CS199583B2

CS199583B2 - Process for preparing derivatives of adenine

Info

Publication number: CS199583B2
Application number: CS752123A
Authority: CS
Inventors: Luciano Re; Piergiorgio Zappelli
Original assignee: Snam Progetti
Priority date: 1974-04-30
Filing date: 1975-03-27
Publication date: 1980-07-31
Also published as: DE2519063A1; NO142081C; CA1058169A; AU8020675A; JPS50149697A; FR2269530A1; ZA751831B; BE828259A; SE419551B; NO751510L; DK140696C; GB1510534A; SE7504842L; CH618169A5; FR2269530B1; US4008363A; HU171512B; DK140696B; DD119789A5; YU79875A

Description

Vynález se týká způsobu přípravy funkčních '' 'derivátů adeninu ' ze ' sloučenin obsahujících adeninové jádro a produktů získaných jejich ' 'přeměnou.

Velká většina uvedených látek .. má velmi důležitý ' význam v ' biochemii a ' možnost' připravit funkční ' deriváty adeninu ' rozšiřuje značně oblast použití těchito sloučenin.

Například je ' možno uvést, že se v případě dinukleotidu nikotinamidadeninu ' (NAD), přičemž ' 'totéž se ' vztahuje '' i ' na ' ' . jiné další případy, mohou jeho deriváty, které byly učiněny funkčními, ' ' použít poté, co byly sloučeniny ' kovalenitní vazbou s molekulami' rozpustnými . nebo nerozpustnými ve vodě v selektivně kombinační chromatografií nebo ' jako' . nedifundující koenzymy.

Proto v případě reakce ' s makromolekulami rozpustnými ve vodě' jich ' lze použít jako makromolekulárních, 've vodě rozpustných nedifunidujících ' koenzymů. ' Takové koenzymy umožňují rozšíření pole aplikace známých enzymových 'soustav, ' ve kterých je enzym fyzikálně ' zakotven v nerozpustných strukturách, například vláknech, . polyakrylamidovém gelu, mikrokapslích ' atd. nerozpustných pro 'makromolekuly.

Z ' ' výše uvedeného' plyne, že fyzikálním zakotvením enzymové nebo polyenzymové soustavy v makromolekulárním koenzymu rozpustném ve vodě zůstávají jak enzym, tak i koenzym v blízkém styku' a itaik se' zabrání rozptýlení posledně ' jmenovaného ' mimo spojovací' strukturu,' zatímco až dosud to bylo nemožné vzhledem k nízké molekulární hmotnosti koenzymu.

V případě reakce s 'makromolekulami nerozpustnými' ve ' vodě je možno těchto sloučenin použít '' pro selektivní kombinační chromatografii nebo pro· ' enzymové reakce v heterogenní fázi s možností opětného získání ' enzymu.

Jak již bylo· uvedeno, vynález se' týká způsobu ' přípravy funkčních derivátů adeninu, přičemž konkrétně je ' možno· ' uvést, že ' pór stupem '' podle vynálezu se aminoskupina v ' poloze 6 v adeninovém jádře učiní funkční, jak ukazuje ' následující' . obecný vzorec:

NHi

ÍS?

V postupu vynálezu se vychází z látek obsahujících toto' jádro, například dinukleotidu ' nikotinamidadeninu, fosforečnanu dinukleotidu nikotinamidadeninu, adenosinmonofosfátu, cyklického· adenosinmonofosfátu, adenosindifosf átu, adenosintrifosfátu, adenosinu, adeninu.

Podstata způsobu přípravy funkčních derivátů adeninu podle vynálezu spočívá v tom, že se ve sloučeninách obsahujících adeninové jádro susbtituuje aminosikupina v poloze 6 reakcí těchto sloučenin s epoxidy kyselin nebo· s estery karboxylových kyselin obecného vzorce:

CH.t-CH-(CH.)cOOOR </ ‘

O ve kterém znamená

R atom vodíku, methylovou skupinu, ethylovou skupinu a propylovou skupinu a n celé číslo od 1 do 4, při teplotě pohybující se v rozmezí od 0 °C do 50 °C, s výhodou při teplotě okolí, v přítomnosti vody, ve vodě rozpustného rozpouštědla nebo rozpouštědla . těchto složek, při hodnotě pH okolo 6, za přídavku kyseliny chloristé, přičemž následuje přesmyk takto vzniklého substituovaného derivátu na dusíku adeninového jádra v poloze 1 při teplotě pohybující . se · v rozmezí od -|-5 do 80 °C a při hodnotě pH v rozmezí od 7 do 11,5.

Ve výhodném , provedení postupu · podle vynálezu se přesmyk vzniklých substituovaných · derivátů na dusíku adeninového· jádra provádí při hodnotě pH 11,2 a při teplotě 75 °C. .

Podle dalšího výhodného provedení , postupu podle vynálezu se ve sloučeninách, , · které kromě adeninového jádra obsahují ještě nikotinamidové jádro, před uvedeným přesmykem vzniklá sloučenina chemicky redukuje a po přesmyku se enzymaticky oxiduje.

Při výše · uvedené reakci · dojde к , alkylaci dusíku v poloze 1 adeninového· jádra, jak znázorňuje následující obecný vzorec:

Θ

ROOC-( CH^-CH - СНд-OH

rooc-(cMí}cCh-ch£nm přesmyiknutím uskutečněným při hodnotě pH mezi 7 a· 11,5 a při teplotě v rozmezí od +5 · do · -j-80^cC, s ' výhodou při hodnotě pH 1122· a při teplotě 75 °C, jaik již bylo· uvedeno výše.

Ve výše uvedených vzorcích mají· n a R význam· již shora uvedený. V případě,· že je přítomna sloučenina s nikotinamidovým jádrem, provede se redukce s výhodou před přesmyknutím.

J-aik již bylo uvedeno, postup podle vynálezu je zcela, obecný.

V · dalším popisu ' bude ' popsán postup přípravy funkčního NAD podle vynálezu a pro bližší ilustraci budou podrobně popsány jednotlivé stupně této přípravy. Z následujícího popisu· bude každému odborníkovi pracujícímu v daném oboru zřejmý postup získání adeninových derivátů s reaktivní funkční skupinou, při kterém se vychází z jakékoliv · adeninové ·sloučeniny, pomocí jednoduché volby pracovních podmínek pro výchozí sloučeniny, aniž se vybočí z rozsahu vynálezu.

Konkrétně uvedeno, příprava NAD derivátů obsahujících reaktivní funkční skupinu se provádí reakcí NAD s epoxykyselinou nebo esterem- ve vodě nebo· ve vodných roztocích běžných organických ' rozpouštědel rozpustných ve vodě · při · udržování · hodnoty pH· okolo 0 za pomoci kyseliny chloristé. · Tímto opatřením se získá · produkt alkylace dusíku v poloze· 1 adeninového· jádra. Tento' produkt se potom· podrobí chemické · redukci nikotinamidového kruhu, potom následuje přesmyk a vznikne · produkt alkylace aminoskupiny v poloze 6 · adeninového jádra.

Nakonec . 'se enzymaticky reoxiduje .· nikotinamidové jádro· dehy-drogenázou, čímž ' še získá derivát NAD obsahující' -reaktivní funkční skupinu. . Je třeba ještě zdůraznit, že jakmile je poloha 1 adeninového· jádra NAD alkylOvána, potom- sé všechny · /další reakce mohou provádět v téže reakční nádobě, aniž je nutné · izolovat · meziprodukty. .

V dalším budou uvedeny praktické příklady · · provedení postupu podle vynálezu · ,s . konkrétními 'pracovními podmínkami · a dalšími podrobnostmi, které· jsou uvedeny · pouze z ilustrativních · důvodů a nijak podstatu postupu podle vynálezu neomezují.

P'říklad 1

3,4-^<^]^<^:^^^l^i^1:anová kyselina

Takto získaný produkt se převede na funkční derivát následujícího vzorce:

β

Podle tohoto příkladu se postupuje tak, že se к 9,46' gramům (110 mmol) kyseliny

3-buitenové, rozpuštěné ve 30 mililitrech dichlormethanu a ochlazené na 0 °C, přidá 110 mmolů kyseliny peroctové v 80% roztoku (připravený podle H. Krimma, patent Spojených států amerických č. 2 813 896, 1957).

Reakční směs takto připravená se potom ponechá při teplotě okolí na vodní lázni.

Po čtyřdenním míchání za teploty okolí se přidá dalších 25 mmolů kyseliny peroctové. Kontrola pomocí plynové chromatografie, prováděna po 24 hodinách po druhém přidání kyseliny peroctové, ukázala na nepřítomnost kyiseliny 3-butenové. Reakční směs se potom zkoncentruje při teplotě 50 st. Celsia a tlaku 2,66 kPa a zbytek byl pětkrát za sebou promyt cyklohexanem a třikrát toluenem za stejného výše uvedeného sníženého tlaku a teploty, z,a účelem odstranění posledních podílů kyseliny octové. Výtěžek činí 10,27 gramu kyseliny 3,4-epo.xy butanové o čistotě 90 %, což bylo zjištěno plynovou chromatografií po esterifikaci diazomethanem. Zkoušky NMR a ebulioskopickou metodou, prováděné s methylesterem, potvrdily strukturu získaného produktu.

Příklad 2

Měthylester kyseliny 3,4-epoxybutanové

Podle tohoto provedení se postupuje tak, že se к 25,5 gramům (255 mimolů) methylesteru kyseliny 3-buténové ve 100 mililitrech ethyléteru, ochlazeného na 0°C, pozvolna přidává 406 mmolů kyseliny peroctové ve formě 80% roztoku, za současného promíchávání směsi;

Výše uvedená reakce se provádí při teplotě Okolí po dobu 10 dnů. Potom se přidá 100 mililitrů methylenchloridu a organická směs se promývá malými dávkami nasyceného roztoku hýdrouhllčttanu sodného až do neutrální réakce.

V dalším postupu se organická fáze vysuší bezvódým síranem sodným a zahustí se při teplotě 45 °C a při atmosférickém tlaku.

Takto získaný zbytek se rozdestiluje v kc loně s vláknitými pásky za sníženého tlaku

2,6 Pa, přičemž se jímá produkt destilující při 30 °C.

Tímto shora uvedeným postupem se získá 11,38 gramů methylesteru kyseliny 3,4-epoxybutanové, který po plynové, analýze a NMR-testu ukázal stejné složení a čistotu s methylesterem připraveným esterifikací 3,4-epoxybutanové kyseliny diazomethanem,

Příklad 3

Příprava dinukleotldu níikotinamid-6-(2-hydroxy-3-proipylamin) purinu, vzorec V, n = 1, R = H.

Podle tohoto provedení se postupuje tak, že se к 1 gramu (1,51 mmolu) NAD, rozpuštěného v 6 mililitrech dvakrát předestilované vody, přidá 42,1 mmolu kyseliny 3,4-epoxybutanové a hodnoty pH této směsi se upraví na 6 při teplotě O^C pomocí 6 N roztoku hydroxidu sodného. Hodnota pH směsi se- potom znova upraví na 6 a reakční nádoba, chráněná .před účinky světla a opat-řená magnetickým míchadlem, se spojí s pH-metrem a automatickou byretpu, naplněnou 1N roztokem kyseliny chíoristé, přičemž se tímto opatřením udržuje hodnota pH na 6 během celého průběhu reakce. Po osmidenním míchání při teplotě okolí se reakce přeruší (chromatografická analýza prováděná v tenké vrstvě) a po okyselení na hodnotu pH 4 pomocí 1 N roztoku kyseliny chíoristé se produkt vysráží přidáním desetinásobného objemu acetonu a ponecháním suspenze přes noc při teplotě okolo —20 °C. Získaný produkt se potom odstředí a suší v rotační sušičce. Ultrafialové spektrum tohoto .produktu v 0,1 N roztoku uhličitanu sodného (sloučenina II, n = = 1, R = H) ukazuje absorpci s vrcholem pří 25i9 milimikronech a s dvěma minimy při 267 milimikronech a přibližně při 290 milimikronech, což je charakteristické pro adeninové jádro alkylované v poloze Ni. Takto izolovaný produkt se potom znovu rozpustí v 60 ímilllitrech 1% hydrouhličitanu sodného. К tomuto roztoku se .potom přidá 400 miligramů Na^SzCk a poté se tento roztok zahřívá na vroucí lázni po dobu 5 minut za vzniku sloučeniny III (n = 1, R — = H). Po rychlém ochlazení tohoto roztoku se provádí probublávání vzduchem po dobu 15 minut za účelem rozložení přebytku Na2S20i.

Ultrafialové spektrum takto získaného roztoku ukazuje kromě maxima při 259 milimikronech a obou minim při 267 a přibližně při 290 milimikronech vznik nového absorpčního vrcholu při 340 milimikronech, který ukazuje na proběhlou redukci nikotinamidóvého kruhu.

. V dalším postupu se hodnota pH upraví na 11,2 pomocí 1 N roztoku hydroxidu sodného a vzniklý roztok se zahřívá při teplotě 75 °C ,po dobu 1 hodiny. V dalším se roztok ochladí na teplotu okolí, čímž se získá sloučenina IV (n = 1, R = H).

Ultrafialové spektrum takto získaného roztoku ukazuje nejen přítomnost vrcholu při 340 milimikronech, ale i vymizení vrcholu při 259 milimikronech a minima při 290 milimikronech, za tvorby nového vrcholu při 267 milimikronech, který je typický pro adeniny s alkylovanou aminoskupinou v poloze 6. V další fázi tohoto postupu se к roztoku přidají 3 mililitry tlumicího roztoku TRIS o koncentraci 3 M, hodnota pH se upraví na 7,5 pomocí 6 N roztoku kyseliny chlorovodíkové a nakonec se přidá 0,5 mililitru acetaldehydu a 100 mililitrů roztoku alkohol—dehydrogenázy z kvas199 983 nic ve 4,5 N roztoku síranu amonného (obsahujícího 29,4 miligramu enzymu na 1 mililitr).

Takto· získaná směs se .potom ponechá při teplotě okolí ve tmě po dobu 40- minut, za vzniku sloučeniny V (n = - 1, R = H).

Ultrafialové spektrum tohoto roztoku, získaného· shora uvedeným způsobem, ukazuje vrchol při -267 milimikronech, přičemž zmizel absorpční vrchol při 340 milimikronech, což potvrzuje úplnou- reoxidaci nikotinamidového kruhu. Po- okyselení roztoku na hodnotu -pH 3 pomocí- 6 N roztoku kyseliny chlorovodíkové se provede vysrážení desetinásobným objemem - acetonu a směs se ponechá stát přes - noc při teplotě okolo —20 °C a potom se oddělí - - olejovitá sraženina. Tato, sraženina, -se zředí 100 -mililitry dvakrát -destilované vody, hodnota pH se- upraví přídavkem - 1 N roztoku - hydroxidu sodného na hodnotu 8 a potom - se - -provede chromatografická analýza na sloupci obsahujícím 40 mililitrů anexové pryskyřice - Dowex 21 -K v HCOO^_ formě. , • Získaný produkt se potom zředí dalšími 100 -mililitry -redestilované -vody a potom 0,075 M roztokem kyseliny mravenčí, -dokud roztok neobsahuje žádné látky absorbující UV při 260 -milimikronech.

Další zředění pomocí 0,2 M roztoku kyseliny -mravenčí (v -množ-ství - 1,5 ' litru) - umožní oddělení celkového množství NAD derivátu obecného vozrce V‘ - (η — 1, R =H).

V další fázi tohoto postupu se provede zkoncentrování lyofUizací přibližně na 1/10 objemu, vysrážení - desetinásobným - - množstvím - acetonu (objemově), směs - se -ponechá stát přes- noc při - , teplotě přibližně- —20st. Celsia -a potom se- provede závěrečné odstředění, - čímž se získá - celkem 190 miligramů NAD - 'derivátu obecného -vzorce V (n— =1, R=H) v -čistém stavu. NMR - analýza, IR analýza a titrace pomocí hydroxidu sodného potvrzují strukturu získaného - produktu (viz schéma č. 1).

Schama 4

CONHt

I, Λ

R-P-PR'

- 'C^^CH-CHPn-O^C^R -- - - -hCi0

V _Θ .... — - - 1 - - -

CONH&

ROOC-ÍCH^CH-C^-N^r—N

OH . /vTT

I Rtp-P-R'

oOQ

RO(^(^-í(^CHíC^H“CHk“N OH

^CONH,

ΪΓ

R00C-I , ,K-P- P-^R'

H.H ><—OONH, ΓΥ

Rlp-P-R*- -· . (IV)

GAzyma-ticki.

ROOC-(C^)-CH-Ch)-NN ^Ομ Al—N w V

R-P-P-R' ^IVI

Příklad 4

Příprava dinukleotidu nikotinamid-6(2-hydroxy-3-karbmethoxypr opylamino] purinu, (sloučenina V, ' n — 1, R = CH3]

Podle tohoto příkladu se postupuje tak, že ' se 1 gram. NAD rozpustí v 5 mililitrech redestilované vody a hodnota pH se upraví na 6 pomocí 1 N roztoku hydroxidu sodného a poté se přidá · 5,25 gramu · methylesteru kyseliny 3,4-epoxybutanové.

Stejně jako v předchozím provedení se reakční nádoba chrání před účinky světla, opatří se· magnetickým míchadlem a propojí se přes pH-metr s automatickou byretou, obsahující 1 N roztok kyseliny chloristé, přičemž se hodnota pH směsi udržuje v této reakční nádobě na hodnotě 6 během celého průběhu reakce.

Reakce se ukončí · po čtyřdenním míchání při (eplotě. okolí (ichromatografická· analýza prováděná v tenké vrstvě], přičemž ' se . potom roztok okyselí přidáním 1 N· roztoku kyseliny chloristé až do dosažení hodnoty pH 4, následuje· vysrážení přídavkem desetinásobného objemu acetonu, přičemž se potom tato směs ponechá stát přes· noc při teplotě — 20 °C. Tímto· postupem se získá produkt II · (n = 1, R = CHs) a zbývající aceton se odstraní na rotačním· odpařováku. UV spektrum odpovídá struktuře.

Získaná sraženina se rozpustí v · 60 mililitrech 1% roztoku hydrouhličitanu sodného, potom se -přidá 400 miligramů NazSžOí, dále se tato směs zahřej‘e a· udržuje· se na vroucí vodní lázni po dobu 5 minut. Tato směs se rychle ochladí a potom se provádí probublávání vzduchem· po dobu 15· minut · za vzniku sloučeniny III (n — 1, · R = CH3], UV spektrum odpovídá struktuře.

Přídavkem · IN roztoku hydroxidu sodného se hodnota · pH roztoku· upraví na 11,2, směs se zahřívá při teplotě 75 °C po dobu 1 hodiny a potom se ochladí na· teplotu 0kolí, přičemž vznikne sloučenina IV (n—l, R=CH3]. UV spektrum · odpovídá struktuře.

K tomuto roztoku se potom přidají 3 militry tlumicího roztoku TRIS o koncentraci 3 M,'hodnota pH roztoku se upraví na 7,5 pomocí 6 N roztoku kyseliny chlorovodíkové a nakonec se přidá 0,5 mililitru acetaldehydu a 100 mi^krtlitru suspenze alkoholdehydrogenázy z kvasnic ve 4,8 N roztoku síranu amonného (obsahujícího 29,4 miligramy enzymu na 1 mililitr].

Takto získaná směs se potom ponechá stát 401 minut při teplotě okolí ve . tmě, přičemž vznikne sloučenina · V {n — 1, R = = · CH3]. UV spektrum odpovídá struktuře.

Získaný · roztok · se potom okyselí pomocí 6 N roztoku kyseliny · chlorovodíkové na hodnotu pH 3, potom se zředí desetaronásobným objemem acetonu, čímž · se· oddělí olejovitá vrstva. Tato olejovitá · vrstva, · získaná po nočním stání při teplotě okolo —20 . st. Celsia,· se rozpustí ve 100 mililitrech redestilované vody, hodnota pH · se upraví · na 8 přídavkem. 1 N roztoku hydroxidu · sodného a nakonec se provede chromatografické rozdělení na sloupci s· obsahem 40· mililitrů pryskyřice Dowex 21 K · v HCOO- formě.

V dalším se získaná látka zředí dalšími 10O · mililitry redestilované vody, potom 0',075 M roztokem kyseliny mravenčí, dokud roztok nemá žádné látky absorbující UV při teplotě 260 milimikronech.

V následující fázi se provede eluce pomocí ·0,2 M roztoku kyseliny mravenčí, čímž se oddělí požadovaný NAD· derivát vzorce V (n ·= 1, R = CH3], který se získá v čistém stavu po · zkon centrování . lyofilizací, vysrážení desetinásobným objemem acetonu, · po nočním stání při . teplotě okolo —20 °C a odstředění.

NMR analýza · a IR spektrum potvrdily strukturu získaného· produktu.

Příklad · 5

Příprava dinukleotidu nikotinamid-6-(2-hydr'Oxy-3-kkrboxypropylamino] purinu, vzorec V (n ·= 1, R = H] z dinukleotidu dihydronikotinamid^- (2-hydroxy-3-.karbme'thoxyprtpylamlno] purinu, vzorec IV (n = 1, R = CH3]

Podle tohoto příkladu se 1 gram dinukleotidu dihydřonikotinamid-6- (2-hydroxy-3-karbmethoxypropylamino] purinu · vzorce IV (n = 1, R — CHs] přidá k, · 15 mililitrům redestilované vody . a 15 mililitrům 0,5 N alkoholického roztoku hydroxidu · sodného a tato směs se zahřívá při teplotě 75' °C po· dobu 30 minut. Bezprostředně potom se tato směs ochladí, provede se enzymatická oxidace a další zpracování, popsané v · příkladu 3. Získaný produkt je identický · · (chrtmatografická analýza v tenké vrstvě, NMR, IR, UV spektra] s látkou připravenou podle příkladu· 3.

Claims

PŘEDMĚT , VYNALEZU

1. Způsob ' přípravy funkčních derivátů adeninu, vyznačující se tím, že se ve sloučeninách obsahujících adeninové jádro substituuje aminoskupina v ' poloze 6 reakcí těchto sloučenin s epoxidy kyselin nebo s estery karbo-xylových kyselin obecného vzorce

C/γ- ch- (сносом / \

O ve kterém znamená

R atom vodíku, -methylovou skupinu, ethylovou skupinu a propylovou skupinu, a n celé číslo od 1 do 4, při teplotě -pohybující se v rozmezí od 0°C do- - 50 °C, s výhodou při teplotě okolí, v přítomnosti vody, ve vodě -rozpustného rozpouštědla nebo roz pouštědla těchto složek, při hodnotě pH okolo- 6 za přídavku kyseliny -chloristé, přičemž následuje- přesmyk takto vzniklého substituovaného -derivátu na dusíku adeninového jádra v poloze 1 při teplotě pohybující se v rozmezí od +5 - do +80 °C a při hodnotě pH v- rozmezí od 7 do- 11,5.
2. Způsob -podle bodu 1, vyznačující se tím, že přesmyk vzniklých substituovaných derivátů na dusíku v poloze 1 adeninového jádra se provádí při hodnotě pH 11,2 a při teplotě 75 °C.
3. Způsob podle bodu 1, vyznačující - se tím, že ve výchozích- - sloučeninách, které kromě adeninového- jádra obsahují ještě nikotinamidové jádro, se před uvedeným přesmykem - vzniklá sloučenina chemicky redukuje a po přesmyku se enzymaticky oxiduje.