CN214076719U - 一种用于免疫分析的微流控芯片 - Google Patents
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Abstract
本实用新型公开了一种用于免疫分析的微流控芯片,包括芯片本体,所述芯片本体内设有微通道,所述微通道由呈Y形分布的反应通道、颗粒计数通道、缓冲液通道三部分组成,所述颗粒计数通道上设有差分阻抗颗粒计数装置,所述差分阻抗颗粒计数装置设有三个金电极,所述金电极的一端设在颗粒计数通道的内部,另一端位于芯片本体的外部且与信号发生器、信号放大器、锁相放大器、滤波器和示波器连接。本实用新型可在芯片内进行免疫反应并对反应产物进行颗粒计数,从而得出待测目标物的含量,具有结构简单、操作简便、检测效率高等优点。
Description
技术领域
本实用新型涉及一种用于免疫分析的微流控芯片,属于生物检测领域。
背景技术
食品安全、体外诊断和环境监测与民生安全息息相关,改善检测方法与手段具有极其重要的现实意义。传统的食品安全、体外诊断和环境监测所用仪器具有精度高、准确性好等特点,但是绝大部分仪器设备造价昂贵且携带不便,在进行检测之前需要对样本进行复杂的前处理,对使用仪器设备的人员也需要经过专业培训,存在成本高、效率低、便携性差等缺点。
免疫学分析方法在检测领域已得到广泛应用。其中,传统的酶联免疫吸附法(ELISA)具有精度高、操作简单和成本低等优点,使用酶标仪即可直接完成检测读数。但整个实验操作繁琐且耗时长,实验过程中诸多因素均会对检测结果产生影响。为解决上述问题,使快检方法更加“快、稳、准”,均相免疫反应应运而生。该方法比传统ELISA方法步骤少、操作简单且成本低,只需要通过一步反应,即可得出检测结果。
前期的工作中,我们将小孔电阻颗粒计数和免疫分析技术相结合,采用高分子绝缘微球作为信号探针,实现了高灵敏度与准确检测。库尔特电阻法在颗粒计数的仪器设备中应用众多,实现形式多为微通道与微孔配合,工作原理为在通道两段施加一定数值的恒压电源,微电极设置在微孔两侧,当颗粒通过微孔时由于微电极间电阻变化而引起电势变化,通过对微电极电势变化的信号进行收集、放大、分离等,从而分析出待测颗粒的数量与粒径。该方法稳定性好、颗粒识别效率高,但是基于库尔特计数法的颗粒计数仪器造价昂贵且携带不便,使用过程中需要反复清洗消除背景干扰,当颗粒数过多或颗粒粒径大于微孔孔径时,会发生堵塞且不易清洗排堵,极大的干扰了检测结果和降低了检测效率。
本实用新型选用差分阻抗法作为颗粒计数方法,在计数通道上摒弃了易堵塞且难以清洗的微孔而选用了通道计数。基于流体动力学原理,高流速的缓冲液与低流速的待检测颗粒液体在颗粒计数通道内形成稳定的不同流速层,待计数颗粒匀速稳定的依次通过芯片内部的金电极,实现信号收集。与之前工作相比,本实用新型结合免疫反应与差分阻抗法颗粒计数技术,将传统的小孔计数改进为基于流体动力学原理的差分阻抗通道计数法,与传统的基于库尔特电阻法颗粒计数器相比,免去了反复清洗、排堵等繁琐过程,芯片制造成本低廉,可以实现一次性使用,随用随换,根据实际需求可以应用于多种场景的快速检测,如食品安全快速检测、体外诊断、环境监测等。
实用新型内容
本实用新型的目的是提供一种用于免疫分析的微流控芯片,该芯片基于差分阻抗颗粒计数,对免疫反应的产物进行分析,从而得出目标物的含量,实现多种目标物检测。
本实用新型采用的技术方案是:
一种用于免疫分析的微流控芯片,包括芯片本体,所述芯片本体内设有微通道,所述微通道由呈Y形分布的反应通道、颗粒计数通道、缓冲液通道三部分组成,所述反应通道和缓冲液通道分别与颗粒计数通道相连通,所述反应通道和缓冲液通道的顶端设有进样口,所述颗粒计数通道的末端设有出样口,所述颗粒计数通道上设有差分阻抗颗粒计数装置,所述差分阻抗颗粒计数装置设有三个金电极,分别为正极电极、负极电极和初始信号电极、所述金电极的一端设在颗粒计数通道的内部,另一端位于芯片本体的外部且与信号发生器、信号放大器、锁相放大器、滤波器和示波器连接。
所述芯片本体外设有永磁铁,所述永磁铁位于反应通道和颗粒计数通道的连接部。
所述反应通道呈S形。
所述反应通道的内径为50-500μm。
所述颗粒计数通道的内径为10-100μm。
所述反应通道的顶端设有三个进样口。
所述滤波器由高通滤波器HPF与低通滤波器LPF组成。
所述信号放大器由一级信号放大器和二级信号放大器组成,所述锁相放大器和滤波器位于一级信号放大器和二级信号放大器之间。
在前期工作中我们将小孔电阻颗粒计数和免疫分析技术相结合,采用高分子绝缘微球作为信号探针,实现了高灵敏、准确检测。但基于库尔特电阻法的小孔颗粒计数装置存在造价高、携带不便、难清洗等缺点。为解决上述问题,本实用新型选用差分阻抗法对颗粒计数,并将免疫反应和差分阻抗颗粒计数集成到微流控芯片中,从而实现低成本、易携带和免清洗的检测。
根据待测对象的不同可选取适当的检测方法。当检测物基质复杂时,选取基于磁分离的方法进行检测。当检测物基质简单时,选取无需磁分离的均相免疫方法进行检测。
所述差分阻抗颗粒计数装置,具体包括信号采集与信号处理两部分,其中信号采集部分由三个金电极组成,分别为正极电极、负极电极和初始信号电极,所述正、负极电极与一级信号放大器相连,用于收集颗粒计数通道内的电势信号,所述初始信号电极与信号发生器连接,用于发出正弦激励信号,施加到初始信号电极的正弦激励信号驱动电流流经溶液到达正极电极和负极电极。所述信号处理部分由一级放大器、锁相放大器、低通滤波器、高通滤波器、二级放大器、示波器依次连接而组成,正、负极电极将电势信号传输到一级放大器进行一级放大,随后通过锁相放大器、低通滤波器与高通滤波器进行锁相和对高低频无关的噪声信号进行过滤去除,最后通过二级放大器进行二次放大,接入示波器观察波形。
本实用新型可应用于包括细胞、生物标志物、抗生素分子、农药分子、兽药分子、生物毒素、细菌等的检测,但不仅限于此类检测物。颗粒计数通道的计数对象为高分子绝缘微球,其粒径从1μm到50μm不等。
与现有的快速检测方法和传统的颗粒计数相比,本实用新型具有如下优点:
(1)本实用新型使用的是基于流体动力学原理的差分阻抗颗粒计数法,与传统的基于库尔特电阻原理的小孔颗粒计数法相比,本实用新型的颗粒计数是在具有一定内径的微通道内进行,不会造成堵塞,不需要反复清洗排堵,而且流速更快,检测效率更高。
(2)本实用新型将生物免疫反应和颗粒计数集成到同一装置上进行,免去了复杂繁琐的前处理和反应产物的分离,可适合各种免疫方法如双抗夹心法、竞争免疫法,均相免疫法等的检测,也适合各种目标物如细胞、细菌、兽药分子、农药分子、抗生素分子、血清和全血中生物标志物等的检测。
(3)微流控芯片具有体积小、精度高、生产成本低等优点,而且只需少量样本即可用于检测,且具有一次性使用随用随弃的特点。
(4)本实用新型还具有检测精度高、灵敏度和抗干扰能力好等优点。
附图说明
图1为本实用新型中免疫分析微流控芯片的结构示意图。
图2为本实用新型中差分阻抗颗粒计数装置的电路原理图。
图3为待检测颗粒通过检测金电极的局部放大图以及对应颗粒产生的电势变化。
图4为基于磁分离的双抗夹心法检测全血中降钙素原浓度与颗粒个数之间的线性关系曲线图。
图5为基于磁分离的免疫竞争法检测毒死蜱浓度与颗粒个数之间的线性关系曲线图。
图6为基于均相免疫法检测血清中降钙素原浓度与颗粒个数之间的线性关系曲线图。
具体实施方式
以下结合附图与实施例对本实用新型做进一步详细说明。
实施例1
本实施例提供一种基于差分阻抗颗粒计数的微流控芯片,用于免疫学分析。
参见图1所示,该微流控芯片包括芯片本体1,由两块聚二甲基硅氧烷基板制成,先通过光刻与丝网印刷在芯片下基板蚀刻出微通道和嵌入金电极,然后与上基板一次性密封成型。
所述微通道由呈Y形分布的反应通道2、颗粒计数通道3、缓冲液通道4三部分组成,所述反应通道2和缓冲液通道4分别与颗粒计数通道3相连通,所述反应通道2和缓冲液通道4的顶端设有进样口5,所述颗粒计数通道3的末端设有出样口6,其中,所述反应通道2的顶端设有三个进样口5,所述进样口5上均设有蠕动泵。
所述反应通道2呈S形,用于延长反应时间,其内径为50-500μm,所述颗粒计数通道3的内径为10-100μm,所述缓冲液通道4的内径略小于颗粒计数通道3。
参见图2所示,所述颗粒计数通道3上设有差分阻抗颗粒计数装置,所述差分阻抗颗粒计数装置上设有三个金电极,分别为正极电极7、负极电极8和初始信号电极9,所述金电极的一端设在颗粒计数通道3的内部,另一端位于芯片本体1的外部且与信号发生器、信号放大器、锁相放大器、滤波器和示波器连接。其中,正极电极7和负极电极8分别位于颗粒计数通道3的两端,用于收集颗粒通过时产生的电势信号,初始信号电极9位于颗粒计数通道3的中间并与信号发生器连接同时接地。由AD630一级放大器对正、负电极收集到的信号进行一级放大,随后通过锁相放大器、低通滤波器LPF与高通滤波器HPF对收集的特定信号进行锁相和对高低频无关的噪声信号进行过滤去除,最后通过AD630二级放大器进行二次放大,接入示波器观察波形。示波器将模拟信号转换成数字信号导入计算机,通过计算机MATLAB软件对数字信号进行绘图与分类,能更好地实现颗粒计数与粒径区分。
该装置可用于无需进行磁分离的均相免疫检测,检测原理如下:针对不同的目标物,将其对应的生物识别分子(如目标物的检测抗体、捕获抗体)分别修饰在绝缘微球表面。将待测物与上述绝缘微球-生物识别分子偶联物通过反应通道2前端的三个进样口5进样,三者在反应通道2内发生免疫反应并生成复合物。由于复合物的粒径远大于未反应的绝缘微球,而目标物的含量又与未反应的绝缘微球数量负相关,与复合物的数量正相关,因此可通过检测未反应的绝缘微球或复合物的数量确定目标物含量。
当反应液流经颗粒计数通道3时,由于绝缘微球的存在会导致通道内部的电阻值变化,电阻值变化又会导致检测电极间产生电势变化,且高分子绝缘微球的粒径越大,则电阻值变化越大,电极间产生的电势幅值越大。通过信号放大器配合滤波器和锁相器,对收集信号处理后导入计算机软件,通过MATLAB对信号进行二次处理,则每一个电势变化均为一个颗粒,且电势变化幅度越大表明通过的颗粒粒径越大,从而实现颗粒计数与粒径区分。
参见图3所示,为颗粒计数的局部放大图与颗粒通过检测电极时的电势变化图。高流速的PBS缓冲液通过缓冲液通道4前端的进样口5进样,与低流速的高分子绝缘微球同时汇入颗粒计数通道3内,基于流体动力学原理,当雷诺数、液体密度和流速满足一定条件时,不同流层的液体不会发生混合而会形成稳定流层,待计数的绝缘微球会稳定有序的通过检测电极,检测电极传递信号完成反馈,从而实现绝缘微球粒径的区分和计数。
在颗粒计数局部放大图中,待检测高分子绝缘微球1、2、3、4、5、6和7依次有序通过检测金电极,当高分子绝缘微球通过电极时发生电势变化,每个颗粒对应电势变化参见图3,当颗粒通过电极时,颗粒计数完成,电势变化结束。
实施例2
实施例1中的装置和方法适合待测物基质干扰少的目标物检测,属于一种均相免疫分析方法,也就是在不对反应产物进行分离的前提下直接进行颗粒计数从而得到目标物含量。
该芯片也适合用于基质干扰大的目标物检测,在对这类物质进行检测时,仅需在芯片本体1外位于反应通道2和颗粒计数通道3的连接部设一个永磁铁10即可。
该装置可用于需进行磁分离的非均相免疫检测,检测原理如下:针对不同的目标物,将其对应的生物识别分子(如目标物的检测抗体、捕获抗体)分别修饰在磁颗粒和绝缘微球表面。将待测物与上述修饰有生物识别分子的磁颗粒和绝缘微球分别通过反应通道2前端的三个进样口5进样,三者在反应通道2内发生免疫反应并生成复合物,接着通过永磁铁10对生成的复合物进行磁分离,剩下的溶液中仅含未反应的绝缘微球。由于目标物的含量与未反应的绝缘微球数量相关,因此可通过检测未反应的绝缘微球的数量确定目标物的含量。
本实施例使用差分阻抗颗粒计数的原理进行绝缘微球的计数,所使用的装置和原理与实施例1相同。
实施例3
为了使本领域技术人员更好地理解和使用本实用新型,下面进一步提供几个微流控芯片具体应用的实施例。
1.基于磁分离的双抗夹心法检测全血中降钙素原(PCT)
(1)制备磁颗粒-降钙素原捕获抗体偶联物
取2mg羧基修饰的磁颗粒(1μm,10mg/mL),用MES缓冲液(pH=6.0)洗涤两次,用MES缓冲液重悬后加入50μL EDC(10mg/mL)和25μL NHS(10mg/mL),混匀后在室温下活化15分钟。
活化完成后用PBS缓冲液洗涤两次,用PBS缓冲液重悬后加入0.2mg降钙素原捕获抗体,室温下反应2-4小时;反应结束后,用1%BSA溶液封闭30分钟,封闭完成后用PBST缓冲液洗涤2次,得到磁颗粒-捕获抗体偶联物并用PBS缓冲液重悬后保存于4℃待用。
(2)制备聚苯乙烯微球-降钙素原检测抗体偶联物
取2mg羧基修饰的聚苯乙烯微球(1μm和3μm,100mg/mL),用MES缓冲液(pH=6.0)洗涤两次,用MES缓冲液重悬后加入100μL EDC(10mg/mL)和50μL NHS(10mg/mL),混匀后在室温下活化15分钟。
活化完成后用PBS缓冲液洗涤两次,用PBS缓冲液重悬后加入0.15mg降钙素原检测抗体,室温下反应2-4小时;反应结束后,用1%BSA溶液封闭30分钟,封闭完成后用PBST缓冲液洗涤2次,得到聚苯乙烯微球-检测抗体偶联物并用PBS缓冲液重悬后保存于4℃待用。
(3)将全血样本、磁颗粒-捕获抗体偶联物、聚苯乙烯微球-检测抗体偶联物分别通过三个进样口注入微流控芯片中的反应通道(内径100μm),当聚苯乙烯微球直径为3μm时,控制磁颗粒与绝缘微球的重量比为3:1;当聚苯乙烯微球的直径为1μm时,控制磁颗粒与绝缘微球的重量比为2:1,同时控制反应通道内的流速为8μL/min,目标物及其捕获抗体、检测抗体三者在反应通道内发生双抗夹心免疫反应,生成复合物并流经永磁铁,将含有磁颗粒的复合物进行磁分离,剩下的反应液继续流入颗粒计数通道(内径60μm),将PBS缓冲液注入缓冲液通道并控制流速为48μL/min,向正、负电极施加DC 30V电压并进行颗粒计数。
当全血样品中降钙素原浓度越高,免疫反应结合的复合物数量越多,则芯片内未反应结合的聚苯乙烯微球数量越少。因此,全血样品中降钙素原含量与芯片内未反应结合的聚苯乙烯微球数量呈现负相关。将免疫复合物磁分离,通过差分阻抗法对未结合的聚苯乙烯微球进行颗粒计数,从而间接计算得出全血中降钙素原浓度。
以未结合的聚苯乙烯微球-检测抗体颗粒个数为纵坐标,降钙素原浓度为横坐标,得到两者之间的相互关系可用于降钙素原的定量检测。如图4所示,在0.1~100ng/mL范围内,颗粒个数与降钙素原浓度之间具有良好的线性关系,线性方程为Y=-102.2X+742.8(X为降钙素原浓度的对数值),R2=0.989。
表1采用标准加入法对全血中的降钙素原进行检测的结果
将该方法与传统的小孔颗粒计数法对比,对比结果如表2所示,结果表明本方法与传统的小孔计数法相比灵敏度高且相对标准偏差(RSD)小。传统的小孔颗粒计数法准确度与小孔和待测颗粒之间宽径比相关,待检测颗粒直径与小孔孔径越接近准确度越高,而本方法采用通道阻抗差分法颗粒计数无需小孔,直接收集待检测颗粒信号,检测结果更加准确。
表2本方法和小孔颗粒计数法对全血中降钙素原检测分析性能对比
分析性能 | 检出限(ng/mL) | RSD(%) |
本方法 | 0.05 | <5 |
小孔颗粒计数 | 0.5 | <12 |
将本方法中不同缓冲液流速下的检出限与检测时间进行对比,对比结果如表3所示,结果表明通过改变缓冲液流速可以改变颗粒通过检测电极速度,从而缩短检测时间,提高检测效率与检测灵敏度。
表3不同缓冲液流速下的检出限与检测时间对比
缓冲液流速(mL/min) | 检出限(ng/mL) | 检测时间(min) |
48 | 0.05 | <7 |
32 | 0.12 | <11 |
2.基于磁分离的免疫竞争法检测农药分子毒死蜱
(1)制备磁颗粒-毒死蜱抗体偶联物
取2mg羧基修饰的磁颗粒(1μm,10mg/mL),用MES缓冲液(pH=6.0)洗涤两次,用MES缓冲液重悬后加入50μL EDC(10mg/mL)和25μL NHS(10mg/mL),混匀后在室温下活化15分钟。
活化完成后用PBS缓冲液洗涤两次,用PBS缓冲液重悬后加入0.1mg毒死蜱抗体,室温下反应2-4小时;反应结束后,用1%BSA溶液封闭30分钟,封闭完成后用PBST缓冲液洗涤2次,磁颗粒-抗体偶联物用PBS缓冲液重悬后保存于4℃待用。
(2)制备聚苯乙烯微球-毒死蜱完全抗原偶联物
取2mg羧基修饰的聚苯乙烯微球(1μm,100mg/mL),用MES缓冲液(pH=6.0)洗涤两次,用MES缓冲液重悬后加入50μL EDC(10mg/mL)和25μL NHS(10mg/mL),混匀后在室温下活化15分钟。
活化完成后用PBS缓冲液洗涤两次,用PBS缓冲液重悬后加入0.2mg毒死蜱完全抗原,室温下反应2-4小时;反应结束后,用1%BSA溶液封闭30分钟,封闭完成后用PBST缓冲液洗涤2次,聚苯乙烯微球-毒死蜱完全抗原用PBS缓冲液重悬后保存于4℃待用。
(3)免疫检测毒死蜱
将一定浓度的毒死蜱、磁颗粒-抗体偶联物、聚苯乙烯微球-完全抗原偶联物同时注入微流控芯片中,三者在微通道中进行免疫竞争反应,反应结束后,未结合的聚苯乙烯微球-完全抗原偶联物数量与毒死蜱浓度正相关,在磁分离后可用于颗粒计数。以未结合的聚苯乙烯微球-完全抗原偶联物颗粒个数为纵坐标,毒死蜱浓度为横坐标,得到两者之间的线性关系。如图5所示,在5~1000ng/mL范围内,颗粒个数与毒死蜱浓度之间具有良好的线性关系,线性方程为Y=105.3X+485.4(X为毒死蜱浓度的对数值),R2=0.992,能够用于毒死蜱的定量检测。
3.采用均相免疫法检测血清中降钙素原
(1)制备聚苯乙烯微球-降钙素原捕获抗体和检测抗体偶联物
分别取2mg羧基修饰的聚苯乙烯微球(3μm,100mg/mL),用MES缓冲液(pH=6.0)洗涤两次,用MES缓冲液重悬后加入100μL EDC(10mg/mL)和50μL NHS(10mg/mL),混匀后在室温下活化15分钟。
活化完成后用PBS缓冲液洗涤两次,用PBS缓冲液重悬后分别加入0.15mg降钙素原捕获抗体和检测抗体,室温下反应2-4小时;反应结束后,用1%BSA溶液封闭30分钟,封闭完成后用PBST缓冲液洗涤2次,聚苯乙烯微球-捕获抗体和检测抗体偶联物分别用PBS缓冲液重悬后保存于4℃待用。
(2)免疫检测血清中降钙素原
将经检验后的含降钙素原的血清样本、聚苯乙烯微球-捕获抗体、聚苯乙烯微球-检测抗体同时注入微流控芯片中,三者在微通道中进行均相免疫反应,反应结束后,进行颗粒计数。以3μm微球颗粒个数为纵坐标,降钙素原浓度为横坐标,得到两者之间的相互关系可用于降钙素原的定量检测。如图6所示,在0.2~50ng/mL范围内,颗粒个数与降钙素原浓度之间具有良好的线性关系,线性方程为Y=-89.26X+1028.4(X为降钙素原浓度的对数值),R2=0.997。
Claims (8)
1.一种用于免疫分析的微流控芯片,包括芯片本体,其特征在于:所述芯片本体内设有微通道,所述微通道由呈Y形分布的反应通道、颗粒计数通道、缓冲液通道三部分组成,所述反应通道和缓冲液通道分别与颗粒计数通道相连通,所述反应通道和缓冲液通道的顶端设有进样口,所述颗粒计数通道的末端设有出样口,所述颗粒计数通道上设有差分阻抗颗粒计数装置,所述差分阻抗颗粒计数装置设有三个金电极,分别为正极电极、负极电极和初始信号电极、所述金电极的一端设在颗粒计数通道的内部,另一端位于芯片本体的外部且与信号发生器、信号放大器、锁相放大器、滤波器和示波器连接。
2.如权利要求1所述用于免疫分析的微流控芯片,其特征在于:所述芯片本体外设有永磁铁,所述永磁铁位于反应通道和颗粒计数通道的连接部。
3.如权利要求1所述用于免疫分析的微流控芯片,其特征在于:所述反应通道呈S形。
4.如权利要求1所述用于免疫分析的微流控芯片,其特征在于:所述反应通道的内径为50-500μm。
5.如权利要求1所述用于免疫分析的微流控芯片,其特征在于:所述颗粒计数通道的内径为10-100μm。
6.如权利要求1所述用于免疫分析的微流控芯片,其特征在于:所述反应通道的顶端设有三个进样口。
7.如权利要求1所述用于免疫分析的微流控芯片,其特征在于:所述滤波器由高通滤波器HPF与低通滤波器LPF组成。
8.如权利要求1所述用于免疫分析的微流控芯片,其特征在于:所述信号放大器由一级信号放大器和二级信号放大器组成,所述锁相放大器和滤波器设在一级信号放大器和二级信号放大器之间。
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CN202022919806.4U CN214076719U (zh) | 2020-12-08 | 2020-12-08 | 一种用于免疫分析的微流控芯片 |
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN114231598A (zh) * | 2021-11-08 | 2022-03-25 | 华中农业大学 | 基于点击反应信号放大可视化检测多目标物的均相分析方法及其配套设备 |
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2020
- 2020-12-08 CN CN202022919806.4U patent/CN214076719U/zh active Active
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN114231598A (zh) * | 2021-11-08 | 2022-03-25 | 华中农业大学 | 基于点击反应信号放大可视化检测多目标物的均相分析方法及其配套设备 |
CN114231598B (zh) * | 2021-11-08 | 2024-05-03 | 华中农业大学 | 基于点击反应信号放大可视化检测多目标物的均相分析方法及其配套设备 |
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GR01 | Patent grant | ||
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