CN1997664A - 阻断c5a受体的化合物及其在治疗中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及能够防止人C5aR N－端残基10至18与其胞外环分子内接触的化合物。更特别地，本发明涉及能够结合人C5aR位置10、15和18的天冬氨酸以及位置12的甘氨酸的化合物。这样的化合物优选具有通式：Xn－E－X39－K－X7－Y－V－X11－Y－Xm，其中：Xn、X39、X7、X11和Xm为氨基酸和其他字母代表相应的氨基酸或其非成蛋白质性类似物的序列段。本发明还涉及其在预防和治疗中的用途。

Description

阻断C5A受体的化合物及其在治疗中的应用
本发明涉及结合C5a受体(C5aR)并阻断由内源性C5a介导的炎性和免疫调节活性，以治疗炎性疾病和疾病状况的化合物。本发明进一步涉及C5a受体(C5aR)N末端氨基酸序列用于选择和开发抗C5aR化合物的用途。
我们的先天免疫系统保护身体不被外来侵入者(例如，细菌、病毒、真菌和癌细胞)入侵。此系统最重要的细胞是单核细胞和嗜中性粒细胞。识别后它们摄取并杀死入侵者如细菌、真菌和病毒。由于它们是身体的第一道防线的一部分，因而其最重要的任务是尽可能快地杀死并去除侵入者。这通过极具攻击性的物质(如自由基和酶)来完成，这些物质不仅对入侵者是致命的，也导致邻近宿主细胞的损伤。来自这些被损伤的细胞和先天系统本身局部激活的细胞的物质将进一步吸引更多数量的嗜中性粒细胞和单核细胞，引发局部炎症。一旦所有的入侵者被杀死并去除，同时去除了该进程中被杀死的多种细胞，炎症将平息。然后，炎症反应所引发的创伤开始康复。
在一些情况下，这种由嗜中性粒细胞的过度激活而导致的攻击性破坏性炎症反应过度强烈，或者甚至在没有感染性触发的情况下启动。在一些情况下，这种炎症反应是形成严重的、有时候致死性紊乱的原因，其包括像成人呼吸窘迫综合征(ARDS)、血栓活动如心脏病发作和中风后的严重组织损伤、炎性肠道疾病和类风湿性关节炎。
补体(C)系统是先天性免疫系统的关键成员，在宿主抗病原体中扮演中枢角色。它还是启动炎症的强大的驱动器，如果不加调节，能够导致引发严重组织损伤的病理。当细菌已经侵入身体并且，例如感染了中枢神经系统(如在脑膜炎中)时，微生物来源的物质导致补体因子5(C5)转化酶-复合体的激活，其将补体系统的C5转化为其活化的C5a形式。C5a是化学引诱剂：激活并从血管吸引细胞(迁移过程)的物质。嗜中性粒细胞对这两种物质起反应，也对白介素-8(IL-8)起反应。
活化的嗜中性粒细胞能够轻易地从血管迁移。这是因为化学引诱剂、微生物产物和来自活化单核细胞的物质将增加血管的通透性并刺激血管壁的内皮细胞表达某些粘附分子。嗜中性粒细胞表达选择蛋白和整联蛋白(例如，CD11b/CD18)，其结合这些粘附分子。一旦嗜中性粒细胞粘附到内皮细胞，其能够在化学引诱剂/趋化因子的引导下通过细胞迁移到感染部位，此处这些物质的浓度最高。
这些物质还激活嗜中性粒细胞以生产一定范围的其他分子，其中一些吸引更多的嗜中性粒细胞(接着是单核细胞)，但它们主要负责破坏入侵细菌。一些这样的物质(例如，自由基、降解蛋白质的酶(蛋白酶)和降解细胞膜的酶(脂肪酶))具有如此的反应性和非特异性，以致来自周围组织的细胞(和嗜中性粒细胞本身)被破坏，引发组织损伤。此损伤由于源于血液的液体的存在而加剧，所述的流体越过渗漏的血管壁，造成总是伴随炎症的肿胀(称为水肿)。此过多的液体所引发的压力增大导致更多的细胞损伤和死亡。
在以后的炎症过程中，单核细胞迁移到现场而激活。除了在去除细菌和细胞碎片中的作用，它们还生产一些物质如肿瘤坏死因子(TNF)和IL-8，其继而吸引更多活化的嗜中性粒细胞，引发更多的局部损伤。TNF还对嗜中性粒细胞有直接的刺激效应。一旦全部入侵者已被去除，炎症反应将平息，所述区域的剩余″伤亡″将被清理。然后创伤愈合进程开始。通常，损伤的组织将被主要由成纤维细胞和胶原形成的疤痕组织所取代。当炎症在身体具有重要功能的区域例如由心肌细胞、脑细胞或肺泡细胞形成的组织中发生时，正常功能将被形成的疤痕所损害，引发严重症状如心力衰竭、麻痹和肺气肿。为了最小化这些症状的衰弱性后果，尽可能快地“阻抑”所述的炎症反应是重要的。
干预以控制所述的急性早期炎症反应为许多具有可归因于上述事件的症状的受试者提供了改善预后的机会。这样的方法已被提倡用于许多基于急慢性炎症的疾病，而且相关疾病模型中的研究结果显示其具有潜力。在功效或安全性方面，经典抗炎药如甾体类和非甾体类抗炎药(NSAIDS)不具有所述的理想作用谱。甾体类影响″错误的″细胞类型(单核细胞)，并且其阻抑作用很容易被绕开。NSAIDS通常显示相对温和的效果，这部分地是由于它们是在炎性进程晚期介入的。两类药物都由于其药理学活性的其他方面而产生一定程度的不良副作用。直接而特异地防止嗜中性粒细胞的迁移和活化的药物可能具有许多好处。几种尚处于早期开发中的药物只干扰嗜中性粒细胞活化(例如C5转化酶抑制剂、抗C5a的抗体、C5a受体阻断药物)和迁移(抗嗜中性粒细胞上的整联蛋白(象CD11b/CD18)和L-选择蛋白的抗体以及抗内皮细胞上的粘附分子(像ICAM-1和E-选择蛋白)的抗体)的一个方面。抗TNF和IL-8的抗体在慢性炎症中有影响，但在急性炎症中只有边缘性的作用，因为单核细胞(其主要负责这些物质的产生)在急性期中起的作用最小。
有时，急性炎症的成因不能去除，从而炎症变成慢性的。除肺结核、慢性肝炎和某些其他适应症之外，在感染中很少出现这样的情况。然而，慢性炎症还可以由非细菌的刺激例如自身免疫反应所引起。研究已显示在慢性炎症中单核细胞的作用突出得多，嗜中性粒细胞迁移和活化、单核细胞迁移和活化、组织损伤、死亡细胞的去除和创伤愈合都同时发生。细胞与许多不同细胞因子和趋化因子之间相互作用的复杂级联反应已成为许多年集中研究的课题。人们曾经相信单核细胞及其产物是阻抑慢性炎症所需要抑制的最重要的成分。这解释了为什么与单核细胞特异地相互作用的甾体类通常相对于急性炎症在慢性炎症中更为有效。然而长期用甾体类治疗不是理想的选择，因为在产生临床效果所需的剂量下，会产生严重的不可接受的副作用。后来使用抗TNF或IL-8抗体的治疗显示了良好效果，而且最初被视为单核细胞在慢性炎症中起主要作用的证据。但新近的研究对单核细胞在炎症中独一无二的作用提出了疑问，并指出嗜中性粒细胞的关键性作用，目前看来嗜中性粒细胞代表了治疗干预的更好的靶标。
慢性炎性症状的潜在病因并不总是清楚的，而且最初的病因可能不会总是导致将来的复发。一些科学家相信在某些慢性炎性疾病中存在事件的连续循环。他们的想法是现有的活化嗜中性粒细胞和单核细胞持续地吸引和活化新的细胞群，这样，即使最初的刺激已不复存在，炎症反应也将无限地持续下去。这暗示，使用嗜中性粒细胞和单核细胞活化的有效抑制剂进行急性和周期性治疗，可能终止新细胞募集的循环，从而适时地导致病症进展的改变，或者甚至是完全治愈，而不仅仅是症状的减轻。
希望发现可用于炎症治疗的替代性化合物。
一种有希望的候选化合物是具有炎症抑制特性的新药物，其发现于生长中的金黄色葡萄球菌(S.aureus)的胞外基质中，命名为来自于金黄色葡萄球菌的趋化性抑制蛋白(CHIPS)，如WO00/02913中所述。在fMLP-和C5a-诱导的嗜中性粒细胞趋化性中，发现CHIPS抑制fMLP-和C5a-诱导的嗜中性粒细胞活化。使用FITC-标记的CHIPS发现，CHIPS以不同的结构域结合C5aR和FPR二者。这些受体属于趋化因子受体家族，它们都是7次跨膜的异源三聚体G蛋白偶联受体(GPCR)超家族的成员。嗜中性粒细胞在其表面上包含该受体家族的几个成员，包括甲酰化肽、C5a、C3a、PAF和LTB4的受体，以及分别识别IL-8和NAP/GRO/ENA的趋化因子受体CXCR1和CXCR2。GPCR具有胞外的N-端部分、三个胞外和三个胞内环和胞内C-端部分。
然而，预期完整分子太大而不能用于治疗。此外，发现当给予个体CHIPS时，由于预先存在抗这种细菌毒力因子的抗体而导致免疫复合物的形成。
因此本发明的目的是提供具有炎症抑制特性的替代性化合物。
本发明基于CHIPS与C5aR相互作用并因此抑制C5a介导的活化作用的研究。由文献得知C5a在两个不同的位点：识别位点和活化位点结合其受体。认为识别位点位于C5aR N-端残基21-30片段。然而，存在于C5aR N-端位置10、15、16和18的天冬氨酸对于受体对C5a的结合亲和性似乎也是关键的。
这些结果使本发明人想到，C5a结合于由氨基酸21-30组成的识别位点，并且通过C5aR N-端残基10-18与C5aR包外环的分子内接触稳定如此获得的构象。该结合和稳定化将C5a置于适当的位置，以通过其C末端活化位点激活所述受体。
发明人使用两种不同的表达系统，在HEK293细胞中表达完整C5aR和单独表达C5aR N-端。由此发现CHIPS主要结合到C5aR N-端。
C5aR N-端定点突变研究惊奇地证实，CHIPS-结合位点不位于C5a识别位点(氨基酸21-30)。看起来CHIPS通过C5aR N端残基10-18区域而防止所述氨基酸10-18与C5aR胞外环的分子内接触。位置10、15和18的天冬氨酸(D10、D15、和D18)和位置12的甘氨酸(G12)在这里起重要作用。
完整C5aR的N-端定点突变显示，D18和G12是涉及CHIPS结合的最重要的氨基酸，但至少两个天冬氨酸突变的组合对于完全抑制CHIPS的结合是必需的。
C5aR的氨基酸38-350不涉及CHIPS的结合。
另外，在核磁共振(NMR)中，使用包含氨基酸7至28的磺酸化C5aR-衍生肽(这里称为“SO4-C5AR pep7-28”)，其中用C5aR-pep7-28滴定5N-标记的CHIPSΔ30(CHIPS减去前30个氨基酸)，发现了CHIPSΔ30中涉及结合C5aR N端的确切的氨基酸。最明显涉及的氨基酸是R46、K50、K51、G52、K54、E60、K100、K101、G102、K105、Y108、V109、和Y121，但下列的氨基酸可能也涉及CHIPS与C5aR-N-端的结合：T37，L38，R44，L45，N47，Y48，L49，T53，A57，F59，K61，V63，I64，L65，Y71，T73，L76，L80，D83，R84，K85，E88，L89，G91，M93，T96，Y97，E103，I110，N111，和K115。
初步试验使用了两个CHIPS突变体，它们含有赖氨酸突变K50、K51+K54和K100、K101+K105，初步试验确实地显示这两个赖氨酸区域都涉及CHIPS与C5aR的结合。
因此，本发明基于CHIPS与C5aR的精确结合位置信息。另外，本发明还提供了有关CHIPS分子内涉及结合C5aR的氨基酸的信息。然后将上述双重发现用于开发抗-C5aR化合物，所述化合物可以是CHIPS-衍生的化合物或者非CHIPS-衍生的化合物。
因而本发明涉及化合物，该化合物能够防止人C5aR的N-端残基10至18与其胞外环的分子内接触。特别地，本发明涉及化合物，该化合物能够结合到人C5a受体(C5aR)中的下列残基：位置10、15、和18的天冬氨酸(D10、D15、和D18)和位置12的甘氨酸(G12)。
本发明更特别地涉及如下通式的化合物：
Xn-E-X39-K-X7-Y-V-X11-Y-Xm    (I)
其中：
Xn可以存在或者可以不存在，并且是成蛋白质性氨基酸、非成蛋白质性氨基酸、D-氨基酸、肽模拟物构建单元或其组合的序列段(stretch)；
K是赖氨酸或其非成蛋白质性类似物；
E是谷氨酸或其非成蛋白质性类似物；
Y是酪氨酸或其非成蛋白质性类似物；
V是缬氨酸或其非成蛋白质性类似物；
X39、X7和X11各自分别是39、7或11个成蛋白质性氨基酸、非成蛋白质性氨基酸、D-氨基酸、肽模拟物构建单元或其组合的序列段；
Xm可以存在或者可以不存在，并且是成蛋白质性氨基酸、非成蛋白质性氨基酸、D-氨基酸、肽模拟物构建单元或其组合的序列段；并且具有与天然CHIPS相同的三维构象。
具体而言，本发明涉及如下通式的化合物：
Xn-R-X3-K-K-G-X-K-X5-E-X39-K-K-G-X2-K-X2-Y-V-X11-Y-Xm    (II)
其中：
Xn可以存在或者可以不存在，并且是成蛋白质性氨基酸、非成蛋白质性氨基酸、D-氨基酸、肽模拟物构建单元或其组合的序列段；
R是精氨酸或其非成蛋白质性类似物；
K是赖氨酸或其非成蛋白质性类似物；
E是谷氨酸或其非成蛋白质性类似物；
X、X2、X3、X5、X11和X39各自分别是1、2、3、5、11和39个成蛋白质性氨基酸、非成蛋白质性氨基酸、D-氨基酸、肽模拟物构建单元或其组合的序列段。
Y是酪氨酸或其非成蛋白质性类似物；
V是缬氨酸或其非成蛋白质性类似物；
Xm可以存在或者可以不存在，并且是成蛋白质性氨基酸、非成蛋白质性氨基酸、D-氨基酸、肽模拟物构建单元或其组合的序列段；并且具有与天然CHIPS相同的三维构象。
本发明的特定实施方案中，所述化合物具有通式：
Xn-T-X6-R-L-R-N-X2-K-K-G-T-K-X4-F-E-K-X-V-X7-Y-X4-L-X11-E-X11-K-K-G-E-X-K-X2-Y-V-X-N-X3-K-X5-Y-Xm    (III)
其中
Xn可以存在或者可以不存在，并且是成蛋白质性氨基酸、非成蛋白质性氨基酸、D-氨基酸、肽模拟物构建单元或其组合的序列段；
T是苏氨酸或其非成蛋白质性类似物；
R是精氨酸或其非成蛋白质性类似物；
L是亮氨酸或其非成蛋白质性类似物；
N是天冬酰胺或其非成蛋白质性类似物；
X，X2，X3，X4，X5，X6，X7，X11和X16各自分别是1、2、3、4、5、6、7或16个成蛋白质性氨基酸、非成蛋白质性氨基酸、D-氨基酸、肽模拟物构建单元或其组合的序列段；
K是赖氨酸或其非成蛋白质性类似物；
G是甘氨酸或其非成蛋白质性类似物；
F是苯丙氨酸或其非成蛋白质性类似物；
E是谷氨酸或其非成蛋白质性类似物；
Y是酪氨酸或其非成蛋白质性类似物；
V是缬氨酸或其非成蛋白质性类似物；并且有与天然CHIPS相同的三维构象。
在本发明的另一实施方案中，所述化合物具有通式：
Xn-T-L-X5-R-L-R-N-Y-L-K-K-G-T-K-X2-A-X-F-E-K-X-V-I-L-X5-Y-X-T-X2-L-X3-L-X2-D-R-K-X2-E-L-X-G-X-M-X2-T-Y-X2-K-K-G-E-X-K-X2-Y-V-I-N-X3-K-X5-Y-Xm    (IV)
其中
Xn可以存在或者可以不存在，并且是成蛋白质性氨基酸、非成蛋白质性氨基酸、D-氨基酸、肽模拟物构建单元或其组合的序列段；
T是苏氨酸或其非成蛋白质性类似物；
R是精氨酸或其非成蛋白质性类似物；
L是亮氨酸或其非成蛋白质性类似物；
I是异亮氨酸或其非成蛋白质性类似物；
M是蛋氨酸或其非成蛋白质性类似物；
A是丙氨酸或其非成蛋白质性类似物；
D是天冬酰胺或其非成蛋白质性类似物；
N是天冬酰胺或其非成蛋白质性类似物；
K是赖氨酸或其非成蛋白质性类似物；
G是甘氨酸或其非成蛋白质性类似物；
F是苯丙氨酸或其非成蛋白质性类似物；
E是谷氨酸或其非成蛋白质性类似物；
Y是酪氨酸或其非成蛋白质性类似物；
V是缬氨酸或其非成蛋白质性类似物；
X、X2、X3和X5，各自分别是1、2、3或5个成蛋白质性氨基酸、非成蛋白质性氨基酸、D-氨基酸、肽模拟物构建单元或其组合的序列段；
并且具有与天然CHIPS相同的三维构象。
在式I中，Xn和Xm可以各自包含0-100个，优选1-90个，更优选-75个，最优选1-59个。
在式II中，Xn和Xm可以各自包含0-100个，优选1-50个，更优选1-25个，最优选1-15个。
在式III和IV中，Xn和Xm可以各自包含0-100个，优选1-50个，更优选1-25个，最优选1-6个。
更具体的实施方案是CHIPSΔ1，CHIPSΔ17，CHIPSΔ30，其缺少天然产生的CHIPS N末端结构域的1、17和30个氨基酸。天然CHIPS不包括于本发明所要求的范围内。
因此本发明涉及具有骨架的化合物，在所述骨架中，与CHIPS中相同或相似的氨基酸残基以与CHIPS中相同或相似的构象存在，这允许它们结合于C5aR的10、15和18位天冬氨酸(D10、D15和D18)和12位甘氨酸(G12)。涉及结合的CHIPS的氨基酸残基的鉴定是生产一系列化合物的基础，这些化合物可能差异很大，但是有一个共同之处，即所需构象中的结合残基。在此基础上，分子建模领域的技术人员通过使用抗体或所谓的结合体(bindingbodies)，通过筛选肽文库或其他使用这些序列为模板的方法，将能设计出满足这些要求并因此能用于涉及C5aR的适应症的治疗的化合物。
可以通过多种方式来在本发明的化合物中提供与天然CHIPS构象相同或相似的结合残基，例如通过以氨基酸、非成蛋白质性类似物、或跨越相同空间距离的其他分子来连接热点。
或者，可以用从C5aR方面获得的信息由化合物文库筛选结合C5aR的化合物。因此本发明提供了鉴定能够结合C5aR的化合物的方法，包括
a)提供候选化合物文库，
b)将文库成员与C5aR相关化合物接触，该C5aR相关化合物包含基序Xq-D-X-G-X2-D-X2-D-Xr，其中Xq、X、X2和Xr分别是0-9、1、2和0-20个成蛋白质性氨基酸或其非成蛋白质性类似物的序列段，D是天冬氨酸，G是甘氨酸，其以与天然C5aR中发现的相同或相似的构象存在，
c)鉴定结合C5aR相关化合物的文库成员，C5aR相关化合物可以是C5aR本身或至少包含目前发现涉及结合天然构象形式的CHIPS的残基。
以上方法可以进一步包括提供如此鉴定的成员，以用于预防或治疗的步骤。本发明还涉及这样鉴定的化合物和其用途。
适合地，具有CHIPS中发现的C5aR结合残基的化合物为肽或多肽。然而，所有的这些肽可以作为起点进行进一步修饰，例如用其他构建单元取代一个或多个氨基酸。
具有结合C5aR能力的肽可以通过已知的化学合成方法制备。通过合成方法构建肽的方法是本领域技术人员已知的。这些合成的肽由于与涉及结合C5aR的CHIPS的序列段有共同的一级，二级和/或三级结构和/或构象特征，将拥有与之相同的活性，指结合C5aR的性质。因此，这样合成生产的肽，可以作为生物学活性上或免疫上的替代物来替代具有所需的C5aR结合能力并由成蛋白质性氨基酸组成的(多)肽。
这里提供的化合物还包括以氨基酸序列为特征的化合物，在所述氨基酸序列中天然地提供了或者有意地引入了修饰。肽的修饰可由本领域技术人员使用已知的常规技术完成。化合物序列中感兴趣的修饰包括置换、插入或缺失编码序列中所选择的氨基酸残基。
在一些实例中，肽在药物中使用的潜能可能由于几种原因而受到限制。例如肽可能过于亲水而不能穿过像细胞膜和血脑屏障之类的膜，可能通过肾脏和肝脏迅速地从体内排出，从而导致低的生物利用度。另外，由于可能被蛋白酶迅速降解，例如在胃肠道中，肽的生物稳定性和化学稳定性可能较差。同样，肽通常是可呈现为数千种构象的柔性化合物。生物活性构象通常只是这些可能性中的一种，其有时可能会导致对靶受体例如C5aR的低选择性和亲和性。最后，肽的效力可能不足以用于治疗目的。
由于上述缺陷，肽有时主要用作设计其他药物的来源，而本身不作为实际药物。在这种情况下，需要开发减少了这些缺陷的化合物。肽的替代物为所谓的肽模拟物。以本发明的化合物为基础的肽模拟物也是本申请的一部分。在那种情况下，一个或多个氨基酸被肽模拟物构建单元所取代。
文献中描述了肽模拟物的多种定义。其中，将肽模拟物描述为“设计用于将肽中包含的信息转变为小型非肽结构的化学结构”，“模拟肽的生物学活性但不包含任何肽键的分子”，“在与受体和酶相互作用中作为肽的合适替代物的结构”以及“化学特洛伊木马”。
总体上，肽模拟物可分为两类。第一类由具有非肽样结构的化合物组成，通常是其上附着了药效基团的支架。因此，它们是低分子量化合物，并且与天然肽无结构相似性，因此对蛋白水解酶的稳定性更高。
第二类主要的肽模拟物由具有与肽相似的模块构造的化合物即寡聚肽模拟物组成。这些化合物可通过肽侧链或肽骨架的修饰而获得。后一类肽模拟物可认为是通过用其他部分替换肽的酰胺键而由肽衍生的。因此，预期这些化合物对于蛋白酶降解更加不敏感。酰胺键的修饰也影响其他特征，例如亲脂性，氢键容量，构象柔性，这在有利的实例中可能导致化合物的药理学和/或制药学特性全面改善。
寡聚肽模拟物原则上可从单体构建单元起始，在反应步骤的重复循环中制备。因此，这些化合物可能适合于自动合成，类似于已经完善的在肽合成仪中制备肽的方法。单体构建单元的另一种应用在于制备肽/肽模拟物杂交体：组合天然氨基酸和肽模拟物构建单元来生成只有一些酰胺键被替代的产物。这可使化合物与天然肽的差异足够大，以获得增强的生物稳定性，但仍具有与原始结构足够的相似性，以保留生物活性。
用于本发明的合适的肽模拟物构建单元是酰胺键替代物(surrogates)，例如寡聚-β-肽(Juaristi，E.Enantioselective Synthesis of b-Amino Acids；Wiley-VCH：New YorK，1996)，插烯肽(vinylogous peptides)(Hagihari，M.等，J.Am.Chem.Soc.1992，114，10672-10674)，拟肽(peptoids)(Simon，R.J.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1992，89，9367-9371；Zuckermann，R.N.等，J.Med.Chem.1994，37，2678-2685；Kruijtzer，J.A.W.&Liskamp，R.M.J.TetrahedronLett.1995，36，6969-6972)；Kruijtzer，J.A.W.Thesis；Utrecht University，1996；Kruijtzer，J.A.W.等，Chem.Eur.J.1998，4，1570-1580)，寡砜(oligosulfones)(Sommerfield，I.&Seebach，D.Angew.Chem.，Int.Ed.Eng.1995，34，553-554)，磷酸二酯(Lin，P.S.；Ganesan，A.Bioorg.Med.Chem.Lett.1998，8，511-514)，寡聚磺酰胺(Moree，W.J.等，Tetrahedron Lett.1991，32，409-412；Moree，W.J.等，Tetrahedron Lett.1992，33，6389-6392；Moree，W.J.等，Tetrahedron 1993，49，1133-1150；Moree，W.J.Thesis；Leiden University，1994；Moree，W.J.等，J.Org.Chem.1995，60，5157-5169；de Bont，D.B.A.等，Bioorg.Med.Chem.Lett.1996，6，3035-3040；de Bont，D.B.A.等，Bioorg.Med.Chem.1996，4，667-672；Lwik，D.W.P.M.Thesis；Utrecht University，1998)，拟肽磺酰胺(van Ameijde，J.&Liskamp，R.M.J.Tetrahedron Lett.2000，41，1103-1106)，插烯磺酰胺(vinylogous sulfonamides)(Gennari，C.等，Eur.J.Org.Chem.1998，2437-2449)，azatides(或肼基肽)(Han，H.&Janda，K.D.J.Am.Chem.Soc.1996，118，2539-2544)，寡聚氨基甲酸酯(Paikoff，S.J.等，Tetrahedron Lett.1996，37，5653-5656；Cho，C.Y.等，Science 1993，261，1303-1305)，脲拟肽(ureapepoids)(Kruijtzer，J.A.W.等，Tetrahedron Lett.1997，38，5335-5338；Wilson，M.E.&Nowick，J.S.Tetrahedron Lett.1998，39，6613-6616)和oligopyrrolinones(Smith III，A.B.等，J.Am.Chem.Soc.1992，114，10672-10674)。
已经开发了插烯肽和oligopyrrolinones，用于形成类似于肽的那些二级结构(β-链构象)，或模拟肽的二级结构。预期所有这些寡聚肽模拟物都是抗蛋白酶的，可以在高产率偶联反应中从光学活性单体(除了拟肽)装配。
肽磺酰胺由包含一个或多个磺酰胺过渡态等排物的α-或β-取代氨基乙烷磺酰胺组成，所述磺酰胺过渡态等排物为酰胺键的水解类似物。已发现包含酰胺键水解的过渡态类似物的肽类似物在蛋白酶抑制剂如HIV-蛋白酶抑制剂开发中的广泛用途。
另一种开发寡聚肽模拟物的方法是，通过用不可水解的替代物如氨基甲酸酯、砜、脲和磺胺基团替换所有的酰胺键，从而完全修饰肽的骨架。这样的寡聚肽模拟物可能具有增强的代谢稳定性。最近，已设计出以酰胺为基础的替代性寡聚肽模拟物，即N-取代的甘氨酸寡肽，所谓的拟肽。拟肽的特点是氨基酸侧链存在于酰胺氮上，而不象肽中那样存在于α-C原子上，这导致代谢稳定性增强，同时消除骨架的手性。手性α-C原子的缺失可认为是优点，因为对于拟肽来说不再存在肽中存在的空间限制。另外，拟肽中侧链与羰基之间的空间与肽中相同。尽管肽与拟肽不同，但已表明它们产生生物活性化合物。
将肽链翻译成拟肽肽模拟物可能产生拟肽(直接翻译)或反拟肽(retropeptoid)(反序列)。在后一类中保持了羰基对侧链的相对方向，因此与亲本肽更为相似。
此处将有关肽模拟物的综述性文章引入作为参考：Adang，A.E.P.等；Recl.Tav.Chim.Pays-Bas 1994，113，63-78；Giannis，A.&Kolter，T.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1993，32，1244-1267；Moos，W.H.等，Annu.Rep.Med.Chem.1993，28，315-324；Gallop，M.A.等，J.Med.Chem.1994，37，1233-1251；Olson，G.L.等，J.Med.Chem.1993，36，3039-30304；Liskamp，R.M.J.Recl.Tav.Chim.Pays-Bas 1994，113，1-19；Liskamp，R.M.J.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1994，33，305-307；Gante，J.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1994，33，1699-1720；Gordon，E.M.等，Med.Chem.1994，37，1385-1401；和Liskamp，R.M.J.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1994，33，633-636。
因此，本发明还涉及这样的化合物，它们本身不是肽或多肽，但具有与本发明的化合物相似的结构和功能。这种分子的例子有上述的肽模拟物，还有其中一个或多个成蛋白质性氨基酸被非成蛋白质性氨基酸或D-氨基酸所取代的化合物。当本申请中涉及化合物时，还将包括这样的其他化合物，这些化合物具有与原始肽化合物相似或相同的结构和功能，因此也就具有相似或相同的生物学活性。
更具体而言，可用于取代的非成蛋白质性氨基酸选自下列：2-萘基丙氨酸(Nal(2))、β-环己基丙氨酸(Cha)、对-氨基-苯丙氨酸((Phe(p-NH2)、对-苯甲酰基苯丙氨酸(Bpa)、鸟氨酸(Orn)、正亮氨酸(Nle)、4-氟-苯丙氨酸(Phe(p-F))、4-氯-苯丙氨酸(Phe(p-Cl))、4-溴-苯丙氨酸(Phe(p-Br))、4-碘-苯丙氨酸(Phe(p-I))、4-甲基-苯丙氨酸(Phe(p-Me))、4-甲氧基-苯丙氨酸(Tyr(Me))、4-硝基-苯丙氨酸(Phe(p-NO2))。
在本发明的化合物中取代成蛋白质性氨基酸的合适的D-氨基酸为例如选自下列：D-苯丙氨酸、D-丙氨酸、D-精氨酸、D-天冬酰胺、D-天冬氨酸、D-半胱氨酸、D-谷氨酸、D-谷氨酰胺、D-组氨酸、D-异亮氨酸、D-亮氨酸、D-赖氨酸、D-蛋氨酸、D-脯氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-色氨酸、D-酪氨酸、D-缬氨酸、D-2-萘基丙氨酸(D-Nal(2))、β-环己基-D-丙氨酸(D-Cha)、4-氨基-D-苯丙氨酸(DPhe(p-NH2))、对-苯甲酰基-D-苯丙氨酸(D-Bpa)、D-鸟氨酸(D-Orn)、D-正亮氨酸(D-Nle)、4-氟-D-苯丙氨酸(D-Phe(p-F))、4-氯-D-苯丙氨酸(D-Phe(p-Cl))、4-溴-D-苯丙氨酸(D-Phe(p-Br))、4-碘-D-苯丙氨酸(D-Phe(p-I))、4-甲基-D-苯丙氨酸(D-Phe(p-Me))、4-甲氧基-D-苯丙氨酸(D-TYr(Me))、4-硝基-D-苯丙氨酸(D-Phe(p-NO2))。
本发明化合物中的一个或多个成蛋白质性氨基酸可由例如选自下列的拟肽构建单元所取代：N-取代的甘氨酸，如N-苄基甘氨酸(NPhe)、N-甲基甘氨酸(NAla)、N-(3-胍基丙基)甘氨酸(NArg)、N-(羧甲基)甘氨酸(NAsp)、N-(氨基甲酰基甲基)甘氨酸(NAsn)、N-(硫代乙基)-甘氨酸(NhCys)、N-(2-羧乙基)甘氨酸(NGlu)、N-(2-氨基甲酰基乙基)甘氨酸(NGln)、N-(咪唑基乙基)甘氨酸(NhHis)、N-(1-甲基丙基)甘氨酸(NIle)、N-(2-甲基丙基)甘氨酸(NLeu)、N-(4-氨基丁基)甘氨酸(NLys)、N-(2-甲基硫代乙基)甘氨酸(NMet)、N-(羟乙基)甘氨酸(NhSer)、N-(2-羟丙基)甘氨酸(NhThr)、N-(3-吲哚甲基)甘氨酸(NTrp)、N-(对羟基苯甲基)-甘氨酸(NTyr)、N-(1-甲基乙基)甘氨酸(NVal)。
本发明的所有化合物也可以是环状的。环状化合物可以具有改善的效力、稳定性、刚性和/或其他制药学和/或药理学特征。
另一方面，本发明涉及抗C5aR或C5aR相关化合物的抗体或其衍生物，该C5aR相关化合物包含基序Xq-D-X-G-X2-D-X2-D-Xr，其中Xq、X、X2和Xr是0-9、1、2和0-20个的序列段。这里所用的衍生物是众所周知的具有抗体的特异性但不是完整抗体的化合物。衍生物的例子是本领域熟知的，包括scFv、Fab片段、嵌合抗体、双功能抗体及其他。
本发明化合物的功能活性可通过多种方法测定。可通过用流式细胞仪测定化合物防止荧光-C5a(如FITC-C5a)结合嗜中性粒细胞的能力而测定化合物的C5aR结合活性。
也可通过趋化性试验如转孔系统(Transwell system)测定化合物防止嗜中性粒细胞向C5a迁移的能力而测定化合物的活性。另外，基于趋化因子包括C5a启动细胞内钙浓度迅速瞬时提高的能力的试验，可用于筛选本发明化合物的生物学活性。或者，基于趋化因子包括C5a启动例如弹性蛋白酶的分泌的能力的试验，可用于筛选本发明的化合物的生物学活性，其中弹性蛋白酶由细胞松弛素B刺激的嗜中性粒细胞分泌。可使用本领域已知的多种其他试验，包括但不限于多种钙特异性荧光探针与流式细胞仪或荧光测定法、或微量生理测定组合。作为用于以任何方法筛选生物学活性的细胞，例如可以使用新分离的嗜中性粒细胞或用C5aR、野生型或突变形式的该受体转染的细胞。
本发明的化合物可用于预防或治疗涉及嗜中性粒细胞、单核细胞和内皮细胞上的C5a受体(C5aR)的适应症。这类适应症可涉及急性或慢性炎症反应，可选自表4所列出的组。表4并不意味着限制本发明化合物的可能用途。化合物在未来的适应症中的用途也是本发明的一部分。
本发明进一步涉及所述化合物在预防或治疗涉及除嗜中性粒细胞、单核细胞和内皮细胞以外的其他细胞上的C5aR的适应症。其他细胞可以是淋巴细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、巨噬细胞、小胶质细胞、星形胶质细胞、Kupfer细胞、肝细胞和上皮细胞。
本发明的化合物也可用于针对由产CHIPS细菌如金黄色葡萄球菌引起的感染的预防性或治疗性疫苗中。
本发明的化合物也可用于制备涂覆组合物，用于通过皮肤介入人体的或在手术过程中置于体内的医学装置表面上。该表面可以是导管尖端的表面。适合地，所述组合物为缓释组合物。
本发明涉及化合物本身以及如上所述的化合物的多种用途。另外，本发明提供治疗性和预防性组合物，包含合适的赋形剂和一种或多种所要求的化合物。
根据另一方面，本发明涉及预防或治疗受试者的方法，所述受试者患有涉及嗜中性粒细胞、单核细胞和内皮细胞上的C5aR的适应症，该方法包括给药预防或治疗有效量的一种或多种所要求的化合物。所要治疗的适应症与上述相同。
在其另一实施方案中，本发明涉及预防或治疗受试者的方法，所述受试者患有涉及除嗜中性粒细胞、单核细胞和内皮细胞以外的其他细胞上的C5aR的适应症，所述方法包括给药预防或治疗有效量的一种或多种所要求的化合物。所述的其他细胞为淋巴细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、巨噬细胞、小胶质细胞、星形胶质细胞、Kupfer细胞、肝细胞和上皮细胞。
本发明的对受试者进行抗产CHIPS细菌感染的预防或治疗性处理的方法，该方法包括施用预防或治疗有效量的一种或多种所要求的化合物。
标准遗传密码编码20种氨基酸，这些氨基酸被称为成蛋白质性(proteinogenic)(构成蛋白质)的。在自然界中已发现500种以上的其他氨基酸。这些其他的氨基酸此处称为“非成蛋白质性氨基酸”。
蛋白中的所有氨基酸呈现出与L-甘油醛相同的绝对空间构型。因此，它们都是L-氨基酸。D-氨基酸从未在蛋白中发现，尽管它们存在于自然界中。此处将其称为“D-氨基酸”。
肽模拟物(peptidomimetic)是包括非肽结构成分、能模仿或拮抗天然亲本肽的生物学作用的化合物。肽模拟物不再有经典的肽特征如肽键。肽模拟物的组成部分此处称为“肽模拟物构建单元”(peptidomimetic building blocks)。
所有特定氨基酸的非蛋白质变异体此处称为“其非成蛋白质性类似物”。
将进一步在下述实施例中阐述本发明，这些实施例不意味着以任何方式限制本发明。实施例中参考下述附图：
图1显示CHIPS-FITC与C5aR N末端的结合，C5aR N末端包括不同的点突变和缺失，用pDISPLAY载体表达于HEK-293细胞上。
图2A显示CHIPS-FITC与完整C5aR的结合，C5aR其N末端包含不同的点突变和缺失，用pcDNA3.1载体表达于HEK-293细胞上。
图2B显示CHIPS-FITC与完整C5aR和C5aR嵌合体的结合，其中N末端和胞外环由其他G蛋白偶联受体的相应区域所交换。在大多数嵌合体中也构建了额外的D10A突变。所有受体均使用pcDNA3.1载体表达于HEK-293细胞上。
图3显示包含7-28位氨基酸的SO4-C5aR-N末端肽对CHIPS-FITC结合野生型C5aR的抑制，该野生型C5aR表达于U937细胞上。
图4显示人嗜中性粒细胞中WT-CHIPS和CHIPS31-121抑制C5a诱导的钙动员的能力。
图5A+B显示CHIPS31-121和CHIPS31-121的所示突变体对抗C5aR单克隆抗体结合C5aR的抑制，其中C5aR表达于U937细胞上。
表1显示所有涉及结合野生型CHIPS(WT-CHIPS)的C5aR的氨基酸，其通过测试所有C5aR突变体和C5aR嵌合体的WT-CHIPS结合而获得，如图1和2中所描述的。
表2显示所有涉及或可能涉及CHIPS31-121与C5aR结合的CHIPS31-121的氨基酸，其通过在15N-1H-HSQC NMR试验中用SO4-C5AR pep7-28滴定15N-标记的CHIPS31-121而获得。
表3显示不同CHIPS31-121突变体的IC50值，其中单个的氨基酸取代为丙氨酸(除非另有说明)。用图6A+B所示试验完成IC50的测定。
表4列出了由炎症反应引发的疾病和疾病状况，其涉及补体活化和/或嗜中性粒细胞和/或单核细胞。对本发明多肽治疗这些疾病的治疗有效性的支持可在以下参考文献中所发现：
对于ARDS：Demling RH(1995).The modern version of adult respiratorydistress syndrome.Ann.Rev.Med.46：193-202；和Fujishima S，Aikawa N(1995)Neutrophil-mediated tissue injury and its modulation.Intensive Care Med21：277-285；
对于严重感染(脑膜炎)：Tunkel AR和Scheld WM(1993).Pathogenesisand pathophysiology of bacterial meningitis.Clin.Microbiol.Rev.6：118.对于缺血/再灌注后损伤：Helier T，等(1999).Selection of a C5a receptor antagonistfrom phage libraries attenuating the inflammatory response in immune complexdisease and ischemia/reperfusion injury.J.Immunol.163：985-994。
对于类风湿性关节炎：Edwards SW和Hallett MB 25(1997).Seeing thewood for the trees：the forgotten role of neutrophils in rheumatoid arthritis.Immunology Today 18：320-324；和Pillinger MH，Abramson SB(1995).Theneutrophil in rheumatoid arthritis.Rheum.Dis.Clin.North Am.199521：691-714。
对于心肌梗塞：Byrne JG，Smith WJ，Murphy MP，Couper GS，AppleyardRF，Cohn LH(1992).Complete prevention of myocardial stunning，contracture，low-reflow，and edema after heart transplantation by blocking neutrophiladhesion molecules during reperfusion.J.Thorac.Cardiovasc.Surg.104：1589-96。
对于CORD：Cox G(1998).The role of neutrophils in inflammation.Can.Respir.J.5 Suppl A：37A-40A；and Hiemstra S PS，van Wetering S，Stolk J(1998).Neutrophil serine proteinases and defensins in chronic obstructivepulmonary disease：effects on pulmonary epithelium.Eur.Respir.J.12：1200-1208。
对于中风：Barone FC，Feuerstein GZ(1999).Inflammatory mediators andstroke：new opportunities for novel therapeutics.J.Cereb.Blood Flow Metab.19：819-834；和Jean WC，Spellman SR.Nussbaum ES，Low WC(1998).Reperfusion injury after focal cerebral ischemia：the role of inflammation and thetherapeutic horizon.Neurosurgery 43：1382-1396。
对于脑膜炎：luomanen EI(1996).Molecular and cellular mechanisms ofpneumococcal meningitis.Ann.N.Y.Acad.Sci.797：4252。
对于所有补体直接相关疾病：改编自：A.Sahu和J.D.LambrisImmunophannacology 49(2000)133-148。
实施例
实施例1
C5aR中CHIPS结合位点的鉴定
材料与方法
1.1完整C5aR和C5aR N-端的克隆
用引物PCR扩增编码人全长C5aR的DNA序列，所述引物的序列经修饰，在C5aR开放阅读框(ORF)的第一个蛋氨酸(起始密码子)的下游引入了N末端FLAG表位标签(DYKDDDDK)，以及允许在表达质粒pcDNA3.1(Invitrogen，Paisley，UK)中克隆带FLAG标签的C5aR序列的限制性位点(EcoRI和XbaI)。所述片段以合适的方向插入，使得可以由CMV启动子表达带FLAG标签的C5aR。通过序列分析确认克隆的FLAG-标记的C5aR序列。FLAG-标签使得可以用单克隆抗体(mAb)M2(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO，USA)检测C5aR。
用引物通过PCR克隆编码人C5aR的前38个氨基酸(相当于C5aR N末端)的DNA序列，所述引物序列被修饰以引入限制性位点(AccI和BglII)，从而可以在表达质粒pDISPLAY(Invitrogen，Paisley，UK)中克隆C5aR N末端序列。所述片段以合适的方向插入，使得可以由CMV启动子表达C5aR N末端。存在于C5aR N末端序列上游的鼠Igκ链V-J2-C信号肽序列使C5aR N末端蛋白得以被定向引导至真核细胞的分泌途径。存在于C5aR N-端序列下游的PDGF受体的跨膜结构域将C5aR N-端蛋白锚定于真核细胞的质膜以进行展示。存在于C5aR N末端序列上游和信号肽下游的血凝素A表位标签使得可以用mAb 12CA5(Roche，Molecular Biochemicals，Mannheim，Germany)检测pDISPLAY C5aR N-末端蛋白。通过序列分析确认克隆的C5aR N末端序列。
1.2 CHIPS制备
用Thermal Ace DNA聚合酶(Invitrogen，Paisley，UK)PCR扩增编码WT-CHIPS(CHIPS 1-121)的金黄色葡萄球菌的染色体DNA，所用引物为：
CHIPS 1-121的5’TTTACTTTTGAACCGTTTCCTAC与
3’CGTCCT GAATTCTTAGTATGCATATTCATTAG(加下划线的序列代表EcoRI位点)的组合。用金黄色葡萄球菌Newman的染色体DNA作为模板进行扩增反应，所述模板是用高纯度PCR模板制备试剂盒(Roche MolecularBiochemicals，Mannheim，Germany)分离的。提供N-端组氨酸标签的pRSET表达载体(Invitrogen)用BamHI消化并用S1核酸酶(Roche Diagnostics；100U/ml，30min 37℃)处理，以准确地在编码肠激酶裂解位点的DNA序列之后提供平端载体。
随后，用EcoRI消化载体，并与EcoRI-消化的PCR产物连接。在TOP10F’大肠杆菌(E.Coli)中增殖质粒。为了表达，转化了BL21(DE3)E.Coli，1个克隆在含有50μg/ml羧苄青霉素(Sigma)的2ml LB中生长一整天，随后过夜(1∶1000)。第二天早上，沉淀细胞并重悬于含50μg/ml羧苄青霉素的新鲜LB中，获得0.1的OD660。培养物生长至OD660为0.8，用1mM IPTG 37℃诱导2.5小时。然后，沉淀细胞并重悬于含500mM NaCl，pH7.8的20mM磷酸钠缓冲液中，-20℃保存直至使用。
为分离CHIPS1-121或CHIPS31-121，用100μg/ml卵清溶菌酶(Sigma)在冰上处理细胞15分钟。为进一步裂解细胞，超声处理细菌，在液氮中冷冻并在37℃水浴中解冻，总共四个循环。
之后，在冰上加入RNase和DNase(5μg/ml)，作用30分钟。随后，将溶解产物于3000g 4℃下离心30分钟，以0.45μm过滤器过滤，用冰冷的pH7.8磷酸盐缓冲液1∶1稀释，并以0.2ml/min的流速通过带电荷的镍柱(Invitrogen)。分别用pH7.8、pH6.0、和pH5.3的磷酸盐缓冲液冲洗柱子。用PBS/50mMEDTA洗脱柱子。室温下用肠激酶(1U/ml蛋白)裂解4小时以去除组氨酸标签。
1.3用FITC标记纯化的CHIPS蛋白
室温下将纯化的CHIPS(500μg/ml蛋白)和1/10体积的1mg/ml FITC(异硫氰酸荧光素，Fluorescein Isothiocyanate，异构体I；Sigma)一起在pH9.6的1M碳酸钠缓冲液中温育1小时。使混合物通过脱盐柱(Pharmacia，Fast DesaltingHR 10/10)，将FITC-标记的CHIPS与游离的FITC分离，由在线偶联荧光仪(on-line coupled fluorometer)(Perkin Elmer)监测洗出液的OD280和荧光。合并具有高OD280和荧光的级分，用Micro BCA蛋白测定(Pierce)分析蛋白含量。将CHIPS-FITC在-20℃以小等份保存。
1.4 C5aR与C5aR N-端的表达
在HEK293细胞中通过转染包含C5aR的ORF的pcDNA3.1质粒来表达完整C5aR。因此，根据生产商的说明(Invitrogen)，在6孔平板中用lipofectamine2000(5μl)以1μgDNA转染HEK293细胞，所述HEK293细胞保持在含有0.1mM非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠、10μg/ml庆大霉素和10％FCS的MEM(Gibco Invitrogen Corporation)中。
转染2至3天后，用PBS/胰蛋白酶收集细胞，用RPMI/0.05％人血清白蛋白(HSA；CLB，Amsterdam，The Neterlands)洗涤，与10μg/ml抗-FLAG M2mAb和3μg/ml FITC-标记的CHIPS一起培养，随后与2μ/ml APC标记的羊抗小鼠Igs(PharMingen，San Diego，CA，USA)一起培养。在添加碘化丙啶(propidium jodide)后，洗涤细胞并在流式细胞仪上检测CHIPS-FITC与表达C5aR N-端蛋白(APC-阳性)且为碘化丙啶阴性(活的)细胞的结合。
为了表达C5aR N-端，如上述在HEK293细胞中转染包含C5aR N-端序列的pDISPLAY质粒，不同的是当检测CHIPS-FITC的结合时，所述细胞与5μg/ml抗-HA标签12CA5mAb而不是抗-FLAG M2 mAb一起培养。
1.5 C5aR-或C5aRN-末端-突变体和C5aR嵌合体的克隆与表达
通过重叠延伸PCR(Ho SN等，1989，Gene 77；51)在C5aR和/或C5aR N末端上进行定点诱变。诱变在C5aR N末端从氨基酸脯氨酸9(命名为P9)直到天冬氨酸21(命名为D21)的所有氨基酸上进行。表1描述了C5aRN末端的全部氨基酸序列。所有的氨基酸都突变为丙氨酸(A；命名为P9A、D10A等)，作为单突变或突变组合。只有酪氨酸(Y)11和14变为苯丙氨酸(F；命名为Y11F等.)而不是丙氨酸。其他的突变体是缺失N末端8、13、或18位氨基酸，命名为del-8、del-13、del-18。还通过重叠延伸PCR构建了下述的C5aR嵌合体：
*N-C3aR+C5aR：C5aR的N-末端(对应于C5aR的氨基酸1-37)替换为C3aR的N-末端(对应于C3aR的氨基酸1-23)。
*N-C5aR+C3aR：C3aR的N-末端(对应于C3aR的氨基酸1-23)替换为C5aR的N-末端(对应于C5aR的氨基酸1-37)。
*C5aR-lp1(IL8R)：C5aR胞外环1(对应于C5aR的氨基酸90-117)替换为IL8R的胞外环1(对应于IL8R的氨基酸93-118)。
*C5aR-lp2(IL8R)：C5aR胞外环2(对应于C5aR的氨基酸172-211)替换为IL8R的胞外环2(对应于IL8R的氨基酸172-211)。
*C5aR-lp3(C3aR)：C5aR胞外环3(对应于C5aR的氨基酸265-280)替换为C3aR的胞外环3(对应于C3aR的氨基酸400-415)。
在上述所有的C5aR嵌合体中，除N-C3aR+C5aR外，还构建了额外的D10A突变。如1.1所述将突变的完整C5aR和C5aR嵌合体的PCR片段克隆到pcDNA3.1质粒中。如1.1中所述将突变的C5aR N-末端的PCR片段克隆到pDISPLAY质粒中。
结果
图1显示CHIPS-FITC与C5aR N末端的结合，C5aR N末端包含不同的点突变和缺失，用pDISPLAY载体表达于HEK-293细胞上。由此可见，通过位置15和18的突变和1-13位以及更多氨基酸的删除使结合几乎完全消除。
图2A显示CHIPS-FITC与完整C5aR的结合，在C5aR的N末端包含不同的点突变和删除，其用pcDNA3.1载体表达于HEK-293细胞上。由此可见第10、15和18位3个天冬氨酸的突变最显著地减少了CHIPS-FITC与完整C5aR的结合。
图2B显示CHIPS-FITC与完整C5aR和C5aR嵌合体的结合，其中N末端和胞外环替换为其他G蛋白偶联受体的相应区域。在大部分嵌合体中也构建了额外的D10A突变。所有的受体都用pcDNA3.1载体表达于HEK-293细胞上。图2B显示没有一个C5aR的胞外环涉及与CHIPS的结合。因而，CHIPS只结合C5aRN-末端。
表1显示所有涉及结合WT-CHIPS的C5aR的氨基酸，其通过测试所有C5aR突变体和C5aR嵌合体的WT-CHIPS结合而获得，如图1和2中所描述。发现位置10、15和18的天冬氨酸和位置12的甘氨酸涉及此结合。未发现氨基酸38-350与结合有关。
实施例2
磺化的C5aR N-末端肽7-28对CHIPS-FITC结合C5aR的影响
材料与方法
SO4-C5aR pep7-28对CHIPS-FITC结合C5aR的影响
4℃下，将CHIPS-FITC(0至1μg/ml)与200μM的SO4-C5aR pep7-28一起预培养30分钟。然后，加入表达野生型C5aR的U937细胞(5×106个细胞/ml)，4℃下再培养30分钟。随后，在流式细胞仪上分析CHIPS-FITC与U937细胞的结合。
结果
图3显示SO4-C5aR pep 7-28对CHIPS-FITC结合野生型C5aR的抑制，该野生型C5aR表达于U937细胞上。由这些结果可以推断只有一部分合成为硫酸化肽(该肽中存在的两个酪氨酸都是硫酸化的，天然C5aR中同样如此)的C5aRN-末端(氨基酸7至28)能结合CHIPS，并防止其结合表达于U937细胞上的C5aR。
实施例3
WT-CHIPS(CHIPS1-121)和CHIPS31-121的C5a抑制活性的比较
材料与方法
3.1 CHIPS31-121的表达与纯化
如1.2节CHIPS的制备中所述克隆、表达和纯化CHIPS31-121，使用引物：
5’AATAGTGGTCTTCCTACAAC和
3’CGTCCT GAATTCTTAGTATGCATATTCATTAG(加下划线的序列代表EcoRI位点)。
3.2嗜中性粒细胞中的细胞内钙动员
为了测定WT-CHIPS(CHIPS1-121)和CHIPS31-121对C5a诱导的细胞内钙动员的影响，室温并持续搅拌的情况下，向嗜中性粒细胞加载RPMI/0.05％HAS中的2μM的Fluo-3AM，用缓冲液洗涤两次，在RPMI/0.05％HAS中悬浮至1×106个细胞/ml。随后，室温下，在有或没有30nM WT-CHIPS或CHIPS31-121的情况下预培养细胞15分钟。每个细胞样品首先测定约10秒钟以确定基础荧光水平。接下来，加入浓缩的C5a(所用C5a的浓度范围：10-12M至10-7M)，并迅速放回样品容器中继续测定。在FACScan或Calibur流式细胞仪上以前向散射和侧向散射设门分析细胞，以排除死亡细胞和碎片。
结果
图4显示WT-CHIPS和CHIPS31-121抑制C5a诱导的人嗜中性粒细胞中钙动员的能力。由此可见，CHIPS31-121在抑制C5a-诱导的钙动员方面与WT-CHIPS同样有效或者更加有效。因此，对于C5a-抑制能力而言，WT-CHIPS的前30个氨基酸并不重要。
实施例4
涉及CHIPS与C5aR结合的CHIPS31-121的氨基酸
材料与方法
4.1 15N-和13C/15N-均一标记的CHIPS31-121的制备
如1.2节CHIPS制备中所述克隆并表达15N-标记的和13C/15N-标记的CHIPS31-121(CHIPS，缺少前30个氨基酸)，使用引物：
5’AATAGTGGTCTTCCTACAAC和
3’CGTCCT GAATTCTTAGTATGCATATTCATTAG(加下划线的序列代表EcoRI位点)。
对于CHIPS31-121的15N-标记，用pRSET/CHIPS31-121质粒转化的BL21(DE3)大肠杆菌不培养在LB培养基中，而是培养在M9基本培养基中，每升该基本培养基包含：6g Na2HPO4、3g KH2PO4、0.5g NaCl、1g 15NH4Cl、2ml 1M MgSO4、10μl CaCl2、1ml 0.01M FeSO4、10ml 20％葡萄糖、1ml1000×维生素溶液(每升1000×维生素溶液包含：0.4g氯化胆碱、0.5g叶酸、0.5g泛酸、0.5g烟酰胺、1.0g肌醇、0.5g盐酸吡哆醛、0.5g盐酸硫胺素、0.05g核黄素、和1g生物素)，和1ml的1000X微量营养素(每升1000X微量营养素包含：3×10-6 M钼酸铵，4×10-4M H3BO3，3×10-5M CoCl2，1×10-5MCuSO4，8×10-5M MnCl2，和1×10-5M ZnSO4)。
对于CHIPS31-121的13C/15N-标记，每升M9基本培养基使用1g 15NH4Cl和2g 13C-葡萄糖。将纯化的CHIPS31-121样品在含有20mM磷酸钠缓冲液pH5.0/0.01％NaN3的93％1H2O/7％2H2O(v/v)中溶解至1-2mM的浓度。
4.2 NMR波谱
4.2.1概述
所有的NMR数据均在Varian Unity INOVA 500(UIPS)或INOVA600(GBB)NMR波谱仪上于298K获得。用NMRPipe包(Delaglio等，1995)处理NMR数据，并用Sparky NNR归属与积分软件(T.D.Goddard and D.G.Kneller，SPARKY 3，University of California，San Francisco)分析。
4.2.2波谱归属
用标准三重共振试验(参见Cavanagh等，1996)对骨架1H，15N，13Cα/β和1Hα/β核进行归属。用先前13Cα/β和1Hα/β核的归属作为起点，通过HC(C)H-TOCSY(Kay等，1993)试验的解析完成脂肪族侧链的归属。用2D试验归属芳香族侧链，其将13Cβ和1Hβ共振与芳香族部分的质子相关联(Yamazaki等，1993)，再加上13C载体置于芳香族区域的的3DHC(C)H-TOCSY，以连接芳香族自旋系统。用15.5ms DIPSI-3混合序列(Shaka等，1988)完成HC(C)H-TOCSY试验中的相干混合。
4.2.3 NMR滴定试验
进行滴定试验，其中监测CHIPS31-1211H和15N的化学位移，作为递增的SO4-C5AR pep7-28量的函数。获得了样品的1H-15N HSQC系列试验，其中[SO4-C5AR pep7-28]∶[CHIPS31-121]的比率在0∶1和1∶1之间变动。这是通过向400ml的0.45mM CHIPS31-121溶液加入9ml的4mM SO4-C5ARpep7-28(这提供了1∶5的初始[SO4-C5AR pep7-28]∶[CHIPS31-121]比率)以及随后加入9ml的等份而实现的。
结果
表2显示了所有涉及或可能涉及CHIPS31-121与C5aR结合的CHIPS31-121的氨基酸，其由15N-1H-HSQC NMR试验中通过用SO4-C5ARpep7-2815滴定N-标记的CHIPS31-121而获得。证实了残基R46，K50，K51，K54，E60，K100，K101，G102，K105，Y108，V109和Y121与结合有关。
实施例5
涉及CHIPS与C5aR结合的CHIPS31-121的氨基酸的分子生物学确认
材料与方法
5.1 CHIPS31-121和CHIPS31-121突变体在周质渗漏(periplasmic leaky)表达系统中的表达
为了在周质渗漏表达系统中表达CHIPS31-121和CHIPS31-121突变体，将CHIPS31-121克隆到pET-22b(+)-载体(Novagen)中。这样，如1.2节CHIPS制备中所述，PCR扩增CHIPS31-121，使用引物：
5’CGATGGCCAATAGTGGTCTTCCTACAACG和
3’CTACTAGCT GAATTCTTAGTATGCATATTCATTAG。
通过重叠延伸PCR(Ho SN等，1989，Gene 77；51)在CHIPS31-121上使用定点诱变构建所有的CHIPS31-121突变体。用MscI和EcoRI消化纯化的PCR产物，随后连接到MscI-和EcoRI-消化的pET-22b(+)-载体中。在TOP10F’大肠杆菌中增殖质粒。
用构建体转化BL21(DE3)E.Coli用于表达。30℃下用1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)诱导过夜，完成CHIPS31-121和CHIPS31-121突变体的表达。加入HSA(0.1％)以抵消蛋白的损耗。随后，收集上清并加入PMSF以避免针对所表达的蛋白的蛋白酶活性。
用捕获ELISA(capture ELISA)测定细菌上清中表达的CHIPS31-121或CHIPS31-121突变体的浓度，其中多克隆兔抗-CHIPS抗体包被到ELISA平板上。
结合后，用生物素化的多克隆兔抗-CHIPS抗体，随后用链霉亲合素-过氧化物酶结合检测CHIPS31-121或CHIPS31-121突变体。
5.2 CHIPS31-121或CHIPS31-121突变体与抗-C5aR mAb竞争结合表达C5aR的U937细胞
表达C5aR的U937细胞与递增浓度的CHIPS31-121或CHIPS31-121突变体(存在于细菌上清中)一起在含有0.05％人血清白蛋白(RPMI/0.05％HSA)的RPMI中于冰上培养15分钟。然后，将所述样品与10μg/ml FITC-标记的抗-C5aR S5/1mAb(抗-CD88(Serotec，Oxford，UK))一起在冰上培养30分钟。洗涤后，在FACscan流式细胞仪(Becton Dickinson，San Jose，CA，USA)上分析细胞。
结果
图5A+B显示CHIPS31-121和所示的CHIPS31-121突变体对抗C5aR单克隆抗体结合C5aR的抑制，其中C5aR表达于U937细胞上。图5A中的粗线显示CHIPS31-121和在结合C5aR中影响最大的CHIPS31-121突变体(为E60，K100，Y108，V109和Y121)。图5B中的粗线显示在CHIPS31-121和结合C5aR中影响最大的CHIPS31-121突变体(为R46，N47，K50，K51，K54，K101，G102，K105和Y121删除的)。所有突变体均为单一氨基酸取代为丙氨酸(除非另作说明)。
表3显示不同的CHIPS31-121突变体的IC50值，其中的单个氨基酸取代为丙氨酸(除非另作说明)。用图5A+B所示试验完成IC50的测定。
表1
涉及或可能涉及CHIPS与C5aR结合的C5aR的氨基酸，通过C5aR-N末端和完整C5aR+/-突变体的表达获得
Figure A20058001967300331
氨基酸38-350：
ILALVIFAVVFLVGVLGNALVVWVTAFEAKRTINAIWFLNLAVADFLSCLALPILFTSIVQHHHWPFGGAACSILPSLILLNMYASILLLATISADRFLLVFKPIWCQNFRGAGLAWIACAVAWGLALLLTIPSFLYRVVREEYFPPKVLCGVDYSHDKRRERAVAIVRLVLGFLWPLLTLTICYTFILLRTWSRRATRSTKTLKVVVAVVASFFIFWLPYQVTGIMMSFLEPSSPTFLLLNKLDSLCVSFAYINCCINPIIYVVAGQGFQGRLRKSLPSLLRNVLTEESVVRESKSFTRSTVDTMAQKTQAV
不涉及CHIPS的结合
表2涉及或可能涉及CHIPS与C5aR结合的CHIPS的氨基酸，在15N-1H-HSQC NMR试验中通过用C5aR-pep7-2B滴定15N-标记的CHIPS-delta-30而获得
Figure A20058001967300342
Figure A20058001967300345
++ 涉及CHIPS与C5aR的结合
+ 最可能涉及CHIPS与C5aR的结合
+/- 可能涉及CHIPS与C5aR的结合
- 不涉及CHIPS与C5aR的结合
nd 未测定
*经mol.Biol.确认：经分子生物学确认
表3
CHIPS31-121突变体(取代为丙氨酸，除非另作说明)的IC50值，其在抑制抗-C5aR mAb与表达C5aR的U937细胞结合中测得。
    IC50(ng/ml)
   CHIPS31-121     2
   N47R46Y121缺失的K54K50G102K101K105Y121K100E60V109Y108     51010101012152550100150250＞500
表4
涉及补体激活和/或涉及嗜中性粒细胞和或单核细胞的炎症反应引发的疾病。
·急性反应性关节炎              30 ·中枢神经系统疾病
·急性移植排斥                     ·子宫内膜异位症
·成人呼吸窘迫综合症(ARDS)         ·实验性变应性脑脊髓炎(EAE)
·酒精性肝炎                       ·实验性变应性神经炎(EAN)
·异基因移植                       ·冻伤
·阿尔茨海默氏病                35 ·胃癌
·动脉硬化                         ·胃肠疾病
·阿蒂斯反应(Arthus reaction)      ·泌尿生殖性疾病
·哮喘                             ·痛风
·动脉粥样硬化                     ·幽门螺杆菌(Heliobacter pylon)
·特应性皮炎                    40   胃炎
·细菌性脑膜炎                     ·血液透析
·支气管癌                         ·遗传性血管水肿
·大疱性类天疱疮                   ·高敏性肺炎
·烧伤                             ·原发性肺纤维化
·心肺转流术                    45 ·免疫复合物(IC)-诱导的血管炎
·心血管疾病                       ·缺血性(ischaemic)休克
·慢性支气管炎                     ·缺血-再灌注事件(episodes)
·慢性淋巴自血病                   ·缺血-再灌注损伤
·慢性阻塞性肺病(COPD)             ·关节病
·接触性皮炎                    50 ·(大)血管手术
·Crohn氏病                        ·金属烟雾热
·皮肤T-细胞淋巴瘤                 ·多发性硬化
·囊性纤维化病                     ·多发性系统器官衰竭
·皮肤病                           ·重症肌无力
·心肌梗塞
·胰腺炎
·腹膜炎
·胸膜肺气肿(pleural emphesema)
·心肺转流术后(CBP)炎症
·牛皮癣
·重复性劳损(RSI)(repetitve strain injury)
·呼吸系统疾病
·类风湿性关节炎
·败血症
·败血性休克
·鼻窦炎
·皮肤疾病
·中风
·系统性红斑狼疮(SLE)
·移植
·(外伤性)脑损伤
·溃疡性结肠炎
·尿道感染
·血管渗漏综合征
·脉管炎
·异种移植

Claims (48)

1.化合物，其能够防止人C5aR N-端残基10至18与其胞外环的分子内接触。
2.如权利要求1所述的化合物，其特征在于其能够结合人C5aR位置10、15和18的天冬氨酸和位置12的甘氨酸。
3.如权利要求1-3中任一项所述的化合物，其中该化合物具有通式：
Xn-E-X39-K-X7-Y-V-X11-Y-Xm    (I)
其中：
Xn可以存在或者可以不存在，并且是成蛋白质性氨基酸、非成蛋白质性氨基酸、D-氨基酸、肽模拟物构建单元或其组合的序列段；
K是赖氨酸或其非成蛋白质性类似物；
E是谷氨酸或其非成蛋白质性类似物；
Y是酪氨酸或其非成蛋白质性类似物；
V是缬氨酸或其非成蛋白质性类似物；
X39、X7、和X11各自分别是39、7或11个成蛋白质性氨基酸、非成蛋白质性氨基酸、D-氨基酸、肽模拟物构建单元或其组合的序列段；
Xm可以存在或者可以不存在，并且是成蛋白质性氨基酸、非成蛋白质性氨基酸、D-氨基酸、肽模拟物构建单元或其组合的序列段；并且具有与天然CHIPS相同的三维构象。
4.如权利要求3中所述的化合物，其中通式I中的Xn和Xm可以各自包含0-100个，优选1-90个，更优选-75个，最优选1-59个残基。
5.如权利要求1-3中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有通式：
Xn-R-X3-K-K-G-X-K-X5-E-X39-K-K-G-X2-K-X2-Y-V-X11-Y-Xm(II)
其中：
Xn可以存在或者可以不存在，并且是成蛋白质性氨基酸、非成蛋白质性氨基酸、D-氨基酸、肽模拟物构建单元或其组合的序列段；
R是精氨酸或其非成蛋白质性类似物；
K是赖氨酸或其非成蛋白质性类似物；
E是谷氨酸或其非成蛋白质性类似物；
X，X2，X3，X5和X39各自分别是1、2、3、5、11和39个成蛋白质性氨基酸，非成蛋白质性氨基酸，D-氨基酸，肽模拟物构建单元或其组合的序列段；
Y是酪氨酸或其非成蛋白质性类似物；
V是缬氨酸或其非成蛋白质性类似物；
Xm可以存在或者可以不存在，并且是成蛋白质性氨基酸、非成蛋白质性氨基酸、D-氨基酸、肽模拟物构建单元或其组合的序列段；并且具有与天然CHIPS相同的三维构象。
6.如权利要求5中所述的化合物，其中式II中的Xn和Xm可以各自包含0-100个，优选1-50个，更优选1-25个，最优选1-15个。
7.如权利要求1-3中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有通式：
Xn-T-X6-R-L-R-N-X2-K-K-G-T-K-X4-F-E-K-X-V-X7-Y-X4-L-X11-E-X11-K-K-G-E-X-K-X2-Y-V-X-N-X3-K-X5-Y-Xm    (III)，
其中
Xn可以存在或者可以不存在，并且是成蛋白质性氨基酸、非成蛋白质性氨基酸、D-氨基酸、肽模拟物构建单元或其组合的序列段；
T是苏氨酸或其非成蛋白质性类似物；
R是精氨酸或其非成蛋白质性类似物；
L是亮氨酸或其非成蛋白质性类似物；
N是天冬酰胺或其非成蛋白质性类似物；
X，X2，X3，X4，X5，X6，X7和X11各自分别是1、2、3、4、5、6、7或11个成蛋白质性氨基酸、非成蛋白质性氨基酸、D-氨基酸、肽模拟物构建单元或其组合的序列段；
K是赖氨酸或其非成蛋白质性类似物；
G是甘氨酸或其非成蛋白质性类似物；
F是苯丙氨酸或其非成蛋白质性类似物；
E是谷氨酸或其非成蛋白质性类似物；
Y是酪氨酸或其非成蛋白质性类似物；
V是缬氨酸或其非成蛋白质性类似物；
并且具有与天然CHIPS相同的三维构象。
8.如权利要求1-4中任一项所述的化合物，其中该化合物具有通式：
Xn-T-L-X5-R-L-R-N-Y-L-K-K-G-T-K-X2-A-X-F-E-K-X-V-I-L-X5-Y-X-T-X2-L-X3-L-X2-D-R-K-X2-E-L-X-G-X-M-X2-T-Y-X2-K-K-G-E-X-K-X2-Y-V-I-N-X3-K-X5-Y-Xm(IV)，
其中，
Xn可以存在或者可以不存在，并且是成蛋白质性氨基酸、非成蛋白质性氨基酸、D-氨基酸、肽模拟物构建单元或其组合的序列段；
T是苏氨酸或其非成蛋白质性类似物；
R是精氨酸或其非成蛋白质性类似物；
L是亮氨酸或其非成蛋白质性类似物；
I是异亮氨酸或其非成蛋白质性类似物；
M是蛋氨酸或其非成蛋白质性类似物；
A是丙氨酸或其非成蛋白质性类似物；
D是天冬酰胺或其非成蛋白质性类似物；
N是天冬酰胺或其非成蛋白质性类似物；
K是赖氨酸或其非成蛋白质性类似物；
G是甘氨酸或其非成蛋白质性类似物；
F是苯丙氨酸或其非成蛋白质性类似物；
E是谷氨酸或其非成蛋白质性类似物；
Y是酪氨酸或其非成蛋白质性类似物；
V是缬氨酸或其非成蛋白质性类似物；
X，X2，X3和X5各自分别是1、2、3或5个成蛋白质性氨基酸、非成蛋白质性氨基酸、D-氨基酸、肽模拟物构建单元或其组合的序列段；并且具有与天然CHIPS相同的三维构象。
9.如权利要求7或8所述的化合物，其中式III和IV中的Xn和Xm可以各自包含0-100个，优选1-50个，更优选1-25个，最优选1-6个。
10.如权利要求1-9中任一项所述的化合物，其中所述化合物选自CHIPSΔ1、CHIPSΔ17、CHIPSΔ30，其分别缺失天然CHIPS的N末端结构域的1、17和30个氨基酸。
11.如权利要求1-10任一项中的化合物，其中所述非成蛋白质性类似物选自下组：2-萘基丙氨酸(Nal(2))、β-环己基丙氨酸(Cha)、对-氨基-苯丙氨酸((Phe(p-NH2)、对-苯甲酰基苯丙氨酸(Bpa)、鸟氨酸(Orn)、正亮氨酸(Nle)、4-氟-苯丙氨酸(Phe(p-F))、4-氯-苯丙氨酸(Phe(p-Cl))、4-溴-苯丙氨酸(Phe(p-Br))，4-碘-苯丙氨酸(Phe(p-I))、4-甲基-苯丙氨酸(Phe(p-Me))，4-甲氧基-苯丙氨酸(Tyr(Me))，4-硝基-苯丙氨酸(Phe(p-NO2))。
12.如权利要求1-11任一项中所述的化合物，其中所述非成蛋白质性类似物为选自下列的D氨基酸：D-苯丙氨酸、D-丙氨酸、D-精氨酸、D-天冬酰胺、D-天冬氨酸、D-半胱氨酸、D-谷氨酸、D-谷氨酰胺、D-组氨酸、D-异亮氨酸、D-亮氨酸、D-赖氨酸、D-蛋氨酸、D-脯氨酸、D-丝氨酸、D-苏氨酸、D-色氨酸、D-酪氨酸、D-缬氨酸、D-2-萘基丙氨酸(D-Nal(2))、β-环己基-D-丙氨酸(D-Cha)、4-氨基-D-苯丙氨酸(D-Phe(p-NH2))、对-苯甲酰基-D-苯丙氨酸(D-Bpa)、D-鸟氨酸(D-Orn)、D-正亮氨酸(D-Nle)、4-氟-D-苯丙氨酸(D-Phe(p-F))、4-氯-D-苯丙氨酸(D-Phe(p-Cl))、4-溴-D-苯丙氨酸(D-Phe(p-Br)、4-碘-D-苯丙氨酸(D-Phe(p-I))、4-甲基-D-苯丙氨酸(D-Phe(p-Me))、4-甲氧基-D-苯丙氨酸(D-Tyr(Me))、4-硝基-D-苯丙氨酸(D-Phe(p-NO2))。
13.如权利要求1-12任一项中所述的化合物，其中所述非成蛋白质性类似物为选自下列的肽模拟物构建单元：寡聚-β-肽、寡聚磺酰胺、插烯磺酰胺、肼基肽/azatides、寡聚氨基甲酸酯、脲拟肽、oligourea、磷酸二酯、拟肽、寡砜、拟肽磺酰胺、插烯肽。
14.如权利要求13中所述的化合物，其中的肽模拟物构建单元选自：N-取代的甘氨酸，如N-苄基甘氨酸(NPhe)、N-甲基甘氨酸(NAla)、N-(3-胍基丙基)甘氨酸(NArg)、N-(羧甲基)甘氨酸(NAsp)、N-(氨基甲酰甲基)甘氨酸(NAsn)、N-(硫代乙基)-甘氨酸(NhCys)、N-(2-羧乙基)甘氨酸(NGlu)、N-(2-氨基甲酰基乙基)甘氨酸(NGln)、N-(咪唑基乙基)甘氨酸(NhHis)、N-(1-甲基丙基)甘氨酸(NIle)、N-(2-甲基丙基)甘氨酸(NLeu)、N-(4-氨基丁基)甘氨酸(NLys)、N-(2-甲基硫代乙基)甘氨酸(NMet)、N-(羟乙基)甘氨酸(NhSer)、N-(2-羟丙基)甘氨酸(NhThr)、N-(3-吲哚甲基)甘氨酸(NTrp)、N-(对-羟基苯甲基)-甘氨酸(NTyr)、N-(1-甲基乙基)甘氨酸(NVal)。
15.如权利要求1-14中任一项所述的化合物，其为环状的。
16.如权利要求1和2所述的化合物，该化合物为抗C5aR或C5aR相关化合物的抗体或其衍生物，C5aR相关化合物包含基序Xq-D-X-G-X2-D-X2-D-Xr，其中Xq、X、X2和Xr是0-9、1、2和0-20个的序列段。
17.用于预防或治疗的如权利要求1-16中任一项所述的化合物。
18.用于预防或治疗适应症的如权利要求1-16中任一项所述的化合物，所述适应症涉及嗜中性粒细胞、单核细胞和内皮细胞上的C5a受体(C5aR)。
19.如权利要求18所述的化合物，其中所述适应症涉及急性或慢性炎症反应。
20.如权利要求19所述的化合物，其中所述适应症选自表4所列出的组。
21.用于预防或治疗适应症的如权利要求1-16中任一项所述的化合物，所述适应症涉及除嗜中性粒细胞、单核细胞和内皮细胞以外的其他细胞上的C5aR。
22.如权利要求21所述的化合物，其中其他细胞为淋巴细胞，树突状细胞，嗜酸性粒细胞，嗜碱性粒细胞，巨噬细胞，小胶质细胞，星形胶质细胞，Kupfer细胞，肝细胞和上皮细胞。
23.用于预防性或治疗性疫苗中的如权利要求1-16任一项中所述的化合物，所述疫苗用于产CHIPS细菌所引起的感染。
24.如权利要求23中所述的化合物，其中产CHIPS细菌为金黄色葡萄球菌。
25.如权利要求1-16中所述的化合物在制备用于预防或治疗用的治疗制剂中的用途。
26.如权利要求25中所述的用途，其中治疗制剂用于预防和治疗涉及嗜中性粒细胞、单核细胞和内皮细胞上的C5aR的适应症。
27.如权利要求25所述的用途，其中所述适应症涉及急性或慢性炎症反应。
28.如权利要求27所述的用途，其中所述适应症选自表4所列出的组。
29.如权利要求25所述的用途，其中治疗组合物用于预防或治疗涉及除嗜中性粒细胞、单核细胞和内皮细胞以外的其他细胞上的C5aR的适应症。
30.如权利要求29所述的用途，其中其他细胞为淋巴细胞，树突状细胞，嗜酸性粒细胞，嗜碱性粒细胞，巨噬细胞，小胶质细胞，星形胶质细胞，Kupfer细胞，肝细胞和上皮细胞。
31.如权利要求25中所述的用途，其中所述治疗制剂为预防性或治疗性疫苗，所述疫苗用于针对产CHIPS细菌所引起的感染的预防或治疗。
32.如权利要求31中所述的用途，其中产CHIPS细菌为金黄色葡萄球菌。
33.治疗组合物，包含合适的赋形剂和一种或多种如权利要求1-16中所述的化合物。
34.预防组合物，其包含合适的赋形剂和一种或多种如权利要求1-16中所述的化合物。
35.如权利要求1-16中任一项中所述的化合物在制备用于医用装置表面上的涂覆组合物中的用途，所述医用装置通过皮肤介入人体或在手术过程中置于体内。
36.如权利要求35中所述的用途，其中所述表面为导管尖端的表面。
37.如权利要求35和36中所述的用途，其中所述组合物为缓释组合物。
38.治疗性或预防性组合物，其包含合适的赋形剂和一种或多种如权利要求1-16任一项中所述的化合物。
39.预防或治疗受试者的方法，所述受试者患有涉及嗜中性粒细胞、单核细胞和内皮细胞上的C5aR的适应症，该方法包括施用预防或治疗有效量的如权利要求1-16任一项中所述的一种或多种化合物。
40.如权利要求39中所述的方法，其中所述适应症涉及急性或慢性炎症反应。
41.如权利要求39中所述的方法，其中所述适应症选自表4所列出的组。
42.预防或治疗受试者的方法，所述受试者患有涉及除嗜中性粒细胞、单核细胞和内皮细胞以外的其他细胞上的C5aR的适应症，所述方法包括给予预防或治疗有效量的如权利要求1-16任一项中所述的一种或多种化合物。
43.如权利要求42中所述的方法，其中所述其他细胞为淋巴细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、巨噬细胞、小胶质细胞、星形胶质细胞、Kupfer细胞、肝细胞和上皮细胞。
44.对受试者施行抗产CHIPS细菌感染的预防性或治疗性处理的方法，所述方法包括施用预防或治疗有效量的如权利要求1-16任一项中所述的一种或多种化合物。
45.鉴定可与C5aR结合的化合物的方法，所述方法包括
a)提供候选化合物文库，
b)将文库成员与C5aR相关化合物接触，该C5aR相关化合物包含基序Xq-D-X-G-X2-D-X2-D-Xr，其中Xq、X、X2和Xr分别是0-9、1、2和0-20个成蛋白质性氨基酸或其非成蛋白质性类似物的序列段，D是天冬氨酸，G是甘氨酸，其以与天然产生的C5aR中发现的构象相同或相似的构象存在，和
c)鉴定文库中结合所述C5aR相关化合物的成员。
46.如权利要求45所述的方法，其还包括提供如此鉴定的成员用于预防或治疗的步骤。
47.按照权利要求45所述方法鉴定的化合物。
48.如权利要求47所述的化合物在制备治疗和预防与C5aR有关的适应症的药物组合物中的用途。
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