all prepared in the same manner as described for SQR catechin.

Exemplo 2 - Condições cromatográficas para a corrida exploratória em gradiente Inicialmente, a determinação dos melhores solventes para os extratos foi avaliada com base nos dados de solubilidade dos padrões e dos extratos de barbatimão. Selecionaram-se soluções hidroalcóolicas para solubilização das amostras e dos padrões, nas quais os marcadores químicos apresentaram estabilidade suficiente para a construção das curvas analíticas.Example 2 - Chromatographic conditions for gradient exploratory running Initially, the determination of the best solvent for the extracts was evaluated based on the standard solubility data and barbatimon extracts. Hydroalcoholic solutions were selected for solubilization of samples and standards, in which the chemical markers presented sufficient stability for the construction of the analytical curves.

Por meio de uma corrida cromatográfica inicial em gradiente exploratório amplo (Tabela 1) obteve-se o cromatograma apresentado na Figura 1. As amostras apresentaram composição complexa, com grande elevação de linha de base e eluíram num tempo máximo de 25 minutos, em um tempo total de corrida de 60 minutos.An initial chromatographic run on a wide exploratory gradient (Table 1) yielded the chromatogram shown in Figure 1. The samples showed complex composition with high baseline elevation and eluted within 25 minutes at a time. 60 minute running total.

Tabela 1 - Condições cromatográficas para a corrida exploratória em gradiente para determinação de taninos em insumos ou produtos vegetais (barbatimão S. adstringens (Martius) Coville e S. obovatum Benth) Após a avaliação do perfil cromatográfico em gradiente exploratório amplo apresentado pelo extrato etanólico seco de S. adstringens, outras condições cromatográficas pré-otimizadas foram estabelecidas para obtenção de uma eluição em gradiente mais brando (Tabela 2).Table 1 - Chromatographic conditions for gradient exploratory run for determination of tannins in inputs or plant products (barbatimão S. adstringens (Martius) Coville and S. obovatum Benth) After evaluation of the wide exploratory gradient chromatographic profile presented by dry ethanolic extract of S. adstringens, other pre-optimized chromatographic conditions were established to obtain a milder gradient elution (Table 2).

Tabela 2 - Condições cromatográficas pré-otimizadas em gradiente para determinação de taninos em insumos ou produtos vegetais (barbatimão S. adstríngens (Martius) Coville e S. obovatum Benth).Table 2 - Pre-optimized gradient chromatographic conditions for the determination of tannins in plant inputs or products (barbatimão S. astringens (Martius) Coville and S. obovatum Benth).

Nestas condições, obteve-se o cromatograma apresentado na Figura 2. As amostras apresentaram os picos principais com melhor resolução e eluíram no tempo máximo de 40 minutos, em um tempo de corrida total de 60 minutos.Under these conditions, the chromatogram presented in Figure 2 was obtained. The samples presented the main peaks with better resolution and eluted at the maximum time of 40 minutes, in a total running time of 60 minutes.

Observa-se neste cromatograma que a linha de base sofre grande alteração ao longo da análise. Com o intuito de minimizar tal problema, desenvolveu-se um método para prévia purificação da amostra, por partição líquido-líquido (PLL).It is observed in this chromatogram that the baseline changes greatly throughout the analysis. In order to minimize this problem, a method for previous sample purification by liquid-liquid partition (PLL) was developed.

Exemplo 3 - Pré-purificação das amostras de extrato etanólico seco de S. adstríngens e de S. obovatum por partição líquido-líquido O objetivo da etapa de purificação foi eliminar interferentes da amostra que possam prejudicar a análise sem, no entanto, retirar os marcadores de interesse para quantificação no extrato. Tais interferentes podem prejudicar a eluição da amostra ao longo da coluna cromatográfica levando a obtenção de uma linha de base com alterações ao longo do gradiente no cromatograma.Example 3 - Pre-purification of samples of dry ethanolic extract of S. astringens and S. obovatum by liquid-liquid partition The objective of the purification step was to eliminate sample interferents that may impair analysis without, however, removing the markers. of interest for quantification in the extract. Such interferents may impair the elution of the sample along the chromatographic column leading to a baseline with changes along the gradient in the chromatogram.

Este problema dificulta a integração adequada do cromatograma, perdendo-se exatidão e precisão do método.This problem makes it difficult to properly integrate the chromatogram, losing method accuracy and precision.

Com a purificação por meio de PLL dos extratos etanólicos de S. adstríngens e de S. obovatum obtiveram-se duas frações: orgânica e aquosa. Os cromatogramas das duas frações são apresentados nas Figuras 3 e 4, respectivamente.Purification by PLL of the ethanolic extracts of S. astringens and S. obovatum gave two fractions: organic and aqueous. The chromatograms of the two fractions are shown in Figures 3 and 4, respectively.

Diversas composições de fases para PLL, assim como o número de lavagens, o volume da fase orgânica e da fase aquosa e a relação massa de amostras por volume de solventes foram avaliadas. A purificação das amostras de extratos etanólicos secos de S. adstríngens e de S. obovatum foi realizada por meio de fracionamento por PLL de acordo com a Tabela 3.Several phase compositions for PLL, as well as the number of washes, the volume of the organic phase and the aqueous phase, and the sample mass to solvent volume ratio were evaluated. The purification of samples of dry ethanolic extracts of S. astringens and S. obovatum was performed by PLL fractionation according to Table 3.

Tabela 3 - Composição do sistema extrator utilizado como tratamento prévio de insumos ou produtos vegetais. a: para amostras maiores, ajustar as quantidades dos solventes do sistema proporcionalmente.Table 3 - Composition of the extraction system used as pre-treatment of inputs or plant products. a: For larger samples, adjust the system solvent quantities proportionally.

Para a preparação do sistema extrator utilizado para o tratamento prévio dos extratos por PLL procedeu-se da seguinte maneira: 1. Mediu-se, separadamente, em duplicata, cada volume do sistema extrator, transferindo-os para dois erlenmeyers com boca esmerilhada e tampa. Homogeneizou-se com auxílio de agitador magnético durante 30 minutos, 2. Transferiu-se o volume de sistema extrator (suficiente para 1 lavagem) de cada erlenmeyer para funil de separação. 3. Adicionaram-se cerca de 250 mg de extrato seco (pesados com exatidão). 4. Agitou-se, vigorosamente, por 30 s, três vezes, alternadas após a separação das fases; 5. Recolheu-se a fase aquosa (inferior) em um béquer e a fase orgânica I (superior) em cápsula de porcelana tarada. 6. Retornou-se a fase aquosa para o mesmo funil de separação e adicionou-se novo sistema extrator, previamente homogeneizado, repetindo-se os procedimentos 4 e 5. 7. Recolheu-se a fase orgânica II em cápsula de porcelana tarada, reunindo-a com a fase orgânica I coletada. 8. Recolheu-se a fase aquosa em cápsula de porcelana tarada. 9. Secaram-se a fase aquosa e as fases orgânicas reunidas até resíduo, sob ar aquecido (não mais que 40 °C.) em capela. 10. Após a secagem das frações aquosa e orgânicas, pesaram-se as cápsulas e calculou-se o rendimento da extração para as frações obtidas. 11. Armazenaram-se as amostras, em frasco âmbar, hermeticamente fechado, identificado, em geladeira.For the preparation of the extractor system used for the previous treatment of the extracts by PLL, proceed as follows: 1. Each volume of the extractor system was separately measured in duplicate, transferring them to two ground-mouth erlenmeyers with a lid. . It was homogenized using a magnetic stirrer for 30 minutes. 2. The volume of extractor system (sufficient for 1 wash) was transferred from each conical flask to the separatory funnel. 3. About 250 mg of dry extract (accurately weighed) was added. 4. Shaken vigorously for 30 s three times alternately after phase separation; 5. The aqueous (lower) phase was collected in a beaker and the organic (upper) phase in a tared porcelain capsule. 6. The aqueous phase was returned to the same separatory funnel and a new previously homogenized extractor system was added, repeating procedures 4 and 5. 7. The organic phase II was collected in tared porcelain capsule and combined. it with the organic phase I collected. 8. The aqueous phase was collected in tared porcelain capsule. 9. The aqueous phase and the combined organic phases were dried to residue under heated air (not more than 40 ° C) in a hood. 10. After drying the aqueous and organic fractions, the capsules were weighed and the extraction yield for the obtained fractions was calculated. 11. The samples were stored in a hermetically sealed, labeled, amber bottle in a refrigerator.

Os cromatogramas obtidos (Figuras 3 e 4) com injeções de soluções de frações purificadas por PLL apresentaram linha de base com menor variação da inclinação ao longo da eluição em gradiente, com melhoria da resolução dos picos. Pode-se observar que a fração aquosa também apresentou picos dos marcadores galocatequina e gaiato de epigalocatequina em concentração muito baixa. Isto demonstra que tais marcadores tiveram o equilíbrio deslocado no sentido da fração orgânica quando dissolvidos no sistema particional binário de purificação. Portanto, por meio da purificação por PLL desenvolvida foi possível retirar compostos da matriz da amostra, os quais poderíam interferir nas análises por CLAE e conservarem quase sua totalidade os marcadores.The chromatograms obtained (Figures 3 and 4) with injections of PLL-purified fraction solutions showed baseline with less inclination variation along gradient elution, with improved peak resolution. It can be observed that the aqueous fraction also showed peaks of markers galocatechin and epigallocatechin gallate at very low concentration. This demonstrates that such markers had their equilibrium shifted towards the organic fraction when dissolved in the binary particle purification system. Therefore, through the developed PLL purification it was possible to remove compounds from the sample matrix, which could interfere with HPLC analysis and preserve almost all the markers.

Exemplo 4 - Otimização das condições cromatográficas Para uma verificação individualizada do perfil de marcadores comuns para taninos condensados, uma solução de catequina SQR 1 mg/mL, em metanol, volume de injeção 1 μΙ_, foi injetada, sob variação do pH da fase móvel (em torno de 2 a 6). Dessa forma avaliou-se o fator de cauda obtido. Outros parâmetros cromatográficos obtidos em função da variação do pH e da fase móvel são apresentados na Tabela 5.Example 4 - Optimization of Chromatographic Conditions For an individualized verification of the common marker profile for condensed tannins, a solution of catechin SQR 1 mg / mL in methanol, injection volume 1 μΙ_, was injected under mobile phase pH ( around 2 to 6). Thus, the obtained tail factor was evaluated. Other chromatographic parameters obtained as a function of pH and mobile phase variation are presented in Table 5.

Tabela 4 - Parâmetros cromatográficos obtidos para catequina SQR 1 mg/mL em metanol, volume de injeção 1 μΙ_, em diferentes composições de fase móvel Observa-se que o fator de cauda com menor valor foi obtido em fase móvel com pH aparente entre 2,0 e 3,0, alcançado com adição de ácido fosfórico de no mínimo 0,075% (V/V) na fase aquosa. Apesar desta faixa de pH estar próxima ao limite de trabalho para colunas de fase ligada, a redução do fator de cauda permite uma análise mais precisa e exata. A melhoria na simetria do pico ocorreu devido à supressão da ionização das hidroxilas fenólicas dos taninos condensados.Table 4 - Chromatographic parameters obtained for catechin SQR 1 mg / mL in methanol, injection volume 1 μΙ_, in different mobile phase compositions It is observed that the lowest value tail factor was obtained in mobile phase with apparent pH between 2, 0 and 3.0, achieved with the addition of at least 0.075% (V / V) phosphoric acid in the aqueous phase. Although this pH range is close to the working limit for phase-bound columns, tail factor reduction allows for more accurate and accurate analysis. The improvement in peak symmetry was due to the suppression of the phenolic hydroxyl ionization of the condensed tannins.

Como o método baseia-se em um gradiente linear, o pH aparente da fase móvel se altera ao longo da análise com a acidificação somente da fase aquosa, portanto, os dois componentes da fase móvel: aquoso e orgânico foram acidificados (ACN).Since the method is based on a linear gradient, the apparent pH of the mobile phase changes throughout the analysis with acidification of the aqueous phase only, so both components of the mobile phase: aqueous and organic were acidified (ACN).

As condições cromatográficas finais estabelecidas para avaliação de soluções diluídas de extrato etanólico seco de S. adstringens 1 mg/mL, em metanol 10% V/V, são apresentadas na Tabela 5. Em λ 210 nm houve maior sensibilidade na detecção uma vez que os taninos apresentam uma boa absortividade neste comprimento de onda. Com o aumento de temperatura de 30 °C para 40 °C houve melhoria do perfil cromatográfico aumentando-se a resolução entre os picos.The final chromatographic conditions established for the evaluation of diluted solutions of dry S. adstringens 1 mg / mL ethanolic extract in 10% V / V methanol are presented in Table 5. At λ 210 nm there was a higher detection sensitivity as the Tannins exhibit good absorptivity at this wavelength. Increasing the temperature from 30 ° C to 40 ° C improved the chromatographic profile increasing the resolution between the peaks.

As condições estabelecidas na Tabela 5 também foram utilizadas para a validação do método.The conditions set out in Table 5 were also used for method validation.

Tabela 5 - Condições cromatográficas em gradiente otimizadas para análise de extratos de barbatimão Foram injetadas, individualmente e em conjunto, soluções padrão de ácido gálico SQR, catequina SQR, epigalocatequina SQR, gaiato de epigalocatequina SQR, galocatequina SQR e proantocianidina B2 SQR para demonstração da resolução entre os picos e para avaliação dos tempos de retenção (Tabela 6).Table 5 - Gradient chromatographic conditions optimized for analysis of barbatimon extracts. Standard solutions of SQR gallic acid, SQR catechin, SQR epigallocatechin, SQR epigalocatechin gallate, SQR galocatechin and SQR resolution demonstration proanthocyanidin were injected individually and together. between peaks and for retention time evaluation (Table 6).

Soluções de extrato etanólico seco de S. adstríngens fortificadas com os padrões: ácido gálico, catequina, epigalocatequina, gaiato de epigalocatequina, galocatequina e proantocianidina B2 foram injetadas (Figura 6). A concentração 1 mg/mL para as amostras com volume de injeção de 10 pL foi considerada ideal.Solutions of dry ethanolic extract of S. astringens fortified to the standards: gallic acid, catechin, epigallocatechin, epigallocatechin gallate, galocatechin and proanthocyanidin B2 were injected (Figure 6). The 1 mg / mL concentration for samples with 10 pL injection volume was considered optimal.

Analisando-se o cromatograma do extrato etanólico seco de S. adstringens fortificado conclui-se que o mesmo não possui o marcador proantocianidina B2 em sua composição. Estes dados podem ser confirmados pela sobreposição do cromatograma da solução sem adição de padrão e após adição de padrões apresentados na Figura 7. Os demais padrões estão presentes no extrato etanólico seco de S. adstringens. No entanto, o ácido gálico e a catequina estão em concentração mais baixa em relação aos demais marcadores químicos no S. adstringens do que no S. obovatum. Entretanto, pode-se, para o extrato de S. adstringens, quantificar a galocatequina e o gaiato de epigalocatequina no método desenvolvido por CLAE, enquanto que em S. obovatum pode-se quantificar a catequina, a galocatequina e o gaiato de epigalocatequina.Analyzing the chromatogram of the dry ethanolic extract of S. adstringens fortified it is concluded that it does not have the marker proanthocyanidin B2 in its composition. These data can be confirmed by overlapping the solution chromatogram without standard addition and after standard addition shown in Figure 7. The other standards are present in the dry ethanolic extract of S. adstringens. However, gallic acid and catechin are lower in concentration than other chemical markers in S. adstringens than in S. obovatum. However, for S. adstringens extract, the gallocatechin and epigallocatechin gallate can be quantified in the method developed by HPLC, while in S. obovatum the catechin, galocatechin and epigallocatechin gallate can be quantified.

Ainda foi possível observar a presença de um pico de mais elevada intensidade no centro do cromatograma, com tempo de retenção próximo a 14 minutos. Não foi possível identificar esta substância por meio dos padrões utilizados, entretanto, pode-se afirmar que se trata de um derivado de flavan-3-ol pela semelhança do espectro UV/DAD (pureza de pico de 99,17%) obtido em relação aos espectros dos padrões avaliados.It was still possible to observe the presence of a higher intensity peak in the center of the chromatogram, with retention time close to 14 minutes. It was not possible to identify this substance by the standards used, however, it can be stated that it is a flavan-3-ol derivative by the similarity of the UV / DAD spectrum (peak purity 99.17%) obtained with respect to to the spectra of the evaluated standards.

Exemplo 6 - Validação do método analítico por CLAE O método analítico para quantificação de galocatequina e gaiato de epigalocatequina nos extratos de barbatimão por CLAE foi validado de acordo com as figuras de mérito e as especificações recomendadas pela Resolução RE n° 899 de 29 de maio de 2003 da ANVISA (BRASIL. Ministério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução RE n° 899, de 29 de maio de 2003. Diário Oficial da União, Brasília, DF, 02 jun. 2003) e o Guia ICH de Validação de Procedimentos Analíticos (INTERNATIONAL Conference on Harmonisation (ICH) of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use. Validation of Analytical Procedures, Q2(R1), Geneva. nov. 2005. Disponível em: http://www.ich.org/LOB/media/MEDIA417.pdf Acesso em: 05 jul 2009.). Foram avaliadas as figuras de mérito linearidade, precisão, exatidão, seletividade, robustez, limite de quantificação e limite de detecção.Example 6 - Validation of the HPLC Analytical Method The analytical method for quantification of gallocatechin and epigallocatechin gallate in HPLC barbatimon extracts was validated according to the merit figures and specifications recommended by Resolution RE 899 of May 29, 2003 (BRAZIL. Ministry of Health. National Health Surveillance Agency. Resolution No. 899 of May 29, 2003. Federal Official Gazette, Brasilia, DF, June 2, 2003) and the ICH Guide for Validation of Analytical Procedures (INTERNATIONAL Conference on Harmonization (ICH) of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use. Validation of Analytical Procedures, Q2 (R1), Geneva, Nov. 2005. Available at: http://www.ich.org/ LOB / media / MEDIA417.pdf Accessed on: 05 Jul 2009.). The figures of merit linearity, precision, accuracy, selectivity, robustness, limit of quantification and limit of detection were evaluated.

Pará a realização dos testes utilizou-se a fração orgânica do extrato etanólico seco da espécie S. adstringens. Após a validação do método, determinou-se também o teor dos marcadores na fração orgânica do extrato etanólico seco obtido de cascas da espécie S. obovatum.For the tests, the organic fraction of the dry ethanolic extract of the species S. adstringens was used. After the validation of the method, the content of the markers in the organic fraction of the dry ethanolic extract obtained from barks of the species S. obovatum was also determined.

Para determinação do tempo morto (t0), 5 μ1_ de solução de nitrato de sódio a 0,1% p/V solubilizado em fase móvel ACN:água (5:95) acidificada com acido fosfórico 0,1% V/V foram injetados nas mesmas condições de análise.For the determination of the dead time (t0), 5 μ1_ of 0.1% w / v sodium nitrate solution solubilized in mobile phase ACN: water (5:95) acidified with 0.1% V / V phosphoric acid were injected. under the same conditions of analysis.

Seletividade A seletividade foi avaliada pela determinação da pureza espectral dos picos dos marcadores químicos selecionados como substâncias químicas de referência, obtida com auxílio do detector UV/DAD, no intervalo λ 200 nm a 800 nm. Considerou-se uma pureza mínima, 98,0%, como valor aceitável demonstrando-se que o pico cromatográfico é atribuído a um só componente e o método é seletivo. A seletividade também foi avaliada pela eficiência da separação da condição cromatográfica estabelecida através dos parâmetros de adequação do sistema (resolução, fator de retenção, fator de cauda, número de pratos teóricos) para os picos dos marcadores químicos, apresentados na Tabela 6. A Figura 7 apresenta o cromatograma dos padrões reunidos.Selectivity Selectivity was assessed by determining the spectral purity of the peaks of the selected chemical markers as reference chemicals, obtained with the aid of the UV / DAD detector, in the range λ 200 nm to 800 nm. A minimum purity of 98.0% was considered as acceptable value demonstrating that the chromatographic peak is assigned to a single component and the method is selective. Selectivity was also evaluated by the separation efficiency of the chromatographic condition established through the system adequacy parameters (resolution, retention factor, tail factor, number of theoretical plates) for the chemical marker peaks, presented in Table 6. Figure 7 shows the chromatogram of the pooled standards.

Os marcadores químicos galocatequina e gaiato de epigalocatequina apresentaram pureza de pico maior que 99,0% nas análises.The chemical markers galocatechin and epigallocatechin gallate showed peak purity greater than 99.0% in the analyzes.

Tabela 6 - Resultados dos parâmetros cromatográficos obtidos para os marcadores reunidos 100 pg/mL cada, em metanol, por CLAE nas condições otimizadas (volume de injeção 2 pL; demais condições descritas na Tabela 5). 1 a: A resolução foi calculada em relação ao pico precedente.Table 6 - Results of the chromatographic parameters obtained for the markers assembled 100 pg / mL each in methanol by HPLC under optimized conditions (injection volume 2 pL; other conditions described in Table 5). 1a: The resolution was calculated from the previous peak.

Linearidade Foi realizada a construção de curvas analíticas, em dois dias diferentes, utilizando os marcadores químicos galocatequina (GC) SQR e gaiato de epigalocatequina (GEGC) SQR para verificação da linearidade. Preparou-se uma solução padrão única contendo 10 pg/mL de cada marcador químico em metanol 10% (V/V). A faixa de concentração dos marcadores foi estabelecida considerando a estimativa dos percentuais encontrados nos extratos preparados. Em seguida as soluções foram filtradas por meio de dispositivos filtrantes adequados e, transferidas para mini-frascos e injetadas no cromatógrafo.Linearity Analytical curves were constructed on two different days using chemical markers galocatechin (GC) SQR and epigallocatechin gallate (GEGC) SQR to verify linearity. A single standard solution containing 10 pg / ml of each chemical marker in 10% (V / V) methanol was prepared. The concentration range of the markers was established considering the estimated percentages found in the prepared extracts. Then the solutions were filtered through suitable filter devices and transferred to mini vials and injected into the chromatograph.

Injetaram-se, em triplicata, os volumes 3, 9, 15, 21, 27 e 33 pL da solução padrão única, totalizando-se 18 injeções, e a curva analítica foi construída para a relação massa da substância injetada versus área do pico (Tabela 7).Volumes 3, 9, 15, 21, 27 and 33 pL of the single standard solution were injected in triplicate, totaling 18 injections, and the analytical curve was constructed for the injected substance versus peak area ratio ( Table 7).

Tabela 7 - Construção da curva analítica para galocatequina e gaiato de epigalocatequina por CLAE-UV/DAD (10 μg/mL cada, em metanol 10% V/V). A faixa linear avaliada para cada marcador químico foi de 20% a 220% da concentração de trabalho, o que corresponde à faixa de concentração de 3 pg/mL a 33 pg/mL. A equação da reta e os resultados estatísticos foram obtidos a partir da regressão linear por meio do método dos mínimos quadrados. O coeficiente de correlação (r) foi superior a 0,99, o que indica linearidade satisfatória entre a área dos picos e as massas injetadas para os marcadores utilizados.Table 7 - Construction of the analytical curve for galocatechin and epigallocatechin gallate by HPLC-UV / DAD (10 μg / mL each in 10% V / V methanol). The linear range evaluated for each chemical marker was 20% to 220% of working concentration, which corresponds to the concentration range of 3 pg / mL to 33 pg / mL. The equation of the line and the statistical results were obtained from the linear regression by the least squares method. The correlation coefficient (r) was greater than 0.99, which indicates satisfactory linearity between the peak area and the injected masses for the markers used.

Tabela 8 - Parâmetros de linearidade obtidos para GC e GEGC (faixa linear de massa injetada 30-330 ng) por CI_AE (n = 6, em triplicata).Table 8 - Linearity parameters obtained for GC and GEGC (linear range of injected mass 30-330 ng) by CI_AE (n = 6, in triplicate).

Precisão intra-ensaio e precisão inter-ensaio A avaliação da precisão intra-ensaio (repetitividade) foi realizada, por meio de cálculo do desvio padrão relativo (DPR), a partir da injeção de soluções amostra de extrato etanólico seco de S. adstríngens (n = 6) contendo os marcadores a 100% da concentração de trabalho. As soluções da amostra foram preparadas conforme descrito a seguir: Solução da fração orgânica de extrato etanólico seco de S. adstríngens (1 mg/mL): Pesaram-se com exatidão cerca de 100 mg da fração orgânica de extrato etanólico seco, transferiram-se para balão volumétrico de 10 ml_. Adicionaram-se cerca de 5 ml_ de metanol, agitou-se manualmente para dissolução da amostra e completou-se o volume com metanol. Em seguida, pipetou-se 1,000 ml_ desta solução, em sextuplicata, com auxílio de micropipeta, para balões volumétricos de 10 ml_. Completou-se o volume com água ultrapura e homogeneizou-se. As soluções, na concentração 1 mg/mL, foram filtradas por meio de dispositivos filtrantes adequados, transferidas para mini-frascos e 10 pL de cada solução foram injetados no cromatógrafo.Intraassay Precision and Intraassay Precision Intraassay precision (repeatability) was assessed by calculating the relative standard deviation (RPD) from the injection of sample solutions of dry S. astringens ethanolic extract ( n = 6) containing markers at 100% working concentration. The sample solutions were prepared as follows: Solution of the organic fraction of S. astringens dry ethanolic extract (1 mg / mL): Approximately 100 mg of the organic fraction of dry ethanolic extract was weighed, transferred for 10 ml volumetric flask. About 5 ml of methanol was added, stirred manually to dissolve the sample and made up to volume with methanol. Then, 1,000 ml of this solution was pipetted into a micropipette in a sextuplicate into 10 ml volumetric flasks. The volume was completed with ultrapure water and homogenized. The solutions, at a concentration of 1 mg / mL, were filtered through suitable filter devices, transferred to mini vials and 10 µl of each solution was injected into the chromatograph.

Os teores de GC e GEGC nas frações orgânicas foram calculados a partir das áreas dos picos obtidos com as soluções amostra e com auxílio das curvas analíticas construídas conforme item Linearidade. A precisão inter-ensaio (precisão intermediária) foi avaliada após a repetição deste procedimento em dois dias diferentes, com o mesmo analista (n = 12) e também em dois diferentes, com analistas diferentes (n = 12). Os resultados foram agrupados e calculou-se o desvio padrão relativo (DPR). Na repetitividade (n = 6), os teores obtidos para GC e GEGC foram 1,29% (DPR= 1,62%) e 1,34% (DPR= 1,10%), respectivamente. Os valores de teor obtidos na precisão intermediária (n = 12), em dois dias diferentes com o mesmo analista, foram 1,29% (DPR= 1,76%) e 1,33% (DPR= 2,63%) para GC e GEGC, respectivamente. Os teores obtidos na precisão intermediária (n = 12), em dois dias diferentes por analistas diferentes foram 1,36% (DPR= 5,22%) e 1,31% (DPR= 2,77%) para GC e GEGC, respectivamente. Os valores de DPR (%) obtidos para a precisão inter e intra-ensaio indicam precisão satisfatória do método cromatográfico aplicado a matrizes vegetais.The GC and GEGC contents in the organic fractions were calculated from the peak areas obtained with the sample solutions and with the aid of the analytical curves constructed according to item Linearity. Interassay precision (intermediate precision) was evaluated after repeating this procedure on two different days with the same analyst (n = 12) and also on two different with different analysts (n = 12). The results were grouped and the relative standard deviation (SDR) was calculated. In repeatability (n = 6), the contents obtained for GC and GEGC were 1.29% (DPR = 1.62%) and 1.34% (DPR = 1.10%), respectively. The grade values obtained at intermediate precision (n = 12) on two different days with the same analyst were 1.29% (SDR = 1.76%) and 1.33% (SDR = 2.63%) for GC and GEGC, respectively. The levels obtained in intermediate precision (n = 12) on two different days by different analysts were 1.36% (DPR = 5.22%) and 1.31% (DPR = 2.77%) for GC and GEGC, respectively. The DPR values (%) obtained for inter and intra-assay precision indicate satisfactory accuracy of the chromatographic method applied to plant matrices.

Exatidão A determinação da exatidão foi realizada em três níveis de concentração, em triplicata para cada nível, por meio do método de adição de padrões (marcadores químicos) a uma quantidade conhecida de amostra de fração orgânica.Accuracy Determination of accuracy was performed at three concentration levels in triplicate for each level by the method of adding standards (chemical markers) to a known amount of organic fraction sample.

As soluções amostra fortificadas e não fortificadas foram filtradas por meio de dispositivos filtrantes adequados, transferidas para mini-frascos e 10 μΙ_ de cada solução foram injetados no cromatógrafo. Os teores foram calculados a partir das áreas dos marcadores químicos e das curvas analíticas obtidas. A exatidão foi calculada pela relação entre a concentração média de padrão determinada experimentalmente e a concentração de padrão teórica correspondente.Fortified and non-fortified sample solutions were filtered through suitable filter devices, transferred to mini-vials and 10 μΙ_ of each solution injected into the chromatograph. The levels were calculated from the chemical marker areas and the analytical curves obtained. Accuracy was calculated by the relationship between the experimentally determined mean standard concentration and the corresponding theoretical standard concentration.

As recuperações médias (n = 9) de 104,98% (RSD = 3,21%) obtida para GEGC e de 76,50% (RSD = 4,53%) obtida para GC comprovam a exatidão do método.The mean recoveries (n = 9) of 104.98% (RSD = 3.21%) obtained for GEGC and 76.50% (RSD = 4.53%) obtained for GC confirm the accuracy of the method.

Limite de detecção (LD) e limite de quantificação (LQ) Os limites de detecção e quantificação obtidos a partir das curvas analíticas são apresentados na Tabela 9.Detection Limit (LD) and Quantitation Limit (LQ) The detection and quantification limits obtained from the analytical curves are presented in Table 9.

Tabela 9 - Valores de limites de detecção (LD) e de quantificação (LQ) para os marcadores químicos GC e GEGC estimados pelas curvas analíticas.Table 9 - Limit of detection (LD) and quantification (LQ) values for chemical markers GC and GEGC estimated by analytical curves.

Avaliação do extrato de S. obovatum pelo método por CLAEEvaluation of S. obovatum extract by HPLC method

Realizou-se o doseamento da fração orgânica do extrato etanólico seco de S. obovatum. Os teores médios encontrados foram 1,22% p/p para GC e 1,42% p/p para GEGC. Para a espécie S. adstríngens os teores médios encontrados foram 1,35% p/p para GC e 1,32% p/p para GEGC.The organic fraction of the dry ethanolic extract of S. obovatum was measured. The average contents found were 1.22% w / w for GC and 1.42% w / w for GEGC. For S. astringens species the average contents were 1.35% w / w for GC and 1.32% w / w for GEGC.

Nas duas espécies, os marcadores químicos estão presentes na fração orgânica, variando-se somente a concentração dos mesmos.In both species, the chemical markers are present in the organic fraction, varying only their concentration.

Claims (9)

1. MÉTODO EXTRATIVO-ANALÍTICO PARA DETERMINAÇÃO DE TANINOS, caracterizado por utilizar monômeros como marcadores característicos e não fenóis totais, compreendendo as seguintes etapas: A) Preparo das soluções de amostra em concentrações determinadas; B) Pré-purificação das amostras por partição líquido-líquido; C) Otimização das condições cromatográficas; D) Validação do método analítico.1. EXTRACTIVE ANALYTICAL METHOD FOR DETERMINING TANIN, characterized by using monomers as characteristic markers and not total phenols, comprising the following steps: (A) preparation of sample solutions at specified concentrations; B) Pre-purification of samples by liquid-liquid partition; C) Optimization of chromatographic conditions; D) Validation of the analytical method. 2. MÉTODO EXTRATIVO-ANALÍTICO PARA DETERMINAÇÃO DE TANINOS, caracterizado pela etapa “A” da reivindicação 1, utilizar soluções de extrato etanólico seco e de substâncias de referência.EXTRACTIVE ANALYTICAL METHOD FOR DETERMINING TANIN, characterized by step "A" of claim 1, using solutions of dry ethanolic extract and reference substances. 3. MÉTODO EXTRATIVO-ANALÍTICO PARA DETERMINAÇÃO DE TANINOS, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo uso de marcadores químicos característicos selecionados do grupo compreendendo catequina, epicatequina, ácido gálico, galocatequina, epigalocatequina, proantocianidina B2 e gaiato de epigalocatequina.EXTRACTIVE ANALYTICAL METHOD FOR DETERMINING TANINS according to claim 2, characterized by the use of characteristic chemical markers selected from the group comprising catechin, epicatechin, galic acid, epigallocatechin, proanthocyanidin B2 and epigallocatechin gallate. 4. MÉTODO EXTRATIVO-ANALÍTICO PARA DETERMINAÇÃO DE TANINOS, caracterizado pela etapa “B” da reivindicação 1, ocorrer por partição líquido-líquido.EXTRACTIVE-ANALYTICAL METHOD FOR DETERMINING TANIN, characterized by step "B" of claim 1, occurring by liquid-liquid partition. 5. MÉTODO EXTRATIVO-ANALÍTICO PARA DETERMINAÇÃO DE TANINOS, caracterizado pela etapa “C” da reivindicação 1, compreender: A) Fase móvel A:B (95:5); A: H3PO4 0,1% V/V em água; B: H3PO4 0,1% V/V em acetonitrila; B) Modo de eluição Gradiente B 5% a 40% por 60 min; Isocrático B 40% por 5 min; Gradiente B 40% a 5% por 10 min; C) Fluxo 1 mL/min; D) Coluna C18, 250 x 4 mm, 5 μιη; E) Temperatura da coluna 40 °C; F) Comprimento de onda de detecção λ 210 nm com aquisição de espectros UV-VIS/DAD; G) Tempo de corrida de 60 a 100 min.EXTRACTIVE ANALYTICAL METHOD FOR DETERMINING TANINS, characterized by step "C" of claim 1, comprising: A) Mobile phase A: B (95: 5); A: H 3 PO 4 0.1% V / V in water; B: 0.1% V / V H 3 PO 4 in acetonitrile; B) Elution mode Gradient B 5% to 40% for 60 min; Isocratic B 40% for 5 min; Gradient B 40% to 5% for 10 min; C) Flow 1 mL / min; D) Column C18, 250 x 4 mm, 5 μιη; E) Column temperature 40 ° C; F) Detection wavelength λ 210 nm with acquisition of UV-VIS / DAD spectra; G) Running time from 60 to 100 min. 6. MÉTODO EXTRATIVO-ANALÍTICO PARA DETERMINAÇÃO DE TANINOS, caracterizado pela etapa “D” compreender ensaios de linearidade, precisão, exatidão, seletividade, robustez, limite de quantificação e limite de detecção.6. EXTRACTIVE ANALYTICAL METHOD FOR DETERMINING TANIN, characterized by step “D” comprising linearity, precision, accuracy, selectivity, robustness, quantification limit and detection limit tests. 7. MÉTODO EXTRATIVO-ANALÍTICO PARA DETERMINAÇÃO DE TANINOS, de acordo com as reivindicações 1 a 6, caracterizado por separar, identificar e quantificar marcadores químicos específicos de taninos compreendendo catequina, epicatequina, ácido gálico, galocatequina, epigalocatequina, proantocianidina B2 e gaiato de epigalocatequina em um tempo de corrida adequado para análises de rotina em matrix complexa de 60 a 100 min.EXTRACTIVE ANALYTICAL METHOD FOR DETERMINING TANINS according to claims 1 to 6, characterized in that it separates, identifies and quantifies specific chemical markers of tannins comprising catechin, epicatechin, gallic acid, galocatechin, epigallocatechin, proanthocyanidin B2 and epigallocatechid. at a running time suitable for routine analysis in complex matrix from 60 to 100 min. 8. MÉTODO EXTRATIVO-ANALÍTICO PARA DETERMINAÇÃO DE TANINOS, de acordo com as reivindicações 1 a 7, caracterizado por possibilitar a utilização de pequenas quantidades de amostras, na ordem de grandeza de miligramas.EXTRACTIVE ANALYTICAL METHOD FOR DETERMINING TANINS according to any of claims 1 to 7, characterized in that it allows the use of small quantities of samples in the order of milligrams. 9. MÉTODO EXTRATIVO-ANALÍTICO PARA DETERMINAÇÃO DE TANINOS, de acordo com as reivindicações 1 a 8, caracterizado por ser utilizado tanto em escala analítica, quanto em preparativa.EXTRACTIVE ANALYTICAL METHOD FOR DETERMINING TANINES according to any one of claims 1 to 8, characterized in that it is used on both an analytical and preparative scale.
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