CN211645259U

CN211645259U - 一种dna处理器、文库构建器、杂交捕获文库的制备装置

Info

Publication number: CN211645259U
Application number: CN201921931825.XU
Authority: CN
Inventors: 王晓雯; 王娟; 李大为; 玄兆伶; 王海良; 肖飞
Original assignee: Anouta Gene Technology Beijing Co ltd; Beijing Annoroad Medical Laboratory Co ltd
Current assignee: Anouta Gene Technology Beijing Co ltd; Beijing Annoroad Medical Laboratory Co ltd
Priority date: 2018-12-29
Filing date: 2019-11-11
Publication date: 2020-10-09
Anticipated expiration: 2029-11-11

Abstract

本实用新型提供一种DNA处理器、文库构建器、杂交捕获文库的制备装置，所述制备装置顺序包括文库构建器和杂交组件。所述文库构建器基于经所述提取部件提取的备处理的DNA建立DNA文库样本，所述杂交组件基于所述文库构建器建立的DNA文库样本制备杂交捕获文库。本实用新型涉及的装置采用双标签的策略，在加接头时将文库两端加入不同的随机标签，通过PCR扩增，每个相同来源的DNA片段形成带有互补标签家族的正负链文库，起到对同一个模板的DNA正负链进行区分的目的，通过对正负链的高深度测序，互相校正，从而降低假阳性率，避免PCR错误及测序错误及DNA损伤等。

Description

一种DNA处理器、文库构建器、杂交捕获文库的制备装置

技术领域

本实用新型涉及基因测序领域，尤其涉及一种DNA处理器以及基于所述 DNA处理器的杂交捕获文库的制备装置。

背景技术

肿瘤在生长过程中，经过快速多次的增殖分裂，其子细胞DNA序列发生改变，导致其侵袭能力、药物敏感性等多方面产生差异。因其具有高度异质性的，故同一个肿瘤组织中可以含有多种亚克隆，并且其突变可能以极低比例存在(如0.1％-0.01％)。而目前Illumina Hiseq测序的单碱基错误率为0.2％左右，另外PCR过程中，DNA聚合酶的固有错误率也可以达到10⁷～10^-5，因此，低频突变的检出准确性，假阳性结果的过滤成为很大的挑战。

肿瘤病人外周血循环DNA与组织DNA所携带的突变具有一定的一致性，即检测肿瘤病人外周血游离DNA能够在一定程度上反应肿瘤组织的突变状况，再加上循环外周血留取方便、无创、可随时进行动态检测，因此成为了癌组织样本较佳的替代选择。

但在循环血中除了肿瘤DNA，也存在正常组织DNA，且因个体差异，肿瘤发生发展时期，治疗时期等因素，循环DNA的总量不定，肿瘤DNA所占比例可以很低，这就要求突变检测的技术手段不依赖DNA浓度的判断，且具备高特异性以及超高的检测灵敏度。

新一代高通量快速基因测序技术是国际上近十年发展起来的新技术，对于研究人类某些疾病的科学家来说，他们感兴趣的往往只是很小部分的基因组区域，因此选择性地对这些区域进行测序，将使测序总成本显著降低同时也能缩短测序时间。序列捕获技术是一种对基因组特定区域进行选择性富集的技术，其通过合适的方法将感兴趣的区域从基因组中分离出来，然后再对该目标区域进行测序，目标区域测序技术可以快速、全面地检测出目标基因突变。

基于杂交的序列捕获技术是目前在第二代测序平台中使用较多的序列富集方法，主要分为固相芯片杂交和液相杂交两种。液相杂交技术是制备杂交探针库，对目标基因进行富集，液相杂交在动力学上相对固相杂交更具优势，能降低对于样品起始量要求。

由于对于低频检测局限性的限制，有一些方法通过实验或者信息分析方法的改进，降低二代测序流程中所产生的错误。如Cir-seq是基于滚环复制的一种文库构建方法。这种方法首先对原始cfDNA模板进行环化，随后使用随机引物对模板进行滚环复制，产生具有几个复制子的长链DNA，将低起始量模板进行了信号放大。还有的方法，在PCR过程中，将标签加入到DNA分子中，这种方法可以避免PCR第2轮次之后的错误以及测序错误。还有的方法，在文库构建中正负链上加入已知的成对的Index，区分正负链，后期通过序列两端的绝对位置进行聚类分析，可以确定哪些DNA分子来自于同一条模板，从而达到降低错误率的作用。还有一些方法则从数据算法方面进行优化，降低二代测序的错误率。

目标区域液相捕获技术对目标区域设计多种携带生物素标记的探针，通过探针与目标区域的互补结合，使用携带链霉亲和素标记的磁珠将目标区域捕获下来。实现了对目标区域的靶向测序，对靶基因进项变异检测。

片段化的cfDNA，由于其断裂长度均为170bp左右，故片段化的DNA模板中会存在大量同样断裂位置，但来源于不同细胞的DNA模板。传统目标区域液相捕获技术由于没有在PCR前加入标签序列，在后续实验中，同等断裂位置的DNA模板无法区分，使得低频突变可能会被当做PCR错误去掉，另外，如果PCR前几轮次中出现错误，错误无法去除，会被当做阳性结果，导致假阳性率偏高。

扩增子测序(Amplicon seq)就是通过设计感兴趣的基因组区域的引物，通过PCR扩增，将目标区域DNA富集后进行高通量测序的研究策略。适用于大量样本的特定基因组区域研究，针对感兴趣的基因组区域进行遗传变异位点的寻找，对特定区域进行深入研究。

PCR靶向富集法适合用于捕获一些很小的区域，或者是一些连续的区域；而对于较大的非连续的区域，该方法需要合成大量的引物、PCR反应等。因此，PCR序列捕获方法的适用性受到较大的限制。

实用新型内容

基于上述本领域技术中存在的问题，本实用新型的目的是提供一种DNA 处理器以及基于所述DNA处理器的一种基于双标签建库的杂交捕获文库的制备装置。本实用新型涉及的装置采用双标签的策略，在加接头时将文库两端加入不同的随机标签，通过PCR扩增，每个相同来源的DNA片段形成带有互补标签家族的正负链文库，起到对同一个模板的DNA正负链进行区分的目的，通过对正负链的高深度测序，互相校正，从而降低假阳性率，避免PCR错误及测序错误及DNA损伤等。

本实用新型提供一种DNA处理器，所述DNA处理器包括如下部件：接头制备部件，所述接头制备部件包括接头延伸单元和酶切单元，所述接头延伸单元对接头加第一标签以获得带有第一标签的延伸产物，所述酶切单元对带有第一标签的延伸产物进行酶切以获得带有第一标签的接头；第一DNA处理部件，所述第一DNA处理部件对备处理的DNA片段进行末端修复并修饰以获得DNA修饰片段；第二DNA处理部件，所述第二DNA处理部件为经所述第一DNA处理部件处理后获得的DNA修饰片段加入经所述接头制备部件获得的带有两个第一标签的接头，以获得两端分叉结构的双标签DNA片段。

根据本实用新型的一个实施方式，其中所述第一DNA片段化处理部件顺序包括如下结构单元：第一结构单元，所述第一结构单元将备处理的DNA进行末端修复，以获得DNA修复片段；第二结构单元，所述第二结构单元将经过所述第一结构单元获得的DNA修复修饰，以获得DNA修饰片段。

根据本实用新型的一个实施方式，其中所述第一标签为随机碱基片段。

根据本实用新型的一个实施方式，其中所述接头制备部件还包括冷却结构单元，所述冷却结构单元对第一标签延伸单元处理得到的DNA片段进行冷却。

本实用新型还提供了一种文库构建器，其特征在于：所述文库构建器包括：PCR处理部件，所述PCR处理部件采用带有第二标签的引物对经本实用新型所述的DNA处理器获得的带有两个第一标签的DNA片段进行放大扩增以获得带有两个第一标签和第二标签的DNA文库样本。

根据本实用新型的一个实施方式，其中所述文库构建器还包括：提取部件，所述提取部件用于提取备处理的DNA片段；以及纯化部件，所述纯化部件对经所述PCR处理部件建立的DNA文库样本进行纯化。

本实用新型还提供了一种杂交捕获文库的制备装置，所述制备装置顺序包括如下组成部分：根据本实用新型所述的文库构建器，所述文库构建器基于经所述提取部件提取的备处理的DNA片段建立DNA文库样本；杂交组件，所述杂交组件基于所述文库构建器建立的DNA文库样本制备杂交捕获文库。

根据本实用新型的一个实施方式，其中所述杂交组件包括：样本预处理部件，所述样本预处理部件对所述文库构建器构建的文库样本进行引物封闭和标签封闭，获得封闭的文库样本；

杂交部件，所述杂交部件对经所述样本预处理部件获得的封闭的文库样本与探针进行杂交，获得杂交样本；链霉亲和素结合部件，所述链霉亲和素结合部件将带有链霉亲和素的磁珠与经所述杂交部件获得的杂交样本进行结合，获得磁珠-素杂交样本；扩增部件，所述扩增部件对经所述链霉亲和素结合部件获得的磁珠-杂交样本混合物进行PCR放大扩增。

根据本实用新型的一个实施方式，其中所述链霉亲和素结合部件包括结合结构单元和清洗结构单元，所述结合结构单元通过链霉亲和素磁珠与经所述杂交部件获得的杂交样本混合以获得磁珠-杂交样本混合物，所述清洗结构单元对磁珠-杂交样本混合物进行清洗溶解并溶解备用。

根据本实用新型的一个实施方式，其中所述扩增部件包括扩增结构单元和纯化结构单元，所述纯化结构单元对经所述扩增结构单元扩增之后的产物进行回收纯化。

附图说明

图1示出了本实用新型DNA处理器构造的示意图；

图2示出了本实用新型文库构建器构造的示意图；

图3示出了本实用新型基于双标签建库的杂交捕获文库的制备装置构造的示意图。

具体实施方式

以下采用实施例和附图来详细说明本实用新型的具体实施方式，借此对本实用新型如何应用技术手段来解决技术问题，并达成技术效果的实现过程能充分理解并据以实施。

如图1所示，其示出的是本实用新型的DNA处理器120构造示意图，本实用新型的DNA处理器120包括：接头制备部件121、第一DNA片段处理部件122和第二DNA片段处理部件123。本实用新型的接头制备部件121包括接头延伸单元1211和酶切单元1212，所述接头延伸单元1211对接头加第一标签以获得带有第一标签的延伸产物，所述酶切单元1212对带有第一标签的延伸产物进行酶切以获得带有第一标签的接头。本实用新型第一DNA片段处理部件122对备处理的DNA进行末端修复并修饰以获得DNA修饰片段，其顺序包括第一结构单元1221、第二结构单元1222。所述第一结构单元1221 将备处理的DNA片段进行末端修复，以获得DNA修复片段，对备处理的DNA 片段进行末端修复，补齐片段中的缺损，至此DNA片段为平末端。第二结构单元1222将经过所述第一结构单元1221获得的DNA修复片段进行修饰，以获得DNA修饰片段，向DNA片段的3'端加入“A”碱基突起，至此DNA片段为突起末端。第二DNA处理部件123为经所述第一DNA处理部件122处理后获得的DNA修饰片段加入经所述酶切部件获得的粘性末端接头，以获得两端分叉结构的DNA片段，具体为通过AT互补，为DNA片段两端加入含 Illuminate测序接头的带有两个随机标签(第一标签，不同序列)的接头，至此DNA片段为两端分叉结构。

如图2所示，其示出了本实用新型文库构建器100构造的示意图。本实用新型的文库构建器100主要组成部分为上述的DNA处理器120，此外还包括DNA提取部件110、PCR处理部件130和纯化部件140。提取部件110用于提取备处理的DNA片段；PCR处理部件124对经所述第二DNA处理部件123 获得的两端分叉结构的DNA片段(带有两个第一标签的DNA片段)进行放大扩增，以通过PCR方法，为不同样本的DNA文库接头末端引入两个第一标签序列；纯化部件140对经PCR处理部件130建立的文库样本进行纯化，至此 Illumina标准文库构建完成。

如图3所示，其示出了本实用新型基于双标签建库的杂交捕获文库的制备装置1604构造的示意图。本实用新型的基于双标签建库的杂交捕获文库的制备装置1604顺序包括文库构建器100、杂交组件200。其中文库构建器 100基于经所述提取部件110提取的备处理的DNA建立文库样本，杂交组件 200基于所述文库构建器100建立的文库样本制备杂交捕获文库。本实用新型的杂交组件200包括样本预处理部件210、杂交部件220、链霉亲和素结合部件230、扩增部件240。样本预处理部件210对文库构建器构建100的文库样本进行引物封闭和标签封闭，获得封闭的文库样本；杂交部件220对经所述文库构建器构建的文库样本进行杂交，获得杂交样本，具体地，例如将需要杂交的1μg文库与1000pM Dup公共引物、1000pMIndex，COT DNA 混合杂交，形成杂交文库。链霉亲和素结合部件230将带有链霉亲和素的磁珠与经所述杂交部件220获得的杂交样本进行结合，获得磁珠-链霉亲和素杂交样本。所述链霉亲和素结合部件230包括结合结构单元和清洗结构单元，所述结合结构单元通过链霉亲和素磁珠与经所述杂交部件获得的杂交样本混合以获得磁珠-杂交样本，具体地，将杂交文库与制备好的链霉亲和素磁珠按比例混合使DNA与磁珠结合。清洗结构单元使用缓冲液对结合了DNA的磁珠进行清洗，而后用ddH₂O溶解备用。扩增部件240对经所述链霉亲和素结合部件获得的磁珠-杂交样本进行PCR放大扩增，所述扩增部件240包括扩增结构单元和纯化结构单元。具体地，扩增结构单元使用Post-PCR引物对杂交产物进行扩增。纯化结构单元对经所述扩增结构单元扩增之后的产物进行回收纯化，具体地，用Ampure磁珠回收纯化反应体系中的DNA。

本实用新型创新点在于DNA处理器、文库构建器和双标签建库的杂交捕获文库的制备装置的构造改进，其中所涉及的组成部件和结构单元均为由本领域现有技术中所采用或者可以通过市售购得的能够实现所述功能的设备仪器。

基于本实用新型的DNA处理器、文库构建器和双标签建库的杂交捕获文库的制备装置的构造改进，可以实现采用双标签的策略，即在加接头时将文库两端加入不同的随机标签，通过PCR扩增，每个相同来源的DNA片段形成带有互补标签家族的正负链文库，起到对同一个模板的DNA正负链进行区分的目的，通过对正负链的超高深度测序，互相校正，从而降低假阳性率，避免PCR错误及测序错误及DNA损伤等。相比较于传统液相捕获设备或装置，可降低假阳性率。相比于Amplicon设备或装置，采用本实用新型的双标签建库的杂交捕获文库的制备装置避免了PCR Bias，并避免了较大的非连续区域的大量引物合成及反应条件的优化。

所有上述的首要实施这一知识产权，并没有设定限制其他形式的实施这种新产品和/或新方法。本领域技术人员将利用这一重要信息，上述内容修改，以实现类似的执行情况。但是，所有修改或改造基于本实用新型新产品属于保留的权利。

以上所述，仅是本实用新型的较佳实施例而已，并非是对本实用新型作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本实用新型技术方案内容，依据本实用新型的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本实用新型技术方案的保护范围。

Claims

1.一种DNA处理器，其特征在于，

所述DNA处理器包括如下部件：

接头制备部件，所述接头制备部件包括接头延伸单元和酶切单元，所述接头延伸单元对接头加第一标签以获得带有第一标签的延伸产物，所述酶切单元对带有第一标签的延伸产物进行酶切以获得带有第一标签的接头；

第一DNA片段处理部件，所述第一DNA处理部件对备处理的DNA片段进行末端修复并修饰以获得DNA修饰片段；

第二DNA片段处理部件，所述第二DNA处理部件为经所述第一DNA处理部件处理后获得的DNA修饰片段加入经所述接头制备部件获得的带有第一标签的接头，以获得带有两个第一标签的DNA片段。

2.根据权利要求1所述的DNA处理器，其中，

所述第一DNA片段处理部件顺序包括如下结构单元：

第一结构单元，所述第一结构单元将备处理的DNA片段进行末端修复，以获得DNA修复片段；

第二结构单元，所述第二结构单元将经过所述第一结构单元获得的DNA修复片段进行修饰，以获得DNA修饰片段。

3.根据权利要求1所述的DNA处理器，其中所述第一标签为随机碱基片段。

4.根据权利要求3所述的DNA处理器，其中所述接头制备部件还包括冷却结构单元，所述冷却结构单元对第一标签延伸单元处理得到的DNA片段进行冷却。

5.一种文库构建器，其特征在于，

所述文库构建器包括：PCR处理部件，所述PCR处理部件采用带有第二标签的引物对经如权利要求1至4任一项所述的DNA处理器获得的带有两个第一标签的DNA片段进行放大扩增以建立带有两个第一标签和第二标签的DNA文库样本。

6.根据权利要求5所述的文库构建器，其中，

所述文库构建器还包括：

提取部件，所述提取部件用于提取备处理的DNA片段；以及

纯化部件，所述纯化部件对经所述PCR处理部件建立的DNA文库样本进行纯化。

7.一种杂交捕获文库的制备装置，其特征在于，

所述制备装置包括如下组成部分：

根据权利要求5所述的文库构建器，所述文库构建器基于经提取部件提取的备处理的DNA片段建立DNA文库样本；

杂交组件，所述杂交组件基于所述文库构建器建立的DNA文库样本制备杂交捕获文库。

8.根据权利要求7所述的制备装置，其中，

所述杂交组件包括：

样本预处理部件，所述样本预处理部件对所述文库构建器构建的文库样本进行引物封闭和标签封闭，获得封闭的文库样本；

杂交部件，所述杂交部件对经所述样本预处理部件获得的封闭的文库样本与探针进行杂交，获得杂交样本；

链霉亲和素结合部件，所述链霉亲和素结合部件将带有链霉亲和素的磁珠与经所述杂交部件获得的杂交样本进行结合，获得磁珠-杂交样本混合物；

扩增部件，所述扩增部件对经所述链霉亲和素结合部件获得的磁珠-杂交样本混合物进行PCR放大扩增。

9.根据权利要求8所述的制备装置，其中，

所述链霉亲和素结合部件包括结合结构单元和清洗结构单元，所述结合结构单元通过链霉亲和素磁珠与经所述杂交部件获得的杂交样本混合以获得磁珠-杂交样本混合物，所述清洗结构单元对磁珠-杂交样本混合物进行清洗并溶解备用。

10.根据权利要求8所述的制备装置，其中，

所述扩增部件包括扩增结构单元和纯化结构单元，所述纯化结构单元对经所述扩增结构单元扩增之后的产物进行回收纯化。