CN1987470A - 一种蛋白水解度的测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种蛋白水解度的测定方法。本方法是通过测定水解前后乳中游离氨基氮的含量，来计算蛋白水解度的一种方法。在水解牛乳样中加入三氯乙酸(TCA)溶液使蛋白沉淀，然后过滤掉沉淀的蛋白，通过水解后在三氯乙酸(TCA)溶液中增加的游离氨基酸与TNBS反应的颜色变化来测定蛋白水解度。本方法操作简便，可省时、增效。

Description

一种蛋白水解度的测定方法
技术领域：
本发明涉及一种蛋白水解度的测定方法，尤其是涉及一种乳中游离氨基氮的定量检测方法。
背景技术：
牛乳是优秀的营养食品，蛋白含量为3.0％～3.5％，其中酪蛋白(CN)含量较高，约占总蛋白的80％。酪蛋白主要有四种即αs1-、αs2-、β-、κ-CN，牛乳中酪蛋白与乳清蛋白的含量比为80∶20，而人乳中酪蛋白与乳清蛋白的含量比为60∶40。由于其与人乳中的蛋白组成不同，有很多人饮用了牛乳后会产生过敏现象。许多研究表明牛乳中αs-酪蛋白、β-乳球蛋白(β-LG)是最主要的过敏原，其中约82％的牛乳过敏人都对β-LG过敏，尤其是婴儿。
为了解决牛乳过敏的问题，要对牛乳蛋白进行改性研究。目前，研究热点集中在通过酶水解牛乳蛋白来降低或消除过敏原。因此开发一种准确可行的蛋白水解度测定方法具有深远的意义。
目前检测蛋白水解度的方法有很多，如邻苯二甲醛(OPA)法、茚三酮比色法、甲醛滴定法和三硝基苯磺酸(TNBS)方法等。但每种方法的适用性不同，有的显色液不稳定，且测定不同的蛋白需要不同的显色液，稍有不慎即会使结果出现偏差；有的实验步骤操作繁杂；有的实验试剂用量太大。因此研究一种适合于乳蛋白水解度测定，既稳定准确又简单快速的方法非常有意义。本发明人研发了一种新的测定蛋白水解度的方法，可以弥补现有技术中存在的不足。
发明内容：
蛋白水解度(Degree of Hydrolysis，DH)的定义是指蛋白肽键裂解的百分比，通过水解后增加的游离氨基氮占总蛋白的百分比来表示。本方法适用于乳中游离氨基氮的检测和牛乳蛋白水解度的检测，也可以检测牛乳中掺入的外源水解蛋白，作为掺假的监测手段。其中蛋白水解度测定中的总氮测定采用IDF20-2：2001的乳中氮含量的测定方法。
本方法是通过测定水解前后乳中游离氨基氮的含量，来计算蛋白水解度的一种方法。在水解牛乳样中加入三氯乙酸(TCA)溶液使蛋白沉淀，然后过滤掉沉淀的蛋白，通过水解后在三氯乙酸(TCA)溶液中增加的游离氨基酸与TNBS反应的颜色变化来测定蛋白水解度。以甘氨酸为标准物质，在420nm处有吸收峰。本方法结果重现性好，检验耗时短，试剂用量少，可操作性高，只用分光光度计即可满足测定需求。
具体方法如下：
取乳样，加入2倍乳样体积的0.7N-0.8N的三氯乙酸，室温下放置20min-30min，过滤取上清液，加入10倍上清液体积的0.095M-0.15M硼酸钠，再加入4倍上清液体积的4.95mM-5.05mM TNBS，室温下暗处放置20min-30min，加入4倍上清液体积的2M混合终止剂，所述混合终止剂为包含17.95mM/L-18.05mM/L亚硫酸钠的1.95M/L-2.05M/L磷酸二氢钠，混匀，在420nm处测定吸光值。
所述硼酸钠的pH为9.0-9.4。
所述TNBS和混合终止液现用现配。
所述测定方法还包括以不同浓度的甘氨酸为标准物质绘制标准曲线，通过标准曲线计算样品中游离氨基氮的含量。
所述方法测得的乳样吸光值在标准曲线浓度范围之内。
根据公式1和公式2分别计算游离氨基氮的含量和蛋白水解度。游离氨基氮的含量按下式计算
C＝B□A    ----------------------------1
其中：C：样品中游离氨基酸的含量，mM/L，
B：根据滤液的吸光度，通过标准曲线计算出的游离氨基氮的浓度，mM/L，
A：稀释因子。
蛋白水解度按下式计算
Figure A20061015636800041
其中：DH％：蛋白肽键裂解的百分比，
C1：水解前样品中游离氨基氮的含量，mM/L，
C2：水解后样品中游离氨基氮的含量，mM/L，
Pro：样品中蛋白质的浓度，g/100mL，
htot：为每克蛋白质的肽键的豪摩尔数，htot对于某一特定蛋白质来讲是一个常数(乳清蛋白htot＝8.8(mM/g))。
附图说明：
附图1：甘氨酸标准曲线。
具体实施方式：
实施例1：水解酪蛋白中的游离氨基氮的测定
适当稀释样品。然后取稀释后的样品2mL，加入4mL 0.7N的TCA，20℃放置20min，过滤取上清液待测。取上清液0.2mL加入2mL 0.095M硼酸钠，0.8mL 4.95mM TNBS，20℃暗处放置30min，加入0.8mL 2M混合终止剂(所述混合终止剂为包含18mM/L亚硫酸钠的2M/L磷酸二氢钠)，混匀，同时用未水解的牛奶作对照，用蒸馏水做空白试验，在分光光度计上，用1cm直径吸收池，以空白为参比，于波长420nm测其吸光度，颜色可稳定近1h。分别移取不同浓度的甘氨酸标准溶液2mL于不同的试管中，加入4mL 0.75N的TCA，后续处理同样品分析。然后以吸光度与浓度绘制标准曲线。通过标准曲线求出样品的浓度。同一试样做两次平行，取平均值；重复测定3次。根据公式1计算游离氨基氮的含量，结果见表1。
表1水解酪蛋白水解样品游离氨基氮的测定结果    单位：mM/L
样品  游离氨基氮的含量 游离氨基氮的含量 游离氨基氮的含量 均值 变异系数
   1234567    1.5813.0625.9880.5451.3212.4614.667   1.5812.9595.6300.5451.2842.4634.684    1.5892.9365.7160.5431.2972.4674.803   1.5842.9865.7780.5441.3012.4644.718    0.29％2.25％3.23％0.21％1.44％0.12％1.57％
实施例2：酶水解乳清蛋白水解度的测定
适当稀释酶水解后的乳清蛋白样品。然后取稀释后的样品2mL，加入4mL 0.8N的TCA，25℃放置30min，过滤取上清液待测。取上清液0.2mL加入2mL 0.15M硼酸钠，0.8mL 5.05mM TNBS，25℃暗处放置20min，加入0.8mL 2M混合终止剂(所述混合终止剂为包含17.95mM/L亚硫酸钠的2.05M/L磷酸二氢钠)，混匀，同时用未水解的牛奶作对照，用蒸馏水做空白试验，在分光光度计上，用1cm直径吸收池，以空白为参比，于波长420nm测其吸光度，颜色可稳定近1h。分别移取不同浓度的甘氨酸标准溶液2mL于不同的试管中，加入4mL 0.75N的TCA，后续处理同样品分析。然后以吸光度与浓度绘制标准曲线。通过标准曲线求出样品的浓度。同一试样做两次平行测定。根据公式1和公式2分别计算游离氨基氮的含量和蛋白水解度，结果见表2和表3。
表2酶水解乳清蛋白样品游离氨基氮及水解度的测定结果
  样品 游离氨基氮含量1 水解度％1 游离氨基氮含量2   水解度％2
  对照12345678     2.52659.76458.1176.42475.63653.54854.13956.20758.176   /9.58％9.30％12.37％12.24％8.54％8.64％8.98％9.31％     2.5158.77958.1176.97576.18750.49653.54856.10858.964     /9.42％9.31％12.46％12.33％8.03％8.54％8.97％9.45％
表3酶水解乳清蛋白样品水解度的测定结果的分析表
  样品    水解度％1    水解度％2    变异系数
   12345678     9.58％9.30％12.37％12.24％8.54％8.64％8.98％9.31％     9.42％9.31％12.46％12.33％8.03％8.54％8.97％9.45％     1.21％0.02％0.54％0.55％4.34％0.79％0.11％1.01％
实施例3：水解酪蛋白中的游离氨基氮的测定
适当稀释样品。然后取稀释后的样品2mL，加入4mL 0.75N的TCA，22℃放置20min，过滤取上清液待测。取上清液0.2mL加入2mL 0.1M硼酸钠，0.8mL 5mMTNBS，22℃暗处放置30min，加入0.8mL 2M混合终止剂(所述混合终止剂为包含18mM/L亚硫酸钠的2M/L磷酸二氢钠)，混匀，同时用未水解的牛奶作对照，用蒸馏水做空白试验，在分光光度计上，用1cm直径吸收池，以空白为参比，于波长420nm测其吸光度，颜色可稳定近1h。分别移取不同浓度的甘氨酸标准溶液2mL于不同的试管中，加入4mL 0.75N的TCA，后续处理同样品分析。然后以吸光度与浓度绘制标准曲线。通过标准曲线求出样品的浓度。同一试样做两次平行测定，取平均值；重复测定3次。根据公式1计算游离氨基氮的含量，结果见表4。
表4水解酪蛋白水解样品游离氨基氮的测定结果    单位：mM/L
样品  游离氨基氮的含量 游离氨基氮的含量 游离氨基氮的含量 均值 变异系数
   12345    1.5833.0605.9850.5401.320   1.5822.9635.6300.5491.284   1.5872.9365.7190.5431.298   1.5842.9865.7780.5441.301    0.29％2.25％3.23％0.21％1.44％

Claims (5)

1、一种蛋白水解度的测定方法，其特征在于：
取乳样，加入2倍乳样体积的0.7N-0.8N的三氯乙酸，室温下放置20min-30min，过滤取上清液，加入10倍上清液体积的0.095M-0.15M硼酸钠，再加入4倍上清液体积的4.95mM-5.05mM TNBS，室温下暗处放置20min-30min，加入4倍上清液体积的2M混合终止剂，所述混合终止剂为包含17.95mM/L-18.05mM/L亚硫酸钠的1.95M/L-2.05M/L磷酸二氢钠，混匀，在420nm处测定吸光值。
2、权利要求1所述的测定方法，其中所述硼酸钠的pH为9.0-9.4。
3、权利要求1所述的测定方法，其中所述TNBS和混合终止液现用现配。
4、权利要求1-3任一项所述的测定方法，其中还包括以不同浓度的甘氨酸为标准物质绘制标准曲线，通过标准曲线计算样品中游离氨基氮的含量。
5、权利要求4所述的测定方法，乳样测得的吸光值在标准曲线浓度范围之内。
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CN102590107A (zh) * 2012-01-09 2012-07-18 天津大学 一种蛋白水解度的检测方法及用于检测的试剂盒
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