CN2881633Y

CN2881633Y - 病人尿载脂蛋白b100超微量定量酶免试剂盒

Info

Publication number: CN2881633Y
Application number: CN 200520041931
Authority: CN
Inventors: 杜凤鸣
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2005-05-27
Filing date: 2005-05-27
Publication date: 2007-03-21
Anticipated expiration: 2015-05-27

Abstract

本实用新型属于生物技术领域，具体涉及病人尿中载脂蛋白B₁₀₀ (Apolipoprotein B₁₀₀，简称Apo B₁₀₀)超微量定量的酶免试剂盒。本实用新型提供一种病人尿中载脂蛋白B₁₀₀超微量定量酶联免疫吸附试验试剂盒，包括一个盒体(1)，盒体(1)内有一块48孔或96孔的载脂蛋白B₁₀₀抗体IgG预包被板(2)12瓶试剂，12瓶试剂分别为载脂蛋白B₁₀₀标准品6瓶(3)、载脂蛋白B₁₀₀抗体IgG酶标记液1瓶(4)、阴性对照1瓶(5)、10倍浓洗涤液1瓶(6)、显色剂甲液1瓶(7)、显色剂乙液1瓶(8)和终止液1瓶(9)。

Description

病人尿载脂蛋白B100超微量定量酶免试剂盒

技术领域

本实用新型属于生物技术领域，具体涉及病人尿中载脂蛋白B₁₀₀(Apolipoprotein B₁₀₀，简称Apo B₁₀₀)超微量定量的酶免试剂盒。

背景技术

当前临床对肾病综合症及糖尿病尿中Apo B₁₀₀(正常人及他种疾病尿中无Apo B₁₀₀)的检测还停留在检测血清等体液的酶免技术，检测Apo B₁₀₀量是g/L水平。用这种酶免技术检测一些疾病的Apo B₁₀₀超微量(μg/L)变化是不可能的。

研制肾病综合症及糖尿病尿中Apo B₁₀₀超微量定量的高灵敏度和高特异性的诊断试剂盒尚无报道。

发明内容

本实用新型的发明目的在于创建病人尿中载脂蛋白B₁₀₀超微量定量酶免试剂盒，既超越当前的检测技术g/L水平，又超越了微量的ng/L水平(1g＝1000ng)，而是超微量的μg/L(1ng＝1000μg)技术。

本实用新型提供一种病人尿载脂蛋白B₁₀₀超微量定量酶免试剂盒，包括一个盒体，盒体内有一块48孔或96孔的载脂蛋白B₁₀₀抗体IgG预包被板和12瓶试剂，12瓶试剂分别为载脂蛋白B₁₀₀标准品6瓶、载脂蛋白B₁₀₀抗体IgG酶标记工作液1瓶、阴性对照1瓶、10倍浓洗涤液1瓶、显色剂甲液1瓶、显色剂乙液1瓶和终止液1瓶。其配制如下：

一、载脂蛋白B₁₀₀标准品6瓶分别为浓度为10000μg/ml、8000μg/ml、6000μg/ml、4000μg/ml、2000μg/ml、0μg/ml各1瓶。

二、预包被板的制备 48孔或96孔

(1)包被液：

Na₂CO₃ 0.6g

NaHCO₃ 1.58g

重蒸水 500ml

加入Apo B₁₀₀抗体IgG，15μg/ml，调整PH至9.5加入板条各孔中，置湿盒中加盖，4℃过夜后甩干。

(2)洗涤液

Tris 2.42g

重蒸水 1000ml

加入板条各孔中，静置5秒后甩干，上述操作重复3次，以除去剩余抗体。

(3)封闭液

蔗糖 100g

羊血清 25ml

0.1MPBS 1000ml

加入板条各孔中放入湿盒中(加盖)37℃2h，弃去液体，吸水纸上拍干重复一次，待干燥后，放入有干燥剂的塑料袋封口，保存于4℃。

三、阴性对照的制备

正常人尿液用本实用新型试剂盒测定OD值0-0.09用万分之二硫柳汞防腐备用分装，500ul/瓶。

四、酶标记抗体工作液

小牛血清 30ml

0.15MPBS 50ml

甘油 20ml

20％Tween-20 2.5ml

调PH至7.2加入酶标记Apo B₁₀₀抗体IgG为1∶2000分装3ml/瓶。

五、显色剂甲

Na₂HPO₄.12H₂O 1.7g

柠檬酸.H₂O 0.5g

3％H₂O₂ 200ul

重蒸水 100ml

调PH至5.0 分装3ml/瓶

六、显色剂乙

EDTA 17.5mg

柠檬酸.H₂O 0.5g

重蒸水 100ml

加入10mlDMSO含60mg TMB的溶液25ul分装3ml/瓶

七、10倍浓洗涤液

Na₂HPO₄.12H₂O 2.6g

NaH₂PO₄.2H₂O 0.4g

20％Tween-20 2.5ml

重蒸水 100ml

调整PH至7.2 分装13ml/瓶

八、终止液

3M H₂SO₄ 3ml/瓶

本实用新型是用Apo B₁₀₀纯品为标准品，用Apo B₁₀₀抗体IgG包被，其最佳包被量为15μg/ml，Apo B₁₀₀抗体IgG联接辣根过氧化物酶为检测抗体，其最佳酶标记抗体工作浓度为1∶2000。Apo B₁₀₀超微量定量的夹心法，检测糖尿病及肾病综合症尿中的Apo B₁₀₀含量。

本实用新型酶联免疫吸附试验(ELISA)双抗体夹心法的操作步骤如下：

取出已包被条孔，插入支架上，用胶布固定，以防脱落。

↓

反应孔中分别加各浓度Apo B₁₀₀标准品每孔加10000μg/ml、8000μg/ml、6000μg/ml、4000μg/ml、2000μg/ml、0μg/ml各100μl待检尿液、阴性对照尿液各100μl。

↓

去反应孔内液体在草纸上拍2-3下，然后用洗涤液洗5次，每次孔中加满洗涤液后停留30秒钟，甩去洗涤液后都要在草纸上拍干，以便洗涤彻底。(10倍浓洗涤液1ml+9ml蒸馏水即为工作洗涤液)

↓

各孔滴加显色剂甲、乙各1滴，37℃中反应10分钟后再各孔滴加终止液1滴，置酶标仪450nm波长读取各孔光密度(OD)值。

↓

以标准品浓度为横座标，OD值为纵座标绘出标准曲线，以各待测尿液OD值在标准曲线上查出该尿液的Apo B₁₀₀浓度。

抗体IgG的鉴定：经两次盐析纯化的Apo B₁₀₀抗体IgG，经长海医院实验诊断科血清室用免疫电泳鉴定结果，Apo B₁₀₀为单一沉淀线。

标准曲线的制备：倍比稀释的Apo B₁₀₀(SigMA进口)标准液，作双抗体夹心法ELISA测定，分别绘出标准曲线图。标准曲线测定ApoB₁₀₀含量范围为0-1000μg/ml。在ELISA双抗夹心法的酶标板上的标准曲线的梯度浓度良好。

精密度试验：为了明确和证明本实用新型超微量定量Apo B₁₀₀ELISA的精密度，作了批内、批间和各医院实验室间重复性试验。批内及批间实验，在正常尿液中加Apo B₁₀₀标准品做批内测定，结果见表1。在正常尿液中加Apo B₁₀₀标准品做批间含量测定，结果见表2。所得变异系数(CV％)，说明本实用新型重复性良好。

表1 正常尿加标准品Apo B₁₀₀之批内实验

尿加Apo B₁₀₀(μg/ml)	n	测得Apo B₁₀₀X(μg/ml)	SD	CV％
尿加Apo B₁₀₀(μg/ml)	n	测得Apo B₁₀₀X(μg/ml)	SD	CV％	200	10	190.6	10.9	5.7

表2 正常尿加标准品Apo B₁₀₀之批间实验

尿加Apo B₁₀₀(μg/ml)	n	测得Apo B₁₀₀X(μg/ml)	SD	CV％
尿加Apo B₁₀₀(μg/ml)	n	测得Apo B₁₀₀X(μg/ml)	SD	CV％	200	10	188.0	13.2	7.0

特异性检定：正常人尿液11份，分别加入IgA、IgM、IgG、C3、β2M、α巨球蛋白、转铁蛋白、白蛋白、纤维蛋白降解产物(FDP)、Apo B₁₀₀及Apo AI各1000ng/ml尿，用Apo B₁₀₀试剂盒检测只测出Apo B₁₀₀的结果见表3：

表3 正常人尿中加不同蛋白的检出量

蛋白种类	正常人尿中各蛋白的加入量	检测结果	回收率
蛋白种类	正常人尿中各蛋白的加入量	检测结果	回收率	IgAIgMIgGC3β2Mα巨球蛋白转铁蛋白白蛋白FDPApo AIApo B₁₀₀	2.0g/ml尿2.0g/ml尿2.0g/ml尿2.0g/ml尿2.0g/ml尿2.0g/ml尿2.0g/ml尿2.0g/ml尿2.0g/ml尿1000μg/ml尿1000μg/ml尿	阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性960μg/ml尿	000000000096％

以上试验说明本ELISA试剂盒具有Apo B₁₀₀的特异性。

稳定性试验：将Apo B₁₀₀ELISA试剂盒放置37℃0、1、2、3、4、5天，每天分别测定同一阳性尿样，活性下降很少，说明本试剂盒稳定性好，结果见表4：

表4 Apo B₁₀₀试剂盒稳定性试验

年月日A_450nm	2003.3.8	2003.3.9	2003.3.10	2003.3.11	2003.3.12
年月日A_450nm	2003.3.8	2003.3.9	2003.3.10	2003.3.11	2003.3.12	阳性尿	0.940	0.912	0.900	0.892	0.878

注：阳性尿液在4℃冰箱放置5天。

上海长海医院肾内科及内分泌科用本实用新型试剂盒进行尿载脂蛋白Apo B₁₀₀测定的试验：

本文检测对象为21例正常人及原发性肾病综合症(肾病)24例(I型12例，II型12例)；另有8例重症糖尿病人，所有检测对象均留24小时尿，以酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定尿中(Apo AI)和(ApoB₁₀₀)，以μg/L为单位。

方法：用Apo AI及Apo B₁₀₀超微量定量试剂盒，以ELISA法进行检测。

结果：

1.正常人21例对照尿中Apo AI和Apo B₁₀₀均为“0”。

2.8例重症糖尿病人尿有Apo AI及Apo B₁₀₀为6例。单有Apo AI为2例。

3.肾病综合症病人尿中Apo AI和Apo B₁₀₀的含量见下表5：

表5 12例肾病综合症病人尿中Apo AI和Apo B₁₀₀的含量(μg/L)

I型		II型
I型		II型		Apo AI	Apo B₁₀₀	Apo AI	Apo B₁₀₀
260290420480520380420280325365420470	000000000000	460340310380820610490395725510670605	12021090280720420310205310210360405	Apo AI	Apo B₁₀₀	Apo AI	Apo B₁₀₀

讨论：

正常人尿中未检测到Apo AI和Apo B₁₀₀。

肾病综合症病人中I型者尿中Apo AI均阳性，而Apo B₁₀₀均阴性。II型者尿中Apo AI及Apo B₁₀₀均呈阳性，而且Apo AI含量＞Apo B₁₀₀含量。因此作为肾病综合症I型与II型鉴别的指标。一般认为I型肾小球滤过膜损伤比II型较轻。

初步认为尿中载脂蛋白Apo AI和Apo B₁₀₀测定可做为选择性载脂蛋白尿与非选择性载脂蛋白尿的鉴别指标之一。Apo B₁₀₀在尿中出现对肾病综合症患者的保肾或换肾症以及重症糖尿病的微细小血管已有损伤，出现的严重併发症有预警价值。

初步认为糖尿病人有严重併发症者微细小血管已有损害，尿中出现Apo AI和Apo B₁₀₀，有较大预警价值。

上海第二医科大学附属新华医院用ELISA法测定尿中载脂蛋白的试验：

在我院首次用于临床超微量定量检测20例肾病综合症尿中载脂蛋白AI(Apo AI)和载脂蛋白B₁₀₀(Apo B₁₀₀)，现将结果公布如下：

一、方法

用Apo AI及Apo B₁₀₀超微量定量试剂盒，以ELISA法进行检测。

二、结果

1.Apo AI和Apo B₁₀₀的标准曲线，可测范围在0～1000μg/ml之间。

2.正常人尿中脂蛋白含量：检测正常人对照15例，尿中Apo AI及Apo B₁₀₀均为阴性。检测肾病综合症20例，结果见表6。I型(10例)肾病综合症尿中Apo AI为阳性，Apo B₁₀₀为阴性，II型(10例)肾病综合症尿中Apo AI和Apo B₁₀₀均为阳性。

表6 肾病综合症尿中Apo AI及Apo B₁₀₀含量(μg/L)

I型		II型
I型		II型		Apo AI	Apo B₁₀₀	Apo AI	Apo B₁₀₀
310490320410460260	000000	420290490620430860	120110210410190780	Apo AI	Apo B₁₀₀	Apo AI	Apo B₁₀₀

280380490310

0000

610480590425

380310400180

三、讨论

根据我院试用ELISA方法结果，标准曲线与长海医院基本一致。同做一组样品呈显著相关。说明该法准确性及重演性均较好。15例正常人尿中均未见Apo AI及Apo B₁₀₀，而肾病综合症组患者，I型(轻型)尿中只出现Apo B₁₀₀，而II型(重型)尿中出现Apo AI及Apo B₁₀₀。由于呈球状的Apolipopretein分子颗粒大小不一样，Apo B₁₀₀分子直径约为Apo AI数倍，因此尿中Apolipopretein出现的种类不同不仅说明肾小球泸过膜受到损害，而且还能说明其损害的程度，故用ELISA法对肾病综合症进行分型比其他方法更为敏感，而Apo AI经Apo B₁₀₀又更敏感些。同时，又发现糖尿病患者(重症)尿中也有Apo AI经Apo B₁₀₀。ELISA法简便、快速、特异性强、灵敏度高、超微量，用于临床有较大的社会效益和经济效益。

同济大学上海放射免疫研究所用ELISA法测定人尿中载脂蛋白的试验：

在某些肾脏疾病中，尿中可出现不同类型的载脂蛋白，但以往没有见过这方面的报导。我所首先运用杜凤鸣教授创立的超微量定量酶联免疫吸附试验(简称ELISA)法检测人尿中载脂蛋白Apo AI和载脂蛋白Apo B₁₀₀。

现将结果公布如下：

一、方法

用Apo AI及Apo B₁₀₀超微量定量试剂盒，以ELISA法进行检测。

二、对象

(1)选正常健康人3个年龄组，4～16岁组(男20人，女30人)，17～23岁组(男25人，女20人)，45～60岁组(男35人，女30人)共160人。测定血中载脂蛋白AI(Apo AI)及载脂蛋白B₁₀₀(ApoB₁₀₀)含量。

(2)选肾病综合症I型及II型各13例，测定其尿中Apo AI及ApoB₁₀₀含量。

三、结果

(1)Apo AI及Apo B₁₀₀的标准曲线，可测范围在0～1000μg/ml之间。

(2)检测正常健康人尿中脂蛋白组分含量尿中Apo AI及Apo B₁₀₀均为“0”。检测肾病综合症26例，其中I型13例，II型13例，尿中载脂蛋白含量见表7。

表7 肾病综合症病人尿中载脂蛋白含量(μg/L)

I型		II型
I型		II型		ApoAI	Apo B₁₀₀	ApoAI	Apo B₁₀₀
340310460410480340410305380490390	00000000000	510610360310350820710610505740390	21041018080180590390340210420180	ApoAI	Apo B₁₀₀	ApoAI	Apo B₁₀₀

390240

00

580290

390180

四、讨论

根据我所试用ELISA方法结果，标准曲线与长海医院基本一致。同做一组样品呈显著相关。说明该法准确及重演性均好。健康人尿中均未见Apo AI和Apo B₁₀₀。

有意义的是肾病综合症，I型(轻型)尿中只出现Apo B₁₀₀，而II型(重型)尿中出现Apo AI和Apo B₁₀₀。由于呈球状的Apo分子颗粒大小不一样，Apo AI分子直径约比Apo B₁₀₀大，因此尿中Apo Lipoprotein出现的种类不同不仅说明肾小球泸过膜受到损害，而且还能说明其损害的程度，故用ELISA法对肾病综合症进行分型比其他方法更为敏感。来判断病人的病情轻重，以及预后。该ELISA法简便快速，超微量特异性强，灵敏度高，用于临床有较大的社会效益和经济效益。

用本实用新型检测血清及其他体液Apo B₁₀₀，需多倍稀释样品误差大，难以区别正常与异常含量差别。我们也曾用临床常用检测血清等体液酶免盒检测肾综合症及重症糖尿病尿中Apo B₁₀₀含量，几乎全部是“0”。因此两者不能相互扩展使用。

综合以上多家医院的使用情况，用本实用新型检测肾病综合症及重症糖尿病尿中发现Apo AI及Apo B₁₀₀。用本实用新型的Apo AI及Apo B₁₀₀试剂盒联合使用，可明确区分肾病综合症的I型或II型及重症糖尿病的微细小血管损伤的预警。可向临床提供上述两种疾病的预后。对肾疾综合症的保肾或换肾以及糖尿病的严重併发的下肢坏疽、视网膜病变，糖尿病的肾病及糖尿病的心脑血管病变有预警价值。

本实用新型具有较好的社会效益和经济效益。

附图说明

图1本实用新型的结构示意图

具体实施方式

实施例1

如图1所示，一种病人尿中载脂蛋白B₁₀₀超微量定量酶联免疫吸附试验试剂盒，包括一个盒体1，盒体1内有一块96孔的载脂蛋白B₁₀₀抗体IgG预包被板2和12瓶试剂。12瓶试剂分别为载脂蛋白B₁₀₀标准品6瓶3、载脂蛋白B₁₀₀抗体IgG酶标记液1瓶4、阴性对照1瓶5、10倍浓洗涤液1瓶6、显色剂甲液1瓶7、显色剂乙液1瓶8、终止液1瓶9。其中的载脂蛋白B₁₀₀标准品3分别为浓度为10000μg/ml、8000μg/ml、6000μg/ml、4000μg/ml、2000μg/ml、0μg/ml各1瓶；其中的载脂蛋白B₁₀₀抗体IgG酶标记液4、显色剂甲液7、显色剂乙液8和终止液9均为3ml；阴性对照5为500μl；10倍浓洗涤液6为13ml。

Claims

1、一种病人尿中载脂蛋白B₁₀₀超微量定量酶联免疫吸附试验试剂盒，包括一个盒体(1)，其特征在于：盒体(1)内有一块48孔或96孔的载脂蛋白B₁₀₀抗体IgG预包被板(2)和12瓶试剂，12瓶试剂分别为载脂蛋白B₁₀₀标准品6瓶(3)、载脂蛋白B₁₀₀抗体IgG酶标记液1瓶(4)、阴性对照1瓶(5)、10倍浓洗涤液1瓶(6)、显色剂甲液1瓶(7)、显色剂乙液1瓶(8)和终止液1瓶(9)。

2、根据权利要求1所述的一种病人尿中载脂蛋白B₁₀₀超微量定量酶联免疫吸附试验试剂盒，其特征在于其中的载脂蛋白B₁₀₀抗体IgG酶标记液(4)、显色剂甲液(7)、显色剂乙液(8)和终止液(9)均为3ml；阴性对照(5)为500ul；10倍浓洗涤液(6)为13ml。