CN211179855U - 结直肠癌检测装置 - Google Patents

Abstract

一种结直肠癌检测装置，包括：用以对待测者血液细胞中细胞外囊泡进行加热的加热单元；设置在所述加热单元一侧的样品仓室单元；设置在所述样品仓室单元一侧的信号处理单元，所述信号处理单元对至少一种光信号参量进行获取，并通过量化和采用无加权和/或有加权模型对相应的光参量进行计算，获取单一种类蛋白表达强度。本实用新型通过使用适体或抗体对患者血液细胞中的细胞外囊泡进行光标记，并使用检测单元对光标记中的光参量进行检测和处理，通过量化光参量并通过采用无加权和/或有加权模型对相应光参量进行计算，能够快速准确的得出细胞外囊泡的表达蛋白强度，检测精度高。

Description

结直肠癌检测装置

技术领域

本发明涉及癌症诊断技术领域，尤其涉及一种结直肠癌检测装置。

背景技术

直肠癌是世界上常见的三大恶性肿瘤之一，其死亡率排第三位，近年来，其发病率呈明显上升趋势。目前国内外对直肠癌的早期诊断仍处于较低水平，约半数的患者明确诊断时已进入中期和晚期直肠癌。因此，提高直肠癌的早期诊断是目前国内外迫切需要解决的关键问题。目前早期诊断直肠癌有以下几种的常用技术：

(1)大便隐血试验：大便隐血试验是结肠癌常用的筛查方法，操作简便、无创，主要缺点是灵敏度低、特异性差。

(2)电子肠镜：电子肠镜(简称内镜)是发现及诊断直肠癌最有效的手段，也是目前早期诊断直肠癌的主要方法，尤其是在高危人群的检查具有重要的临床价值。因其为创伤性检查伴有出血、肠穿孔等危险的副作用、且需要一定的设备和仪器，对操作人员的专业水平要求较高，故在大范围人群的检查存在着很大的局限性。

(3)电化学发光技术检测：电化学发光技术检测常用肿瘤标记物：如CEA、 CA199、CA242、CA50，因其阳性率低，缺乏特异性(66.7％)，不合适用于直肠癌的早期诊断。

(4)采用PCR技术检测患者血清或粪便内的DNA和检测微小RNA的浓度对直肠癌治疗监测和预后评价有一定的价值，但它们在应用于直肠癌的早期诊断方面还有待于进一步研究。

近年来，国内外学者开始致力于寻找敏感、特异、可靠、有效的直肠癌新生物标记物以及建立无创伤性检查和实验方法来提高早期诊断直肠癌的诊断率。有研究显示，M2型丙酮酸激酶(M2-PK)在胃肠肿瘤的发生、发展和代谢中发挥重要的作用。与正常组织相比，胃癌组织中M2-PK表达升高，与患者低生存率相关。国外学者认为肿瘤M2-PK在血浆、粪便检测其灵敏度(90.7％)和特异性(96.3％) 较高，且与疾病分期和淋巴结转移相关，有望成为直肠癌新型肿瘤标记物，尤其是在粪便的检测其临床价值更大。M2-PK主要以两种形式存在，即前者主要存在于分化的组织和正常增殖的细胞中，而后者常存在于肿瘤细胞中，与底物亲和力低，促使肿瘤细胞内糖代谢中间体如磷酸烯醇类物质等积累，对肿瘤细胞的增殖具有重要作用。当肿瘤发生时往往伴随二聚体形式的M2-PK含量增加。

由于直肠癌在遗传学上是多步骤、多阶段、多基因改变的过程，多基因联合检测对提高检出率及检测敏感性更有重要意义。直肠癌是一种多基因性疾病，在发生发展过程中涉及到相关基因的改变如：K-ras、APC等基因突变。国外学者报道K-ras基因突变与直肠癌密切相关，是直肠癌的早期分子事件。APC基因突变与早期直肠癌和腺瘤的诊断有较大的临床价值，尤其是在高危人群早期诊断具有重要意义。近年来我国学者提出富含亮氨酸重复测序G蛋白耦联受体5(LGR5)，是一种干细胞分子标记物，也是Wnt信号通路的靶基因之一，其表达量的增加能够促进胃肠黏膜的自我更新，LGR5在直肠癌组织中呈高水平的表达。目前有研究提出AKT和PI3K基因突变可作为肿瘤的早期诊断、确定肿瘤的浸润范围以及判断预后的重要指标。近年来，有研究表明MXRAS有可能成为对大肠癌前病变早期诊断的有实用价值的肿瘤标记物。

因此急需一种能够是实现与肿瘤细胞紧密结合的光探测技术，尤其是能够利用量子点技术，能够准确实现对直肠癌的检测的技术。

中国专利公开号：CN105277707A公开了一种基于量子点标记的结直肠癌细胞的检测方法及试剂盒，其包括步骤：制备抗人M2型丙酮酸激酶的单克隆抗体过程、量子点光探针的制备过程和往结直肠癌细胞加入量子点光探针，并在共聚焦光显微镜下观察结直肠癌细胞的光图像；由此可见，所述检测方法存在以下问题：

第一、在进行测试时需要选取两只小鼠进行免疫反应，由于小鼠个体间存在差异，因而在测量后得到的结果也会存在偏差；

第二、所述检测方法在使用光探针时，仅使用单一种类标记物对细胞进行光标记，这样在检测完成后无法得到具体数据，检测精度低；

第三、在制备抗人M2型丙酮酸激酶的单克隆抗体过程中，需要用到多种试剂，步骤繁琐，且制备抗体需要大量时间，增加了所述检测方法的检测周期。

发明内容

为此，本发明提供一种基于热泳细胞外囊泡检测的直肠癌测检测装置，用以克服现有技术中检测方法由于检测参量的局限性导致的检测精度低的问题。

本发明提供一种结直肠癌检测装置，包括：

用以对待测者血液中的细胞外囊泡进行加热的加热单元；

设置在所述加热单元一侧，用以装载细胞外囊泡的样品仓室单元，所述样品仓室单元用以装载与标有发光催化物抗体一同孵育的细胞外囊泡，通过抗体与细胞外囊泡表达蛋白特异性结合将细胞外囊泡标记酶，标记完成后，向所述样品仓室单元内部加入发光底物，酶催化发光底物并使其达到激发状态，在其转化为基态时发出光信号，并在所述加热单元对所述样品仓室单元加热后，所述样品仓室单元内产生热泳效应及对流，将细胞外囊泡汇聚在所述样品仓室单元内温度较低的一侧；

设置在所述样品仓室单元远离加热单元的一侧，用以对放大后的光信号进行采集和计算的信号处理单元，包括设置在所述第二导热面远离所述加热单元的一侧，用以观察光信号的物镜和设置在所述物镜远离所述加热单元的一侧，用以反射光标记的采集反光镜；

所述信号处理单元对至少一种光信号参量进行获取，通过量化光参量并通过采用加权模型和/或无加权模型对相应光参量进行计算，获取细胞外囊泡蛋白的加权表达强度和/或无加权表达强度以及表达蛋白总丰度，通过结合三种数值得出细胞外囊泡的SUM表达图，并根据SUM表达图对待测者是否患有结直肠癌症做出判定。

进一步地，所述样品仓室单元，用以将孵育后细胞外囊泡中的发光催化物与适体或抗体发生放置在样本仓室单元内，发光催化物催化发光底物使其达到激发态，并在其转化成基态时释放光能以使细胞外囊泡表面标记光信号。

进一步地，所述信号处理单元的检测物理量包括光信号的波长λ、亮度L、强度C以及吸光度A中的至少一种。

进一步地，所述加热单元为设有聚焦装置的激光加热器，通过改变焦点以调节具体加热位置。

进一步地，所述样品仓室单元设置在所述加热单元一侧，所述信号处理单元设置在所述样品仓室单元远离所述加热单元的一侧，包括：

设置在所述加热单元一侧，用以吸收所述加热单元热量的第一导热面；

设置在所述第一导热面下方，用以吸收所述加热单元热量的第二导热面；

设置在所述第一导热面与第二导热面之间的垫片，垫片中心开设有通孔，用以装载样品液体。

进一步地，所述第一导热面与第二导热面均为透明材质，且第二导热面的导热性高于第一导热面的导热性。

进一步地，所述垫片中开设有通孔，用以与所述第一导热面和第二导热面配合形成装载细胞外囊泡的空间。

进一步地，所述采集反光镜与所述放大反光镜均与所述物镜呈一定夹角，以分别将光信号和放大光源反射至指定位置。

进一步地，所述信号采集单元根据检测装置需要检测的光参量，为CCD相机、照度计、分光计、单色器、sCMOS、EMCCD、PMT中的一种或多种。

与现有技术相比，本实用新型的有益效果在于，通过使用适体对患者血液细胞外囊泡表面对结直肠癌癌有高表达的表达蛋白进行光标记，并使用检测单元对光标记中光的物理参量进行检测和处理，通过分析光参量能够快速准确的得出细胞外囊泡对结直肠癌癌有高表达的表达蛋白加权表达强度，检测精度高。尤其是，本实用新型通过采用多种物理参量的聚积检测，而非直接通过生物反应检测，检测过程更加简便及易操作，样本用量小，并且，通过物理参量的聚积检测，相比生物反应检测，其检测量的表达更容易量化，能够对结直肠癌癌病变程度进行清晰判定。尤其，本实用新型对于细胞外囊泡对结直肠癌有高表达的表达蛋白的检测、及光度的参量化，基于加权模型和/或无加权求和模型的计算方式获取，然后根据标准的蛋白质标志物浓度与光某种参量的标准函数关系，来确定癌变程度。如，通过对光强度C、光亮度L、光频率λ、特定波长吸光度A下的样本浓度等光特性检测物理量进行判定。并且，在基于同一抗体或适体的检测过程中，通过对多种物理参量的检测及计算，相互比较，选取最优的物理参量的表达来确定最终的癌变结果。

尤其，本实用新型采用化学发光和热泳效应、对流相结合的光聚积方式，通过与细胞外囊泡结合的抗体中的发光催化物催化而达到激发状态，并在转化为基态过程中释放光能以使细胞外囊泡表面标记光信号，在检测时，所述发光催化物能够保持较长时间发光。

尤其，本实用新型由于通过加权模型和/或无加权求和模型的计算方式，通过对多种细胞外囊泡表达蛋白的量化精准计算，能够准确确定癌变程度。

进一步地，本实用新型样品仓室单元设有透明材质的第一导热面和第二导热面，通过对其内部的样品液体加热使细胞外囊泡产生热泳效应并向低温处移动，同时，温度升高后样品液体会产生热对流并使细胞外囊泡聚积在指定位置，以此放大细胞外囊泡的光信号，这样，在对光参量进行检测的时候能够更加准确的观测到细胞外囊泡光参量的具体数值，进一步提高了所述检测系统的检测精度。尤其，通过该种方式，可以同时采集多种光物理参量，如，对光强度C、光亮度L、光频率λ、特定波长吸光度A等参量的检测。

进一步地，本实用新型所述检测系统使用热泳效应和热对流效应聚积细胞外囊泡，因此，所述检测系统对所述样品仓室单元的尺寸没有具体限制。所述样品仓室单元中的样品液体用于装载细胞外囊泡和适体或抗体并能够使其产生热泳效应和对流，因此本检测系统在样品液体的选择上不作具体限制，只要所述样品液体能够在热对流效应下带动细胞外囊泡移动并聚积即可。进一步地，所述细胞外囊泡与适体或抗体通过特异性结合的方式连接在一起，这样，光标记能够稳固的链接在细胞外囊泡上，在细胞外囊泡聚积时，也能够更加准确地将细胞外囊泡的光参量观测出来，进一步提高了所述检测系统的检测精度。细胞外囊泡在热泳效应下受到的力与其直径平方成正比，而与细胞外囊泡数量无关，因此，在检测时只需要少量的血样即可完成，对于细胞外囊泡仅需0.1微升的样本用量，并且无需对样品进行前置处理。

进一步地，所述样品仓室单元在被加热时，只要所述第一导热面和第二导热面之间存在温差，就能够使样品仓室单元内产生热泳效应和热对流并将带有光标记的细胞外囊泡聚积至指定位置。所述检测系统中仅需对聚积的细胞外囊泡光参量进行检测，无需使用其他特殊仪器，在不影响检测系统检测精度的情况下，节约了检测装置的成本。

进一步地，所述检测系统中设有数据采集单元，其能够从采集到的蛋白表达图谱中提取指定的光参量，并将其带入加权模型和/或无加权求和模型模型中以计算细胞外囊泡表达蛋白的加权表达强度和/或无加权表达强度，通过将直观的图像转换为具体的数字，进一步提高了所述检测系统的检测精度。

进一步的，所述检测装置能够针对不同癌症中高表达蛋白选择对应的适体或抗体对其进行标记，以此测得对应表达蛋白的丰度图谱并计算出表达强度，这样，所述检测装置不仅能够对结直肠癌进行检测，同时还能对其他癌症进行快速而准确地检测，如：肺癌、胰腺癌、大肠癌、胃癌、前列腺癌、头颈部癌、皮肤癌、肾癌、睾丸癌、甲状腺癌、膀胱癌、子宫癌、阴道癌、子宫内膜癌、卵巢癌、食道癌、口腔癌、唾液腺癌、喉癌、腹膜癌、鼻癌、喉癌、输卵管癌、肾母细胞癌、淋巴癌、胆管癌，以及秋千肉瘤、滑膜肉瘤、髓母细胞瘤、滋养层细胞瘤、胶质瘤、成胶质细胞瘤、胆脂瘤、软骨肉瘤、室管膜瘤、神经鞘瘤、神经瘤、横纹肌肉瘤。

附图说明

图1为本实用新型结直肠癌检测装置的结构图；

图2为本实用新型基于热泳细胞外囊泡检测利用化学发光的前直肠癌检测装置的结构图；

图3为本实用新型利用单色器检测细胞外囊泡样本吸光度的原理图。

具体实施方式

为了使本发明的目的和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明作进一步描述；应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。

以下结合附图，对本发明上述的和另外的技术特征和优点作更详细的说明。

下面参照附图来描述本发明的优选实施方式。本领域技术人员应当理解的是，这些实施方式仅仅用于解释本发明的技术原理，并非在限制本发明的保护范围。

需要说明的是，在本发明的描述中，术语“上”、“下”、“左”、“右”、“内”、“外”等指示的方向或位置关系的术语是基于附图所示的方向或位置关系，这仅仅是为了便于描述，而不是指示或暗示所述装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

此外，还需要说明的是，在本发明的描述中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域技术人员而言，可根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

系统实施例一

本发明实施例为基于热泳细胞外囊泡的结直肠癌检测系统，请参阅图1所示，其为本发明基于热泳细胞外囊泡检测的结直肠癌症检测系统的结构示意图，本实施例的系统包括加热单元1、样品仓室单元2、信号放大单元3和信号处理单元4，其中，所述加热单元1设置在所述样品仓室单元2的上方，用以对所述样品仓室单元2内的样品加热；所述样品仓室单元2内装有样品液体，用以装载细胞外囊泡和带有荧光标记的适体；所述信号放大单元3设置在所述样品仓室单元2下方，用以放大所述荧光标记的荧光信号，所述信号处理单元4设置在所述信号放大单元3侧面，用以采集和记录所述放大后的荧光信号，并对荧光信号的光亮度、光强度和光波长参数中的一种或几种进行或获取，同时使用加权和无加权求和对待测样品细胞外囊泡进行癌症病变程度的检测。

具体而言，在基于热泳细胞外囊泡检测的结直肠癌症检测系统工作前，先将细胞外囊泡和带有荧光标记的适体放入样品仓室单元2，通过适体与细胞外囊泡表面的一种对结直肠癌癌有高表达的表达蛋白进行特异性结合，以将荧光标记在细胞外囊泡上。标记完成后，所述加热单元1开始对样品仓室单元2加热，样品仓室单元2受热后，其内部的样品液体开始产生热泳效应并发生对流，并将被标记的细胞外囊泡聚集在指定位置；聚集完成后，信号放大单元3会向细胞外囊泡聚集的位置发射对比光源，信号处理单元4会采集聚集的细胞外囊泡的相关信息，并对其进行相应的分析，通过光的光亮度L、光强度C、波长λ参数中的一种或几种获取，采取加权和无加权求和的方式进行癌症病变程度进行判断。本领域的技术人员可以理解的是，本实施例基于热泳细胞外囊泡检测的结直肠癌检测装置不仅可用于对细胞外囊泡进行聚集和检测，也可对细胞外囊泡或其他种类的微纳生物粒子进行检测，只要满足所述基于热泳细胞外囊泡检测的结直肠癌症检测系统能够达到其指定的工作状态即可。

请继续参阅图1所示，本发明实施例加热单元1为一激光加热器，其设置在所述样品仓室单元2上方，用以对所述样品仓室单元2内部的样品液体进行加热，以在其内部产生圆形的加热区域。当细胞外囊泡被标记完成后，所述加热单元1 对所述样品仓室单元2内部的样品液体进行加热，以将细胞外囊泡聚集起来。可以理解的是，所述加热单元1的加热方式并不仅限于激光照射，且激光照射的方向和功率的选择本实施例均不作具体限制，只要满足所述加热单元1能够使所述样品仓室单元2内部产生温差以汇聚细胞外囊泡即可。

请继续参阅图1所示，本发明实施例所述样品仓室单元2设置在所述加热单元1下方，用以盛装含有细胞外囊泡和适体的样品液体，包括第一导热面21、第二导热面22和垫片23；其中所述垫片23设置在所述第一导热面21下方并与其相接触，用以盛装样品液体，所述第二导热面22设置在所述垫片23下方，用以与所述第一导热面21一同将所述垫片23内部的样品液体密封。当所述加热单元1对所述样品仓室单元2进行加热时，激光会依次穿过所述第一导热面21和第二导热面22并对其进行加热，由于样品液体受热升温，在加热后所述细胞外囊泡温度也会升高，此时细胞外囊泡会产生热泳效应并向温度较低的第一导热面 21和第二导热面22方向移动，由于所述第一导热面21与第二导热面22的导热性不同，在加热后所述第一导热面21加热点处的温度会高于第二导热面22加热点处的温度并使样品液体产生温度差，样品液体从而在样品仓室单元2中沿低温处向高温处方向产生热对流，使样品中细胞外囊泡迁移并聚积到所述第二导热面 22处。可以理解的是，本实施例所述样品仓室单元2可以设置在所述加热单元1 的下方、上方、左方或右方，只要所述加热单元1能够对所述样品仓室单元2 加热而使其内部的样品液体升高温度即可。

具体而言，本发明所述第一导热面21为玻璃片，其设置在所述垫片23上方，用以密封所述垫片23内部的样品液体并与所述加热单元1一同对样品液体加热。当所述加热单元1的激光穿过所述第一导热面21时，其会对所述第一导热面21 的中心处进行加热，并提高加热处的温度，温度提高后，所述第一导热面21会将热量传递至所述垫片23中的样品液体，并使样品液体产生对流，以聚积细胞外囊泡。可以理解的是，所述第一导热面21的材料可以为玻璃、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、蓝宝石或其他种类的透明材料，只要满足所述第一导热面21能够受热升温即可。

具体而言，本发明所述第二导热面22为导热性高于所述第一导热面21的玻璃片，其设置在所述垫片23下方，用以密封所述垫片23内部的样品液体并与所述加热单元1一同对样品液体加热。当所述加热单元1的激光穿过所述第二导热面22时，其会对所述第二导热面22的中心处进行加热，并提高加热处的温度，温度提高后，所述第二导热面22会将热量传递至所述垫片23中的样品液体，由于所述第二导热面22的导热性高于所述第一导热面21，在所述加热单元1加热完成后，所述第二导热面22的温度会小于所述第一导热面21的温度，在所述垫片23内产生温差，并使样品液体产生对流，以聚积细胞外囊泡。可以理解的是，所述第二导热面22的材料可以为玻璃、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、蓝宝石或其他种类的透明材料，只要满足所述第二导热面22 能够受热升温且其温度低于样品液体中心温度即可。

具体而言，所述垫片23为一设有通孔的圆片，其设置在所述第一导热面21 和第二导热面22之间，用以装载样品液体和聚积细胞外囊泡。当所述加热单元 1对所述样品仓室单元2进行加热时，加热激光的焦点会位于所述垫片内部的样品液体处，通过对样品液体加热使样品液体内部的细胞外囊泡产生热泳效应并向所述第二导热面22聚集，同时因为所述第一导热面21和第二导热面22之间的温差，样品液体开始产生对流并将细胞外囊泡聚集在所述第二导热面22的激光照射处。可以理解的是，所述垫片23中的样品液体材质可以为血浆、血清或任意形式的血液或其处理加工的衍生样本，只要满足所述样品液体能够装载细胞外囊泡和适体并能够使其产生热泳效应和对流即可。

请继续参阅图1所示，本发明实施例所述信号放大单元3设置在所述样品仓室单元2下方，用以照射所述第二导热面22中聚集的细胞外囊泡并将所述细胞外囊泡中的荧光信号放大，包括物镜31、采集反光镜32、放大反光镜33和观测光源34。其中，所述物镜31设置在所述第二导热面22下方，用以收集所述带有荧光标记细胞外囊泡的荧光信号，所述采集反光镜32设置在所述目镜31下方，用以将放大的荧光信号反射给所述信号处理单元4，所述放大反光镜33设置在所述采集反光镜32下方，用以将所述观测光源34中的光线反射至所述物镜31 中，所述观测光源34设置在所述放大反射镜33右侧，用以提供放大荧光信号的光线。当所述信号放大单元开始工作时，所述观测光源34发射光线，通过所述放大反光镜33反射至所述物镜31，所述物镜31将光线照射至所述第二导热面 22中的细胞外囊泡聚集处，并以此放大外所述细胞外囊泡的荧光信号，放大完成后，所述信号处理单元4会使用所述采集反光镜32采集所述放大后的荧光信号，以此完成荧光信号的采集和处理。可以理解的是，所述信号放大单元3可以设置在所述样品仓室单元2的上方、下方、左方或右方，只要满足其能够对样品仓室内的荧光信号进行采集即可。

具体而言，本发明所述物镜31设置在所述第二导热面22细胞外囊泡聚集处的下方，用以收集所述细胞外囊泡中的荧光信号，当所述观测光源34的光线照射至物镜31时，物镜31会将光线照射至所述第二导热面22上，以此放大所述细胞外囊泡上的荧光信号。可以理解的是，所述物镜31的种类本实施例不作具体限制，只要满足所述物镜31能够达到其指定的工作状态即可。

具体而言，本发明实施例所述采集反光镜32为一平面镜，其设置在所述物镜31下方并与物镜31呈45°夹角，用以反射所述放大后的荧光信号。当所述细胞外囊泡的荧光信号被放大后，所述采集反光镜32将荧光标记反射至所述信号处理单元4，以完成荧光信号的采集。可以理解的是，所述采集反光镜32的尺寸本实施例不作具体限制，只要满足所述采集反光镜32能够将荧光信号完整的反射至所述信号采集单元即可。

请继续参阅图1所示，本发明实施例所述信号处理单元4包括一CCD相机，其设置在所述采集反光镜32右侧，用以采集所述细胞外囊泡的荧光信号。当所述荧光信号被放大后，所述采集反光镜32会将放大后的荧光信号反射至所述信号处理单元4中，所述信号处理单元4对荧光信号进行采集和整理，形成单次检测的图谱，可以理解的是，信号处理单元4可以包括CDD相机，也可以为任何能够探测荧光信号的仪器，只要所述信号处理单元4能够通过所述信号放大单元3 对带有荧光标记的细胞外囊泡进行拍照，获取信息即可。当然，所述信号处理单元4可以位于所述信号放大单元3的左侧、右侧、上侧或下侧，只要满足所述信号处理单元4能够通过信号放大单元3采集和处理荧光信号即可。

本系统实施例检测系统在对待测者是否患有结直肠癌进行检测时通过先将荧光标记与适体相连,再将适体与待测样品细胞外囊泡一同孵育以将细胞外囊泡标上荧光标记，操作简单，易于执行，在使用本系统对多个待测者进行检测时，患者仅需要提供少量血样，就能够对患者的病情进行快速的诊断。

系统实施例二

本发明实施例为基于热泳细胞外囊泡检测利用化学发光的结直肠癌检测系统，作为本发明的优选实施例，请参阅图2所示，其为本发明实施例基于热泳细胞外囊泡检测利用化学发光的结直肠癌检测系统的结构示意图，本实施例的系统包括加热单元1、样品仓室单元2和信号处理单元4，该上述单元与上述实施例一相同。

与上述实施例一不同的是，本发明的光标记采用化学发光标记方法，在使用基于热泳细胞外囊泡检测的结直肠癌检测系统前，先将细胞外囊泡待测样品与标记有发光催化物的抗体一同孵育，发光催化物可以为酶，通过抗体与细胞外囊泡表达蛋白特异性结合将细胞外囊泡标记酶，标记完成后，将孵育完成的样本放入所述样品仓室单元2，并向所述样品仓室单元内部加入发光底物，酶催化发光底物并使其达到激发状态，并在其转化为基态时发出光信号。

当所述基于热泳细胞外囊泡检测利用化学发光的结直肠癌检测系统开始工作时，所述加热单元1对所述样品仓室单元2进行加热，使其内部的细胞外囊泡产生热泳效应而开始向温度低的一面移动，同时所述样品仓室单元的两侧温度不同使所述样品仓室单元2内部开始产生对流，并将细胞外囊泡聚积在指定位置，聚积完成后，所述信号采集单元3开始对细胞外囊泡的光信号进行采集，并得出所述细胞外囊泡表面表达蛋白的丰度图谱。请继续参阅图2所示，本发明实施例所述信号处理单元4设置在所述样品仓室单元2下方，用以对所述聚集的细胞外囊泡进行观测和采集。

具体而言，在本实施例利用化学发光的细胞外囊泡检测体系中，所述标记酶可以为辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(ALP)或其他种类的标记酶；所述发光底物为鲁米诺(32氨基邻苯二甲酰肼)、异鲁米诺(42氨基邻苯二甲酰肼)或其他种类的衍生物，只要满足所述标记酶能够与细胞外囊泡发生反应并粘在细胞外囊泡表面，且所述发光底物能够与所述标记酶发生反应并发出光亮即可。

本实施例与上述实检测系统施例一相比，加热单元1、样品仓室单元2的结构、原理和工作功能均相同，但由于本实施例使用化学反应产生的光对细胞外囊泡进行标记，在对结直肠癌有高表达的表达蛋白进行标记完后细胞外囊泡表面会保持有长时间的高亮光信号，因此本实施例不使用所述放大反光镜33和观测光源34对光信号进行放大也可对细胞外囊泡的光信号进行准确地观测和采集。

本实施例检测系统在检测时先将抗体与细胞外囊泡一同孵育并使其互相连接，孵育完成后将细胞外囊泡与发光底物一同放入所述样品仓室单元2中，通过抗体中发光催化物催化发光底物使其达到激发态，并在其转化成基态时释放光能以此在细胞外囊泡表面标记光信号，同时，本实施例所述的化学反应为催化反应，发光催化物作为催化剂能够一直催化发光底物发生反应并持续产生光亮，这样，在检测时，所述细胞外囊泡能够保持长时间发光。

进一步地，由于光信号能够长时间维持，故而无需对光信号进行二次放大，在采集光信号时，相比于所述系统实施例一，本实施例只需一次就能对光信号进行清晰准确的采集，节约了系统的检测时间，提高了检测效率。

进一步地，在检测时，将标记完成的细胞外囊泡从孵育容器中转移到装有样品液体的样品仓室单元2中，这样一来，就排除了多余抗体中的发光催化物与发光底物催化而发生反应并一同发光的现象，使得所述基于热泳细胞外囊泡利用化学检测的癌症检测系统在对细胞外囊泡进行检测时，在具有所述基于热泳细胞外囊泡检测的癌症检测系统优点的基础上，拥有高度的准确性。

基于上述两种实施例而言，对于细胞外囊泡的光度的检测、及参量化，基于加权和无加权求和的计算方式获取，然后根据标准的蛋白质标志物浓度与光某种参量的标准函数关系，来确定癌变程度。如，通过对光强度、光亮度、光频率、特定波长吸光度下的样本浓度等光特性检测物理量进行判定。

下面通过实施例进行说明。

作为较优的一实施例，本实施例中的光参量X采用光亮度L，此时所述检测系统中的采集器选用CCD相机，在对光亮度进行测量时，通过使用CCD相机对细胞外囊泡集合后发出的光进行拍摄，以得出细胞外囊泡光信号的单个图谱，在测量完成后，对单个表达蛋白的多个测量结果，可以使用光亮度对照表将各图谱中的光亮度L从图像转换成具体数值L₁,L₂...L_k，并以此作为自变量X带入所述加权求和模型中对某一种类蛋白加权加权表达强度Y进行计算，以此得出某一种类蛋白的加权加权表达强度Y。

此时，所述细胞外囊泡的蛋白加权表达强度Y_L为：

Y_L＝β₀+β₁L₁+β₂L₂+...+β_kL_k+ε (10)

对上述式(10)进行假定后，对两边取期望，可得：

E(Y_L|L₁,L₂...L_k)＝β₀+β₁L₁+β₂L₂+...+β_kL_k (11)

对所述式(10)取期望完成后，根据光亮度L给出回归参数β₀，β₁，β₂，...，β_k相应的估计值

此时可以得到蛋白加权表达强度Y_L相应的估计值：

此时使用最小二乘得到参数估计：

在所述式(13)中分别对

求偏导数，并令所述偏导数等于0，得到：

对上述式(14)中的方程组进行求解，即可得到回归参数β₀，β₁，β₂，...，β_k的估计值

和蛋白加权表达强度Y_L。

求出参数的估计值

和蛋白加权表达强度Y_L后，根据表达蛋白种类和各类蛋白的加权表达强度Y_L。

经过计算可以得出，在使用光亮度L作为光参量X进行计算时，测得的光图谱能够较为直观的表达细胞外囊泡表达蛋白的丰度，在计算时也比较简便，测量周期短。

作为较优的一实施例，本实施例中，采用光强度C而非光亮度L进行测量，此时检测系统中使用的采集器选用照度计(或称勒克斯计)测定细胞外囊泡光信号中的光强度C。其中，照度计是把光能直接转换成电能的光电元件。当光线射到硒光电池表面时，入射光透过金属薄膜到达半导体硒层和金属薄膜的分界面上，在界面上产生光电效应。产生的光生电流的大小与光电池受光表面上的照度有一定的比例关系。这时如果接上外电路，就会有电流通过，电流值从以勒克斯 (Lx)为刻度的微安表上指示出来。

通过使用照度计对多例细胞外囊泡中某一种类表达蛋白光标记的光强度进行测量后，会得到对某一种类表达蛋白的光亮度C₁,C₂...C_k，并以此作为自变量 X带入所述加权求和模型中对某一种类蛋白加权表达强度Y_C进行计算，以此得出某一种类蛋白的加权表达强度Y_C。

此时，所述细胞外囊泡的蛋白加权表达强度Y_C为：

Y_C＝β₀+β₁C₁+β₂C₂+...+β_kC_k+ε (15)

对上述式(15)进行假定后，对两边取期望，可得：

E(Y_C|C₁,C₂...C_k)＝β₀+β₁C₁+β₂C₂+...+β_kC_k (16)

对所述式(15)取期望完成后，根据光强度C给出回归参数β₀，β₁，β₂，...，β_k相应的估计值

此时可以得到蛋白加权表达强度Y_C相应的估计值：

此时使用最小二乘得到参数估计：

在所述式(18)中分别对

求偏导数，并令所述偏导数等于0，得到：

对上述式(19)中的方程组进行求解，即可得到回归参数β₀，β₁，β₂，...，β_k的估计值

和蛋白加权表达强度Y_C。

求出参数的估计值

和蛋白加权表达强度Y_C后，根据表达蛋白种类和各类蛋白的加权表达强度Y_C。

在使用光强度C作为光参量X进行计算时，在测量光图谱时具有较高的抗干扰性，求得的细胞外囊泡加权表达强度Y_C相对准确；

作为较优的另一实施例，本实施例中，采用光频率ν而非光亮度L、光强度 C进行测量，此时所述检测系统中选用的采集器为分光计，在对细胞外囊泡光信号进行测量时，通过所述分光计对某一种类表达蛋白中每例细胞外囊泡光信号的波长λ₁,λ₂...λ_k，得到光波长的数据后，根据公式λν＝c＝299792458(m/s)计算出各光信号所对应的光频率值ν₁,ν₂...ν_k，计算完成后将其作为自变量X带入所述加权求和模型中对所述某一种类蛋白加权表达强度Y_ν进行计算，以此得出某一种类蛋白的加权表达强度Y_ν。

此时，所述细胞外囊泡的蛋白加权表达强度Y_ν为：

Y_ν＝β₀+β₁ν₁+β₂ν₂+...+β_kν_k+ε (20)

对上述式(20)进行假定后，对两边取期望，可得：

E(Y_ν|ν₁,ν₂...ν_k)＝β₀+β₁ν₁+β₂ν₂+...+β_kν_k (21)

对所述式(20)取期望完成后，根据光强度ν给出回归参数β₀，β₁，β₂，...，β_k相应的估计值

此时可以得到蛋白加权表达强度Y_ν相应的估计值：

此时使用最小二乘得到参数估计：

在所述式(23)中分别对

求偏导数，并令所述偏导数等于0，得到：

对上述式(24)中的方程组进行求解，即可得到回归参数β₀，β₁，β₂，...，β_k的估计值

和蛋白加权表达强度Y_ν。

在使用光频率ν作为光参量X进行计算时，能够将测得的光图谱进行准确的数字转换，求得的细胞外囊泡表达强度Y_ν值准确度最高。

作为较优的另一实施例，本实施例中，采用细胞外囊泡样本浓度H而非光亮度L、光强度C或光频率ν进行测量，此时所述检测系统中选用的采集器为单色器，其中利用所述单色器测量吸光度的原理如图3所示，所述单色器包括光源5、单色仪6、调整孔7、玻璃管8、光敏电阻9、放大器10和输出屏11；当光源5 发出指定光强度的光亮并照射至所述单色仪6时，单色仪6会将光信号的光线分散成不同波长的单色光；此时对所述调整孔7进行调节，使450nm波长的单色光穿过并将其他波长的单色光挡住；所述玻璃管8中装有待检测的细胞外囊泡样本，当所述450nm波长的单色光穿过玻璃管8时，细胞外囊泡样本会吸收450nm 波长单色光的部分光强度；被吸收后的单色光会照射至光敏电阻9上，并将光强度转换成电阻；所述光敏电阻9经过所述放大器10放大，被输送至输出屏11 上，以将吸收后单色光的光强度显示在屏幕上。得到吸收后光强度，并结合吸收前光强度，即可计算出细胞外囊泡样本的吸光度A。

在对细胞外囊泡光信号进行测量前，通过测定一系列已知浓度的蛋白质标志物条件下在450nm波长下的吸光度作为参考，得到浓度与吸光度之间的特定函数关系，此时，通过所述单色器分别对未知浓度的每例细胞外囊泡测出光信号在 450nm波长处的吸光度A₁,A₂...A_k，得到光信号吸光度的数据后，根据所述函数关系计算出各例吸光度所对应的浓度H₁,H₂...H_k，计算完成后将其作为自变量X 带入所述加权求和模型中对某一种类蛋白加权表达强度Y_H进行计算，以此得出某一种类蛋白的加权表达强度Y_H。

此时，所述细胞外囊泡的蛋白加权表达强度Y_H为：

Y_H＝β₀+β₁H₁+β₂H₂+...+β_kH_k+ε (25)

对上述式(25)进行假定后，对两边取期望，可得：

E(Y_H|H₁,H₂...H_k)＝β₀+β₁H₁+β₂H₂+...+β_kH_k (26)

对所述式(25)取期望完成后，根据光强度ν给出回归参数β₀，β₁，β₂，...，β_k相应的估计值

此时可以得到蛋白加权表达强度Y_ν相应的估计值：

此时使用最小二乘得到参数估计：

在所述式(28)中分别对

求偏导数，并令所述偏导数等于0，得到：

对上述式(29)中的方程组进行求解，即可得到回归参数β₀，β₁，β₂，...，β_k的估计值

和蛋白加权表达强度Y_H。

在使用细胞外囊泡样本浓度H作为光参量X进行计算时，能够将测得的光图谱进行准确的数字转换，求得的细胞外囊泡加权表达强度Y_H准确度最高。

下面选取10例结直肠癌患者，先通过常规检测方法对患者进行检测以得出各患者体内各表达蛋白的实际加权表达强度Y₀，并分别使用上述四种测量方法分别对各患者内个表达蛋白的加权表达强度进行测量，得出表达蛋白测量强度 Y_L,Y_C,Y_ν,Y_H，通过以下公式求出各表达蛋白测量强度Y_L,Y_C,Y_ν,Y_H与表达蛋白实际强度Y₀的偏差值з，以判断上述四种方法的检测准确度：

其中，本实施例检测的细胞外囊泡标志物中，CD9、CD63和CD81三种细胞外囊泡普遍具有较高表达的蛋白，所以在检测时选用上述三种表达蛋白以对上述四种方法的检测准确度进行对比，对比结果如表1所示：

表1

根据表1可以得出，相对于其他两种方法，在使用光强度C细胞外囊泡样本浓度H作为自变量X对患者细胞外囊泡蛋白加权加权表达强度Y进行检测和计算时，得出的偏差值相对较高，测量精准度低；而在选用光亮度L和光频率ν作为自变量X对患者细胞外囊泡蛋白加权加权表达强度Y进行检测和计算时，得出的偏差值明显低于光强度偏差值з_C，所以，相对于光强度C和细胞外囊泡样本浓度H，本实施例会从光亮度L和光频率ν中选用一种参量作为加权求和模型中的自变量X。

然而，在使用光频率ν作为所述自变量X进行计算时，使用的数据数值非常庞大，这样，在测定蛋白加权加权表达强度Y前会消耗大量的时间，同时在数据整理完成后，使用加权求和模型对整理出的光频率数据进行运算时，由于整理得出的光频率ν数值同样庞大，因此也需要大量的运算才能得出所述细胞外囊泡蛋白加权加权表达强度Y，整个过程会耗费大量的时间和运算，因此，在偏差值相似的情况下，本实施例选用在数据处理过程中相对简便的光亮度L作为加权求和模型的自变量X。

具体而言，本检测系统中对细胞外囊泡表达蛋白丰度的加权求和方法包括：

步骤a：将细胞外囊泡表达蛋白总丰度设为因变量M，某种标志物的的光参量设为自变量D，则根据检测的表达蛋白顺序分别将测得的光参量设为： D₁,D₂,...,D_k；

步骤b：由于不同种类表达蛋白在不同患者间的丰度均不相同，因此需根据不同种类的表达蛋白设置对应的权重系数α₁,α₂,...α_k，则所述细胞外囊泡表达蛋白总丰度M可通过下式求得：

M＝α₁D₁+α₂D₂+...+α_kD_k (6)

步骤c：确定测定癌症种类的总数量N，并确定各种类表达蛋白在所述癌症种类数量中具有高表达的个数n₁,n₂,...n_k，则各表达蛋白在癌症中具有高表达的比例为：

步骤d：对所述步骤a中各表达蛋白光参量D取平均值

并对光参量D求方差：

步骤f：根据所述步骤c和步骤d中得出的数据对对权重系数α进行确定：

步骤g：权重系数α确定后，即可根据步骤b中公式即可求得细胞外囊泡表达蛋白总丰度：

其中，所述光参量选用光亮度L。

至此，已经结合附图所示的优选实施方式描述了本发明的技术方案，但是，本领域技术人员容易理解的是，本发明的保护范围显然不局限于这些具体实施方式。在不偏离本发明的原理的前提下，本领域技术人员可以对相关技术特征做出等同的更改或替换，这些更改或替换之后的技术方案都将落入本发明的保护范围之内。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明；对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种结直肠癌检测装置，其特征在于，包括：

用以对待测者血液中的细胞外囊泡进行加热的加热单元；

设置在所述加热单元一侧，用以装载细胞外囊泡的样品仓室单元，所述样品仓室单元用以装载与标有发光催化物抗体一同孵育的细胞外囊泡，通过抗体与细胞外囊泡表达蛋白特异性结合将细胞外囊泡标记酶，标记完成后，向所述样品仓室单元内部加入发光底物，酶催化发光底物并使其达到激发状态，在其转化为基态时发出光信号，并在所述加热单元对所述样品仓室单元加热后，所述样品仓室单元内产生热泳效应及对流，将细胞外囊泡汇聚在所述样品仓室单元内温度较低的一侧；

设置在所述样品仓室单元远离加热单元的一侧，用以对放大后的光信号进行采集和计算的信号处理单元，包括用以观察光信号的物镜和设置在所述物镜远离所述加热单元的一侧，用以反射光标记的采集反光镜；

所述信号处理单元对至少一种光信号参量进行获取，通过量化光参量并通过采用加权模型和/或无加权模型对相应光参量进行计算，获取细胞外囊泡蛋白的加权表达强度和/或无加权表达强度以及表达蛋白总丰度，通过结合三种数值得出细胞外囊泡的SUM表达图，并根据SUM表达图对待测者是否患有结直肠癌症做出判定。

2.根据权利要求1所述的结直肠癌检测装置，其特征在于，所述信号处理单元的检测物理量包括光信号的波长λ、亮度L、强度C以及吸光度A中的至少一种。

3.根据权利要求1所述的结直肠癌检测装置，其特征在于，所述加热单元为设有聚焦装置的激光加热器，通过改变焦点以调节具体加热位置。

4.根据权利要求1所述的结直肠癌检测装置，其特征在于，所述样品仓室单元设置在所述加热单元一侧，所述信号处理单元设置在所述样品仓室单元远离所述加热单元的一侧，包括：

设置在所述加热单元一侧，用以吸收所述加热单元热量的第一导热面；

设置在所述第一导热面下方，用以吸收所述加热单元热量的第二导热面；

设置在所述第一导热面与第二导热面之间的垫片，垫片中心开设有通孔，用以装载样品液体。

5.根据权利要求4所述的结直肠癌检测装置，其特征在于，所述第一导热面与第二导热面均为透明材质，且第二导热面的导热性高于第一导热面的导热性。

6.根据权利要求4所述结直肠癌检测装置，其特征在于，所述垫片中开设有通孔，用以与所述第一导热面和第二导热面配合形成装载细胞外囊泡的空间。

7.根据权利要求1所述的结直肠癌检测装置，其特征在于，所述信号采集单元根据检测装置需要检测的光参量，为CCD相机、照度计、分光计、单色器、sCMOS、EMCCD、PMT中的一种或多种。

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