CN220564640U - 基于反应器的细胞培养系统 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及细胞培养技术领域，提供了基于反应器的细胞培养系统，包括：中空纤维反应器组件、滤后液收集桶、膜式氧合器、生物反应器以及与生物反应器分别通过管路连通的补料瓶和接种瓶；中空纤维反应器组件包括多个并联的中空纤维反应器；中空纤维反应器的进液口连通有多通转接头，中空纤维反应器的排液口连通有滤后液收集桶；多通转接头通过两条管路与生物反应器并联，且其中一条管路上连通有膜式氧合器；管路上设置有蠕动泵；接种瓶内设置有细胞液，补料瓶内设置有培养液。利用膜式氧合器补充氧气，保证中空纤维反应器内细胞高密度生长的需要，同时，利用相并联的另一条管路为微载体提供通道。
Description
技术领域
本实用新型属于细胞培养技术领域，具体涉及一种基于反应器的细胞培养系统。
背景技术
目前的细胞培养系统是基于中空纤维反应器，将培养液在中空纤维反应器里循环流动，实现细胞的培养。但目前的系统存在的问题是，细胞高密度培养时溶氧无法保证，且生长在微载体上的HEPG2细胞需要直接灌注到中空纤维反应器里生长培养，存在占用空间大，细胞密度低，细胞分布均一性较差的问题。
实用新型内容
本实用新型的目的在于克服现有细胞培养系统溶氧无法保证的问题，提供一种基于反应器的细胞培养系统，以保证细胞高密度培养时的溶氧量。
本实用新型提供一种基于反应器的细胞培养系统，包括：中空纤维反应器组件、滤后液收集桶、膜式氧合器、生物反应器以及与生物反应器分别通过管路连通的补料瓶和接种瓶；所述中空纤维反应器组件包括多个并联的中空纤维反应器；所述中空纤维反应器的进液口连通有多通转接头，所述中空纤维反应器的排液口连通有所述滤后液收集桶；所述多通转接头通过两条管路与所述生物反应器并联，且其中一条管路上连通有所述膜式氧合器；所述管路上设置有蠕动泵；所述接种瓶内设置有细胞液，所述补料瓶内设置有培养液。
进一步地，所述基于反应器的细胞培养系统还包括缓冲瓶，所述缓冲瓶通过管路连通所述生物反应器，所述管路上设置有蠕动泵。
进一步地，所述生物反应器与所述管路通过管接头可拆式连接。
进一步地，所述管接头包括相拔插配合的第一管体和第二管体。
进一步地，所述管接头包括相螺纹配合的固定管和活动管，所述固定管与所述生物反应器固定连接，所述活动管的内壁设置有同心的凹槽环，所述管路的末端设置有同心的凸起筋，所述凸起筋同心活动嵌套在所述凹槽环内。
进一步地，所述中空纤维反应器组件包括四个并联的中空纤维反应器，所述中空纤维反应器设置于水浴锅内。
本实用新型的有益效果是：通过将与进液口连通的多通转接头与生物反应器并联两条管路，并在其中一条管路上设置膜式氧合器，利用膜式氧合器补充氧气，保证中空纤维反应器内细胞高密度生长的需要，同时，利用相并联的另一条管路为微载体提供通道。
附图说明
图1为本实用新型基于反应器的细胞培养系统的结构示意图。
图2为图1的任意一个管接头的剖视示意图。
图中，1-中空纤维反应器；2-滤后液收集桶；3-膜式氧合器；4-生物反应器；5-管路；6-补料瓶；7-接种瓶；8-缓冲瓶；9-蠕动泵；10-管接头；11-固定管；12-活动管；13-凸起筋；14-螺纹段；15-进液口；16-排液口；17-多通转接头。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本实用新型作进一步的详细描述。
如图1-2所示的基于反应器的细胞培养系统，包括：中空纤维反应器组件、滤后液收集桶2、膜式氧合器3、生物反应器4以及与生物反应器4分别通过管路5连通的补料瓶6、接种瓶7和缓冲瓶8；中空纤维反应器组件包括多个并联的中空纤维反应器1；中空纤维反应器1的进液口15连通有多通转接头17，中空纤维反应器1的排液口16连通有滤后液收集桶2；多通转接头17通过两条管路5与生物反应器4并联，且其中一条管路5上连通有膜式氧合器3；管路5上设置有蠕动泵9；接种瓶7内设置有细胞液，补料瓶6内设置有培养液，缓冲瓶8用于暂时存储生物反应器4内的培养液。
生物反应器4与管路5通过管接头10可拆式连接。在一些实施例中，管接头10包括相拔插配合的第一管体和第二管体。比如，将第一管体与生物反应器4固定连接，将第二管体与管路5固定连接，再将第一管体与第二管体拔插配合，实现生物反应器4与管路5的拔插连接。
本实施中，如图2所示，管接头10包括相螺纹配合的固定管11和活动管12，固定管11与生物反应器4固定连接，活动管12的内壁设置有同心的凹槽环，管路5的末端设置有同心的凸起筋13，凸起筋13同心活动嵌套在凹槽环内。固定管11处于固定状态，转动活动管12，可将活动管12与固定管11分离，也可通过活动管12实现管路5与生物反应器4的连通。其中，凸起筋13可在凹槽环内转动，但无法沿轴向移动，使活动管12可相对于管路5转动，但不脱离。
本实施例的中空纤维反应器组件包括四个并联的中空纤维反应器1，中空纤维反应器1设置于水浴锅内。
本实施例的生物反应器4集合了在线控制PH，DO以及带有搅拌等多功能的培养容器，主要由罐体和控制柜组成，通过PID式的过程控制算法，来对搅拌，温度，PH，DO，深层通气，表层通气，蠕动泵9实现智能控制，以及附加的模拟输入和输出，可用于细胞培养增殖的空间场所，并通过不断的向生物反应器4内补等量培养液的方式，再以等量培养液输入到中空纤维反应器1内，来达到灌流培养的目的。本实施例的基于反应器的细胞培养系统主要用于生长在微载体上HEPG2细胞的培养。
本实施例中生物反应器4通过控制柜的PLC控制系统来实现生物反应器4的自动化智能过程控制，其罐体包括不锈钢罐盖、底座和水夹套玻璃罐体各一个。在罐盖中设置的进出口包括：接种，温度传感器套管，深层通气，进料，出料，尾气冷凝，PH与DO传感器，灌流培养基添加，备用接口等，配置的接口规格有PG13.5mm出入口12个，6.35mm出入口3个，19mm出入口1个，可分别根据细胞培养需要来安装电极探头包括温度，PH，DO以及进料，出料，通气，尾气冷凝端口以及对应部件的硅胶管路5，组装好罐体后，通过121℃高压湿热灭菌，待罐体冷却后，通过控制柜上PH电极线，DO电极线，温度探头与罐体各电极接口的互联，细胞培养所需的工艺用气气点与罐体上通气口的互联，控制柜上水路进出循环接口与罐体水夹套进出循环接口互联，补料瓶6，缓冲瓶8，膜式氧合器3等与罐体的管路5接口通过管接头10互联，即可使生物反应器4成为一个无菌培养环境，用于细胞大规模培养生产的场所。其中，生物反应器4的罐体上设置有刻度线，通过刻度线反馈罐体内液体的体积。
本实施例的中空纤维反应器1，包括用来进液和排液使用的外壁管口，包括进液口15和排液口16，充填在外壁内部的中空纤维丝以及在外壁管两端的密封卡块和端盖。端盖在本文中位于外壁管两端的盖子，可以是具有一定深度的敞口盖子，可通过螺纹等方式与外壁管密闭连接。外壁管的材质可为本领域常用于细胞培养的生物相容性材料。中空纤维丝的材质可为生物相容性好的聚丙烯、聚砜、聚丙烯晴或聚乙烯等。
带有微载体的细胞液从进液口15进入中空纤维反应器1里，由于微载体cytopore由交联纤维素组成，孔径30μm，不会进入孔径小于1μm的中空纤维丝里，而中空纤维丝的微孔可截留分子量在10kDa的小分子，可进行小分子物资(如离子，小分子营养物质和气体分子)交换，如培养基营养液就可与毛细管外空间(简称ECS)处的生长在微载体上的细胞，进行物质交换。其原理是当培养基流过中空纤维反应器1时，由于流体内的压强在进液口15处，排液口16处以及ECS处的压强不同，迫使培养液向不同方向流动。当中空纤维反应器1的进液口15出于封闭时，由于进液口15处的压强(Pin)与排液口16处的压强(Pout)及ECS处的压强(Pecs)之间存在着Pin>Pecs>Pout的关系，培养液遵循流体力学的规律，一部分培养液直接通过中空纤维反应器1内腔，另外一部分培养液在进液口15处通过中空纤维丝，进入ECS，然后又在排液口16处穿过中空纤维丝，流回中空纤维反应器1内腔。这样就使附着在ECS处的细胞处于流动着的培养液中。培养液有效地向细胞提供营养物质，氧气等，同时不断将细胞培养中产生的代谢废弃物带走，避免其堆积起来对细胞生长造成不利影响，从而为细胞高密度生长创造有利条件，并通过与生物反应器4的串联共同培养，利用生物反应器4的在线培养系统，组成一个对在中空纤维反应器1内生长在微载体上的细胞产生连续灌流作用的培养在线系统。
由于生物反应器4本身可以对生长在其内的细胞完成DO，PH等工艺参数的控制，但考虑到中空纤维反应器1里的细胞高密度生长时，对DO的需求非常高，故在培养液输入至中空纤维反应器1内之前，在生物反应器4与中空纤维反应器1之间加装膜式氧合器3，来保证中空纤维反应器1里细胞高密度生长的需要。本实例中所用的膜式氧合器3为中空纤维式氧合器，以中空纤维膜作为气液交换的介质，为达到良好的气体渗透和防止培养液等物质对纤维孔洞的渗透多采用微孔中空纤维膜，膜壁的孔径约为0.03～0.1μm，壁外常涂覆具有特殊功能的高分子分离膜，气体与培养液在膜两侧通过扩散作用把O2溶解到培养液里，这种交换方式避免了与培养液直接接触，提高了培养液吸收O2能力。
培养液从膜式氧合器3的液体入口进入，医用纯氧从膜式氧合器3的气体入口进入，O2在中空纤维膜处经扩散作用与培养液接触后，培养液从膜式氧合器3的液体出口排出，进入到中空纤维反应器1内，气体从膜式氧合器3的气体出口排出，并在气体出口接上0.22μm的空气滤器，防止外源微生物造成污染。
本实施例中，使液体循环起来的动力装置是蠕动泵9，更优选是双向蠕动泵9。本实施例中，所使用的双向蠕动泵9，指该泵可驱动液体正向流动，也可驱动液体反向流动。可采用本领域常用的流量在1～100ml/min的蠕动泵9。
以在线培养在微载体cytopore上的HEPG2细胞为例，生物反应器4的工作体积为10L，将生物反应器4的各个部件如罐体，PH电极，DO电极，各种端口通路与之对应的取样、补料、接种、排液硅胶管路5等组装完成后，经121℃高压湿热灭菌1小时以上，与控制柜的各种探头线互联，如温度，PH，DO，转子马达，水路，工艺用气气路。打开对生物反应器4的控制，温度设定在37℃，搅拌速度设置在30rpm/min，PH设置在7.2，DO设置在50％，通气量设置在0.1到1SLPM。
中空纤维反应物的体积为140ml，缓冲区为80ml，其中，中空纤维材料为聚丙烯，长度180mm，纤维壁厚60μm，内经300μm，截留分子量为350kDa。
将6320cm2培养面积共10层细胞工厂的HEPG2细胞经0.25％胰酶-EDTA溶液消化，在用加了10％胎牛血清的MEM培养液终止对HEPG2细胞的解离消化，获得总量约为2*109的HEPG2的细胞液。
将细胞液在无菌环境下，直接倒入灭菌过的2L带有空气滤器的接种瓶7中，该接种瓶7由一个2L容量的血清瓶和2个不锈钢管路5穿过瓶盖，其中一根管路5连接空气滤器，防止接种瓶7被空气污染，另外一根管路5顶端通过管接头10与生物反应器4连通，通过蠕动泵9可将接种瓶7内的细胞液输入至生物反应器4内。
生物反应器4在完成细胞接种这一步操作前，早已于前一天完成了对cytopore微载体的孵育，将2g/L的1L微载体与9L加了10％胎牛血清的MEM培养液充分混匀在生物反应器4中，可促进有利于HEPG2细胞生长的蛋白贴壁在cytopore上。待HEPG2细胞液与孵育好的cytopore微载体接触后，将生物反应器4的参数设置为：转速30rpm，温度37℃，打开DO，PH的控制，待温度稳定2个小时后，取样对PH进行复测以及对贴壁在微载体上的细胞进行细胞密度的检测，测得细胞密度V0。
HEPG2细胞接种后24小时以内，细胞培养的过程只在生物反应器4内进行。通过实时取样测得生物反应器4内培养液的含糖量为1g/L，与MEM培养液的含糖量一致，由此得到细胞培养了24小时这段时间细胞都不怎么耗糖，说明HEPG2细胞处于细胞生长周期的延迟期，并测得培养24小时时微载体上细胞的细胞密度为V1。
从D1天开始开启连续灌流这一操作步骤，补料瓶6与生物反应器4连通的管路5上的蠕动泵9以5～6ml/min的速度往生物反应器4内补入含10％胎牛血清的MEM培养液，生物反应器4以等量的速度往中空纤维反应器1的进液口15输入培养液。
本实施例中，多通转接头17通过两条管路5与所述生物反应器4并联，其中一条管路5上连通有膜式氧合器3，与该膜式氧合器3连通的管路5与生物反应器4连通后，生物反应器4内与该管路5连通的管道内设置有35μm的滤网，用于允许培养液通过，但不允许微载体通过。而多通转接头17与生物反应器4并联的另一条未连通膜式氧合器3的管路5既可以允许微载体通过，也可以允许培养液通过。
等中空纤维反应器1注满培养液1小时后，通过与缓冲瓶8连通的蠕动泵9，将生物反应器4内的8L培养液输入至缓冲瓶8内，而生物反应器4内剩余的2L带有微载体的细胞液为4个中空纤维反应器1的一个培养周期所需的细胞液体积。每天通过蠕动泵9将500ml带有微载体的细胞液泵送至4个中空纤维反应器1内，共四天可将2L带有微载体的细胞液使用完。再将缓冲瓶8内的8L培养液利用蠕动泵9反向输入至生物反应器4内。开启震荡恒温水浴锅，温度设置为37℃，转速为40rpm，取样测得细胞密度为V2。
其中，在D2天对膜式氧合器3通入纯度为99.7％以上的医用氧气，以保证中空纤维反应器1内细胞高密度生长的DO需要。在中空纤维反应器1的一端，插入一根实时检测DO的光学电极，可用于检测中空纤维反应器1内的DO值，有利于根据中空纤维反应器1内的DO值，来实时调整通入膜式氧合器3的纯氧的通气量。
在中空纤维反应器1里生长在微载体上的HEPG2细胞培养的D5天，即可停止对生物反应器4的连续灌流培养，将生物反应器4内的培养液泵入至缓冲瓶8内，将补料瓶6清洗干净，补料瓶6存储生理盐水，将12L的生理盐水全部输入至生物反应器4内，通过蠕动泵9以60ml/min的连续灌流的速度完成对4个中空纤维反应器1内培养液的置换，将12L生理盐水全部清洗置换完后，即完成对生长在微载体上HEPG2细胞的生长培养收获工艺。
以上所述仅是本实用新型的优选实施方式，本实用新型的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本实用新型思路下的技术方案均属于本实用新型的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本实用新型原理前提下的若干改进和润饰，同样也应视为本实用新型的保护范围。
Claims (6)
1.一种基于反应器的细胞培养系统，其特征在于，包括：中空纤维反应器组件、滤后液收集桶、膜式氧合器、生物反应器以及与生物反应器分别通过管路连通的补料瓶和接种瓶；所述中空纤维反应器组件包括多个并联的中空纤维反应器；所述中空纤维反应器的进液口连通有多通转接头，所述中空纤维反应器的排液口连通有所述滤后液收集桶；所述多通转接头通过两条管路与所述生物反应器并联，且其中一条管路上连通有所述膜式氧合器；所述管路上设置有蠕动泵；所述接种瓶内设置有细胞液，所述补料瓶内设置有培养液。
2.根据权利要求1所述的基于反应器的细胞培养系统，其特征在于，所述基于反应器的细胞培养系统还包括缓冲瓶，所述缓冲瓶通过管路连通所述生物反应器，所述管路上设置有蠕动泵。
3.根据权利要求1所述的基于反应器的细胞培养系统，其特征在于，所述生物反应器与所述管路通过管接头可拆式连接。
4.根据权利要求3所述的基于反应器的细胞培养系统，其特征在于，所述管接头包括相拔插配合的第一管体和第二管体。
5.根据权利要求3所述的基于反应器的细胞培养系统，其特征在于，所述管接头包括相螺纹配合的固定管和活动管，所述固定管与所述生物反应器固定连接，所述活动管的内壁设置有同心的凹槽环，所述管路的末端设置有同心的凸起筋，所述凸起筋同心活动嵌套在所述凹槽环内。
6.根据权利要求1所述的基于反应器的细胞培养系统，其特征在于，所述中空纤维反应器组件包括四个并联的中空纤维反应器，所述中空纤维反应器设置于水浴锅内。
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| CN202321969622.6U CN220564640U (zh) | 2023-07-25 | 2023-07-25 | 基于反应器的细胞培养系统 |
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Family
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Family Applications (1)
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2023
- 2023-07-25 CN CN202321969622.6U patent/CN220564640U/zh active Active
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