CN215623633U - 一种慢病毒滴度检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本实用新型提供一种慢病毒滴度检测试剂盒，包括具有内腔的盒体和盒盖，所述盒体的内部设有固定层，所述固定层的侧面与所述盒体的内侧壁相贴，所述固定层的底面与所述盒体的底面接触；所述固定层上设有多个圆形凹槽，所述圆形凹槽包括第一凹槽和第二凹槽，多个所述第一凹槽并列一排设置于固定层上，多个所述第二凹槽并列一排、并与多个所述第一凹槽平行设置于固定层上，所述第一凹槽的直径为2.5～5cm，所述第二凹槽的直径为0.5～2cm，多个所述圆形凹槽内插设有慢病毒滴度检测试剂。所述慢病毒滴度检测试剂盒携带、储存方便安全、操作简便，且结构简单，易于生产制作，在病毒滴度检测试剂盒领域具有广阔的应用前景。

Description

一种慢病毒滴度检测试剂盒

技术领域

本实用新型属于生物技术领域，涉及一种病毒滴度检测试剂盒，尤其涉及一种慢病毒滴度检测试剂盒。

背景技术

慢病毒载体(Lentiviral vector，LVs)是在人类免疫缺陷I型病毒(HIV-1)基础上改造而成的病毒载体系统，区别于一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，能将目的基因或RNAi导入动物和人的原代细胞或细胞系。慢病毒的基因组是两条相同的正链RNA，感染细胞后在细胞浆中被其自身携带的反转录酶反转录为DNA，形成DNA整合前复合体，DNA进入细胞核后能整合到细胞基因组中，整合后的DNA转录为mRNA，mRNA进入细胞浆中，表达目的蛋白或产生RNAi干扰。

慢病毒载体产品在使用前需要进行滴度测定，现有技术中主要采用Elisa法、病毒基因组RT-qPCR法或病毒整合基因组qPCR法进行慢病毒滴度检测。

CN207998609U公开了一种慢病毒滴度检测试剂盒，包括盒体、盒盖、蜂鸣器、显示屏、按钮和微处理器，提供时间设定的功能，同时设有对照和检测两个部分，能够对慢病毒滴度进行检测，但其准确度较低。

CN210826178U公开了一种慢病毒滴度检测试剂盒，包括下壳、移动装置、固定装置和滴定装置，试剂盒密封度较高，检测环境较为洁净，且能够保证检测环境稳定，同时能够对实验时间进行准确计时，从而避免检测结果出现较大误差，但其结构复杂，操作繁琐。

综上所述，现有技术中如需对慢病毒滴度进行准确的检测，需使用多种试剂，多个试剂容器分装，携带和储存都不方便，因此，提供一种携带、储存方便安全、操作简便同时准确度高的慢病毒滴度检测试剂盒，在慢病毒滴度检测领域具有重要意义。

实用新型内容

针对现有技术的不足和实际需求，本实用新型提供一种慢病毒滴度检测试剂盒，所述试剂盒能够储存慢病毒滴度检测试剂，各慢病毒滴度检测试剂的试剂瓶能够牢固且有序地装在试剂盒内，携带、存储方便安全，取用过程便捷。

为实现上述目的，本实用新型采用以下技术方案：

本实用新型提供一种慢病毒滴度检测试剂盒，所述慢病毒滴度检测试剂盒包括具有内腔的盒体1和用于内腔开合的盒盖2，所述盒体的内部设有固定层3，所述固定层3的侧面与所述盒体1的内侧壁相贴，所述固定层3的底面与所述盒体1的底面接触，所述固定层3上设有多个圆形凹槽，所述圆形凹槽包括第一凹槽4和第二凹槽5；

多个所述第一凹槽4并列一排设置于固定层3上，多个所述第二凹槽5并列一排、并与多个所述第一凹槽4平行设置于固定层3上；

所述第一凹槽4的直径为2.5～5cm，包括但不限于2.6cm、2.7cm、2.8cm、3.0cm、3.5cm、4.0cm、4.2cm、4.4cm、4.6cm、4.7cm或4.9cm；

所述第二凹槽5的直径为0.5～2cm，包括但不限于0.6cm、0.7cm、0.8cm、0.9cm、1.2cm、1.4cm、1.6cm、1.7cm、1.8cm或1.9cm；

多个所述圆形凹槽内插设有慢病毒滴度检测试剂。

本实用新型中，慢病毒滴度检测试剂盒盒体1内的固定层3上设有多个圆形凹槽，多个所述圆形凹槽内插设有慢病毒滴度检测试剂，且圆形凹槽的直径不同，适用于不同体积的慢病毒滴度检测试剂，能够使装载更牢固，各慢病毒滴度检测试剂分别插入各圆形凹槽中，并不混放，取用时方便快捷。

所述固定层3的上表面为水平或倾斜设置，优选为倾斜设置。

本实用新型中，所述固定层3的上表面倾斜设置，此时固定层3上的圆形凹槽有深有浅，深的圆形凹槽用以插入较高的慢病毒滴度检测试剂的试剂瓶，浅的圆形凹槽用以插入较矮的慢病毒滴度检测试剂的试剂瓶，有助于均匀固定所有慢病毒滴度检测试剂的试剂瓶，并方便取用。

所述固定层3的底面与所述盒体1的底面粘接相连。

本实用新型中，所述固定层3的底面与所述盒体1的底面粘接相连，用以更稳固地固定各慢病毒滴度检测试剂的试剂瓶。

所述盒盖2内沿和/或盒体1上沿设有密封垫圈9。

所述固定层3为泡沫固定层或海绵固定层。

多余的所述圆形凹槽用与固定层3相同的材料进行填充。

所述盒盖2的内顶部设有缓冲层6，所述缓冲层上设有多个圆形凹槽，所述圆形凹槽包括第三凹槽7和第四凹槽8，所述缓冲层6上的第三凹槽7和第四凹槽8的位置和直径分别与所述固定层3上的第一凹槽4和第二凹槽5的位置和直径相对应。

本实用新型中，所述缓冲层6上的第三凹槽7和第四凹槽8的位置和直径分别与所述固定层3上的第一凹槽4和第二凹槽5的位置和直径相对应，用以插入各慢病毒滴度检测试剂的试剂瓶的瓶盖，在储藏和运输途中保持各慢病毒滴度检测试剂的试剂瓶稳定。

所述盒体1与盒盖2外侧设有包装盒。

所述盒体1为长方体型结构。

所述固定层3的第一凹槽4内插设有第一试剂瓶，所述固定层3的第二凹槽5内插设有第二试剂瓶；

所述第一试剂瓶包括缓冲溶液试剂瓶和去离子水试剂瓶；

所述第二试剂瓶包括引物试剂瓶、PCR酶试剂瓶、染料试剂瓶和探针试剂瓶。

本实用新型的慢病毒滴度检测试剂盒装载多种检测试剂，能够使用流式滴度法和病毒整合基因组qPCR法检测慢病毒的滴度，对两种结果进行对比，从而更准确反应慢病毒滴度。

与现有技术相比，本实用新型至少具有以下有益效果：

(1)本实用新型的慢病毒滴度检测试剂盒中，所述固定层上设有多个圆形凹槽，多个所述圆形凹槽内插设有慢病毒滴度检测试剂，圆形凹槽的直径不同，适用于不同体积的慢病毒滴度检测试剂，能够使装载更牢固，各慢病毒滴度检测试剂分别插入各圆形凹槽中，并不混放，取用时方便快捷；

(2)本实用新型的慢病毒滴度检测试剂盒中，所述缓冲层上的第三凹槽和第四凹槽的位置和直径分别与所述固定层上的第一凹槽和第二凹槽的位置和直径相对应，用以插入各慢病毒滴度检测试剂的试剂瓶的瓶盖，在储藏和运输途中保持各慢病毒滴度检测试剂的试剂瓶稳定；

(3)本实用新型的慢病毒滴度检测试剂盒装载多种检测试剂，能够使用流式滴度法和病毒整合基因组qPCR法检测慢病毒的滴度，对两种结果进行对比，从而更准确反应慢病毒滴度；

(4)本实用新型的慢病毒滴度检测试剂盒携带、储存方便安全、操作简便，且结构简单，易于生产制作，在病毒滴度检测试剂盒领域具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为实施例1慢病毒滴度检测试剂盒的盒体的结构图；

图2为实施例1慢病毒滴度检测试剂盒的盒盖的结构图；

图3为实施例2慢病毒滴度检测试剂盒的盒体的结构图；

图4为实施例2慢病毒滴度检测试剂盒的盒盖的结构图；

图5为荧光定量PCR标准曲线图；

其中，1-盒体，2-盒盖，3-固定层，4-第一凹槽，5-第二凹槽，6-缓冲层，7-第三凹槽，8-第四凹槽，9-密封垫圈。

具体实施方式

为进一步阐述本实用新型所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本实用新型作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本实用新型，而非对本实用新型的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1

如图1和图2所示，本实用新型提供一种慢病毒滴度检测试剂盒，包括盒体1、盒盖2、固定层3、第一凹槽4、第二凹槽5、缓冲层6、第三凹槽7、第四凹槽8和密封垫圈9。

所述盒体1的内部设有固定层3，所述固定层3的侧面与所述盒体1的内侧壁相贴，所述固定层3的底面与所述盒体1的底面接触，所述固定层3上设有多个圆形凹槽，所述圆形凹槽包括直径为2.5cm的第一凹槽4和直径为0.5cm的第二凹槽5，两个第一凹槽4并列一排设置于固定层3上，五个第二凹槽5并列一排、并与两个第一凹槽4平行设置于固定层3上。

所述固定层3的上表面为水平设置。

所述固定层3的底面与所述盒体1的底面粘接相连。

所述盒盖2的内顶部设有缓冲层6，所述缓冲层6上设有多个圆形凹槽，所述圆形凹槽包括第三凹槽7和第四凹槽8，所述缓冲层6上的第三凹槽7和第四凹槽8的位置和直径分别与所述固定层3上的第一凹槽4和第二凹槽5的位置和直径相对应。

所述固定层3为泡沫固定层。

所述盒盖2内沿设有密封垫圈9。

所述固定层3的第一凹槽4内插设有第一试剂瓶，所述固定层的第二凹槽5内插设有第二试剂瓶；

所述第一试剂瓶包括缓冲溶液试剂瓶和去离子水试剂瓶，缓冲溶液试剂瓶中装有流式缓冲液(流式buffer)，去离子水试剂瓶中装有去离子水；

所述第二试剂瓶包括引物试剂瓶、PCR酶试剂瓶、染料试剂瓶和探针试剂瓶，引物试剂瓶有2个，分别装有上游引物(WF primer)和下游引物(WR primer)，PCR酶试剂瓶中装有荧光定量PCR酶(2x Taqman qPCR Mix)，染料试剂瓶中装有定量PCR参考染料(ROX)，探针试剂瓶中装有探针(probe)，引物和探针的序列如表1所示。

表1

实施例2

本实用新型提供一种结构如图3和图4所示的慢病毒滴度检测试剂盒，包括盒体1、盒盖2、固定层3、第一凹槽4、第二凹槽5、缓冲层6、第三凹槽7、第四凹槽8和密封垫圈9。

所述盒体1的内部设有固定层3，所述固定层3的侧面与所述盒体1的内侧壁相贴，所述固定层3的底面与所述盒体1的底面接触，所述固定层3上设有多个圆形凹槽，所述圆形凹槽包括直径为5cm第一凹槽4和直径为2cm第二凹槽5，两个第一凹槽4并列一排设置于固定层3上，六个第二凹槽5并列一排、并与两个第一凹槽4平行设置于固定层3上。

所述固定层3的上表面为倾斜设置。

所述固定层3的底面与所述盒体1的底面粘接相连。

所述盒盖2的内顶部设有缓冲层6，所述缓冲层6上设有多个圆形凹槽，所述圆形凹槽包括第三凹槽7和第四凹槽8，所述缓冲层6上的第三凹槽7和第四凹槽8的位置和直径分别与所述固定层3上的第一凹槽4和第二凹槽5的位置和直径相对应。

所述固定层3为海绵固定层。

所述盒盖2内沿设有密封垫圈9。

所述固定层3的第一凹槽4内插设有第一试剂瓶，所述固定层的第二凹槽5内插设有第二试剂瓶；

所述第一试剂瓶包括缓冲溶液试剂瓶和去离子水试剂瓶，缓冲溶液试剂瓶中装有流式缓冲液(流式buffer)，去离子水试剂瓶中装有去离子水；

所述第二试剂瓶包括引物试剂瓶、PCR酶试剂瓶、染料试剂瓶和探针试剂瓶，引物试剂瓶有2个，分别装有上游引物(WF primer)和下游引物(WR primer)，PCR酶试剂瓶中装有荧光定量PCR酶(2x Taqman qPCR Mix)，染料试剂瓶中装有定量PCR参考染料(ROX)，探针试剂瓶中装有探针(probe)，引物和探针的序列如表1所示。

实施例3

使用实施例1所示试剂盒以流式滴度法对慢病毒LV-Luc-2A-eGFP(以下简称“Luc慢病毒”)进行滴度检测，检测方法包括以下步骤：

(1)收集细胞

1)将293T细胞接种到装有含有10％胎牛血清的DMEM培养基的12孔板中，每孔3×10⁵个细胞，培养过夜，慢病毒感染前取一个孔的细胞进行胰酶消化并进行细胞计数，计数结果记为B，为6×10⁵个/mL；使用含有10％胎牛血清的DMEM培养基将Luc慢病毒的原液分别梯度稀释4倍和16倍，分别取上述20μL Luc慢病毒的原液、20μL稀释4倍和20μL稀释16倍的Luc慢病毒加入到12孔板中进行慢病毒感染，每个样品进行两个重复，将12孔板中未进行慢病毒感染的293T细胞作为阴性对照，将12孔板置于37℃、5％二氧化碳培养箱中继续培养；

2)慢病毒感染24h后，弃掉12孔板中的培养基，每孔分别加入1mL新鲜含有10％胎牛血清的DMEM培养基，置于37℃、5％二氧化碳培养箱中继续培养；

3)慢病毒感染48h后，弃掉12孔板中的培养基，每孔分别加入200μL胰酶，消化30s后再加入800μL含有10％胎牛血清的DMEM培养基，使用移液器将孔内细胞充分吹散，吸出200μL吹散的细胞悬液加入到1.5mL离心管中并做好标记；

(2)流式滴度法检测滴度：

1)将步骤(1)获得细胞悬液于1000rpm离心5min，弃掉上清，并用200μL流式Buffer洗涤细胞；

2)继续于1000rpm离心5min，弃掉上清，加入100μL流式buffer重悬；

3)进行流式检测测定eGFP阳性细胞比例为(Luc慢病毒的原液99.4％，99.4％；4倍稀释的Luc慢病毒84.5％，89.9％；16倍稀释的Luc慢病毒42.0％，46.5％)；

(3)流式检测结果分析：

最终Luc慢病毒滴度结果为使用流式阳性率在10％～50％的样品的数据按公式(1)计算所得的结果；

Luc慢病毒滴度＝细胞数(B)×流式阳性率×稀释倍数/添加Luc慢病毒体积(mL)(1)；

结果为：Luc慢病毒滴度＝6×10⁵个/mL×(42.0％+46.5％)/2×16/0.02mL＝2.1E+08IU/mL。

实施例4

使用实施例2所示试剂盒以病毒整合基因组qPCR法对Luc慢病毒进行滴度检测，检测方法包括以下步骤：

(1)制备WPRE元件标准品，使用热激法将含有WPRE元件的质粒(核酸序列如SEQ IDNO:4所示)转入大肠杆菌Stbl3感受态(全式金)，将转化后的感受态细胞涂布于具有卡那霉素抗性的LB平板培养基，37℃培养过夜，挑取菌落接种至100mL液体LB培养基中，37℃、200rpm下过夜培养，收集菌液，使用无内毒素质粒中量提取试剂盒(天根)按说明书提取质粒，得到标准品。

分别将标准品稀释至1×10⁸copies/μL、1×10⁶copies/μL、1×10⁴copies/μL和1×10²copies/μL。

(2)收集细胞过程与实施例3所述步骤(1)相同；

(3)基因组提取：用血液组织细胞基因组提取试剂盒(天根，DP304)按说明书提取步骤(2)收集的细胞的基因组DNA；

(4)使用微量紫外分光光度计检测基因组DNA浓度(Luc慢病毒的原液感染细胞的基因组DNA浓度为168.32ng/μL，4倍稀释Luc慢病毒感染细胞的基因组DNA浓度为184.88ng/μL，16倍稀释Luc慢病毒感染细胞的基因组DNA浓度为119.14ng/μL)；

(5)qPCR分析：以提取到的Luc慢病毒感染细胞基因组DNA为模板，进行qPCR分析，同时对不同梯度稀释的标准品进行qPCR分析，qPCR反应体系如表2所示，qPCR采取两步法，使用仪器为Applied Biosystems QuantStudio3型实时荧光定量PCR仪，程序如表3所示；为减少误差每个样品进行3个重复，最终结果为所有结果的平均值，引物和探针的序列如表1所示；

表2

表3

(6)qPCR结果分析：检测结束后，使用仪器自带的软件以标准品的实验数据绘制标准曲线，标准曲线如图5所示，将Luc慢病毒感染细胞基因组的Ct值代入标准曲线，计算Luc慢病毒基因组拷贝数，Luc慢病毒滴度按式(2)计算；

Luc慢病毒滴度＝Luc慢病毒基因组拷贝数×稀释倍数/(100ng/6.6pg)×6×10⁵个/mL/添加病毒体积(mL)(2)；

检测结果如表4所示，最终Luc慢病毒滴度为不同稀释样品滴度(2.82E+07，4.50E+07，4.23E+07)的平均值3.85E+07。

表4

SEQ ID NO:4：

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综上所述，本实用新型的慢病毒滴度检测试剂盒中，固定层上不同直径的圆形凹槽适用于不同体积的慢病毒滴度检测试剂，能够使装载更牢固，各慢病毒滴度检测试剂分别插入各圆形凹槽中，并不混放，取用时方便快捷；缓冲层上的圆形凹槽的位置和直径分别与固定层上的圆形凹槽的位置和直径相对应，用以插入各慢病毒滴度检测试剂的试剂瓶的瓶盖，在储藏和运输途中保持各慢病毒滴度检测试剂的试剂瓶稳定，可见，本实用新型的慢病毒滴度检测试剂盒携带、储存方便安全、操作简便，且结构简单，易于生产制作，在病毒滴度检测试剂盒领域具有广阔的应用前景。

申请人声明，本实用新型通过上述实施例来说明本实用新型的详细方法，但本实用新型并不局限于上述详细方法，即不意味着本实用新型必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本实用新型的任何改进，均落在本实用新型的保护范围和公开范围之内。

Claims (5)

1.一种慢病毒滴度检测试剂盒，其特征在于，所述慢病毒滴度检测试剂盒包括具有内腔的盒体(1)和用于内腔开合的盒盖(2)；

所述盒体(1)的内部设有固定层(3)，所述固定层(3)的侧面与所述盒体(1)的内侧壁相贴，所述固定层(3)的底面与所述盒体(1)的底面接触；

所述固定层(3)上设有多个圆形凹槽，所述圆形凹槽包括第一凹槽(4)和第二凹槽(5)；

多个所述第一凹槽(4)并列一排设置于固定层(3)上，多个所述第二凹槽(5)并列一排、并与多个所述第一凹槽(4)平行设置于固定层(3)上；

所述第一凹槽(4)的直径为2.5～5cm，所述第二凹槽(5)的直径为0.5～2cm；

多个所述圆形凹槽内插设有慢病毒滴度检测试剂；

所述固定层(3)的上表面为倾斜设置；

所述盒盖(2)的内顶部设有缓冲层(6)；

所述缓冲层(6)上设有多个圆形凹槽，所述圆形凹槽包括第三凹槽(7)和第四凹槽(8)；

所述缓冲层(6)上的第三凹槽(7)和第四凹槽(8)的位置和直径分别与所述固定层(3)上的第一凹槽(4)和第二凹槽(5)的位置和直径相对应；

所述固定层(3)的第一凹槽(4)内插设有第一试剂瓶，所述固定层(3)的第二凹槽(5)内插设有第二试剂瓶；

所述第一试剂瓶包括缓冲溶液试剂瓶和去离子水试剂瓶；

所述第二试剂瓶包括引物试剂瓶、PCR酶试剂瓶、染料试剂瓶和探针试剂瓶。

2.根据权利要求1所述的慢病毒滴度检测试剂盒，其特征在于，所述固定层(3)的底面与所述盒体(1)的底面粘接相连。

3.根据权利要求1所述的慢病毒滴度检测试剂盒，其特征在于，所述盒盖(2)内沿和/或盒体(1)上沿设有密封垫圈(9)。

4.根据权利要求1所述的慢病毒滴度检测试剂盒，其特征在于，所述盒体(1)与盒盖(2)外侧设有包装盒。

5.根据权利要求1所述的慢病毒滴度检测试剂盒，其特征在于，所述盒体(1)为长方体型结构。

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