CS196604B1

CS196604B1 - Method of producing microbial rennet

Info

Publication number: CS196604B1
Application number: CS765577A
Authority: CS
Inventors: Frantiska Paleckova; Karel Culik; Jiri Pelzbauer; Raimund Denk; Milos Teply; Jaroslav Masek; Jana Havlova; Ludmila Mikova
Original assignee: Frantiska Paleckova; Karel Culik; Jiri Pelzbauer; Raimund Denk; Milos Teply; Jaroslav Masek; Jana Havlova; Ludmila Mikova
Priority date: 1977-11-21
Filing date: 1977-11-21
Publication date: 1980-03-31

Description

, ' Yynálevse týká způsobu výroby mikrobiálního „syřiala na bázi směsi exoproteáz s vysokým obsahem neutrální proteázy, kultivací mikroorganismu Bacillus subtijist za aerobních podmínek, v tekuté živné¹ půdě obsahující zdroje asimilovatelného uhlíku a dusíku., 'Yynálevse relates to microbial "syřiala exoproteases based mixtures with high content of neutral protease, culturing the Bacillus microorganisms subtijist under aerobic conditions in a liquid nutrient medium containing ^one sources of assimilable carbon and nitrogen.

„v , i _r L'V, i _r L

Jako syřidla, bylo používáno a stále se ještě používá rennetu, extraktu ze žaludků narozených telat. .Avšak již koncem 19. století bylo popsáno účinné mikrobiální syřidlo (H. W, Čonn, Centr. -Bqct. 12, 223, .1892,- C. Corini, Riv. Ing. Sanit. 3, 527, 1892). Nověji byl a, popsána syřidla produkovaná mikroorganismy, Aspergillus sp., Mucor sp., .Penicilliurn sp, a. Eurotium oryzae (americký pat. spis č. 1,391.219),„jakož i bakterie, které produkují enzymy vhodná* přo použití v sýrařství (G, J. WahΊίη. ϊ. Bact. lé, 355', 1928). .Rennet, an extract from the stomachs of born calves, has been used and is still used as rennet. However, by the end of the 19th century, an effective microbial rennet has been described (H. W, Bon, Centr-Bqct. 12, 223, 1892, C. Corini, Riv. Ing. Sanit. 3, 527, 1892). More recently, rennets produced by microorganisms, Aspergillus sp., Mucor sp., Penicilliurn sp, and Eurotium oryzae (U.S. Pat. No. 1,391,219) have been described, as well as bacteria that produce enzymes suitable for use in cheese production ( G, J. WahΊίη, B Bact., 355 ', 1928). .

,- I když rennet zůstává hlavním syřidlem, je stále více nahrgzpvgn, syřidly jiného původu, neboť je výrobně dražší a nestačí zvyšující se výrobě sýrů. _f Stále stoupající. poče,t 'publikací svědčí o tom, že se výzkum, zaměřuj© na otá.zky výroby syřidel . mikrobiálního původy. .- Although rennet remains the main rennet, it is increasingly nahrgzpvgn, rennets of a different origin, since it is more expensive to produce and is not sufficient for the increasing production of cheese. _f Still rising. While these publications suggest that research focuses on the question of rennet production. of microbial origin. .

Syřidlo bakteriálního původu je směs ěxoproteáz produkovaná na začátku sporulačního stadia cyklu buňky. Vhodnou kombinací genetických vlastností a jejich pozměněním lze získat stabilní směs exoproteáz, jež vyhovuje všem požadavkům kladeným na syřidlo. Důležitou složkou směsi exoproteáz sloužící jako syřidlo je proteáza s enzymatickou aktivitou při neutrální hodnotě pH (neutrální proteáza). Je proto důležité vést kultivaci vhodného mikroorganismu za takových podmínek, a'by se dosáhlo maximální produkce neutrální proteázy. Tomuto účelu je nutno přizpůsobit podmínky aerace, poněvadž vyšší obsah neutrální proteázy jé kromě genetického založení kmené závislý i na množství vzduchu používaného při kultivaci. V laboratorním měřítku lze optimálních podmínek dosáhnout při kultivaci v Erlenmayerových baňkách o objemu 750 ml s 80 ml média a na reciproké třepačce. Zvýšení aerace má sice za následek zvýšení celkového množství produkovaných exoproteáz (měřeno sýřivou aktivitou), ale obsah neutrální proteázy je nižší.Rennet of bacterial origin is a mixture of proteases produced at the beginning of the sporulation stage of the cell cycle. By a suitable combination of genetic properties and their alteration, a stable mixture of exoproteases is obtained which satisfies all the requirements for rennet. An important component of the rennet exoprotease mixture is a protease with enzymatic activity at neutral pH (neutral protease). It is therefore important to cultivate a suitable microorganism under such conditions in order to maximize the production of neutral protease. Aeration conditions need to be adapted to this purpose, since the higher content of neutral protease is dependent on the amount of air used in cultivation in addition to the genetic origin of the strain. On a laboratory scale, optimal conditions can be achieved by cultivating in 750 ml Erlenmeyer flasks with 80 ml medium and on a reciprocating shaker. An increase in aeration results in an increase in the total amount of exoproteases produced (measured by cheese activity), but the neutral protease content is lower.

Schopnost produkovat vysoká množství směsi exoproteáz se zvýšeným podílem neutrální proteázy se příznivě projevuje na půdách s krmnou pšeničnou moukou jako zdrojem uhlíku v koncentraci 8 až 3 % hmot., a to v laboratorních podmínkách na reciproké třepačce o 96 kyveeh/min s výkyvem 9 cm, v provozních podmínkách pak v 5 m³ tanku za míchání 300 obr./min a vzdušnění do 16. hodiny 1000 I vzduchu/min a po 16. hodině 1400 I vzduchu/min,The ability to produce high amounts of a mixture of exoproteases with an increased neutral protease content is beneficial in soils with feed wheat flour as a carbon source at a concentration of 8 to 3% by weight, under laboratory conditions on a 96 kyveeh / min reciprocating shaker with a 9 cm swing. in operating conditions, in a 5 m ³ tank with stirring of 300 rpm and aeration until 4 pm 1000 l air / min and after 4 pm 1400 l air / min,

Z uvedených poznatků vychází a optimálním podmínkám je přizpůsoben způsob výroby mikro>19 6 6 0 4 biálního syřidla na bázi směsi exoproteáz s vysokým obsahem neutrální proteázy, kultivací mikroorganismu Bacillus subtilis za aerobních podmínek v tekuté živné půdě obsahující zdroje asimilovatelného uhlíku a dusíku podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že se kultivace provádí v tekuté živné půdě, obsahující jako základní zdroje živin krmnou pšeničnou mouku, sušené mléko, sladinu a kvasnice nebo kvasničný extrakt, při teplotě 30 až 40 °C, s výhodou při 36 až 38 °C, za vzdušnění 33 až 40 % obj. vzduchu/min v růstové fázi mikroorganismu a 48 až 55 % obj. vzduchu/min v produkční fázi vztaženo na objem živné půdy, po ukončené kultivaci se z vyfermentované půdy oddělí biomáza, filtrát se za sníženého tlaku zahustí na 20 až 30 % původního objemu a z koncentrátu se odstraní balasty srážením rozpustnou vápenatou solí, s výhodou chloridem vápenatým, nebo organickým s vodou mísitelným rozpouštěddlem, s výhodou ethanolem, při teplotě 30 až 40 °C, s výhodou 35 až 38 °C, a při hodnotě pHBased on these findings, the process for producing micro> 19 6 6 0 4 bial rennet based on a mixture of exoproteases with a high neutral protease content is adapted and adapted to optimum conditions by culturing the microorganism Bacillus subtilis under aerobic conditions in a liquid culture medium containing assimilable carbon and nitrogen sources. characterized in that the cultivation is carried out in a liquid nutrient medium comprising, as basic nutrient sources, feed wheat flour, milk powder, wort and yeast or yeast extract, at a temperature of 30 to 40 ° C, preferably at 36 to 38 ° C , with aeration of 33 to 40% by volume of air / min in the growth phase of the microorganism and 48 to 55% by volume of air / min in the production phase, based on the volume of the nutrient medium; it is concentrated to 20 to 30% of the original volume and the ballasts are removed from the concentrate a soluble calcium salt, preferably calcium chloride, or an organic water-miscible solvent, preferably ethanol, at a temperature of 30 to 40 ° C, preferably 35 to 38 ° C, and at a pH value

5,3 až 6,5, s výhodou 5,6 až 6,2, načež se získaný koncentrát, je-li to žádoucí, zpracovává na suchý produkt, například rozprašovacím sušením.5.3 to 6.5, preferably 5.6 to 6.2, whereupon the concentrate obtained is, if desired, processed into a dry product, for example by spray drying.

V literatuře jsou popisovány různé způsoby izolace mikrobiálního syřidlá,' závislé na druhu použitého produkčního mikroorganismu a na složení kultivačního média. Izolace a čištění produktu z kultivačního média je možné různými způsoby a je zásadně ovlivněno požadavkem na čistotu a kvalitu preparátu, popřípadě i tím, zda finální produkt má být kapalný nebo pevný. Jsou popisovány převážně srážecí metody při izoelektrickém bodě, popřípadě v kyselé oblasti pH s přídavkem solí. Další případné čištění se obvykle provádí na iontoměničích, gelovou filtrací, dialýzou a frakčním srážením.Various methods for isolating microbial rennet, depending on the type of production microorganism used and the composition of the culture medium, are described in the literature. Isolation and purification of the product from the culture medium is possible in a variety of ways and is fundamentally influenced by the requirement for purity and quality of the preparation, and possibly whether the final product is to be liquid or solid. In particular, precipitation methods at the isoelectric point or in the acidic pH range with addition of salts are described. Further optional purification is usually carried out on ion exchangers, gel filtration, dialysis and fractional precipitation.

Při studiu různých způsobů izolace s přihlédnutím ke kvalitě konečného produktu bylo zjištěno, že při daném složení fermentační půdy se. optimálního výsledku izolace dosáhne po oddělení biomážy produkčního mikroorganismu, zahuštěním supernatantu, frakčním srážením rozpustných bílkovin a .odstraněním nerozpustných ba.lastních látek a vápenatých solí kyselin za definované hodnoty pH a teploty, přičemž účinná látka zůstává v roztoku, který po případné konzervaci a filtraci představuje finální produkt, tj. vysoce stabilní mikrobiální syřidlo. Jako nejvýhodnější se ukázalo frakční srážení chloridem vápenatým, na druhém místě bylo srážení ethanolem.By studying the different methods of isolation with respect to the quality of the end product, it was found that at a given composition of the fermentation broth, it was. optimal isolation results are achieved after separation of the biomass of the producing microorganism, concentration of the supernatant, fractional precipitation of soluble proteins and removal of insoluble ballasts and calcium salts of acids at a defined pH and temperature, the active ingredient remaining in solution which after preservation and filtration final product, ie a highly stable microbial rennet. Fraction precipitation with calcium chloride proved to be the most advantageous, followed by ethanol precipitation.

Bližší podrobnosti způsobu podle vynálezu jsou patrny z příkladů provedení, které tento způsob pouze ilustrují, ale nijak neomezují.Further details of the method according to the invention can be seen from the examples which illustrate the method but do not limit it in any way.

Příklad 1Example 1

Kulturou kmene Bacillu? subtilis, vyrostlou na šikmém nasopeptonovém agaru při 37 °C za dobu 4 až 5 dní a pak uloženou v chladničce při 5°C, se pomocí kličky zaočkuje 80 ml půdy v 750 ml Erlenmayerově baňce, jež má toto složení (v % hmot.):Bacillus culture? Subtilis, grown on sloping nasopepton agar at 37 ° C for 4 to 5 days and then stored in a refrigerator at 5 ° C, inoculate 80 ml of soil in a 750 ml Erlenmayer flask having this composition (in% by weight). :

krmná pšeničná mouka wheat flour 8,0 8.0 zahuštěná sladina thickened wort 5,2 5.2 odtučněné sušené mléko skimmed milk powder 1,25 1,25 kvasničný extrakt yeast extract nebo sušené kvasnice or dried yeast 0,6 0.6

pH se neupravuje, po sterilizaci má hodnotu kolem 6,0. Sterilizuje se při 120°C 30 minut. Sušené mléko se jako 10% roztok sterilizuje zvlášť při 120’C 20 minut a po sterilizací se přidává do půdy. Do kultivačních baněk se rozděluje po 8Ó ml. Kultivuje se na reciproké třepačce o 95 kyvech/min, s výchylkou 9 cm. Vzorky pro stanovení šýřivé aktivity se odebírají po 24 hodinách. Maximálních hodnot se dosahuje v 72. hodině a dále se již nemění. Tímto postupem se dosáhne produkce exoproteáz sýřivou aktivitou okolo 4000 SRN a obsahu 75 % hmot. neutrální proteázy. Příklad 2The pH is not adjusted, it is about 6.0 after sterilization. Sterilize at 120 ° C for 30 minutes. The milk powder is sterilized as a 10% solution separately at 120 ° C for 20 minutes and is added to the soil after sterilization. Dispense into culture flasks by 8 ml. Cultivate on a reciprocating shaker of 95 rocker / min, with a 9 cm deflection. Samples for determining activity are taken after 24 hours. The maximum values are reached at 72 o'clock and remain unchanged. By this procedure, the production of exoproteases is achieved with a cheese activity of around 4000 FR and a content of 75% by weight. neutral proteases. Example 2

Kultivace za týchž podmínek a na téže půdě jako v příkladu 1, pouze objem půdy v kultivační baňce se sníží na 40 ml (zvýšená aerace). Produkce měřená sýřivou aktivitou je 4500 SRN a obsah neutrální proteázy se sníží na 38 % hmot.Cultivation under the same conditions and on the same soil as in Example 1, only the volume of soil in the culture flask was reduced to 40 ml (increased aeration). Production measured by cheese activity is 4500 FR and the neutral protease content is reduced to 38% by weight.

P ř ř k I a d 3Example I and d 3

Kulturou kmene jako v příkladu 1 se zaočkuje půda tohoto složení (v % hmot.):The culture of the strain as in Example 1 was inoculated with soil of the following composition (in% by weight):

krmná pšeničná mouka wheat flour 3,0 3.0 zahuštěná sladina thickened wort 5,2 5.2 odtučněné sušené mléko skimmed milk powder 2,0 2,0 kvasnicový extrakt nebo yeast extract or sušené kvasnice dried yeast 0,3 0.3

Příprava a sterilizace půdy, očkování a kultivace a stanovení sýřivé aktivity je stejné jako v příkladu 1. Maximální produkce se dosáhne v 72. hodině kultivace, sýřivé aktivity 4200 SRN a obsahu 75 % hmot. neutrální proteázy.The preparation and sterilization of the soil, inoculation and cultivation and determination of the cheesing activity is the same as in Example 1. Maximum production is achieved in the 72nd hour of cultivation, cheesing activity 4200 Germany and a content of 75% by weight. neutral proteases.

Příklad 4Example 4

Kultivace a půda jako v příkladu 3, pouze objem půdy v kultivačních baňkách se sníží , na 40 ml. Produkce měřená sýřivou aktivitou je 4200 SRN a podíl neutrální proteázy se sníží až na 30 % hmot.Cultivation and soil as in Example 3, only the volume of soil in the flasks is reduced to 40 ml. Production measured by cheese activity is 4200 SRN and the proportion of neutral protease is reduced to 30% by weight.

P ř í k I a d 5Example 5

Pro kultivaci v 5 m³ tanku se v prvním stupni použije 24 hod. staré vegetativní inokulum (16 baněk po 80 ml), vyrostlé na půdě podle příkladu 1, jímž se naočkuje 100 litrů půdy ve 250litrovém očkovacím tanku. Půda má toto složení (v % hmot.)For cultivation in a 5 m ³ tank, a 24 hour old vegetative inoculum (16 flasks of 80 ml) grown on the soil of Example 1 was used in the first stage to inoculate 100 liters of soil in a 250 liter seed tank. Soil has this composition (in% by weight)

krmná pšeničná mouka wheat flour 8,0 8.0 zahuštěná sladina thickened wort 5,2 5.2 odtučněné sušené mléko skimmed milk powder 1,25 1,25 sušené kvasnice dried yeast 0,6 0.6 směs sojového a silikonového mixture of soya and silicone oleje (6:1) oils (6: 1) 0,2 0.2

pH se neupravuje, po sterilizaci má hodnotu 5,8 až 6,2. Sterilizuje se 40 minut při 120 °C. Sušené mléko se sterilizuje zvlášť jako 10% roztok 20 minut při 120 °C. Očkovací tank se očkuje 0,5 % vegetativního inokula připraveného : kultivací v baňkách na reciproké třepačce (96 kyvů/min, s výchylkou 9 cm) po dobu 24 h při 37 °C. V očkovacím tanku se kultivuje při 37°C± 1°C, vzdušnění 100 l/min a míchání 200 obr./min po dobu 24 h. Odpěňování není nutné. Po ukončené kultivaci se získaným inokulém v množství 100 I na196604 očkuje 2500 I půdy (stejného složení jako v očkovacím tanku) v 5 m³ produkčním tanku. Kultivace probíhá při 37°C ± 1 °C a míchání 300 obr./min. Do 16 hodiny se vzdušní 1000 l/min, od 16 hod. 1400 l/min. Pokud je nutno odpěňovat, používá se směsi sójového a silikonového oleje (6:1). Sýřivá aktivita se sleduje obvykle po 6., 24., 30., 36. a 42. hodině. Kultivace je ukončena mezi 30. až 42. hodinou, kdy sýřivá aktivita dosáhne maxima a již se dále nemění.The pH is not adjusted, having a value of 5.8 to 6.2 after sterilization. Sterilize at 120 ° C for 40 minutes. The milk powder is sterilized separately as a 10% solution for 20 minutes at 120 ° C. The inoculum tank is inoculated with 0.5% of the vegetative inoculum prepared by culturing in flasks on a reciprocating shaker (96 rpm, 9 cm deflection) for 24 h at 37 ° C. Cultivate in a seed tank at 37 ° C ± 1 ° C, aerate 100 l / min and stir at 200 rpm for 24 h. After completion of the cultivation, the inoculum obtained at 100 L per 196604 was seeded with 2500 L of soil (the same composition as in the seed tank) in a 5 m ³ production tank. Cultivation is carried out at 37 ° C ± 1 ° C and stirring at 300 rpm. Within 16 hours, air is 1000 l / min, from 16 hours 1400 l / min. If antifoam is required, a mixture of soybean and silicone oil (6: 1) is used. Cheese activity is usually observed after 6, 24, 30, 36 and 42 hours. Cultivation is terminated between 30 and 42 hours, when cheese-making activity reaches maximum and does not change anymore.

PřikládáHe attaches

2500 I fermentované půdy, připravené podle příkladu 5, o aktivitě kolem 4000 SRN, se ochladí na teplotu 15 “C a po přídavku 5 kg krystalického chloridu vápenatého se oddělí produkční biomáza na sedimentační odstředivce. Získaný supernatant se vakuově zahustí na filmové odparce na objem 650 litrů, přidá se 16,2 kg chloridu vápenatého, po rozpuštění se upraví pH na hodnotu 6,0 a koncentrát se zahřívá na teplotu 37 °C po dobu 2 hodin. Po ochlazení koncentrátu na 15 °C se vyloučený kal oddělí na sedimentační odstředivce a získaný, téměř čirý filtrát se po přídavku 18 g eugenolu a 18 g thymolu zfiltruje přes bakteriální filtr a rozplní. Účinnost takto připraveného tekutého produktu jě 20 000 SRN. Výtěžek izolace (vztaženo na obsah účinné látky ve fermentované půdě) je 70 %. Stejného výsledku bylo dosaženo při zpracování fermentační půdy složení jako v příkladu 3.The 2500 L of fermented broth prepared according to Example 5, having an activity of about 4000 FR, was cooled to 15 ° C and after addition of 5 kg of crystalline calcium chloride, the production biomass was separated on a sedimentation centrifuge. The supernatant obtained is concentrated in a vacuum evaporator to a volume of 650 liters, 16.2 kg of calcium chloride are added, after dissolution the pH is adjusted to 6.0 and the concentrate is heated at 37 ° C for 2 hours. After cooling the concentrate to 15 ° C, the precipitated sludge is separated on a sedimentation centrifuge and the obtained, almost clear filtrate is filtered through a bacterial filter and filled with 18 g of eugenol and 18 g of thymol. The efficacy of the liquid product thus prepared is 20,000 FR. The recovery yield (based on the active substance content in the fermented broth) is 70%. The same result was obtained in the fermentation broth composition as in Example 3.

Příklad 7Example 7

130 I koncentrátu po zahuštění na filmové odparce z příkladu 5 se smíchá se 40 I ethanolu a po 1 hodině mírného míchání při teplotě 35 °C se vyloučený sediment odfiltruje na rotačním vakuovém filtru, filtrát se zahustí ve vakuové oběhové odparce na objem 90 I, ochladí na 15“C a zfiltruje přes bakteriální filtr. Získaný tekutý preparát má účinnost 28 000 SRN, výtěžek izolace je 72 %.The 130 L of concentrate after concentration on the film evaporator of Example 5 is mixed with 40 L of ethanol and after 1 hour of gentle stirring at 35 ° C, the deposited sediment is filtered on a rotary vacuum filter, the filtrate is concentrated to 90 L in a vacuum circulator. to 15 ° C and filtered through a bacterial filter. The obtained liquid preparation has an efficiency of 28,000 SRN, the recovery yield is 72%.

Příklad 8Example 8

I tekutého produktu z příkladu 6 se usuší na laboratorní rozprašovací sušárně při teplotě 120/ /75 °C. Získá se 0,32 kg pevného preparátu ve výtěžku 51 %.The liquid product of Example 6 was dried in a laboratory spray dryer at 120/75 ° C. 0.32 kg of solid preparation is obtained in a yield of 51%.

P ř í k I a d 9Example 9

I tekutého preparátu z příkladu 7 se rozmíchají se 2 I methanolu, po oddělení vyloučených balastních látek odstředěním se ze získaného supernatantu vysráží další přísadou 1,6 až 1,8 I methanolu produkt, který se odfiltruje, promyje 100 ml methanolu, pak 100 ml izopropanolu a vysuší ve vakuu. Získá se 72,5 g suchého produktu o účinnosti 500 000 SRN ve výtěžku 65 °/₀.The liquid preparation of Example 7 is stirred with 2 l of methanol, after separation of the precipitated ballasts by centrifugation, the resulting supernatant is precipitated by further addition of 1.6 to 1.8 l of methanol. The product is filtered off, washed with 100 ml of methanol then 100 ml of isopropanol. and dried in vacuo. There were obtained 72.5 g of a dry product for efficacy of 500000 FRG yield of 65 ° / _0th

PŘEDMĚTSUBJECT

Claims

A method for producing a microbial rennet based on exoproteases with a high neutral protease content, by culturing the microorganism Bacillus subtilis under aerobic conditions in a liquid nutrient medium containing assimilable carbon and nitrogen sources, characterized in that the cultivation is carried out in a liquid nutrient medium containing wheat feed as essential nutrient sources. flour, milk powder, wort and yeast extract or yeast extract, at a temperature of 30 to 40 ° C, preferably at 36 to 38 ° C, with an aeration of 33 to 40 vol% / min in the growth phase of the microorganism and 48 to 55 vol% min

OF THE INVENTION in the production phase, based on the volume of the nutrient medium, after the cultivation, biomass is separated from the fermented soil, the filtrate is concentrated under reduced pressure to 20-30% of the original volume and the ballasts are removed by precipitation with soluble calcium salt, preferably calcium chloride; an organic, water-miscible solvent, preferably ethanol, at a temperature of 30 to 40 ° C, preferably 35 to 38 ° C, and a pH of 5.3 to 6.5, preferably 5.6 to 6.2, and then the resulting concentrate is optionally processed into a dry product, for example by spray drying.