CN1973043A - 不包含抗生素抗性基因的rsf1010衍生mob－缺陷型质粒、包含该质粒的细菌和生产有用代谢物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供具有RSF1010复制子、包含编码Rep蛋白质的基因的Mob－质粒，并且所述质粒经修饰以使与转移能力有关的基因失活。本发明还描述具有生产有用代谢物能力的包含所述质粒的细菌，所述细菌缺乏由thyA基因编码的活性胸苷酸合酶和由tdk基因编码的胸苷激酶，以及利用所述细菌生产有用代谢物如天然或重组的蛋白质、酶、L－氨基酸、核苷和核苷酸、有机酸、维生素的方法。

Description

不包含抗生素抗性基因的RSF1010衍生MOB-缺陷型质粒、 包含该质粒的细菌和生产有用代谢物的方法
技术领域
本发明涉及突变载体及其用途，更具体地，本发明涉及不包含抗生素抗性基因的广宿主范围RSF1010衍生Mob-质粒。本发明还涉及包含所述质粒的细菌和用所述细菌生产有用代谢物的方法。
背景技术
RSF1010为可转移的(mobilizable)、但不能自我转移的(self-transmissible)熟知的IncQ组质粒，其具有显著的在广细菌宿主范围，包括大多数革兰氏阴性细菌内复制的能力(Frey，J.和Bagdasarian，M.The molecular biology of IncQplasmids.In：Thomas，C.M.(编)，Promiscuous Plasmids of Gram NegativeBacteria.Academic Press，London，1989，p.79-94)。RSF1010质粒的核苷酸序列是已知的(Scholz，P.等，Gene，75(2)，271-288(1989)；登录号GenBank M28829，gi：152577)并且已经非常彻底地研究了该质粒的功能结构。RSF1010质粒含有独特的植物DNA复制起点oriV(De Graaf，J.等，J.Bacteriol.，134，1117-1122(1978)；Haring，V.和Scherzinger，E，Replication Proteins of the IncQplasmid RSF 1010，In：Thomas，C.M.(Ed.)，Promiscuous Plasmids of GramNegative Bacteria.Academic Press，London，1989，p.95-124)，以及repA，repB，repB′和repC，这些是质粒复制的必需基因(Scherzinger，E等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，654-658(1984)；Scherzinger，E等，Nucleic Acids Res.，19，1203-1211(1991)；Scholz，P.等，Replication determinants of the broad-host-rangeplasmid RSF1010.In：Helinski，D.R.等(编)，Plasmids in Bacteria，Plenum Press，New York，1984，p.243-259)。RSF1010质粒还包含松弛复合体(relaxationcomplex)位点oriT和接合DNA转移起点mobA(在可选框架中包括repB基因)、mobB和mobC(mob基因座)、编码反式激活(trans-active)蛋白的基因，其涉及质粒转移(Nordheim，A等，J.Bacteriol.，144，923-932(1980)；Derbyshire.K.M.等，Mol.Gen.Genet.，206，161-168(1987))、以及磺胺抗性(SulR)和链霉素抗性(StrR)基因(分别为sul和str基因)(Scholz，P.等，Gene，75(2)，271-288(1989))。
如果质粒序列是完整的(Scholz，P.等，Gene，75(2)，271-288(1989))，即用电子显微术识别并确认RSF1010物理图谱上引发质粒蛋白翻译的启动子(Bagdasarian，J.Frey，和K.Timmis.Gene 16，237-247(1981))。
RSF1010质粒的复制起始需要由质粒所编码的三种蛋白质的存在：RepA、RepB和RepC，其分别由repA、repB和repC基因所编码。RepC识别复制起点(在重复序列内)并正调节复制的起始；RepA具有解旋酶(helicase)活性；RepB和RepB*(其相当于由同一框架编码的两种蛋白质，但分别在不同的密码子处启动)在体外具有RSF1010-特异性引发酶(primase)活性。RSF1010质粒的复制依赖于DNA聚合酶III和宿主的促旋酶(gyrase)。RSF1010质粒可以通过不相容性组IncI-α、IncM、IncX以及最特别的IncP的质粒的tra功能而从一种革兰氏阴性细菌转移到另一种革兰氏阴性细菌(Derbyshire.K.M.等，Mol.Gen.Genet.，206，161-168(1987))。
在大肠杆菌(E.coli)中，RSF1010以每个细胞12个拷贝数存在(Bagdasarian，M.M.等，Regulation of the rep operon expression of the broad-host range plasmidRSF1010.In：Novick，R和Levy，S(编)，Evolution and Environmental Spread ofAntibiotic Resistance Genes.Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，1986，p.209-223)。位于mobC和mobB基因之间的质粒oriT区域的结构组织是相当复杂的。然而，已知此区域是转移起始所必需的，并还包含质粒复制必需的启动子。已经显示涉及质粒转移的不同基因的消除可能无法预料地改变质粒特性。例如，缺失编码调控蛋白的mobC基因导致质粒拷贝数的显著增加(Frey，J.等，Gene，113，101-106(1992))。这可能是RFS1010质粒的变体仍然未知的原因，所述RFS1010质粒变体不包含所有对转移来说必需的已知序列。
迄今为止还没有描述有关RSF1010及其衍生物稳定性的研究。另外，虽然RSF1010的序列是已知的，但还不能鉴定质粒稳定性决定簇(determinant)，无论是通过功能分析还是通过分子分析。
生物安全性的限制在生物学上大大限制了重组菌株。1987年5月7日由NIH出版的″Guidelines for research involving recombinant DNA molecules″中描述的生物安全水平1(BL1)系统对应于其中的一些局限。例如，如果重组微生物被偶然释放到自然环境中，则这样的质粒不能被传输到其它生物体是至关重要的。欧洲指令(European directive)中描述了类似的规定，例如1990年4月23日关于有意向环境中释放遗传修饰生物的理事会指令(90/220/EEC)、1998年10月26日修改关于遗传修饰微生物包含的用途的指令90/219/EEC的理事会指令98/81/EC。
已经公开了包含复制起点即质粒RP4的par区域且缺乏转移功能的革兰氏阴性细菌载体，所述复制起点在革兰氏阴性细菌中是功能性的(美国专利5670343)。本发明的载体不能由一种革兰氏阴性细菌转移到另一种革兰氏阴性细菌。因此，它们与这些细菌形成具有的1类宿主-载体系统并符合工业规定。此同时处于大肠杆菌(Escherichia coli)和恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)中的系统推定(assume)使用非接合且非可转移质粒。具体地通过缺失包含mob基因座的区域获得了本发明载体的这种非常有利的特性。这种在革兰氏阴性细菌中具有广宿主范围的新的克隆和/或表达载体可用于由包含所述载体的宿主细胞生产重组蛋白质或代谢物。
迄今为止，微生物的遗传工程几乎全都依赖于抗生素抗性基因的使用，无论是用于遗传标记受体细胞还是用于遗传工程方案中鉴定和维持用作载体的质粒。如果菌株携带抗生素抗性基因，那么遗传修饰生物(GMO)释放到一般环境中、其在农业和食品加工工业的应用或在保健品(health care)工业的应用很可能被管理机构所禁止。因此，明显需要可用于替代抗生素抗性基因的标记基因，并且其不会有携带取代标记基因的GMO可能被管理机构慢慢清除的任何后果。
以前描述了胸苷酸合酶(TS)基因适合于取代抗生素抗性基因作为选择标记(欧洲专利申请EP0406003A1)。具体地，发现来自通常用于乳酪制造(并因此确认为安全微生物)的一种细菌，乳链球菌(Streptococcus lactis)的胸苷酸合酶基因作为标记基因是合适的候选物，其可以作为抗生素抗性基因的替代物，尤其是作为“食品级(food grade)”标记基因。胸苷酸合酶(5，10-亚甲基四氢叶酸：dUMP C-甲基-转移酶；EC 2.1.1.45)在DNA合成中扮演关键角色；其催化dUMP至dTMP的还原性甲基化，同时伴随辅助因子5，10-亚甲基四氢叶酸向7，8-二氢叶酸的转化。该活性是DNA的从头生物合成中的基本步骤。通过TS基因中的突变而失去TS活性的细胞不能制造DNA，也不能存活，除非供给胸腺嘧啶或胸苷，其通过替代途径转变为dTMP。可以轻易地将缺少胸苷酸合酶活性的微生物菌株(即TS-)与正常TS+菌株区别开。在化学限定的支持TS+菌株阳性生长的生长培养基中，TS-细胞将死亡，除非所述培养基补充胸腺嘧啶或胸苷。另外，在没有足够胸腺嘧啶或胸苷的培养基或环境中，具有乳链球菌TS基因的克隆载体质粒将稳定地维持在TS-细胞中，质粒的丧失导致细胞死亡。
发明内容
本发明的目的是提供源于不含抗生素抗性基因的RSF1010质粒的广宿主范围Mob-载体、提供包含所述载体并且缺乏胸苷酸合酶和胸苷激酶活性而提供非常稳定的(stabile)载体-宿主系统的细菌、以及提供使用所述细菌生产有用代谢物的方法。
该目标通过构建RSF1010衍生质粒而实现，所述衍生质粒不含与转移能力有关的基因并且没有抗生素抗性基因。此外，将作为选择标记的胸苷酸合酶导入到所构建的质粒中。而且此外，用所述质粒转化缺乏活性胸苷酸合酶和胸苷激酶基因的细菌。结果，存在于质粒上的胸苷酸合酶基因不但成为选择标记，还成为在细菌中稳定所述质粒的因子。由此完成了本发明。
本发明的目的是提供RSF1010衍生Mob-质粒，其中所述质粒选自下组：SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：27、和SEQ ID NO：48，以及与SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：27、和SEQ ID NO：48至少95％同源的SEQ ID NO：24、SEQ IDNO：27、和SEQ ID NO：48的变体，并且其中所述质粒经过修饰以使与转移能力有关的一种或多种基因失活。
本发明的又一目的是提供上述的质粒，其中所述质粒经修饰以使抗生素抗性基因失活。
本发明的又一目的是提供上述的质粒，其中所述质粒经修饰以增加上述质粒的拷贝数。
本发明的又一目的是提供上述的质粒，其包含PlacUV5启动子和来自无mob基因座的RSF1010的复制起点。
本发明的又一目的是提供上述的质粒，其额外包含胸苷酸合酶基因。
本发明的又一目的是提供上述的质粒，其额外包含目标基因。
本发明的又一目的是提供包含上述质粒的细菌。
本发明的又一目的是提供上述的细菌，其中所述细菌是革兰氏阴性细菌。
本发明的又一目的是提供上述的细菌，其中所述细菌缺乏活性胸苷酸合酶并缺乏活性胸苷激酶。
本发明的又一目的是提供上述的细菌，其中所述细菌具有生产有用代谢物的能力。
本发明的又一目的是提供上述的细菌，其中所述有用代谢物选自下组：天然或重组蛋白质、酶、L-氨基酸、核苷、核苷酸、有机酸和维生素。
本发明的又一目的是提供生产有用代谢物的方法，包括
(a)在培养基中培养上述细菌和
(b)从培养基收集所述的有用代谢物。
本发明的又一目的是提供上述的方法，其中所述有用代谢物选自下组：天然或重组蛋白质、酶、L-氨基酸、核苷、核苷酸、有机酸和维生素。
附图简述
图1显示RSF1010质粒的结构。
图2显示pBluescript::lacIrepB质粒的结构。
图3显示RSF1010mob-质粒的结构。
图4显示野生型和改善的thyA启动子区域的序列。-35和-10区域加下划线。-10、-14和-15区域的取代以粗体表示。
图5显示RSF1010-MT质粒的结构。
优选实施方案描述
本发明的RSF1010衍生Mob-质粒包括由RSF1010质粒所构建的质粒，由此将与转移能力有关的基因失活。
本发明所用短语“RSF1010衍生Mob-质粒”定义为以下定义的和SEQ IDNO.1中的RSF1010质粒，及其变体，由此使与转移能力有关的基因失活。图3、图5中提供了RSF1010衍生Mob-质粒的例子，而DNA序列在SEQ IDNO：24、27、和48中公开。
本发明的短语质粒的“衍生物”意思是由本发明质粒的一部分、和/或另一个DNA序列所组成的另一种质粒。“质粒的一部分”意思是包含质粒的自主复制必需的区域的部分，如复制起点(ori)和复制必需的基因(rep)，以维持细菌中的复制。
与转移有关的基因包括，但不限于mobA、mobB、mobC、和oriT。包括在质粒RSF1010中的基因的位置如表1所示。
表1
    基因     蛋白质     序列(SEQ ID：1)     SEQ ID NO：
    strA     Sm抗性蛋白A     63-866     NO2
    strB     Sm抗性蛋白B     866-1702     NO4
    oriV     复制起点     2347-2771
    mobC     转移蛋白C     互补2767-3051     NO6
    mobA     转移蛋白A     3250-5379     NO8
    mobB     转移蛋白B     3998-4411     NO10
    repB     复制蛋白B     4408-5379     NO12
    orfE     未知蛋白E     5440-5652     NO14
    orfF     阻抑蛋白F     5654-5860     NO16
    repA     复制蛋白A     5890-6729     NO18
    repC     复制蛋白C     6716-7567     NO20
    sul     Su抗性蛋白     7875-8663     NO22
RSF1010质粒的核苷酸序列是已知的(Scholz，P.等，Gene，75(2)，271-288(1989)；GenBank登录号M28829，gi：152577)，并在SEQ ID NO：1中示出。RSF1010质粒包含植物(vegetative)DNA复制的独特起点oriV，编码必需复制蛋白的基因repA、repB、repB′和repC，松弛复合体(relaxation composite)位点和接合DNA转移起点oriT，编码涉及质粒转移的反式激活蛋白的基因mobA、mobB和mobC，以及磺酰胺和链霉素抗性(StrR)基因(分别为sul和strA、srrB基因)。
RSF1010质粒包含编码Rep蛋白的基因，所述Rep蛋白具有SEQ ID：13、19和21所示的氨基酸序列。
所述Rep基因为来自RSF1010的repA、B、C基因或其同源物。repA、B、C基因包括编码具有氨基酸序列SEQ ID NOS：13、19、21的蛋白质的基因。所述rep基因同源物可以为编码与SEQ ID NO：13、19、21的全部氨基酸序列具有70％或更高、优选80％或更高、更优选90％或更高、再优选95％或更高、特别优选98％或更高同源性且具有复制能力的蛋白质的基因。可以使用Karlin和Altschul的BLAST(Pro.Natl.Acad.Sci.USA，90，和5873(1993))和FASTA(Methods Enzymol.，183，和63(1990))算法测定氨基酸序列和DNA序列的同源性。称为BLASTN和BLASTX的程序是以此BLAST算法为基础开发的(参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。
另外，本发明的rep基因不限于野生型基因，也可以是编码具有SEQ IDNO：13、19、和21的氨基酸序列的突变的或人工修饰的基因。所编码的蛋白质可以包括一个或多个位置的一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、或插入，只要保留了所编码的Rep蛋白的功能，即复制能力。虽然此处提到的“几个”氨基酸残基的数目根据在三维结构中的位置或氨基酸残基的类型而有所不同，但可以为2至20个，优选2至10个，更优选2至5个。氨基酸的取代优选为保守的取代，包括ser或thr取代ala，gln、his或lys取代arg，glu、gln、lys、his或asp取代asn，asn、glu或gln取代asp，ser或ala取代cys，asn、glu、lys、his、asp或arg取代gln，gly、asn、gln、lys或asp取代glu，pro取代gly，asn、lys、gln、arg或tyr取代his，leu、met、val或phe取代ile，ile、met、val或phe取代leu，asn、glu、gln、his或arg取代lys，ile、leu、val或phe取代met，trp、tyr、met、ile或leu取代phe，thr或ala取代ser，ser或ala取代thr，phe或tyr取代trp，his、phe或trp取代tyr，以及met、ile或leu取代val。上述一个或几个核苷酸的取代、缺失、或插入还包括起源于个体差异、以及含有rep基因的微生物(突变体或变体)物种差异的天然存在的突变。
这样的基因可以通过例如位点特异性诱变来修饰SEQ ID NOS：12、18和20所示的核苷酸序列而获得，从而将一个或多个取代、缺失或插入引入到由基因所编码的蛋白质的特定位点。
另外，还可以通过如下面所提到的那些常规的诱变处理来获得这样的基因。诱变处理的例子包括在体外用羟胺处理具有SEQ ID NOS：12、18和20所示的核苷酸序列的基因，以及用紫外线照射或诱变剂处理微生物如含有RSF1010的埃希氏菌属细菌，所述诱变剂为通常突变处理中所用的诱变剂如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)或EMS(乙基甲磺酸酯(ethylmethanesulfonate))。
rep基因还包括能够在严紧条件下与SEQ ID NOS：12、18、20的核苷酸序列、或由这些序列制备的探针杂交的DNA，并且其编码具有复制能力的蛋白质。如本文所用的“严紧条件”为这样的条件，在此条件下形成所谓的特异性杂合体且不形成非特异性杂合体。难以用任何的数值清楚地表达此条件。然而，严紧条件的例子包括：在其条件下，相互之间具有高度同源性的DNAs，例如具有不小于50％同源性的DNAs互相杂交，而具有低于50％同源性的DNAs不互相杂交的条件，和在其条件下，DNAs在具有Southern杂交通常洗涤的盐浓度互相杂交的条件，即在1×SSC、0.1％SDS在60℃，优选0.1×SSC、0.1％SDS在60℃，更优选0.1×SSC、0.1％SDS在68℃下洗涤一次或优选2-3次。
可以按照如上所述用于Rep蛋白的类似步骤获得本发明中使用的编码转移蛋白的DNA或其它基因。
本文所用短语“使一种或多种与转移能力有关的基因失活”意思是失去从细胞到另一细胞的转移活性。与转移能力有关的基因包括mobA和mobB以及mobC。使基因失活的方法的例子包括突变或缺失选自mobA、B、和C的基因的一部分。突变或缺失基因的方法的例子包括修饰表达调控序列如启动子和Shine-Dalgarno(SD)序列、向开放阅读框中引入错义突变、无义突变、或移码突变、以及缺失基因的一部分(J Biol Chem.1997272(13)：8611-7)或缺失编码转移蛋白的全部区域。可以用通过使同源重组技术或者用转座子或IS因子将突变的基因引入到微生物中，其中染色体上的野生型基因被突变的基因所取代。同源重组技术包括使用线性DNA、温度敏感质粒、和非可复制质粒的方法。这些方法描述于Proc Natl Acad Sci USA.2000 Jun6；97(12)：6640-5、美国专利6303383、JP05-007491A等等。
mobA基因在替代框架内包含mobB基因，且mobA基因的3’末端编码质粒复制必需的RepB蛋白。另外，repB基因的起始密码子与mobB基因的终止密码子重叠，推测存在这些基因的翻译偶联(translational coupling)。
质粒的oriT区域存在于mobC和mobB基因之间，并且是转移起始所必需的组件。已知该区域还包含repB基因翻译必需的启动子。因此有必要引入另一种(些)能够发挥repB基因翻译功能的启动子。
可以通过构建重组质粒的常规方法来进行质粒的部分缺失，例如用限制酶消化，然后连接质粒的其余部分，重组或整合等等。
本发明的具体实施方案是缺失了mobA、mobB和mobC基因的RSF1010衍生质粒。在原始RSF1010质粒(SEQ ID NO：1)上，mobA基因自核苷酸3250延伸至核苷酸5379，mobB基因自核苷酸3998延伸至核苷酸4411，mobC基因自核苷酸3051延伸至核苷酸2767。repB和mobA的编码区是重叠的。因此优选缺失mobA例如核苷酸3250-5379而不缺失repB。去除mob基因座的RSF1010衍生物RSF1010衍生Mob-的序列在序列表中SEQ ID NO：24、27和48中显示。
本发明的又一实施方案是不包含抗生素抗性标记的RSF1010衍生Mob-质粒。原始RSF1010质粒包含链霉素抗性基因(strA和strB基因)和磺酰胺抗性基因(sul基因)。在RSF1010质粒(SEQ ID NO：1)上，strA基因自核苷酸63延伸至866，strB基因自核苷酸866延伸至1702，sul基因自核苷酸7875延伸至8663。不包含抗生素抗性标记的RSF1010衍生Mob-质粒在SEQ ID NO：27和图5中显示。
本发明的又一实施方案是RSF1010衍生Mob-质粒，所述质粒经修饰而使抗生素抗性基因失活。本发明中与抗生素抗性基因有关的基因是磺酰胺和链霉素抗性(StrR)基因(分别是sul和strA、strB基因)。
本发明的又一实施方案是RSF1010衍生Mob-质粒，所述质粒经修饰以增加质粒拷贝数。强启动子或可诱导的启动子可以用于表达repB基因，其经修饰从而可以增加质粒的拷贝数。这种强启动子的例子包括lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、λ噬菌体的PR启动子和PL启动子、tet启动子、amyE启动子、spac启动子等等。这种强启动子的例子包括PlacUV5启动子、lac启动子、尤其是PlacUV5启动子是优选的。包含PlacUV5启动子的RSF1010衍生mob-质粒在SEQ ID NOS：24、27、48中描述。
为了有条件地调控拷贝数，可以使用PlacUV5启动子控制下的PlacUV5启动子与lacI基因的组合。PlacUV5启动子是可以通过添加IPTG诱导的，并且lacI基因阻抑从PlacUV5启动子的表达(J Mol Biol.1982 Nov 5；161(3)：417-38.)，因此，为了增加拷贝数，可以添加IPTG，或者可以缺失lacI基因。与RSF1010相比，预期该质粒的拷贝数增加至两倍、3倍、和4倍。包含PlacUV5启动子的RSF1010mob-lacI-质粒在SEQ ID NO：48中描述。为了减少质粒的拷贝数，优选修饰lacI基因以过表达。包含PlacUV5启动子的RSF1010mob-lacI-质粒在SEQ ID NO：48中描述。
为了减少质粒的拷贝数，优选修饰lacI基因以过表达。
PlacUV5启动子的核苷酸序列公开于Genbank登录号Y00412(核苷酸7-100)中。lacI的核苷酸序列公开于Genbank登录号NP_414879中。另外，用于本发明的PlacUV5启动子的核苷酸序列描述于SEQ ID NO：24(核苷酸2824-2912)。PlacUV5启动子可以根据SEQ ID NO：24的核苷酸序列通过化学合成获得，或者通过由pET表达系统(Novagen)制备而获得。lacI的核苷酸序列也描述于SEQID NO：25。lacI可以根据SEQ ID NO：25或GenBank登录号NP_414879的核苷酸序列，使用大肠杆菌K-12(MG1655)的染色体DNA作为模板，通过PCR获得。包含PlacUV5启动子和lacI的RSF1010mob-质粒在SEQ ID NO：24和图3中显示。
本发明的又一实施方案是额外包含作为选择标记的胸苷酸合酶基因(thyA基因，SEQ ID NO：44)的RSF1010衍生Mob-质粒。胸苷酸合酶在7，8-二氢叶酸释放时，通过消耗5，10-亚甲基四氢叶酸而催化从2’-脱氧尿苷-5’-磷酸(dUMP)形成胸苷-5’-单磷酸(dTMP)。已经阐明了编码大肠杆菌的胸苷酸合酶的thyA基因(GenBank登录号NC_000913.1，gi：16130731的序列中核苷酸编号2962383至2963177)。thyA基因位于大肠杆菌菌株K12的染色体上ppdA和lgt基因之间。因此，可以利用引物通过PCR(聚合酶链式反应；参见White，T.J.等，Trends Genet.，5，185(1989))获得前述基因，所述引物基于所报道的基因的核苷酸序列。具有mob基因座并缺失了所有抗生素抗性基因且包含胸苷酸合酶基因(thyA基因，SEQ ID NO：27196至990)作为选择标记的RSF1010衍生物的序列在序列表SEQ ID NOS：44和45中显示。
额外包含胸苷酸合酶基因(thyA基因)作为选择标记的RSF1010衍生Mob-质粒可以用作载体。载体为DNA分子，其中能够整合另一种合适大小的DNA片段而不丧失载体的自我复制能力；载体将外源DNA引入到宿主细胞中，所述外源DNA可以在宿主细胞中大量复制。包含thyA基因的质粒描述于SEQID NO：27(RSF1010mob-MT)和图5。
因此，本发明的又一实施方案是包含胸苷酸合酶基因(thyA基因)作为选择标记并且额外包含目标基因的RSF1010衍生Mob-质粒。术语“目标基因”意思是涉及或影响有用代谢物的生物合成途径的基因。这些可以是涉及天然或重组蛋白、或涉及L-氨基酸、核苷、核苷酸、有机酸和维生素生物合成的基因或编码调控蛋白的基因。术语“有用代谢物”包括天然的或重组的蛋白质、酶、L-氨基酸、核苷和核苷酸、有机酸、维生素。L-氨基酸包括L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸和L-高丝氨酸、并且优选包括芳香族L-氨基酸，如L-色氨酸、L-苯丙氨酸和L-酪氨酸。核苷包括嘌呤核苷和嘧啶核苷，如腺苷、胞苷、肌苷、鸟苷、胸苷、尿苷和黄苷。核苷酸包括磷酸化的核苷，优选5’-磷酸化的核苷，如2’-脱氧腺苷-5’-单磷酸(dAMP)、2’-脱氧胞苷-5’-单磷酸(dCMP)、2’-脱氧鸟苷5’-单磷酸(dGMP)、胸苷-5’-单磷酸(dTMP)、腺苷-5’-单磷酸(AMP)、胞苷-5’-单磷酸(cMP)、鸟苷5’-单磷酸(GMP)、肌苷5’-单磷酸(IMP)、尿苷-5’-磷酸(UMP)、黄苷-5’-单磷酸(XMP)。有机酸包括琥珀酸、延胡索酸、苹果酸、酮葡糖酸。维生素包括泛酸。
本发明的质粒，尤其是SEQ ID Nos.24、27和48所示质粒可以包括这些序列的变体，只要与产生所述变体之前的质粒相比，这些质粒能够在细菌中发挥功能。本文所用质粒的功能意指当转化到细菌中时，所述质粒具有复制其自身和表达目标基因、以及表达质粒复制所必需的基因的能力。明显的变异乃至缺失可以发生在对于质粒的功能和复制不重要的质粒区域内，例如RSF1010衍生mob-质粒(SEQ ID NO：24)从核苷酸7219至8335的区域和从核苷酸1至2347的区域，和RSF1010-MT质粒(SEQ ID NO：27)从核苷酸1004至1649和/或从6557至6864的区域。这些区域通常可以包含一个或几个选择标记。此外，也可以修饰或缺失调控质粒复制所必需的lacI基因的编码部分(对于RSFmob-质粒(SEQ ID NO：24)为核苷酸2252至3379，对于RSF1010-MT质粒(SEQ ID NO：27)为核苷酸2914至4041)(参见实施例2)，假设这样的修饰或缺失不在lacI基因内产生终止密码子或不产生移码。更多的变异可以是在SEQ ID Nos.24、27和48的其它区域内的取代、缺失、或插入核苷酸，只要所述质粒能够像产生所述变体之前那样发挥功能并复制。优选地，与SEQ ID Nos.24、27和48的序列相比，变体至少80％同源，更优选至少90％同源，最优选至少95％同源，甚至最优选至少97％同源。可以通过常规的熟知的技术如BLAST测定同源性，并且相对于序列SEQ ID NOs.24、27和48的全长测定同源性。例如，可以用软件程序BLAST 2.0计算三个参数：分数、同一性和相似性，以估计两条氨基酸序列之间的同源性。将计算期间获得的相似性值考虑在内以估计同源性百分比。BLAST(基本局部对比搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool))是程序blasta、blastp、blastn、blastx、megablast、tblastn、和tblastx所使用的启发式搜索算法；这些程序采用Karlin、Samuel和Stephen F.Altschul的统计学方法赋予它们的结果以显著性(″Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence featuresby using general scoring schemes″。Proc. Natl. Acad. Sci. USA，87：2264-68(1990)；″Applications and statistics for multiple high-scoring segmentsin molecular sequences″。Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：5873-7(1993))。
制备染色体DNA、杂交、PCR、制备质粒DNA、消化和连接DNA、转化、选择作为引物的寡核苷酸等的方法包括本领域技术人员熟知的常规方法。这些方法描述于Sambrook，J.，和Russell D.，“Molecular Cloning A LaboratoryManual，第三版″，Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)等。
本发明的细菌包括含有本发明所述质粒的细菌，优选革兰氏阴性细菌。优选本发明的细菌具有生产有用代谢物的能力。另外，本发明的细菌包括如上所述的细菌，其缺乏有活性的固有胸苷酸合酶和胸苷激酶。然而，本发明的细菌可以具有活性胸苷酸合酶，其由所述细菌含有的本发明的质粒表达。
术语“具有生产有用代谢物能力的细菌”意指当把本发明的细菌在培养基中培养时，具有引起代谢物在细菌细胞中或优选在培养基中积累的能力的细菌。可以通过培育而赋予或增强生产这种代谢物的能力。本文所用术语“具有生产有用代谢物能力的细菌”还指能够以大于野生型或亲本菌株的量生产并导致代谢物在培养基中积累的细菌，优选指能够以不少于0.5g/L、更优选不少于1.0g/L的量生产并导致目标代谢物在培养基中累积的微生物。
术语“革兰氏阴性细菌”指根据微生物学领域的技术人员已知的分类法将其归类为革兰氏阴性细菌的细菌。这种分类法参见例如″Bergey’s Manual ofDeterminative Bacteriology，第九版″(Bergey，John G Holt(编者)，Noel R.Krieg，Peter H.A.Sneath，D.Bergy，出版商：Lippincott，williams&Wilkins)。革兰氏阴性细菌包括例如以下科的细菌：醋酸杆菌科(Acetobacteriaceae)、产碱菌科(Alcaligenaceae)、类杆菌科(Bacteroidaceae)、着色菌科(Chromatiaceae)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、军团菌科(Legionellaceae)、奈瑟氏球菌科(Neisseriaceae)、硝化菌科(Nitrobacteriaceae)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、立克次氏体科(Rickettsiaceae)、螺旋体科(Spirochaetaceae)、弧菌科(Vibrionaceae)等等。
肠杆菌科包括例如属于肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、埃希氏菌属(Escherichia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、普罗威登斯菌属(Providencia)、沙门氏菌(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、志贺氏菌属(Shigella)等的细菌。
术语“缺乏活性胸苷酸合酶和胸苷激酶”指以所述方式修饰编码这些酶的固有基因以使修饰基因编码完全无活性蛋白。由于一部分基因的缺失、阅读框位移、或者通过修饰基因邻近区域包括控制操纵子表达的序列，如启动子、增强子、衰减子等，修饰的基因也有可能不能表达。
已知丧失了胸苷酸合酶活性的细胞不能生产DNA，也不能存活，除非供给胸腺嘧啶或胸苷，它们通过替代途径转变为dTMP。胸苷激酶的进一步失活可能产生不能利用存在于培养基中的胸腺嘧啶或胸苷的细菌。结果，存在于本发明质粒上的胸苷酸合酶基因不仅成为选择标记，还成为用来稳定细菌中的质粒的因子。
胸苷激酶催化胸苷的ATP-依赖的磷酸化，产生胸苷-5’-单磷酸(dTMP)。已经阐明了编码大肠杆菌胸苷激酶的tdk基因(GenBank登录号NC_000913.1，gi：16129199中核苷酸1292750至1293367)。tdk基因位于大肠杆菌菌株K12染色体上hns基因和ychG ORF之间。tdk基因的核苷酸序列和由该基因编码的氨基酸序列分别如SEQ ID NOS：46和47所示。
基因的失活可以通过常规方法完成，例如用紫外线(UV)照射或亚硝基胍(N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍)处理的诱变处理、定点诱变、使用同源重组或/和插入-缺失诱变的基因破坏(Datsenko K.A.和Wanner B.L.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97：12：6640-45(2000))(也称为“Red-驱动的整合”)。
具体地，使宿主菌株thyA基因失活之后，将修饰的质粒RSF1010转化到突变宿主中，所述修饰的质粒RSF1010缺失了mob基因座和所有抗生素抗性基因，并含有胸苷酸合酶基因(SEQ ID NO：44)，接下来在不含胸苷的培养基上进一步选择转化体。然后进行tdk基因的失活。基因的失活可以通过用抗生素抗性基因取代目标基因来进行，所述抗生素抗性基因侧翼与适于进一步切除抗生素抗性基因的序列相连。通过采用FRT位点和噬菌体λRed重组酶(Flp重组酶)的系统(Datsenko K.A.和Wanner B.L.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97：12：6640-45(2000))、采用来自噬菌体λ的attL和attR位点和int和xis基因的产物的系统(Peredelchuk，M.Y.和Bennett，GN.，Gene，187，231-238(1997))、采用来自噬菌体P1的loxP位点和Cre重组酶的系统(Guo，F.等，Nature，389，40-46)、由Campbell，A.M.(J.Bacterio1.，174，23，7495-7499(1992))描述的类似系统等作为用于切除的系统的示例。
可以通过将本发明的质粒导入到细菌中而获得本发明的细菌，由此，所述细菌具有了生产有用代谢物的固有能力并缺乏活性胸苷酸合酶和胸苷激酶。或者，可以通过赋予细菌生产有用代谢物的能力而获得本发明的细菌，所述细菌已经缺乏活性胸苷酸合酶和胸苷激酶并且含有所述质粒。
本发明的方法包括生产有用代谢物的方法，包括在培养基中培养本发明的细菌，使所述代谢物积累于培养基中，以及从培养基收集代谢物。
在本发明中，由培养基培养、收集、和纯化目标代谢物等可以通过与常规发酵方法类似的方式进行，其中用微生物生产所述目标代谢物。用于培养的培养基可以是合成的或天然的，只要所述培养基包括碳源和氮源和矿物质，及如果需要，微生物生长所需的适量营养物。碳源包括多种碳水化合物如葡萄糖和蔗糖以及多种有机酸。根据所选微生物的同化方式，可以使用醇包括乙醇和甘油。多种铵盐如氨和硫酸铵，其它氮化合物如胺，天然氮源如蛋白胨，大豆水解产物和经消化的发酵微生物可以用作氮源。单磷酸钾(potassiummonophosphate)、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、氯化钙等可以用作矿物质。如果需要，可以向培养基添加例如弥补营养缺陷型的其他营养物。
培养后，可以通过离心或膜过滤从液体培养基去除固体如细胞，然后可以通过常规方法如离子交换、亲和层析、浓缩、结晶和其它适合于所需的特定代谢物的方法收集并纯化目标代谢物。
实施例
以下将参考下述非限制性实施例更具体地解释本发明。
实施例1.RSF1010mob-质粒的构建
通过将包含自主调控元件PlacUV5-lacI的DNA片段“Red-驱动的整合”(Datsenko K.A.和Wanner B.L.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，97：12：6640-45)到RSF1010质粒中以代替mob基因座，来进行RSF1010Mob-质粒的构建，所述自主调控元件PlacUV5-lacI由氯霉素抗性基因(cat基因)所标记。
首先，用引物P1(SEQ ID NO：29)和P2(SEQ ID NO：30)以及pMW-PlacUV5-lacI-118质粒(Skorokhodova，A.Y.等，Biotechnologiya(rus)，No.5，(2004))作为模板，通过PCR扩增PlacUV5启动子控制下的具有lacI基因的结构部分的DNA片段。PlacUV5启动子的核苷酸序列公开于Genbank登录号Y00412(核苷酸7-100)。lacI的核苷酸序列公开于Genbank登录号NP_414879。另外，用于本发明的PlacUV5启动子的核苷酸序列描述于SEQ ID NO：24(核苷酸2824-2912)。PlacUV5启动子可以根据SEQ ID NO：24的核苷酸序列通过化学合成获得，或者通过由pET表达系统(Novagen)制备而获得。lacI的核苷酸序列也描述于SEQ ID NO：25。lacI可以根据SEQ ID NO：25或GenBank登录号NP_414879的核苷酸序列，使用大肠杆菌K-12(MG1655)的染色体DNA作为模板，通过PCR获得。
引物P1与位于质粒上XbaI限制性位点上游的pMW-PlacUV5-lacI-118质粒中的区域一致。引物P2包含引入到其5’端的BamHI限制性位点。用引物P3(SEQ ID NO：31)和P4(SEQ ID NO：32)通过PCR扩增来自质粒RSF1010的repB(SEQ ID：13)基因的片段。在质粒RSF1010上，repB基因的起始密码子和mobB基因的终止密码子重叠(图1)。repB基因的SD序列位于其起始密码子上游4个碱基对处。为了在不存在邻近mobB基因的情况下提供RepB蛋白质的翻译，通过将4个核苷酸添加到引物P3中来修饰repB基因的翻译起始区。另外，引物P3包含引入到其5’端的BamHI限制性位点，而引物P4包含引入到其5’端的KpnI限制性位点。通过琼脂糖凝胶电泳纯化所获得的两种PCR产物，用BamHI限制酶处理，连接，并用作模板使用引物P1和P4进行PCR。用XbaI和KpnI限制酶处理所得DNA片段，并克隆到事先用相同限制酶处理过的pBluescript II SK(+)载体(Stratagene)中。将所得质粒命名为pBluescript::lacIrepB。
然后，构建了包含氯霉素抗性基因(cat基因)和PlacUV5启动子的DNA片段。 利用引物P5(SEQ ID NO：33)和P6(SEQ ID NO：34)从质粒pACYC184(Takara Bio)扩增cat基因。引物P5包含引入到其5’端的BglII限制性位点，是选择mob-质粒后进一步切除cat基因所必需的。引物P6包含引入到其5’端的SacI限制性位点。用引物P7(SEQ ID NO：35)和P8(SEQ ID NO：36)从pMW-PlacUV5-lacI-118质粒扩增PlacUV5启动子。引物P7包含引入到其5’端的SacI限制性位点。引物P8包含引入到其5’端的XbaI限制性位点。通过琼脂糖凝胶电泳纯化所获得的片段，用SacI限制酶处理，连接，并用作模板使用引物P5和P8进行PCR。然后，用XbaI限制酶处理所得产物，并与事先用相同限制酶处理的pBluescript::lacIrepB质粒连接。将所获得的线性产物用作模板以引物P4(SEQ ID NO：32)和P9(SEQ ID NO：37)进行PCR。引物P9包含RSF1010区域的38个核苷酸，其位于oriV和mobC基因3’端之间，BglII限制性位点，和与cat基因的5’端互补的17个核苷酸。
利用“Red-驱动的整合”(Datsenko K.A.和Wanner B.L.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，97：12：6640-45)将所获得的PCR产物用于整合到RSF1010质粒中，取代质粒的mob基因座，其中所述PCR产物包含repB基因的3’端、PlacUV5启动子控制下的lacI基因、cat基因和位于oriV和mobC基因3’端之间的RSF1010区域的38个核苷酸。根据所述方法，将质粒pKD46用作辅助质粒。包含重组质粒pKD46的大肠杆菌菌株BW25113可由大肠杆菌Genetic StockCenter，耶鲁大学，New Haven，USA获得，其登录号为CGSC7630。
通过电穿孔将RSF1010质粒与上述的DNA片段一起导入到菌株MG1655(pKD46)中。菌株MG1655(ATCC编号47076)可由美国典型培养物保藏中心(ATCC，地址：邮政信箱1549，Manassas，VA20108，美国)获得。
将100-200ng PCR扩增的DNA片段和100ng RSF1010质粒用于电穿孔。用电穿孔仪BioRad(编号165-2098，ver.2-89，USA)(脉冲时间为4-5msec，电场强度为12.5kV/cm)进行电穿孔。电穿孔后，立刻将1ml SOC培养基添加到细胞悬液。细胞于37℃培养2小时，涂布在含30μg/ml氯霉素的LB琼脂上，然后37℃生长过夜。
用BglII和XbaI限制酶处理作为同源重组的结果而获得的分离的RSFmob-cat质粒，以去除cat基因，然后与用相同限制酶处理的含PlacUV5启动子的PCR片段连接。用引物P1(SEQ ID NO：29)和P8(SEQ ID NO：36)获得含PlacUV5启动子的PCR片段。具有缺失的mob基因座的RSF1010衍生物的序列(RSF1010mob-，8338 bp)在序列表的SEQ ID NO：24和图3中显示。
至于所获得的质粒的稳定性，在非选择性条件下提供7次传代(passages)的质粒-携带体(plasmid-carrier)培养物，而且在100个独立的克隆当中，没有获得链霉素敏感性(Sms)克隆。因此，在无选择的7次传代后，所获得的质粒RSF1010mob-的稳定性不低于99％。
研究了RSF1010mob-质粒与亲本质粒RSF1010相比的转移效率。为此，以大肠杆菌菌株C600(r+m+)(Funakoshi)为基础构建了供体菌株，所述大肠杆菌菌株C600包含常驻质粒(resident plasmid)RP1-2(Tcr)。该质粒提供接合转移必需的tra-操纵子基因。通过转化，用Strr作为选择标记将质粒RSF1010和RSF1010mob-导入C600(RP1-2)菌株。通过用质粒pAYC32(Chistoserdov，A.Y.和Tsygankov，Y.D.，Plasmid，16，161-167(1986))、pBR322和pUC19转化，构建了三个对照供体菌株。将所有构建的供体菌株与受体菌株LE392met-RifR(Promega)用于接合试验中，以测定转移效率。这些试验的结果提供于表2。
表2
    具有RP1-2的供体中的质粒     转移效率a
    RSF1010b     2.5×10-5
    RSF1010mob-     ＜10-8
    PAYC32c     3×10-4
    PBR322c     4×10-6
    PUC19c     ＜10-8
aC600供体和LE392作为受体杂交过夜后每个供体的转化接合体(transconjugants)数。
b在LB-利福平-链霉素培养基上测定的RSF1010及其衍生物的转移。
c在LB-利福平-氨苄青霉素培养基上测定的质粒的转移。
表2的结果显示质粒RSF1010mob-完全丧失转移能力。在这个方面，它们与不含任何mob基因的pUC19对照质粒类似。
实施例2.拷贝数增加的RSF1010质粒的mob-衍生物的构建
依据我们的数据，在静止期，RSF1010mob-具有与RSF1010相同的拷贝数。在对数生长期，所获得的衍生物的拷贝数比RSF1010质粒的拷贝数低大约两倍。在对数生长期，向培养基添加IPTG导致RSF1010mob-质粒拷贝数增加，因为涉及RSF样质粒复制的repB基因处于PlacUV5-lacI自主调控元件的转录控制之下。因此，提出从RSF1010mob-质粒中消除lacI基因可以增加质粒的拷贝数。通过用XbaI和BamHI限制酶从RSF1010mob-质粒切除lacI基因来获得无lacI基因的RSF1010mob-的相应衍生物。然后，将所得DNA片段的粘端平端化，通过连接获得RSF1010mob-，lacI-质粒。RSF1010mob-，lacI-质粒的DNA序列示于SEQ ID NO：48。
为估计RSF1010质粒衍生物的拷贝数，将三个质粒分别导入到大肠杆菌菌株MG1655中。已用“GenElute Plasmid Miniprep Kit”(Sigma，USA)从等量的不含IPTG的LB培养基中生长过夜的细胞分离了质粒DNA，用EcoRV限制酶和RNAse A处理。将琼脂糖凝胶用溴化乙锭染色后，用“Sorbfil”程序通过扫描相应于每个质粒的大EcoRV片段的电泳条带(bends)，来估计质粒的拷贝数。已将每种类型的三个独立的转化体用于该试验中。RSF1010衍生物的相对拷贝数显示于表3。RFS1010质粒的拷贝数视为1.0。
表3.RSF1010质粒的mob-衍生物的相对拷贝数。
    质粒     相对拷贝数
    RSF1010RSF1010mob-RSF1010mob-，lacI-     1.0±0.30.9±0.12.6±0.3
实施例3.缺乏任何抗生素抗性基因并含有thyA基因作为选择标记的RSF1010Mob-质粒的构建。
首先，以野生型大肠杆菌菌株MG1655为基础构建两个菌株；一个菌株缺失了thyA基因，另一个缺失了tdk基因。通过将包含抗生素抗性标记的片段整合到上述每一个菌株中，将所谓的“Red-驱动的整合”方法(Datsenko K.A.和Wanner B.L.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，97：12：6640-45)用于使目标基因失活。将来自质粒pACYC184的氯霉素抗性基因用于破坏thyA基因(Cmr)，将来自质粒pACYC177的卡那霉素抗性基因用于破坏tdk基因(Kmr)。所获得的携带抗生素抗性标记的两个突变体均可用作供体以将ΔthyA和Δtdk缺失P1转导到另一种大肠杆菌菌株中。
将具有thyA缺失的菌株用于本发明中以筛选克隆在不同质粒上的thyA基因的功能活性拷贝。
第二阶段包括thyA基因功能活性拷贝的克隆。在大肠杆菌MG1655菌株的染色体中，thyA基因位于提出的操纵子结构-lgt-thyA的远端部分。这里可能有该操纵子的邻近启动子。虽然thyA基因在正靠近起始密码子处拥有两个注解的(annotated)启动子(PthyA1和PthyA2)，但其序列不同于规范的启动子，因此其各自的潜在效率仍在讨论中。
根据大肠杆菌染色体的物理图谱，thyA结构基因由795bp组成，并且相应的蛋白质胸苷酸合酶包含264个氨基酸。thyA基因的核苷酸序列和由该基因编码的氨基酸序列分别如SEQ ID NOS：44和45所示。
用引物ThyA1(SEQ ID NO：38)和ThyA2(SEQ ID NO：39)以及来自大肠杆菌细胞TG1(Amersham Pharmacia Biotech)的染色体DNA通过PCR扩增同时包含两个天然启动子的thyA基因的结构部分。这些引物分别包含EcoRI和HindIII限制性位点，用于将thyA基因克隆到载体pUC18(Takara Bio)、pUC19(Takara Bio)和pET22(+)(Promega)中。PCR扩增后，分离了包含thyA基因的994 bp DNA片段，并将其克隆到质粒pUC18、pUC19和pET22(+)的EcoRI和HindIII位点。转化到大肠杆菌菌株TG1中后，在克隆的thyA基因存在下利用使用引物ThyA1和ThyA2的对照PCR分离并检测AmpR克隆。选择了包含期望的DNA片段的几个克隆用于分离重组质粒和测定克隆的thyA基因的功能活性。
为了测定克隆在质粒pUC18、pUC19和pET22(+)上的thyA基因的功能活性，通过转化将所有质粒都导入到菌株MG1655(ΔthyA::Cmr)的受体细胞中。选择了来自各个转化试验的50个独立的AmpR克隆，并检测弥补thyA突变的能力。用ThyA1和ThyA2引物通过对照PCR确认了包含质粒pUC18thyA、pUC19thyA和pET22(+)thyA的克隆中克隆的thyA基因的存在。另外，显示除了源于质粒pET22的那些之外，所检测的所有转化体都能够在无胸苷的基本培养基上生长。这些数据表明，克隆的thyA基因只有在其被克隆在多拷贝质粒pUC18和pUC19上的条件下才能够由其自身启动子表达。
应注意到，包含克隆在pUC18和pUC19质粒上的thyA基因的EcoRI-HindIII片段处于相反的方向。这样，thyA基因的pUC18质粒转录与质粒lacZ基因的转录一致，即thyA基因的转录可由lacZ启动子发生，而在pUC19质粒中，thyA基因的转录只可以从其自身启动子引导。因此，克隆在pUC18和pUC19质粒上的thyA表达的对比允许人们估计thyA启动子的功效。发现与包含pUC19thyA质粒的克隆相比，包含pUC18thyA质粒的MG1655(ΔthyA::Cmr)菌株的克隆在基本培养基上生长更好。这些数据使我们认识到，与包含lacZ启动子上游的构建相比，thyA从其自身启动子转录的水平更低。
另一方面，包含具有克隆thyA基因的pET22(+)载体的受体菌株MG1655(ΔthyA::Cmr)能够在不含胸苷的基本培养基上非常缓慢地生长。此数据表明，在质粒pET22(+)上，thyA基因由其自身启动子的表达不足以支持受体菌株MG1655(ΔthyA::Cmr)的生长。已知与pUC18(19)质粒相比，pET22质粒的拷贝数更低。因为我们的最终载体RSF1010也不是极高拷贝数质粒，所以决定改善克隆在pET22(+)载体上的thyA基因的表达。为此，利用定点PCR诱变将一些额外的突变引入到thyA基因启动子的-10区中。
设计了两个引物：ThyA4(SEQ ID NO：40)和ThyA5(SEQ ID NO：41)。两个引物在启动子的-10区域和位置-15和-14的TG基序中都包含取代，其必然改善由thyA启动子转录的效率。用引物对ThyA1-ThyA5和ThyA2-ThyA4，并以pET-22-thyA质粒作为模板实施了两个单独的PCR扩增，分离两个thyA基因片段。然后，PCR扩增的产物一起退火，并将所得混合物用作模板，用ThyA1和ThyA2引物进行PCR，以分离具有改善的-10区域的全长thyA基因。PCR扩增后，用EcoRI和HindIII限制酶消化该修饰的994bp片段，并克隆到事先用相同的限制酶处理过的载体pUC18、pUC19和pET22中。转化到大肠杆菌菌株TG1中后，在克隆的thyA基因存在下通过利用使用ThyA1和ThyA2引物的对照PCR分离并检测AmpR克隆。选择了包含期望的DNA片段的几个克隆以分离重组质粒，测序并测定克隆的thyA基因的功能活性。
首先，将修饰的thyA基因(以下称为thyA*基因)测序，并确认了启动子区中所引入的突变的存在。新启动子包含完美的Pribnow-盒：TATAAT，和分别在位置-15和-14的TG基序(图1SEQ ID：27中核苷酸87-95)。
为检测改善的thyA启动子提供thyA营养缺陷型生长足够的thyA*基因表达水平的能力，将包含处于修饰的启动子控制之下的thyA*基因的质粒pUC18、pUC19和pET22(+)转化到菌株MG1655(ΔthyA::Cmr)的受体细胞中。选择了来自各个转化试验的50个独立的AmpR克隆，并检测了其弥补thyA突变的能力。用ThyA1和ThyA2引物通过对照PCR，确认了包含质粒pUC18thyA*、pUC19thyA*和pET22thyA*的克隆中克隆的thyA*基因的存在。另外，显示包括那些含有pET22质粒的所检测的所有转化体都能够在不含胸苷的基本培养基上生长。这些数据表明，在改善的thyA*启动子控制之下的胸苷酸合酶的活性对于thyA营养缺陷型的生长来说是足够的。
需要另外一种thyA*基因的修饰以去除基因结构部分中的PstI限制性位点。设计该位点是为了从RSF1010mob-质粒切除SulR基因(SEQ ID：22)。使用如上所述用于位点特异性诱变的PCR技术进行了功能活性基因的结构修饰，以修饰启动子区域。用引物对ThyA1-ThyA16和ThyA17-ThyA2，并以pET-22-thyA*质粒作为模板进行两个独立的PCR扩增，分离两个thyA基因片段。引物ThyA16(SEQ ID NO：42)和ThyA17(SEQ ID NO：43)提供了同义密码子(synonymous codon)的引入，所述同义密码子从thyA基因结构部分消除了PstI限制性位点。然后，将PCR扩增产物一起退火，并将所得混合物作为模板利用ThyA1和ThyA2引物进行PCR，以分离其结构部分中不含PstI限制性位点的全长thyA*基因。PCR扩增后，用EcoRI和HindIII限制酶消化该修饰的994bp片段，并克隆到事先用相同的限制酶处理过的载体pUC18、pUC19和pET22中。转化到大肠杆菌菌株TG1中后，在克隆的thyA*基因存在下使用ThyA1和ThyA2引物通过对照PCR分离并检测AmpR克隆。选择了包含期望的DNA片段的几个克隆以分离重组质粒，测序并测定克隆的thyA*基因的功能活性。
实施例4.用thyA*基因取代RSF1010mob-的抗生素抗性标记(StrR和SulR)。
将分离的克隆中的一个用于分离包含修饰的thyA*基因的质粒pET22(+)。通过EcoRI和NotI限制酶消化质粒DNA，以亚克隆到RSF1010mob-质粒的相应位点中。将连接酶混合物转化到受体菌株MG1655(ΔthyA::Cmr)中，在不含胸苷的基本葡萄糖培养基上分离ThyA+转化体。用thyA*基因侧翼的引物ThyA1和ThyA2，通过PCR检测了ThyA+转化体的重组RSF1010质粒内thyA*基因的存在。显示所有检测的ThyA+转化体都显示出对链霉素的敏感性。这些数据表明，新分离的载体RSF1010mob-thyA*(不含PstI位点)包含由thyA*基因取代的strA和strB基因(SEQ ID NO：2和4)编码的StrR基因。为进行下一个步骤，通过PstI限制酶消化质粒RSF1010mob-thyA*并自连接(self-ligate)，以缺失由sul基因(SEQ ID NO：22)编码的SulR标记。结果，分离了由thyA*选择性标记取代了两个(StrR和SulR)抗生素抗性标记的新的RSF1010mob-thyA*质粒。序列表中SEQ ID NO：27和图5显示了RSF1010的衍生物的序列，所述RSF1010的衍生物缺失了mob基因座和所有的抗生素抗性基因且包含胸苷酸合酶基因(thyA*基因)作为选择标记。该新质粒命名为RSF1010-MT。
实施例5.thyA-、tdk-受体中RSF1010-MT质粒的稳定性研究。
在不含胸苷的基本培养基上分离了用RSF1010-MT质粒转化的菌株MG1655(ΔthyA::Cmr)和ThyA+转化体。根据大肠杆菌染色体的物理图谱，tdk结构基因由618bp组成，并且相应的蛋白质胸苷酸合酶包含205个氨基酸(SEQ ID NOS：46和47)。
然后，我们用生长在染色体上包含tdk::KmR插入的MG1655菌株(MG1655(Δtdk::Kmr))和携带RSF1010-MT质粒的受体菌株MG1655(ΔthyA::Cmr)上的噬菌体P1贮存物(stock)进行了P1转导试验。获得了卡那霉素抗性菌落，并通过PCR检测了染色体上tdk::KmR插入的存在。
分离MG1655(ΔthyA::Cmr，Δtdk::Kmr)/RSF1010-MT菌株后，增殖期间在非选择性条件下进行RSF101-MT质粒的稳定性研究。为此，在37℃将MG1655受体细胞(ΔthyA::Cmr，Δtdk::Kmr)/RSF1010-MT培养在试管中的LB培养液(broth)中培养72小时。然后，将培养物样品涂布在LB平板上，将24h后出现的单菌落在不含胸苷的基本培养基上重复(每种培养物200个菌落)。结果表明，源于包含RSF1010-MT质粒的MG1655(ΔthyA::Cmr，Δtdk::Kmr)菌株的所有200个菌落都能够在不含胸苷的基本培养基上生长，即所有检测的重组体都显示载体的稳定保持。
这些数据表明，克隆在RSF1010mob-质粒上的thyA*基因作为代替抗生素抗性标记的选择性标记提供所述质粒的稳定的保持。
虽然已经参考其优选实施方案详细描述了本发明，然而对于本领域的技术人员显而易见的是，能够进行各种改变和使用等同物(equivalents)，而不脱离本发明的范围。
工业实用性
本发明提供不含抗生素抗性基因的广宿主范围RSF1010衍生Mob-质粒。本发明的RSF1010衍生Mob-质粒可用于使用细菌生产有用代谢物。
序列表
<110>味之素株式会社(Ajinomoto Co.，Inc.)
<120>不包含抗生素抗性基因的RSF1010衍生MOB-缺陷型质粒、包含该质粒的细菌和生产有用代谢物的方法
<130>C261-C5063
<150>RU2004119027
<151>2004-06-24
<160>48
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>8684
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>基因
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<220>
<221>基因
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<220>
<221>基因
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<223>sul
<400>1
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ccccggcctg ttccgtgccc tcaagcgggg cgagcgcaag cgcagcaagc tggacgtgac   6840
gtatgactac ggcgacggca agcggatcga gttcagcggc ccggagccgc tgggcgctga   6900
tgatctgcgc atcctgcaag ggctggtggc catggctggg cctaatggcc tagtgcttgg   6960
cccggaaccc aagaccgaag gcggacggca gctccggctg ttcctggaac ccaagtggga   7020
ggccgtcacc gctgaatgcc atgtggtcaa aggtagctat cgggcgctgg caaaggaaat   7080
cggggcagag gtcgatagtg gtggggcgct caagcacata caggactgca tcgagcgcct   7140
ttggaaggta tccatcatcg cccagaatgg ccgcaagcgg caggggtttc ggctgctgtc   7200
ggagtacgcc agcgacgagg cggacgggcg cctgtacgtg gccctgaacc ccttgatcgc   7260
gcaggccgtc atgggtggcg gccagcatgt gcgcatcagc atggacgagg tgcgggcgct   7320
ggacagcgaa accgcccgcc tgctgcacca gcggctgtgt ggctggatcg accccggcaa   7380
aaccggcaag gcttccatag ataccttgtg cggctatgtc tggccgtcag aggccagtgg   7440
ttcgaccatg cgcaagcgcc gccagcgggt gcgcgaggcg ttgccggagc tggtcgcgct   7500
gggctggacg gtaaccgagt tcgcggcggg caagtacgac atcacccggc ccaaggcggc   7560
aggctgaccc cccccactct attgtaaaca agacattttt atcttttata ttcaatggct   7620
tattttcctg ctaattggta ataccatgaa aaataccatg ctcagaaaag gcttaacaat   7680
attttgaaaa attgcctact gagcgctgcc gcacagctcc ataggccgct ttcctggctt   7740
tgcttccaga tgtatgctct tctgctcctg cagctaatgg atcaccgcaa acaggttact   7800
cgcctgggga ttccctttcg acccgagcat ccgtatgata ctcatgctcg attattatta   7860
ttatagaagc ccccatgaat aaatcgctca tcattttcgg catcgtcaac ataacctcgg   7920
acagtttctc cgatggaggc cggtatctgg cgccagacgc agccattgcg caggcgcgta   7980
agctgatggc cgagggggca gatgtgatcg acctggtccg gcatccagca atcccgacgc   8040
cgcgcctgtt tcgtccgaca cagaaatcgc gcgtatgcgc cggtgctgga cgcgctcagg   8100
cagatggcat tcccgtctcg ctcgacagtt atcaacccgc gacgcaagcc tatgccttgt   8160
cgcgtggtgt ggcctatctc aatgatattc gcggttttcc agacgctgcg ttctatccgc   8220
aattggcgaa atcatctgcc aaactcgtcg ttatgcattc ggtgcaagac gggcaggcag   8280
atcggcgcga ggcacccgct ggcgacatca tggatcacat tgcggcgttc tttgacgcgc   8340
gcatcgcggc gctgacgggt gccggtatca aacgcaaccg ccttgtcctt gatcccggca   8400
tggggttttt tctgggggct gctcccgaaa cctcgctctc ggtgctggcg cggttcgatg   8460
aattgcggct gcgcttcgat ttgccggtgc ttctgtctgt ttcgcgcaaa tcctttctgc   8520
gcgcgctcac aggccgtggt ccgggggtgt cggggccgcg acactcgctg cagagcttgc   8580
cgccgccgca ggtggagctg acttcatccg cacacacgag ccgcgcccct tgcgcgacgg   8640
gctggcggta ttggcggcgc tgaaagaaac cgcaagaatt cgtt                    8684
<210>2
<211>804
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(804)
<223>strA
<400>2
ttg aat cga act aat att ttt ttt ggt gaa tcg cat tct gac tgg ttg      48
Leu Asn Arg Thr Asn Ile Phe Phe Gly Glu Ser His Ser Asp Trp Leu
1               5                   10                   15
cct gtc aga ggc gga gaa tct ggt gat ttt gtt ttt cga cgt ggt gac      96
Pro Val Arg Gly Gly Glu Ser Gly Asp Phe Val Phe Arg Arg Gly Asp
            20                  25                  30
ggg cat gcc ttc gcg aaa atc gca cct gct tcc cgc cgc ggt gag ctc      144
Gly His Ala Phe Ala Lys Ile Ala Pro Ala Ser Arg Arg Gly Glu Leu
        35                  40                  45
gct gga gag cgt gac cgc ctc att tgg ctc aaa ggt cga ggt gtg gct      192
Ala Gly Glu Arg Asp Arg Leu Ile Trp Leu Lys Gly Arg Gly Val Ala
    50                  55                  60
tgc ccc gag gtc atc aac tgg cag gag gaa cag gag ggt gca tgc ttg      240
Cys Pro Glu Val Ile Asn Trp Gln Glu Glu Gln Glu Gly Ala Cys Leu
65                  70                  75                  80
gtg ata acg gca att ccg gga gta ccg gcg gct gat ctg tct gga gcg      288
Val Ile Thr Ala Ile Pro Gly Val Pro Ala Ala Asp Leu Ser Gly Ala
                85                  90                  95
gat ttg ctc aaa gcg tgg ccg tca atg ggg cag caa ctt ggc gct gtt      336
Asp Leu Leu Lys Ala Trp Pro Ser Met Gly Gln Gln Leu Gly Ala Val
            100                 105                 110
cac agc cta tcg gtt gat caa tgt ccg ttt gag cgc agg ctg tcg cga      384
His Ser Leu Ser Val Asp Gln Cys Pro Phe Glu Arg Arg Leu Ser Arg
        115                 120                 125
atg ttc gga cgc gcc gtt gat gtg gtg tcc cgc aat gcc gtc aat ccc      432
Met Phe Gly Arg Ala Val Asp Val Val Ser Arg Asn Ala Val Asn Pro
    130                 135                 140
gac ttc tta ccg gac gag gac aag agt acg ccg ctg cac gat ctt ttg      480
Asp Phe Leu Pro Asp Glu Asp Lys Ser Thr Pro Leu His Asp Leu Leu
145                 150                 155                 160
gct cgt gtc gaa cga gag cta ccg gtg cgg ctc gac caa gag cgc acc      528
Ala Arg Val Glu Arg Glu Leu Pro Val Arg Leu Asp Gln Glu Arg Thr
                165                 170                 175
gat atg gtt gtt tgc cat ggt gat ccc tgc atg ccg aac ttc atg gtg      576
Asp Met Val Val Cys His Gly Asp Pro Cys Met Pro Asn Phe Met Val
            180                 185                 190
gac cct aaa act ctt caa tgc acg ggt ctg atc gac ctt ggg cgg ctc      624
Asp Pro Lys Thr Leu Gln Cys Thr Gly Leu Ile Asp Leu Gly Arg Leu
    195                     200                     205
gga aca gca gat cgc tat gcc gat ttg gca ctc atg att gct aac gcc      672
Gly Thr Ala Asp Arg Tyr Ala Asp Leu Ala Leu Met Ile Ala Asn Ala
    210                 215                 220
gaa gag aac tgg gca gcg cca gat gaa gca gag cgc gcc ttc gct gtc      720
Glu Glu Asn Trp Ala Ala Pro Asp Glu Ala Glu Arg Ala Phe Ala Val
225                 230                 235                 240
cta ttc aat gta ttg ggg atc gaa gcc ccc gac cgc gaa cgc ctt gcc      768
Leu Phe Asn Val Leu Gly Ile Glu Ala Pro Asp Arg Glu Arg Leu Ala
                245                 250                 255
ttc tat ctg cga ttg gac cct ctg act tgg ggt tga                      804
Phe Tyr Leu Arg Leu Asp Pro Leu Thr Trp Gly
            260                 265
<210>3
<211>267
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<400>3
Leu Asn Arg Thr Asn Ile Phe Phe Gly Glu Ser His Ser Asp Trp Leu
1               5                   10                  15
Pro Val Arg Gly Gly Glu Ser Gly Asp Phe Val Phe Arg Arg Gly Asp
            20                  25                  30
Gly His Ala Phe Ala Lys Ile Ala Pro Ala Ser Arg Arg Gly Glu Leu
        35                  40                  45
Ala Gly Glu Arg Asp Arg Leu Ile Trp Leu Lys Gly Arg Gly Val Ala
    50                  55                  60
Cys Pro Glu Val Ile Asn Trp Gln Glu Glu Gln Glu Gly Ala Cys Leu
65                  70                  75                  80
Val Ile Thr Ala Ile Pro Gly Val Pro Ala Ala Asp Leu Ser Gly Ala
                85                  90                  95
Asp Leu Leu Lys Ala Trp Pro Ser Met Gly Gln Gln Leu Gly Ala Val
            100                 105                 110
His Ser Leu Ser Val Asp Gln Cys Pro Phe Glu Arg Arg Leu Ser Arg
        115                 120                 125
Met Phe Gly Arg Ala Val Asp Val Val Ser Arg Asn Ala Val Asn Pro
    130                 135                 140
Asp Phe Leu Pro Asp Glu Asp Lys Ser Thr Pro Leu His Asp Leu Leu
145                 150                 155                 160
Ala Arg Val Glu Arg Glu Leu Pro Val Arg Leu Asp Gln Glu Arg Thr
                165                 170                 175
Asp Met Val Val Cys His Gly Asp Pro Cys Met Pro Asn Phe Met Val
            180                 185                 190
Asp Pro Lys Thr Leu Gln Cys Thr Gly Leu Ile Asp Leu Gly Arg Leu
        195                 200                 205
Gly Tnr Ala Asp Arg Tyr Ala Asp Leu Ala Leu Met Ile Ala Asn Ala
    210                 215                 220
Glu Glu Asn Trp Ala Ala Pro Asp Glu Ala Glu Arg Ala Phe Ala Val
225                 230                 235                 240
Leu Phe Asn Val Leu Gly Ile Glu Ala Pro Asp Arg Glu Arg Leu Ala
                245                 250                 255
Phe Tyr Leu Arg Leu Asp Pro Leu Thr Trp Gly
            260                 265
<210>4
<211>837
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(837)
<223>strB
<400>4
atg ttc atg ccg cct gtt ttt cct gct cat tgg cac gtt tcg caa cct       48
Met Phe Met Pro Pro Val Phe Pro Ala His Trp His Val Ser Gln Pro
1               5                   10                  15
gtt ctc att gcg gac acc ttt tcc agc ctc gtt tgg aaa gtt tca ttg       96
Val Leu Ile Ala Asp Thr Phe Ser Ser Leu Val Trp Lys Val Ser Leu
            20                  25                  30
cca gac ggg act cct gca atc gtc aag gga ttg aaa cct ata gaa gac       144
Pro Asp Gly Thr Pro Ala Ile Val Lys Gly Leu Lys Pro Ile Glu Asp
       35                   40                  45
att gct gat gaa ctg cgc ggg gcc gac tat ctg gta tgg cgc aat ggg       192
Ile Ala Asp Glu Leu Arg Gly Ala Asp Tyr Leu Val Trp Arg Asn Gly
    50                  55                  60
agg gga gca gtc cgg ttg ctc ggt cgt gag aac aat ctg atg ttg ctc       240
Arg Gly Ala Val Arg Leu Leu Gly Arg Glu Asn Asn Leu Met Leu Leu
65                  70                  75                  80
gaa tat gcc ggg gag cga atg ctc tct cac atc gtt gcc gag cac ggc      288
Glu Tyr Ala Gly Glu Arg Met Leu Ser His Ile Val Ala Glu His Gly
                85                  90                  95
gac tac cag gcg acc gaa att gca gcg gaa cta atg gcg aag ctg tat      336
Asp Tyr Gln Ala Thr Glu Ile Ala Ala Glu Leu Met Ala Lys Leu Tyr
            100                 105                 110
gcc gca tct gag gaa ccc ctg cct tct gcc ctt ctc ccg atc cgg gat      384
Ala Ala Ser Glu Glu Pro Leu Pro Ser Ala Leu Leu Pro Ile Arg Asp
        115                 120                 125
cgc ttt gca gct ttg ttt cag cgg gcg cgc gat gat caa aac gca ggt      432
Arg Phe Ala Ala Leu Phe Gln Arg Ala Arg Asp Asp Gln Asn Ala Gly
    130                 135                 140
tgt caa act gac tac gtc cac gcg gcg att ata gcc gat caa atg atg      480
Cys Gln Thr Asp Tyr Val His Ala Ala Ile Ile Ala Asp Gln Met Met
145                 150                 155                 160
agc aat gcc tcg gaa ctg cgt ggg cta cat ggc gat ctg cat cat gaa      528
Ser Asn Ala Set Glu Leu Arg Gly Leu His Gly Asp Leu His His Glu
                165                 170                 175
aac atc atg ttc tcc agt cgc ggc tgg ctg gtg ata gat ccc gtc ggt      576
Asn Ile Met Phe Ser Ser Arg Gly Trp Leu Val Ile Asp Pro Val Gly
            180                 185                 190
ctg gtc ggt gaa gtg ggc ttt ggc gcc gcc aat atg ttc tac gat ccg      624
Leu Val Gly Glu Val Gly Phe Gly Ala Ala Asn Met Phe Tyr Asp Pro
        195                200                 205
gct gac aga gac gac ctt tgt ctc gat cct aga cgc att gca cag atg      672
Ala Asp Arg Asp Asp Leu Cys Leu Asp Pro Arg Arg Ile Ala Gln Met
    210                 215                 220
gcg gac gca ttc tct cgt gcg ctg gac gtc gat ccg cgt cgc ctg ctc      720
Ala Asp Ala Phe Ser Arg Ala Leu Asp Val Asp Pro Arg Arg Leu Leu
225                 230                 235                 240
gac cag gcg tac gct tat ggg tgc ctt tcc gca gct tgg aac gcg gat      768
Asp Gln Ala Tyr Ala Tyr Gly Cys Leu Ser Ala Ala Trp Asn Ala Asp
                245                 250                 255
gga gaa gag gag caa cgc gat cta gct atc gcg gcc gcg atc aag cag      816
Gly Glu Glu Glu Gln Arg Asp Leu Ala Ile Ala Ala Ala Ile Lys Gln
            260                 265                 270
gtg cga cag acg tca tac tag                                          837
Val Arg Gln Thr Ser Tyr
        275
<210>5
<211>278
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<400>5
Met Phe Met Pro Pro Val Phe Pro Ala His Trp His Val Ser Gln Pro
1               5                   10                  15
Val Leu Ile Ala Asp Thr Phe Ser Ser Leu Val Trp Lys Val Ser Leu
            20                  25                  30
Pro Asp Gly Thr Pro Ala Ile Val Lys Gly Leu Lys Pro Ile Glu Asp
        35                  40                  45
Ile Ala Asp Glu Leu Arg Gly Ala Asp Tyr Leu Val Trp Arg Asn Gly
    50                  55                  60
Arg Gly Ala Val Arg Leu Leu Gly Arg Glu Asn Asn Leu Met Leu Leu
65                  70                  75                  80
Glu Tyr Ala Gly Glu Arg Met Leu Ser His Ile Val Ala Glu His Gly
            85                      90                  95
Asp Tyr Gln Ala Thr Glu Ile Ala Ala Glu Leu Met Ala Lys Leu Tyr
            100                 105                 110
Ala Ala Ser Glu Glu Pro Leu Pro Ser Ala Leu Leu Pro Ile Arg Asp
        115                 120                 125
Arg Phe Ala Ala Leu Phe Gln Arg Ala Arg Asp Asp Gln Asn Ala Gly
    130                 135             140
Cys Gln Thr Asp Tyr Val His Ala Ala Ile Ile Ala Asp Gln Met Met
145                 150             155                     160
Ser Asn Ala Ser Glu Leu Arg Gly Leu His Gly Asp Leu His His Glu
                165                 170                 175
Asn Ile Met Phe Ser Ser Arg Gly Trp Leu Val Ile Asp Pro Val Gly
            180                 185                 190
Leu Val Gly Glu Val Gly Phe Gly Ala Ala Asn Met Phe Tyr Asp Pro
        195                 200                 205
Ala Asp Arg Asp Asp Leu Cys Leu Asp Pro Arg Arg Ile Ala Gln Met
    210                 215                 220
Ala Asp Ala Phe Ser Arg Ala Leu Asp Val Asp Pro Arg Arg Leu Leu
225                 230                 235                 240
Asp Gln Ala Tyr Ala Tyr Gly Cys Leu Ser Ala Ala Trp Asn Ala Asp
                245                 250                 255
Gly Glu Glu Glu Gln Arg Asp Leu Ala Ile Ala Ala Ala Ile Lys Gln
            260                 265                 270
Val Arg Gln Thr Ser Tyr
        275
<210>6
<211>285
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(285)
<223>mobC
<400>6
atg gtt aag ggg agc aac aag gcg gcg gat egg ctg gcc aag ctc gaa    48
Met Val Lys Gly Ser Asn Lys Ala Ala Asp Arg Leu Ala Lys Leu Glu
1               5                   10                  15
gaa caa cga gcg cga atc aat gcc gaa att cag cgg gtg cgg gca agg    96
Glu Gln Arg Ala Arg Ile Asn Ala Glu Ile Gln Arg Val Arg Ala Arg
            20                  25                  30
gaa cag cag caa gag cgc aag aac gaa aca agg cgc aag gtg ctg gtg    144
Glu Gln Gln Gln Glu Arg Lys Asn Glu Thr Arg Arg Lys Val Leu Val
        35                  40                  45
ggg gcc atg att ttg gcc aag gtg aac agc agc gag tgg ccg gag gat    192
Gly Ala Met Ile Leu Ala Lys Val Asn Ser Ser Glu Trp Pro Glu Asp
    50                  55                  60
cgg ctc atg gcg gca atg gat gcg tac ctt gaa cgc gac cac gac cgc    240
Arg Leu Met Ala Ala Met Asp Ala Tyr Leu Glu Arg Asp His Asp Arg
65                  70                  75                  80
gcc ttg ttc ggt ctg ccg cca cgc cag aag gat gag ccg ggc tga        285
Ala Leu Phe Gly Leu Pro Pro Arg Gln Lys Asp Glu Pro Gly
                85                  90
<210>7
<211>94
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<400>7
Met Val Lys Gly Ser Asn Lys Ala Ala Asp Arg Leu Ala Lys Leu Glu
1               5                   10                  15
Glu Gln Arg Ala Arg Ile Asn Ala Glu Ile Gln Arg Val Arg Ala Arg
            20                  25                  30
Glu Gln Gln Gln Glu Arg Lys Asn Glu Thr Arg Arg Lys Val Leu Val
        35                  40                  45
Gly Ala Met Ile Leu Ala Lys Val Asn Ser Ser Glu Trp Pro Glu Asp
    50                  55                      60
Arg Leu Met Ala Ala Met Asp Ala Tyr Leu Glu Arg Asp His Asp Arg
65                  70                  75                  80
Ala Leu Phe Gly Leu Pro Pro Arg Gln Lys Asp Glu Pro Gly
                85                  90
<210>8
<211>2130
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(2130)
<223>mobA
<400>8
atg gcg att tat cac ctt acg gcg aaa acc ggc agc agg tcg ggc ggc    48
Met Ala Ile Tyr His Leu Thr Ala Lys Thr Gly Ser Arg Ser Gly Gly
1               5                   10                  15
caa tcg gcc agg gcc aag gcc gac tac atc cag cgc gaa ggc aag tat    96
Gln Ser Ala Arg Ala Lys Ala Asp Tyr Ile Gln Arg Glu Gly Lys Tyr
            20                    25                    30
gcc cgc gac atg gat gaa gtc ttg cac gcc gaa tcc ggg cac atg ccg    144
Ala Arg Asp Met Asp Glu Val Leu His Ala Glu Ser Gly His Met Pro
       35                    40                   45
gag ttc gtc gag cgg ccc gcc gac tac tgg gat gct gcc gac ctg tat    192
Glu Phe Val Glu Arg Pro Ala Asp Tyr Trp Asp Ala Ala Asp Leu Tyr
    50                  55                  60
gaa cgc gcc aat ggg cgg ctg ttc aag gag gtc gaa ttt gcc ctg ccg    240
Glu Arg Ala Asn Gly Arg Leu Phe Lys Glu Val Glu Phe Ala Leu Pro
65                  70                  75                 80
gtc gag ctg acc ctc gac cag cag aag gcg ctg gcg tcc gag ttc gcc    288
Val Glu Leu Thr Leu Asp Gln Gln Lys Ala Leu Ala Set Glu Phe Ala
                85                  90                  95
cag cac ctg acc ggt gcc gag cgc ctg ccg tat acg ctg gcc atc cat    336
Gln His Leu Thr Gly Ala Glu Arg Leu Pro Tyr Thr Leu Ala Ile His
            100                 105                 110
gcc ggt ggc ggc gag aac ccg cac tgc cac ctg atg atc tce gag cgg    384
Ala Gly Gly Gly Glu Asn Pro His Cys His Leu Met Ile Ser Glu Arg
        115                 120                 125
atc aat gac ggc atc gag cgg ccc gcc gct cag tgg ttc aag cgg tac    432
Ile Asn Asp Gly Ile Glu Arg Pro Ala Ala Gln Trp Phe Lys Arg Tyr
    130                 135                 140
aac ggc aag acc ccg gag aag ggc ggg gca cag aag acc gaa gcg ctc    480
Asn Gly Lys Thr Pro Glu Lys Gly Gly Ala Gln Lys Thr Glu Ala Leu
145                 150                 155                 160
aag ccc aag gca tgg ctt gag cag acc cgc gag gca tgg gcc gac cat     528
Lys Pro Lys Ala Trp Leu Glu Gln Thr Arg Glu Ala Trp Ala Asp His
                165                 170                 175
gcc aac cgg gca tta gag cgg gct ggc cac gac gcc cgc att gac cac     576
Ala Asn Arg Ala Leu Glu Arg Ala Gly His Asp Ala Arg Ile Asp His
            180                 185                 190
aga aca ctt gag gcg cag ggc atc gag cgc ctg ccc ggt gtt cac ctg     624
Arg Thr Leu Glu Ala Gln Gly Ile Glu Arg Leu Pro Gly Val His Leu
        195                 200                 205
ggg ccg aac gtg gtg gag atg gaa ggc cgg ggc atc cgc acc gac cgg     672
Gly Pro Asn Val Val Glu Met Glu Gly Arg Gly Ile Arg Thr Asp Arg
    210                 215                 220
gca gac gtg gcc ctg aac atc gac acc gcc aac gcc cag atc atc gac     720
Ala Asp ValAla Leu Asn Ile Asp Thr Ala Asn Ala Gln Ile Ile Asp
225                230                 235                 240
tta cag gaa tac cgg gag gca ata gac cat gaa cgc aat cga cag agt     768
Leu Gln Glu Tyr Arg Glu Ala Ile Asp His Glu Arg Asn Arg Gln Ser
                245                 250                 255
gaa gaa atc cag agg cat caa cga gtt agc gga gca gat cga acc gct     816
Glu Glu Ile Gln Arg His Gln Arg Val Ser Gly Ala Asp Arg Thr Ala
            260                 265                 270
ggc cca gag cat ggc gac act ggc cga cga agc ccg gca ggt cat gag     864
Gly Pro Glu His Gly Asp Thr Gly Arg Arg Ser Pro Ala Gly His Glu
        275                 280                 285
cca gac cca gca ggc cag cga ggc gca ggc ggc gga gtg gct gaa agc     912
Pro Asp Pro Ala Gly Gln Arg Gly Ala Gly Gly Gly Val Ala Glu Ser
    290                 295                 300
cca gcg cca gac agg ggc ggc atg ggt gga gct ggc caa aga gtt gcg     960
Pro Ala Pro Asp Arg Gly Gly Met Gly Gly Ala Gly Gln Arg Val Ala
305                 310                 315                 320
gga ggt agc cgc cga ggt gag cag cgc cgc gca gag cgc ccg gag cgc     1008
Gly Gly Ser Arg Arg Gly Glu Gln Arg Arg Ala Glu Arg Pro Glu Arg
                325                 330                 335
gtc gcg ggg gtg gca ctg gaa gct atg gct aac cgt gat gct ggc ttc     1056
Val Ala Gly Val Ala Leu Glu Ala Met Ala Asn Arg Asp Ala Gly Phe
            340                 345                 350
cat gat gcc tac ggt ggt gct gct gat cgc ate gtt gct ctt gct cga     1104
His Asp Ala Tyr Gly Gly Ala Ala Asp Arg Ile Val Ala Leu Ala Arg
        355                 360                 365
cct gac gcc act gac aac cga gga cgg ctc gat ctg gct gcg ctt ggt     1152
Pro Asp Ala Thr Asp Asn Arg Gly Arg Leu Asp Leu Ala Ala Leu Gly
    370                 375                     380
ggc ccg atg aag aac gac agg act ttg cag gcc ata ggc cga cag ctc     1200
Gly Pro Met Lys Asn Asp Arg Thr Leu Gln Ala Ile Gly Arg Gln Leu
385                 390                     395             400
aag gcc atg ggc tgt gag cgc ttc gat atc ggc gtc agg gac gcc acc     1248
Lys Ala Met Gly Cys Glu Arg Phe Asp Ile Gly Val Arg Asp Ala Thr
                405                     410             415
Vac ggc cag atg atg aac cgg gaa tgg tca gcc gcc gaa gtg ctc cag     1296
Thr Gly Gln Met Met Asn Arg Glu Trp Ser Ala Ala Glu Val Leu Gln
            420                 425                 430
aac acg cca tgg ctc aag cgg atg aat gcc cag ggc aat gac gtg tat     1344
Asn Thr Pro Trp Leu Lys Arg Met Asn Ala Gln Gly Asn Asp Val Tyr
        435                 440                 445
atc agg ccc gcc gag cag gag cgg cat ggt ctg gtg ctg gtg gac gac     1392
Ile Arg Pro Ala Glu Gln Glu Arg His Gly Leu Val Leu Val Asp Asp
    450                 455                 460
ctc agc gag ttt gac ctg gat gac atg aaa gcc gag ggc cgg gag cct     1440
Leu Ser Glu Phe Asp Leu Asp Asp Met Lys Ala Glu Gly Arg Glu Pro
465                 470                 475                 480
gcc ctg gta gtg gaa acc agc ccg aag aac tat cag gca tgg gtc aag     1488
Ala Leu Val Val Glu Thr Ser Pro Lys Asn Tyr Gln Ala Trp Val Lys
                485                 490                 495
gtg gcc gac gcc gca ggc ggt gaa ctt cgg ggg cag att gcc cgg acg     1536
Val Ala Asp Ala Ala Gly Gly Glu Leu Arg Gly Gln Ile Ala Arg Thr
            500                 505                 510
ctg gcc agc gag tac gac gcc gac ccg gcc agc gcc gac agc cgc cac      1584
Leu Ala Ser Glu Tyr Asp Ala Asp Pro Ala Ser Ala Asp Ser Arg His
        515                 520                 525
tat ggc cgc ttg gcg ggc ttc acc aac cgc aag gac aag cac acc acc     1632
Tyr Gly Arg Leu Ala Gly Phe Thr Asn Arg Lys Asp Lys His Thr Thr
    530                 535                 540
cgc gcc ggt tat cag ccg tgg gtg ctg ctg cgt gaa tcc aag ggc aag     1680
Arg Ala Gly Tyr Gln Pro Trp Val Leu Leu Arg Glu Ser Lys Gly Lys
545                 550                 555                 560
acc gcc acc gct ggc ccg gcg ctg gtg cag cag gct ggc cag cag atc     1728
Thr Ala Thr Ala Gly Pro Ala Leu Val Gln Gln Ala Gly Gln Gln Ile
                565                 570                 575
gag cag gcc cag cgg cag cag gag aag gcc cgc agg ctg gcc agc ctc     1776
Glu Gln Ala Gln Arg Gln Gln Glu Lys Ala Arg Arg Leu Ala Ser Leu
            580                 585                 590
gaa ctg ccc gag cgg cag ctt agc cgc cac cgg cgc acg gcg ctg gac     1824
Glu Leu Pro Glu Arg Gln Leu Ser Arg His Arg Arg Thr Ala Leu Asp
        595                 600                 605
gag tac cgc agc gag atg gcc ggg ctg gtc aag cgc ttc ggt gat gac     1872
Glu Tyr Arg Ser Glu Met Ala Gly Leu Val Lys Arg Phe Gly Asp Asp
    610                 615                 620
ctc agc aag tgc gac ttt atc gcc gcg cag aag ctg gcc agc cgg ggc     1920
Leu Ser Lys Cys Asp Phe Ile Ala Ala Gln Lys Leu Ala Ser Arg Gly
625                 630                 635                 640
cgc agt gcc gag gaa atc ggc aag gcc atg gcc gag gcc agc cca gcg     1968
Arg Ser Ala Glu Glu Ile Gly Lys Ala Met Ala Glu Ala Ser Pro Ala
                645                 650                 655
ctg gca gag cgc aag ccc ggc cac gaa gcg gat tac atc gag cgc acc     2016
Leu Ala Glu Arg Lys Pro Gly His Glu Ala Asp Tyr Ile Glu Arg Thr
            660                 665                 670
gtc agc aag gtc atg ggt ctg ccc agc gtc cag ctt gcg cgg gcc gag     2064
Val Ser Lys Val Met Gly Leu Pro Ser Val Gln Leu Ala Arg Ala Glu
        675                 680                 685
ctg gca cgg gca ccg gca ccc cgc cag cga ggc atg gac agg ggc ggg     2112
Leu Ala Arg Ala Pro Ala Pro Arg Gln Arg Gly Met Asp Arg Gly Gly
    690                 695                 700
cca gat ttc agc atg tag                                             2130
Pro Asp Phe Ser Met
705
<210>9
<211>709
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<400>9
Met Ala Ile Tyr His Leu Thr Ala Lys Thr Gly Ser Arg Ser Gly Gly
1               5                   10                  15
Gln Ser Ala Arg Ala Lys Ala Asp Tyr Ile Gln Arg Glu Gly Lys Tyr
            20                  25                  30
Ala Arg Asp Met Asp Glu Val Leu His Ala Glu Ser Gly His Met Pro
        35                  40                  45
Glu Phe Val Glu Arg Pro Ala Asp Tyr Trp Asp Ala Ala Asp Leu Tyr
    50                  55                  60
Glu Arg Ala Asn Gly Arg Leu Phe Lys Glu Val Glu Phe Ala Leu Pro
65                  70                  75                  80
Val Glu Leu Thr Leu Asp Gln Gln Lys Ala Leu Ala Ser Glu Phe Ala
                85                  90                  95
Gln His Leu Thr Gly Ala Glu Arg Leu Pro Tyr Thr Leu Ala Ile His
            100                 105                 110
Ala Gly Gly Gly Glu Asn Pro His Cys His Leu Met Ile Ser Glu Arg
        115                 120                 125
Ile Asn Asp Gly Ile Glu Arg Pro Ala Ala Gln Trp Phe Lys Arg Tyr
    130                 135                 140
Asn Gly Lys Thr Pro Glu Lys Gly Gly Ala Gln Lys Thr Glu Ala Leu
145                 150                 155                 160
Lys Pro Lys Ala Trp Leu Glu Gln Thr Arg Glu Ala Trp Ala Asp His
                165                 170                 175
Ala Asn Arg Ala Leu Glu Arg Ala Gly His Asp Ala Arg Ile Asp His
            180                 185                 190
Arg Thr Leu Glu Ala Gln Gly Ile Glu Arg Leu Pro Gly Val His Leu
        195                 200                 205
Gly Pro Asn Val Val Glu Met Glu Gly Arg Gly Ile Arg Thr Asp Arg
    210                 215                  220
Ala Asp Val Ala Leu Asn Ile Asp Thr Ala Asn Ala Gln Ile Ile Asp
225                 230                 235                 240
Leu Gln Glu Tyr Arg Glu Ala Ile Asp His Glu Arg Asn Arg Gln Ser
                245                 250                 255
Glu Glu Ile Gln Arg His Gln Arg Val Ser Gly Ala Asp Arg Thr Ala
            260                 265                 270
Gly Pro Glu His Gly Asp Thr Gly Arg Arg Ser Pro Ala Gly His Glu
        275                 280                 285
Pro Asp Pro Ala Gly Gln Arg Gly Ala Gly Gly Gly Val Ala Glu Ser
    290                 295                 300
Pro Ala Pro Asp Arg Gly Gly Met Gly Gly Ala Gly Gln Arg Val Ala
305                 310                 315                 320
Gly Gly Ser Arg Arg Gly Glu Gln Arg Arg Ala Glu Arg Pro Glu Arg
                325                 330                 335
Val Ala Gly Val Ala Leu Glu Ala Met Ala Asn Arg Asp Ala Gly Phe
            340                 345                 350
His Asp Ala Tyr Gly Gly Ala Ala Asp Arg Ile Val Ala Leu Ala Arg
        355                 360                 365
Pro Asp Ala Thr Asp Asn Arg Gly Arg Leu Asp Leu Ala Ala Leu Gly
    370                 375                 380
Gly Pro Met Lys Asn Asp Arg Thr Leu Gln Ala Ile Gly Arg Gln Leu
385                 390                 395                 400
Lys Ala Met Gly Cys Glu Arg Phe Asp Ile Gly Val Arg Asp Ala Thr
                405                 410                 415
Thr Gly Gln Met Met Asn Arg Glu Trp Ser Ala Ala Glu Val Leu Gln
            420                 425                 430
Asn Thr Pro Trp Leu Lys Arg Met Asn Ala Gln Gly Asn Asp Val Tyr
        435                 440                 445
Ile Arg Pro Ala Glu Gln Glu Arg His Gly Leu Val Leu Val Asp Asp
    450                 455                 460
Leu Ser Glu Phe Asp Leu Asp Asp Met Lys Ala Glu Gly Arg Glu Pro
465                 470                 475                 480
Ala Leu Val Val Glu Thr Ser Pro Lys Asn Tyr Gln Ala Trp Val Lys
                485                 490                 495
Val Ala Asp Ala Ala Gly Gly Glu Leu Arg Gly Gln Ile Ala Arg Thr
            500                 505                 510
Leu Ala Ser Glu Tyr Asp Ala Asp Pro Ala Ser Ala Asp Ser Arg His
        515                 520                 525
Tyr Gly Arg Leu Ala Gly Phe Thr Asn Arg Lys Asp Lys His Thr Thr
    530                 535                 540
Arg Ala Gly Tyr Gln Pro Trp Val Leu Leu Arg Glu Ser Lys Gly Lys
545                 550                 555                 560
Thr Ala Thr Ala Gly Pro Ala Leu Val Gln Gln Ala Gly Gln Gln Ile
                565                 570                 575
Glu Gln Ala Gln Arg Gln Gln Glu Lys Ala Arg Arg Leu Ala Ser Leu
            580                 585                 590
Glu Leu Pro Glu Arg Gln Leu Ser Arg His Arg Arg Thr Ala Leu Asp
        595                 600                 605
Glu Tyr Arg Ser Glu Met Ala Gly Leu Val Lys Arg Phe Gly Asp Asp
    610                 615                 620
Leu Ser Lys Cys Asp Phe Ile Ala Ala Gln Lys Leu Ala Ser Arg Gly
625                 630                 635                 640
Arg Ser Ala Glu Glu Ile Gly Lys Ala Met Ala Glu Ala Ser Pro Ala
                645                 650                 655
Leu Ala Glu Arg Lys Pro Gly His Glu Ala Asp Tyr Ile Glu Arg Thr
            660                 665                 670
Val Ser Lys Val Met Gly Leu Pro Ser Val Gln Leu Ala Arg Ala Glu
        675                 680                 685
Leu Ala Arg Ala Pro Ala Pro Arg Gln Arg Gly Met Asp Arg Gly Gly
    690                 695                 700
Pro Asp Phe Ser Met
705
<210>10
<211>414
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(414)
<223>mobB
<400>10
atg aac gca ate gac aga gtg aag aaa tcc aga ggc ate aac gag tta    48
Met Asn Ala Ile Asp Arg Val Lys Lys Ser Arg Gly Ile Asn Glu Leu
1               5                   10                  15
gcg gag cag atc gaa ccg ctg gcc cag agc atg gcg aca ctg gcc gac    96
Ala Glu Gln Ile Glu Pro Leu Ala Gln Ser Met Ala Thr Leu Ala Asp
            20                  25                  30
gaa gcc cgg cag gtc atg agc cag acc cag cag gcc agc gag gcg cag    144
Glu Ala Arg Gln Val Met Ser Gln Thr Gln Gln Ala Ser Glu Ala Gln
        35                  40                  45
gcg gcg gag tgg ctg aaa gcc cag cgc cag aca ggg gcg gca tgg gtg    192
Ala Ala Glu Trp Leu Lys Ala Gln Arg Gln Thr Gly Ala Ala Trp Val
    50                  55                  60
gag ctg gcc aaa gag ttg cgg gag gta gcc gcc gag gtg agc agc gcc    240
Glu Leu Ala Lys Glu Leu Arg Glu Val Ala Ala Glu Val Ser Ser Ala
65                  70                  75                  80
gcg cag agc gcc cgg agc gcg tcg cgg ggg tgg cac tgg aag cta tgg    288
Ala Gln Ser Ala Arg Ser Ala Ser Arg Gly Trp His Trp Lys Leu Trp
                85                  90                  95
cta acc gtg atg ctg gct tcc atg atg cct acg gtg gtg ctg ctg atc    336
Leu Thr Val Met Leu Ala Ser Met Met Pro Thr Val Val Leu Leu Ile
            100                 105                 110
gca tcg ttg ctc ttg ctc gac ctg acg cca ctg aca acc gag gac ggc    384
Ala Ser Leu Leu Leu Leu Asp Leu Thr Pro Leu Thr Thr Glu Asp Gly
        115                 120                 125
tcg atc tgg ctg cgc ttg gtg gcc cga tga                            414
Ser Ile Trp Leu Arg Leu Val Ala Arg
    130                 135
<210>11
<211>137
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<400>11
Met Asn Ala Ile Asp Arg Val Lys Lys Ser Arg Gly Ile Asn Glu Leu
1               5                   10                  15
Ala Glu Gln Ile Glu Pro Leu Ala Gln Ser Met Ala Thr Leu Ala Asp
            20                  25                  30
Glu Ala Arg Gln Val Met Ser Gln Thr Gln Gln Ala Ser Glu Ala Gln
        35                  40                  45
Ala Ala Glu Trp Leu Lys Ala Gln Arg Gln Thr Gly Ala Ala Trp Val
    50                  55                  60
Glu Leu Ala Lys Glu Leu Arg Glu Val Ala Ala Glu Val Ser Ser Ala
65                  70                  75                  80
Ala Gln Ser Ala Arg Ser Ala Ser Arg Gly Trp His Trp Lys Leu Trp
                85                  90                  95
Leu Thr Val Met Leu Ala Ser Met Met Pro Thr Val Val Leu Leu Ile
            100                 105                 110
Ala Ser Leu Leu Leu Leu Asp Leu Thr Pro Leu Thr Thr Glu Asp Gly
        115                 120                 125
Ser Ile Trp Leu Arg Leu Val Ala Arg
    130                 135
<210>12
<211>972
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(972)
<223>repB
<400>12
atg aag aac gac agg act ttg cag gcc ata ggc cga cag ctc aag gcc      48
Met Lys Asn Asp Arg Thr Leu Gln Ala Ile Gly Arg Gln Leu Lys Ala
1               5                   10                  15
atg ggc tgt gag cgc ttc gat atc ggc gtc agg gac gcc acc acc ggc      96
Met Gly Cys Glu Arg Phe Asp Ile Gly Val Arg Asp Ala Thr Thr Gly
            20                  25                  30
cag atg atg aac cgg gaa tgg tca gcc gcc gaa gtg ctc cag aac acg      144
Gln Met Met Asn Arg Glu Trp Ser Ala Ala Glu Val Leu Gln Asn Thr
        35                  40                  45
cca tgg ctc aag cgg atg aat gcc cag ggc aat gac gtg tat atc agg      192
Pro Trp Leu Lys Arg Met Asn Ala Gln Gly Asn Asp Val Tyr Ile Arg
    50                  55                  60
ccc gcc gag cag gag cgg cat ggt ctg gtg ctg gtg gac gac ctc agc      240
Pro Ala Glu Gln Glu Arg His Gly Leu Val Leu Val Asp Asp Leu Ser
65                  70                  75                  80
gag ttt gac ctg gat gac atg aaa gcc gag ggc cgg gag cct gcc ctg      288
Glu Phe Asp Leu Asp Asp Met Lys Ala Glu Gly Arg Glu Pro Ala Leu
                85                  90                  95
gta gtg gaa acc agc ccg aag aac tat cag gca tgg gtc aag gtg gcc      336
Val Val Glu Thr Ser Pro Lys Asn Tyr Gln Ala Trp Val Lys Val Ala
            100                 105                 110
gac gcc gca ggc ggt gaa ctt cgg ggg cag att gcc cgg acg ctg gcc      384
Asp Ala Ala Gly Gly Glu Leu Arg Gly Gln Ile Ala Arg Thr Leu Ala
       115                  120                 125
agc gag tac gac gcc gac ccg gcc agc gcc gac agc cgc cac tat ggc      432
Ser Glu Tyr Asp Ala Asp Pro Ala Ser Ala Asp Ser Arg His Tyr Gly
    130                 135                 140
cgc ttg gcg ggc ttc acc aac cgc aag gac aag cac acc acc cgc gcc      480
Arg Leu Ala Gly Phe Thr Asn Arg Lys Asp Lys His Thr Thr Arg Ala
145                 150                 155                 160
ggt tat cag ccg tgg gtg ctg ctg cgt gaa tcc aag ggc aag acc gcc      528
Gly Tyr Gln Pro Trp Val Leu Leu Arg Glu Ser Lys Gly Lys Thr Ala
                165                 170                 175
acc gct ggc ccg gcg ctg gtg cag cag gct ggc cag cag atc gag cag      576
Thr Ala Gly Pro Ala Leu Val Gln Gln Ala Gly Gln Gln Ile Glu Gln
            180                 185                 190
gcc cag cgg cag cag gag aag gcc cgc agg ctg gcc agc ctc gaa ctg      624
Ala Gln Arg Gln Gln Glu Lys Ala Arg Arg Leu Ala Ser Leu Glu Leu
        195                 200                 205
ccc gag cgg cag ctt agc cgc cac cgg cgc acg gcg ctg gac gag tac      672
Pro Glu Arg Gln Leu Ser Arg His Arg Arg Thr Ala Leu Asp Glu Tyr
    210                 215                 220
cgc agc gag atg gcc ggg ctg gtc aag cgc ttc ggt gat gac ctc agc      720
Arg Ser Glu Met Ala Gly Leu ValLys Arg Phe Gly Asp Asp Leu Ser
225                 230                235                 240
aag tgc gac ttt atc gcc gcg cag aag etg gcc agc cgg ggc cgc agt      768
Lys Cys Asp Phe Ile Ala Ala Gln Lys Leu Ala Ser Arg Gly Arg Ser
                245                 250                 255
gcc gag gaa atc ggc aag gcc atg gcc gag gcc agc cca gcg ctg gca      816
Ala Glu Glu Ile Gly Lys Ala Met Ala Glu Ala Ser Pro Ala Leu Ala
            260                 265                 270
gag cgc aag ccc ggc cac gaa gcg gat tac atc gag cgc acc gtc agc      864
Glu Arg Lys Pro Gly His Glu Ala Asp Tyr Ile Glu Arg Thr Val Ser
        275                 280                 285
aag gtc atg ggt ctg ccc agc gtc cag ctt gcg cgg gcc gag ctg gca      912
Lys Val Met Gly Leu Pro Ser Val Glm Leu Ala Arg Ala Glu Leu Ala
    290                 295                 300
cgg gca ccg gca ccc cgc cag cga ggc atg gac agg ggc ggg cca gat      960
Arg Ala Pro Ala Pro Arg Gln Arg Gly Met Asp Arg Gly Gly Pro Asp
305                 310                 315                 320
ttc agc atg tag                                                      972
Phe Ser Met
<210>13
<211>323
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<400>13
Met Lys Asn Asp Arg Thr Leu Gln Ala Ile Gly Arg Gln Leu Lys Ala
1               5                   10                  15
Met Gly Cys Glu Arg Phe Asp Ile Gly Val Arg Asp Ala Thr Thr Gly
            20                  25                   30
Gln Met Met Asn Arg Glu Trp Ser Ala Ala Glu Val Leu Gln Asn Thr
        35                  40                  45
Pro Trp Leu Lys Arg Met Asn Ala Gln Gly Asn Asp Val Tyr Ile Arg
     50                 55                  60
Pro Ala Glu Gln Glu Arg His Gly Leu Val Leu Val Asp Asp Leu Ser
65                  70                  75                  80
Glu Phe Asp Leu Asp Asp Met Lys Ala Glu Gly Arg Glu Pro Ala Leu
                85                  90                  95
Val Val Glu Thr Ser Pro Lys Asn Tyr Gln Ala Trp Val Lys Val Ala
            100                 105                 110
Asp Ala Ala Gly Gly Glu Leu Arg Gly Gln Ile Ala Arg Thr Leu Ala
        115                 120                 125
Ser Glu Tyr Asp Ala Asp Pro Ala Ser Ala Asp Ser Arg His Tyr Gly
    130                 135                 140
Arg Leu Ala Gly Phe Thr Asn Arg Lys Asp Lys His Thr Thr Arg Ala
145                 150                 155                 160
Gly Tyr Gln Pro Trp Val Leu Leu Arg Glu Ser Lys Gly Lys Thr Ala
                165                 170                 175
Thr Ala Gly Pro Ala Leu Val Gln Gln Ala Gly Gln Gln Ile Glu Gln
            180                 185                 190
Ala Gln Arg Gln Gln Glu Lys Ala Arg Arg Leu Ala Ser Leu Glu Leu
        195                 200                 205
Pro Glu Arg Gln Leu Ser Arg His Arg Arg Thr Ala Leu Asp Glu Tyr
    210                 215                 220
Arg Ser Glu Met Ala Gly Leu Val Lys Arg Phe Gly Asp Asp Leu Ser
225                 230                235                 240
Lys Cys Asp Phe Ile Ala Ala Gln Lys Leu Ala Ser Arg Gly Arg Ser
                245                 250                 255
Ala Glu Glu Ile Gly Lys Ala Met Ala Glu Ala Ser Pro Ala Leu Ala
            260                 265                 270
Glu Arg Lys Pro Gly His Glu Ala Asp Tyr Ile Glu Arg Thr Val Ser
        275                 280                 285
Lys Val Met Gly Leu Pro Ser Val Gln Leu Ala Arg Ala Glu Leu Ala
    290                 295                 300
Arg Ala Pro Ala Pro Arg Gln Arg Gly Met Asp Arg Gly Gly Pro Asp
305                 310                 315                 320
Phe Ser Met
<210>14
<211>213
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(213)
<223>orfE
<400>14
atg gaa tac gaa aaa agc gct tea ggg tcg gtc tac ctg atc aaa agt      48
Met Glu Tyr Glu Lys Ser Ala Ser Gly Ser Val Tyr Leu Ile Lys Ser
1               5                   10                  15
gac aag ggc tat tgg ttg ccc ggt ggc ttt ggt tat acg tca aac aag      96
Asp Lys Gly Tyr Trp Leu Pro Gly Gly Phe Gly Tyr Thr Ser Asn Lys
            20                  25                  30
gcc gag gct ggc cgc ttt tca gtc gct gat atg gcc agc ctt aac ctt      144
Ala Glu Ala Gly Arg Phe Ser Val Ala Asp Met Ala Ser Leu Asn Leu
        35                  40                  45
gac ggc tgc acc ttg tcc ttg ttc cgc gaa gac aag cct ttc ggc ccc     192
Asp Gly Cys Thr Leu Ser Leu Phe Arg Glu Asp Lys Pro Phe Gly Pro
    50                  55                  60
ggc aag ttt ctc ggt gac tga                                         213
Gly Lys Phe Leu Gly Asp
65                  70
<210>15
<211>70
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<400>15
Met Glu Tyr Glu Lys Ser Ala Ser Gly Ser Val Tyr Leu Ile Lys Ser
1               5                   10                  15
Asp Lys Gly Tyr Trp Leu Pro Gly Gly Phe Gly Tyr Thr Ser Asn Lys
            20                  25                  30
Ala Glu Ala Gly Arg Phe Ser Val Ala Asp Met Ala Ser Leu Asn Leu
        35                  40                  45
Asp Gly Cys Thr Leu Ser Leu Phe Arg Glu Asp Lys Pro Phe Gly Pro
    50                  55                  60
Gly Lys Phe Leu Gly Asp
65                  70
<210>16
<211>207
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(207)
<223>orfF
<400>16
atg aaa gac caa aag gac aag cag acc ggc gac ctg ctg gcc agc cct    48
Met Lys Asp Gln Lys Asp Lys Gln Thr Gly Asp Leu Leu Ala Ser Pro
1               5                   10                  15
gac gct gta cgc caa gcg cga tat gcc gag cgc atg aag gcc aaa ggg    96
Asp Ala Val Arg Gln Ala Arg Tyr Ala Glu Arg Met Lys Ala Lys Gly
            20                  25                  30
atg cgt cag cgc aag ttc tgg ctg acc gac gac gaa tac gag gcg ctg    144
Met Arg Gln Arg Lys Phe Trp Leu Thr Asp Asp Glu Tyr Glu Ala Leu
        35                  40                  45
cgc gag tgc ctg gaa gaa ctc aga gcg gcg cag ggc ggg ggt agt gac    192
Arg Glu Cys Leu Glu Glu Leu Arg Ala Ala Gln Gly Gly Gly Ser Asp
    50                  55                  60
ccc gcc agc gcc taa                                                  207
Pro Ala Ser Ala
65
<210>17
<211>68
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<400>17
Met Lys Asp Gln Lys Asp Lys Gln Thr Gly Asp Leu Leu Ala Ser Pro
1               5                   10                  15
Asp Ala Val Arg Gln Ala Arg Tyr Ala Glu Arg Met Lys Ala Lys Gly
            20                  25                  30
Met Arg Gln Arg Lys Phe Trp Leu Thr Asp Asp Glu Tyr Glu Ala Leu
        35                  40                  45
Arg Glu Cys Leu Glu Glu Leu Arg Ala Ala Gln Gly Gly Gly Ser Asp
    50                  55                  60
Pro Ala Ser Ala
65
<210>18
<211>840
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(840)
<223>repA
<400>18
atg gct acc cat aag cct atc aat att ctg gag gcg ttc gca gca gcg      48
Met Ala Thr His Lys Pro Ile Asn Ile Leu Glu Ala Phe Ala Ala Ala
1               5                   10                  15
ccg cca ccg ctg gac tac gtt ttg ccc aac atg gtg gcc ggt acg gtc      96
Pro Pro Pro Leu Asp Tyr Val Leu Pro Asn Met Val Ala Gly Thr Val
            20                  25                  30
ggg gcg ctg gtg tcg ccc ggt ggt gcc ggt aaa tcc atg ctg gcc ctg      144
Gly Ala Leu Val Ser Pro Gly Gly Ala Gly Lys Ser Met Leu Ala Leu
        35                  40                  45
caa ctg gcc gca cag att gca ggc ggg ccg gat ctg ctg gag gtg ggc      192
Gln Leu Mla Ala Gln Ile Ala Gly Gly Pro Asp Leu Leu Glu Val Gly
    50                  55                  60
gaa ctg ccc acc ggc ccg gtg atc tac ctg ccc gcc gaa gac ccg ccc      240
Glu Leu Pro Thr Gly Pro Val Ile Tyr Leu Pro A1a Glu Asp Pro Pro
65                  70                  75                  80
acc gcc att cat cac cgc ctg cac gcc ctt ggg gcg cac ctc agc gcc      288
Thr Ala Ile His His Arg Leu His Ala Leu Gly Ala His Leu Ser Ala
                85                  90                  95
gag gaa cgg caa gcc gtg gct gac ggc ctg ctg atc cag ccg ctg atc      336
Glu Glu Arg Gln Mla Val Ala Asp Gly Leu Leu Ile Gln Pro Leu Ile
            100                 105                 110
ggc agc ctg ccc aac atc atg gcc ccg gag tgg ttc gac ggc ctc aag      384
Gly Ser Leu Pro Asn Ile Met Ala Pro Glu Trp Phe Asp Gly Leu Lys
        115                 120                 125
cgc gcc gcc gag ggc cgc cgc ctg atg gtg ctg gac acg ctg cgc cgg      432
Arg Ala Ala Glu Gly Arg Arg Leu Met Val Leu Asp Thr Leu Arg Arg
    130                 135                 140
ttc cac atc gag gaa gaa aac gcc agc ggc ccc atg gcc cag gtc atc      480
Phe His Ile Glu Glu Glu Asn Ala Ser Gly Pro Met Ala Gln Val Ile
145                 150                 155                 160
ggt cgc atg gag gcc atc gcc gcc gat acc ggg tgc tct atc gtg ttc      528
Gly Arg Met Glu Ala Ile Ala Ala Asp Thr Gly Cys Ser Ile Val Phe
                165                 170                 175
ctg cac cat gcc agc aag ggc gcg gcc atg atg ggc gca ggc gac cag      576
Leu His His Ala Ser Lys Gly Ala Ala Met Met Gly Ala Gly Asp Gln
            180                 185                 190
cag cag gcc age cgg ggc agc tcg gta ctg gtc gat aac atc cgc tgg      624
Gln Gln Ala Ser Arg Gly Ser Ser Val Leu Val Asp Asn Ile Arg Trp
        195                 200                 205
cag tcc tac ctg tcg agc atg acc agc gcc gag gcc gag gaa tgg ggt      672
Gln Ser Tyr Leu Ser Ser Met Thr Ser Ala Glu Ala Glu Glu Trp Gly
    210                 215                 220
gtg gac gac gac cag cgc cgg ttc ttc gtc cgc ttc ggt gtg agc aag      720
Val Asp Asp Asp Gln Arg Arg Phe Phe Val Arg Phe Gly Val Set Lys
225                 230                 235                 240
gcc aac tat ggc gca ccg ttc gct gat cgg tgg ttc agg cgg cat gac      768
Ala Asn Tyr Gly Ala Pro Phe Ala Asp Arg Trp Phe Arg Arg His Asp
                245                 250                 255
ggc ggg gtg ctc aag ccc gcc gtg ctg gag agg cag cgc aag agc aag      816
Gly Gly Val Leu Lys Pro Ala Val Leu Glu Arg Gln Arg Lys Ser Lys
            260                 265                 270
ggg gtg ccc cgt ggt gaa gcc taa                                      840
Gly Val Pro Arg Gly Glu Ala
        275
<210>19
<211>279
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<400>19
Met Ala Thr His Lys Pro Ile Asn Ile Leu Glu Ala Phe Ala Ala Ala
1               5                   10                  15
Pro Pro Pro Leu Asp Tyr Val Leu Pro Asn Met Val Ala Gly Thr Val
            20                  25                  30
Gly Ala Leu Val Ser Pro Gly Gly Ala Gly Lys Ser Met Leu Ala Leu
        35                  40                  45
Gln Leu Ala Ala Gln Ile Ala Gly Gly Pro Asp Leu Leu Glu Val Gly
    50                  55                  60
Glu Leu Pro Thr Gly Pro Val Ile Tyr Leu Pro Ala Glu Asp Pro Pro
65                  70                  75                  80
Thr Ala Ile His His Arg Leu His Ala Leu Gly Ala His Leu Ser Ala
                85                  90                  95
Glu Glu Arg Gln Ala Val Ala Asp Gly Leu Leu Ile Gln Pro Leu Ile
            100                 105                 110
Gly Ser Leu Pro Asn Ile Met Ala Pro Glu Trp Phe Asp Gly Leu Lys
        115                 120                 125
Arg Ala Ala Glu Gly Arg Arg Leu Met Val Leu Asp Thr Leu Arg Arg
    130                 135                 140
Phe His Ile Glu Glu Glu Asn Ala Ser Gly Pro Met Ala Gln Val Ile
145                 150                 155                 160
Gly Arg Met Glu Ala Ile Ala Ala Asp Thr Gly Cys Ser Ile Val Phe
                165                 170                 175
Leu His His Ala Ser Lys Gly Ala Ala Met Met Gly Ala Gly Asp Gln
            180                 185                 190
Gln Gln Ala Ser Arg Gly Ser Ser Val Leu Val Asp Asn Ile Arg Trp
        195                 200                 205
Gln Ser Tyr Leu Ser Ser Met Thr Ser Ala Glu Ala Glu Glu Trp Gly
    210                 215                 220
Val Asp Asp Asp Gln Arg Arg Phe Phe Val Arg Phe Gly Val Ser Lys
225                 230                 235                 240
Ala Asn Tyr Gly Ala Pro Phe Ala Asp Arg Trp Phe Arg Arg His Asp
                245                 250                 255
Gly Gly Val Leu Lys Pro Ala Val Leu Glu Arg Gln Arg Lys Ser Lys
            260                 265                 270
Gly Val Pro Arg Gly Glu Ala
        275
<210>20
<211>852
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(852)
<223>repC
<400>20
gtg gtg aag cct aag aac aag cac agc ctc agc cac gtc cgg cac gac      48
Val Val Lys Pro Lys Asn Lys His Ser Leu Ser His Val Arg His Asp
1               5                   10                  15
ccg gcg cac tgt ctg gcc ccc ggc ctg ttc cgt gcc ctc aag cgg ggc      96
Pro Ala His Cys Leu Ala Pro Gly Leu Phe Arg Ala Leu Lys Arg Gly
            20                  25                  30
gag cgc aag cgc agc aag ctg gac gtg acg tat gac tac ggc gac ggc      144
Glu Arg Lys Arg Ser Lys Leu Asp Val Thr Tyr Asp Tyr Gly Asp Gly
        35                  40                  45
aag cgg atc gag ttc agc ggc ccg gag ccg ctg ggc gct gat gat ctg      192
Lys Arg Ile Glu Phe Ser Gly Pro Glu Pro Leu Gly Ala Asp Asp Leu
    50                  55                  60
cgc atc ctg caa ggg ctg gtg gcc atg gct ggg cct aat ggc cta gtg      240
Arg Ile Leu Gln Gly Leu Val Ala Met Ala Gly Pro Asn Gly Leu Val
65                  70                  75                  80
ctt ggc ccg gaa ccc aag acc gaa ggc gga cgg cag ctc egg ctg ttc      288
Leu Gly Pro Glu Pro Lys Thr Glu Gly Gly Arg Gln Leu Arg Leu Phe
                85                  90                  95
ctg gaa ccc aag tgg gag gcc gtc acc gct gaa tgc cat gtg gtc aaa      336
Leu Glu Pro Lys Trp Glu Ala Val Thr Ala Glu Cys His Val Val Lys
            100                 105                 110
ggt agc tat cgg gcg ctg gca aag gaa atc ggg gca gag gte gat agt      384
Gly Ser Tyr Arg Ala Leu Ala Lys Glu Ile Gly Ala Glu Val Asp Ser
        115                 120                 125
ggt ggg gcg ctc aag cac ata cag gac tgc atc gag cgc ctt tgg aag      432
Gly Gly Ala Leu Lys His Ile Gln Asp Cys Ile Glu Arg Leu Trp Lys
    130                 135                 140
gta tcc atc atc gcc cag aat ggc cgc aag cgg cag ggg ttt cgg ctg      480
Val Ser Ile Ile Ala Gln Asn Gly Arg Lys Arg Gln Gly Phe Arg Leu
145                 150                 155                 160
ctg tcg gag tac gcc agc gac gag gcg gac ggg cgc ctg tac gtg gcc      528
Leu Ser Glu Tyr Ala Ser Asp Glu Ala Asp Gly Arg Leu Tyr Val Ala
                165                 170                 175
ctg aac ccc ttg atc gcg cag gcc gtc atg ggt ggc ggc cag cat gtg      576
Leu Asn Pro Leu Ile Ala Gln Ala Val Met Gly Gly Gly Gln His Val
            180                 185                 190
cgc atc agc atg gac gag gtg cgg gcg ctg gac agc gaa acc gcc cgc      624
Arg Ile Ser Met Asp Glu Val Arg Ala Leu Asp Ser Glu Thr Ala Arg
        195                 200                 205
ctg ctg cac cag cgg ctg tgt ggc tgg atc gac ccc ggc aaa acc ggc      672
Leu Leu His Gln Arg Leu Cys Gly Trp Ile Asp Pro Gly Lys Thr Gly
    210                 215                 220
aag gct tcc ata gat acc ttg tgc ggc tat gtc tgg ccg tca gag gcc      720
Lys Ala Ser Ile Asp Thr Leu Cys Gly Tyr Val Trp Pro Ser Glu Ala
225                 230                 235                 240
agt ggt tcg acc atg cgc aag cgc cgc cag cgg gtg cgc gag gcg ttg      768
Ser Gly Ser Thr Met Arg Lys Arg Arg Gln Arg Val Arg Glu Ala Leu
                245                 250                 255
ccg gag ctg gtc gcg ctg ggc tgg acg gta acc gag ttc gcg gcg ggc      816
Pro Glu Leu Val Ala Leu Gly Trp Thr Val Thr Glu Phe Ala Ala Gly
            260                 265                 270
aag tac gac atc acc cgg ccc aag gcg gca ggc tga                      852
Lys Tyr Asp Ile Thr Arg Pro Lys Ala Ala Gly
        275                 280
<210>21
<211>283
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<400>21
Val Val Lys Pro Lys Asn Lys His Ser Leu Ser His Val Arg His Asp
1               5                   10                  15
Pro Ala His Cys Leu Ala Pro Gly Leu Phe Arg Ala Leu Lys Arg Gly
            20                  25                   30
Glu Arg Lys Arg Ser Lys Leu Asp Val Thr Tyr Asp Tyr Gly Asp Gly
        35                  40                  45
Lys Arg Ile Glu Phe Ser Gly Pro Glu Pro Leu Gly Ala Asp Asp Leu
    50                  55                  60
Arg Ile Leu Gln Gly Leu Val Ala Met Ala Gly Pro Asn Gly Leu Val
65                  70                  75                  80
Leu Gly Pro Glu Pro Lys Thr Glu Gly Gly Arg Gln Leu Arg Leu Phe
                85                  90                  95
Leu Glu Pro Lys Trp Glu Ala Val Thr Ala Glu Cys His Val Val Lys
            100                 105                 110
Gly Ser Tyr Arg Ala Leu Ala Lys Glu Ile Gly Ala Glu Val Asp Ser
        115                 120                 125
Gly Gly Ala Leu Lys His Ile Gln Asp Cys Ile Glu Arg Leu Trp Lys
    130                 135                 140
Val Ser Ile Ile Ala Gln Asn Gly Arg Lys Arg Gln Gly Phe Arg Leu
145                 150                 155                 160
Leu Ser Glu Tyr Ala Ser Asp Glu Ala Asp Gly Arg Leu Tyr Val Ala
                165                 170                 175
Leu Asn Pro Leu Ile Ala Gln Ala Val Met Gly Gly Gly Gln His Val
            180                 185                 190
Arg Ile Ser Met Asp Glu Val Arg Ala Leu Asp Ser Glu Thr Ala Arg
        195                 200                 205
Leu Leu His Gln Arg Leu Cys Gly Trp Ile Asp Pro Gly Lys Thr Gly
    210                 215                 220
Lys Ala Ser Ile Asp Thr Leu Cys Gly Tyr Val Trp Pro Ser Glu Ala
225                 230                 235                 240
Ser Gly Ser Thr Met Arg Lys Arg Arg Gln Arg Val Arg Glu Ala Leu
                245                 250                 255
Pro Glu Leu Val Ala Leu Gly Trp Thr Val Thr Glu Phe Ala Ala Gly
            260                 265                 270
Lys Tyr Asp Ile Thr Arg Pro Lys Ala Ala Gly
        275                 280
<210>22
<21l>789
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(789)
<223>sul
<400>22
atg aat aaa tcg ctc atc att ttc ggc atc gtc aac ata acc tcg gac       48
Met Asn Lys Ser Leu Ile Ile Phe Gly Ile Val Asn Ile Thr Ser Asp
1               5                   10                  15
agt ttc tcc gat gga ggc cgg tat ctg gcg cca gac gca gcc att gcg      96
Ser Phe Ser Asp Gly Gly Arg Tyr Leu Ala Pro Asp Ala Ala Ile Ala
            20                  25                  30
cag gcg cgt aag ctg atg gcc gag ggg gca gat gtg atc gac ctg gtc      144
Gln Ala Arg Lys Leu Met Ala Glu Gly Ala Asp Val Ile Asp Leu Val
        35                  40                  45
cgg cat cca gca atc ccg acg ccg cgc ctg ttt cgt ccg aca cag aaa      192
Arg His Pro Ala Ile Pro Thr Pro Arg Leu Phe Arg Pro Thr Gln Lys
    50                  55                  60
tcg cgc gta tgc gcc ggt gct gga cgc gct cag gca gat ggc att ccc      240
Ser Arg Val Cys Ala Gly Ala Gly Arg Ala Gln Ala Asp Gly Ile Pro
65                  70                  75                  80
gtc tcg ctc gac agt tat caa ccc gcg acg caa gcc tat gcc ttg tcg      288
Val Ser Leu Asp Ser Tyr Gln Pro Ala Thr Gln Ala Tyr Ala Leu Ser
                85                  90                  95
cgt ggt gtg gcc tat ctc aat gat att cgc ggt ttt cca gac gct gcg      336
Arg Gly Val Ala Tyr Leu Asn Asp Ile Arg Gly Phe Pro Asp Ala Ala
            100                 105                 110
ttc tat ccg caa ttg gcg aaa tca tct gcc aaa ctc gtc gtt atg cat      384
Phe Tyr Pro Gln Leu Ala Lys Ser Ser Ala Lys Leu Val Val Met His
        115                 120                 125
tcg gtg caa gac ggg cag gca gat cgg cgc gag gca ccc gct ggc gac      432
Ser Val Gln Asp Gly Gln Ala Asp Arg Arg Glu Ala Pro Ala Gly Asp
    130                 135                 140
atc atg gat cac att gcg gcg ttc ttt gac gcg cgc atc gcg gcg ctg      480
Ile Met Asp His Ile Ala Ala Phe Phe Asp Ala Arg Ile Ala Ala Leu
145                 150                 155                 160
acg ggt gcc ggt atc aaa cgc aac cgc ctt gtc ctt gat ccc ggc atg      528
Thr Gty Ala Gly Ile Lys Arg Asn Arg Leu Val Leu Asp Pro Gly Met
                165                 170                 175
ggg ttt ttt ctg ggg gct gct ccc gaa acc tcg ctc tcg gtg ctg gcg      576
Gly Phe Phe Leu Gly Ala Ala Pro Glu Thr Ser Leu Ser Val Leu Ala
            180                 185                 190
cgg ttc gat gaa ttg cgg ctg cgc ttc gat ttg ccg gtg ctt ctg tct      624
Arg Phe Asp Glu Leu Arg Leu Arg Phe Asp Leu Pro Val Leu Leu Ser
        195                 200                 205
gtt tcg cgc aaa tcc ttt ctg cgc gcg ctc aca ggc cgt ggt ccg ggg      672
Val Ser Arg Lys Ser Phe Leu Arg Ala Leu Thr Gly Arg Gly Pro Gly
    210                 215                 220
gtg tcg ggg ccg cga cac tcg ctg cag agc ttg ccg ccg ccg cag gtg      720
Val Ser Gly Pro Arg His Ser Leu Gln Ser Leu Pro Pro Pro Gln Val
225                 230                 235                 240
gag ctg act tca tcc gca cac acg agc cgc gcc cct tgc gcg acg ggc      768
Glu Leu Thr Ser Ser Ala His Thr Ser Arg Ala Pro Cys Ala Thr Gly
                245                 250                 255
tgg cgg tat tgg cgg cgc tga                                          789
Trp Arg Tyr Trp Arg Arg
          260
<210>23
<211>262
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<400>23
Met Asn Lys Ser Leu Ile Ile Phe Gly Ile Val Asn Ile Thr Ser Asp
1               5                   10                  15
Ser Phe Ser Asp Gly Gly Arg Tyr Leu Ala Pro Asp Ala Ala Ile Ala
            20                  25                   30
Gln Ala Arg Lys Leu Met Ala Glu Gly Ala Asp Val Ile Asp Leu Val
        35                  40                  45
Arg His Pro Ala Ile Pro Thr Pro Arg Leu Phe Arg Pro Thr Gln Lys
    50                  55                  60
Ser Arg Val Cys Ala Gly Ala Gly Arg Ala Gln Ala Asp Gly Ile Pro
65                  70                  75                  80
Val Ser Leu Asp Ser Tyr Gln Pro Ala Thr Gln Ala Tyr Ala Leu Ser
                85                  90                  95
Arg Gly Val Ala Tyr Leu Asn Asp Ile Arg Gly Phe Pro Asp Ala Ala
            100                 105                 110
Phe Tyr Pro Gln Leu Ala Lys Ser Ser Ala Lys Leu Val Val Met His
        115                 120                 125
Ser Val Gln Asp Gly Gln Ala Asp Arg Arg Glu Ala Pro Ala Gly Asp
    130                 135                 140
Ile Met Asp His lle Ala Ala Phe Phe Asp Ala Arg Ile Ala Ala Leu
145                 150                 155                 160
Thr Gly Ala Gly Ile Lys Arg Asn Arg Leu Val Leu Asp Pro Gly Met
                165                 170                 175
Gly Phe Phe Leu Gly Ala Ala Pro Glu Thr Ser Leu Ser Val Leu Ala
            180                 185                 190
Arg Phe Asp Glu Leu Arg Leu Arg Phe Asp Leu Pro Val Leu Leu Ser
        195                 200                 205
Val Ser Arg Lys Ser Phe Leu Arg Ala Leu Thr Gly Arg Gly Pro Gly
    210                 215                 220
Val Ser Gly Pro Arg His Ser Leu Gln Ser Leu Pro Pro Pro Gln Val
225                 230                 235                 240
Glu Leu Thr Ser Ser Ala His Thr Ser Arg Ala Pro Cys Ala Thr Gly
                245                 250                 255
Trp Arg Tyr Trp Arg Arg
            260
<210>24
<211>8335
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>基因
<222>(63)..(866)
<223>strA
<220>
<221>基因
<222>(866)..(1702)
<223>strB
<220>
<221>启动子
<222>(2824)..(2912)
<223>Placuv5启动子
<220>
<221>基因
<222>(2957)..(4039)
<223>lacI
<220>
<221>基因
<222>(4059)..(5033)
<223>repB
<220>
<221>基因
<222>(5091)..(5303)
<223>orfE
<220>
<221>基因
<222>(5305)..(5511)
<223>orfF
<220>
<221>基因
<222>(5541)..(6380)
<223>repA
<220>
<221>基因
<222>(6367)..(7218)
<223>repC
<220>
<221>基因
<222>(7526)..(8314)
<223>sul
<400>24
aactgcacat tcgggatatt tctctatatt cgcgcttcat cagaaaactg aaggaacctc    60
cattgaatcg aactaatatt ttttttggtg aatcgcattc tgactggttg cctgtcagag    120
gcggagaatc tggtgatttt gtttttcgac gtggtgacgg gcatgccttc gcgaaaatcg    180
cacctgcttc ccgccgcggt gagctcgctg gagagcgtga ccgcctcatt tggctcaaag    240
gtcgaggtgt ggcttgcccc gaggtcatca actggcagga ggaacaggag ggtgcatgct    300
tggtgataac ggcaattccg ggagtaccgg cggctgatct gtctggagcg gatttgctca    360
aagcgtggcc gtcaatgggg cagcaacttg gcgctgttca cagcctatcg gttgatcaat    420
gtccgtttga gcgcaggctg tcgcgaatgt tcggacgcgc cgttgatgtg gtgtcccgca    480
atgccgtcaa tcccgacttc ttaccggacg aggacaagag tacgccgctg cacgatcttt    540
tggctcgtgt cgaacgagag ctaccggtgc ggctcgacca agagcgcacc gatatggttg    600
tttgccatgg tgatccctgc atgccgaact tcatggtgga ccctaaaact cttcaatgca    660
cgggtctgat cgaccttggg cggctcggaa cagcagatcg ctatgccgat ttggcactca    720
tgattgctaa cgccgaagag aactgggcag cgccagatga agcagagcgc gccttcgctg    780
tcctattcaa tgtattgggg atcgaagccc ccgaccgcga acgccttgcc ttctatctgc    840
gattggaccc tctgacttgg ggttgatgtt catgccgcct gtttttcctg ctcattggca    900
cgtttcgcaa cctgttctca ttgcggacac cttttccagc ctcgtttgga aagtttcatt    960
gccagacggg actcctgcaa tcgtcaaggg attgaaacct atagaagaca ttgctgatga    1020
actgcgcggg gccgactatc tggtatggcg caatgggagg ggagcagtcc ggttgctcgg    1080
tcgtgagaac aatctgatgt tgctcgaata tgccggggag cgaatgctct ctcacatcgt    1140
tgccgagcac ggcgactacc aggcgaccga aattgcagcg gaactaatgg cgaagctgta    1200
tgccgcatct gaggaacccc tgccttctgc ccttctcccg atccgggatc gctttgcagc    1260
tttgtttcag cgggcgcgcg atgatcaaaa cgcaggttgt caaactgact acgtccacgc    1320
ggcgattata gccgatcaaa tgatgagcaa tgcctcggaa ctgcgtgggc tacatggcga    1380
tctgcatcat gaaaacatca tgttctccag tcgcggctgg ctggtgatag atcccgtcgg   1440
tctggtcggt gaagtgggct ttggcgccgc caatatgttc tacgatccgg ctgacagaga   1500
cgacctttgt ctcgatccta gacgcattgc acagatggcg gacgcattct ctcgtgcgct   1560
ggacgtcgat ccgcgtcgcc tgctcgacca ggcgtacgct tatgggtgcc tttccgcagc   1620
ttggaacgcg gatggagaag aggagcaacg cgatctagct atcgcggccg cgatcaagca   1680
ggtgcgacag acgtcatact agatatcaag cgacttctcc tatcccctgg gaacacatca   1740
atctcaccgg agaatatcgc tggccaaagc cttagcgtag gattccgccc cttcccgcaa   1800
acgaccccaa acaggaaacg cagctgaaac gggaagctca acacccactg acgcatgggt   1860
tgttcaggca gtacttcatc aaccagcaag gcggcacttt cggccatccg ccgcgcccca   1920
cagctcgggc agaaaccgcg acgcttacag ctgaaagcga ccaggtgctc ggcgtggcaa   1980
gactcgcagc gaacccgtag aaagccatgc tccagccgcc cgcattggag aaattcttca   2040
aattcccgtt gcacatagcc cggcaattcc tttccctgct ctgccataag cgcagcgaat   2100
gccgggtaat actcgtcaac gatctgatag agaagggttt gctcgggtcg gtggctctgg   2160
taacgaccag tatcccgatc ccggctggcc gtcctggccg ccacatgagg catgttccgc   2220
gtccttgcaa tactgtgttt acatacagtc tatcgcttag cggaaagttc ttttaccctc   2280
agccgaaatg cctgccgttg ctagacattg ccagccagtg cccgtcactc ccgtactaac   2340
tgtcacgaac ccctgcaata actgtcacgc ccccctgcaa taactgtcac gaacccctgc   2400
aataactgtc acgcccccaa acctgcaaac ccagcagggg cgggggctgg cggggtgttg   2460
gaaaaatcca tccatgatta tctaagaata atccactagg cgcggttatc agcgcccttg   2520
tggggcgctg ctgcccttgc ccaatatgcc cggccagagg ccggatagct ggtctattcg   2580
ctgcgctagg ctacacaccg ccccaccgct gcgcggcagg gggaaaggcg ggcaaagccc   2640
gctaaacccc acaccaaacc ccgcagaaat acgctggagc gcttttagcc gctttagcgg   2700
cctttccccc tacccgaagg gtgggggcgc gtgtgcagcc ccgcagggcc tgtctcggtc   2760
gatcattcag cccggctcat agatctgcgg gcagtgagcg caacgcaatt aatgtgagtt   2820
agctcactca ttaggcaccc caggctttac actttatgct tccggctcgt ataatgtgtg   2880
gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gatctagaaa taattttgtt taactttaag   2940
aaggagatat acatatgtga aaccagtaac gttatacgat gtcgcagagt atgccggtgt   3000
ctcttatcag accgtttccc gcgtggtgaa ccaggccagc cacgtttctg cgaaaacgcg   3060
ggaaaaagtg gaagcggcga tggcggagct gaattacatt cccaaccgcg tggcacaaca   3120
actggcgggc aaaccgtcga agcctgtaaa gcggcggtgc acaatcttct cgcgcaacgc   3180
gtcagtgggc tgatagtcgt tgctgattgg cgttgccacc tccagtctgg ccctgcacgc   3240
gccgtcgcaa attgtcgcgg cgattaaatc tcgcgccgat caactgggtg ccagcgtggt   3300
ggtgtcgatg gtagaacgaa gcggcattaa ctatccgctg gatgaccagg atgccattgc   3360
tgtggaagct gcctgcacta atgttccggc gttatttctt gatgtctctg accagacacc   3420
catcaacagt attattttct cccatgaaga cggtacgcga ctgggcgtgg agcatctggt   3480
cgcattgggt caccagcaaa tcgcgctgtt agcgggccca ttaagttctg tctcggcgcg   3540
tctgcgtctg gctggctggc ataaatatct cactcgcaat caaattcagc cgatagcgga   3600
acgggaaggc gactggagtg ccatgtccgg ttttcaacaa accatgcaaa tgctgaatga   3660
gggcatcgtt cccactgcga tgctggttgc caacgatcag atggcgctgg gcgcaatgcg   3720
cgccattacc gagtccgggc tgcgcgttgg tgcggatatc tcggtagtgg gatacgacga   3780
taccgaagac agctcatgtt atatcccgcc gttaaccacc atcaaacagg attttcgcct   3840
gctggggcaa accagcgtgg accgcttgct gcaactctct cagggccagg cggtgaaggg   3900
caatcagctg ttgcccgtct cactggtgaa aagaaaaacc accctggcgc ccaatacgca   3960
aaccgcctct ccccgcgcgt tggccgattc attaatgcag ctggcacgac aggtttcccg   4020
actggaaagc gggcagtgag gatccggggg gtggcccgat gaagaacgac aggactttgc   4080
aggccatagg ccgacagctc aaggccatgg gctgtgagcg cttcgatatc ggcgtcaggg   4140
acgccaccac cggccagatg atgaaccggg aatggtcagc cgccgaagtg ctccagaaca   4200
cgccatggct caagcggatg aatgcccagg gcaatgacgt gtatatcagg cccgccgagc   4260
aggagcggca tggtctggtg ctggtggacg acctcagcga gtttgacctg gatgacatga   4320
aagccgaggg ccgggagcct gccctggtag tggaaaccag cccgaagaac tatcaggcat   4380
gggtcaaggt ggccgacgcc gcaggcggtg aacttcgggg gcagattgcc cggacgctgg   4440
ccagcgagta cgacgccgac ccggccagcg ccgacagccg ccactatggc cgcttggcgg   4500
gcttcaccaa ccgcaaggac aagcacacca cccgcgccgg ttatcagccg tgggtgctgc   4560
tgcgtgaatc caagggcaag accgccaccg ctggcccggc gctggtgcag caggctggcc   4620
agcagatcga gcaggcccag cggcagcagg agaaggcccg caggctggcc agcctcgaac   4680
tgcccgagcg gcagcttagc cgccaccggc gcacggcgct ggacgagtac cgcagcgaga   4740
tggccgggct ggtcaagcgc ttcggtgatg acctcagcaa gtgcgacttt atcgccgcgc   4800
agaagctggc cagccggggc cgcagtgccg aggaaatcgg caaggccatg gccgaggcca   4860
gcccagcgct ggcagagcgc aagcccggcc acgaagcgga ttacatcgag cgcaccgtca   4920
gcaaggtcat gggtctgccc agcgtccagc ttgcgcgggc cgagctggca cgggcaccgg   4980
caccccgcca gcgaggcatg gacaggggcg ggccagattt cagcatgtag tgcttgcgtt   5040
ggtactcacg cctgttatac tatgagtact cacgcacaga agggggtttt atggaatacg   5100
aaaaaagcgc ttcagggtcg gtctacctga tcaaaagtga caagggctat tggttgcccg   5160
gtggctttgg ttatacgtca aacaaggccg aggctggccg cttttcagtc gctgatatgg   5220
ccagccttaa ccttgacggc tgcaccttgt ccttgttccg cgaagacaag cctttcggcc   5280
ccggcaagtt tctcggtgac tgatatgaaa gaccaaaagg acaagcagac cggcgacctg   5340
ctggccagcc ctgacgctgt acgccaagcg cgatatgccg agcgcatgaa ggccaaaggg   5400
atgcgtcagc gcaagttctg gctgaccgac gacgaatacg aggcgctgcg cgagtgcctg   5460
gaagaactca gagcggcgca gggcgggggt agtgaccccg ccagcgccta accaccaact   5520
gcctgcaaag gaggcaatca atggctaccc ataagcctat caatattctg gaggcgttcg   5580
cagcagcgcc gccaccgctg gactacgttt tgcccaacat ggtggccggt acggtcgggg   5640
cgctggtgtc gcccggtggt gccggtaaat ccatgctggc cctgcaactg gccgcacaga   5700
ttgcaggcgg gccggatctg ctggaggtgg gcgaactgcc caccggcccg gtgatctacc   5760
tgcccgccga agacccgccc accgccattc atcaccgcct gcacgccctt ggggcgcacc   5820
tcagcgccga ggaacggcaa gccgtggctg acggcctgct gatccagccg ctgatcggca   5880
gcctgcccaa catcatggcc ccggagtggt tcgacggcct caagcgcgcc gccgagggcc   5940
gccgcctgat ggtgctggac acgctgcgcc ggttccacat cgaggaagaa aacgccagcg   6000
gccccatggc ccaggtcatc ggtcgcatgg aggccatcgc cgccgatacc gggtgctcta   6060
tcgtgttcct gcaccatgcc agcaagggcg cggccatgat gggcgcaggc gaccagcagc   6120
aggccagccg gggcagctcg gtactggtcg ataacatccg ctggcagtcc tacctgtcga   6180
gcatgaccag cgccgaggcc gaggaatggg gtgtggacga cgaccagcgc cggttcttcg   6240
tccgcttcgg tgtgagcaag gccaactatg gcgcaccgtt cgctgatcgg tggttcaggc   6300
ggcatgacgg cggggtgctc aagcccgccg tgctggagag gcagcgcaag agcaaggggg   6360
tgccccgtgg tgaagcctaa gaacaagcac agcctcagcc acgtccggca cgacccggcg   6420
cactgtctgg cccccggcct gttccgtgcc ctcaagcggg gcgagcgcaa gcgcagcaag   6480
ctggacgtga cgtatgacta cggcgacggc aagcggatcg agttcagcgg cccggagccg   6540
ctgggcgctg atgatctgcg catcctgcaa gggctggtgg ccatggctgg gcctaatggc   6600
ctagtgcttg gcccggaacc caagaccgaa ggcggacggc agctccggct gttcctggaa   6660
cccaagtggg aggccgtcac cgctgaatgc catgtggtca aaggtagcta tcgggcgctg   6720
gcaaaggaaa tcggggcaga ggtcgatagt ggtggggcgc tcaagcacat acaggactgc   6780
atcgagcgcc tttggaaggt atccatcatc gcccagaatg gccgcaagcg gcaggggttt   6840
cggctgctgt cggagtacgc cagcgacgag gcggacgggc gcctgtacgt ggccctgaac   6900
cccttgatcg cgcaggccgt catgggtggc ggccagcatg tgcgcatcag catggacgag   6960
gtgcgggcgc tggacagcga aaccgcccgc ctgctgcacc agcggctgtg tggctggatc   7020
gaccccggca aaaccggcaa ggcttccata gataccttgt gcggctatgt ctggccgtca   7080
gaggccagtg gttcgaccat gcgcaagcgc cgccagcggg tgcgcgaggc gttgccggag   7140
ctggtcgcgc tgggctggac ggtaaccgag ttcgcggcgg gcaagtacga catcacccgg   7200
cccaaggcgg caggctgacc ccccccactc tattgtaaac aagacatttt tatcttttat   7260
attcaatggc ttattttcct gctaattggt aataccatga aaaataccat gctcagaaaa   7320
ggcttaacaa tattttgaaa aattgcctac tgagcgctgc cgcacagctc cataggccgc   7380
tttcctggct ttgcttccag atgtatgctc ttctgctcct gcagctaatg gatcaccgca   7440
aacaggttac tcgcctgggg attccctttc gacccgagca tccgtatgat actcatgctc   7500
gattattatt attatagaag cccccatgaa taaatcgctc atcattttcg gcatcgtcaa   7560
cataacctcg gacagtttct ccgatggagg ccggtatctg gcgccagacg cagccattgc   7620
gcaggcgcgt aagctgatgg ccgagggggc agatgtgatc gacctggtcc ggcatccagc   7680
aatcccgacg ccgcgcctgt ttcgtccgac acagaaatcg cgcgtatgcg ccggtgctgg   7740
acgcgctcag gcagatggca ttcccgtctc gctcgacagt tatcaacccg cgacgcaagc   7800
ctatgccttg tcgcgtggtg tggcctatct caatgatatt cgcggttttc cagacgctgc   7860
gttctatccg caattggcga aatcatctgc caaactcgtc gttatgcatt cggtgcaaga   7920
cgggcaggca gatcggcgcg aggcacccgc tggcgacatc atggatcaca ttgcggcgtt   7980
ctttgacgcg cgcatcgcgg cgctgacggg tgccggtatc aaacgcaacc gccttgtcct   8040
tgatcccggc atggggtttt ttctgggggc tgctcccgaa acctcgctct cggtgctggc   8100
gcggttcgat gaattgcggc tgcgcttcga tttgccggtg cttctgtctg tttcgcgcaa   8160
atcctttctg cgcgcgctca caggccgtgg tccgggggtg tcggggccgc gacactcgct   8220
gcagagcttg ccgccgccgc aggtggagct gacttcatcc gcacacacga gccgcgcccc   8280
ttgcgcgacg ggctggcggt attggcggcg ctgaaagaaa ccgcaagaat tcgtt         8335
<210>25
<211>1083
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1083)
<223>lacI
<400>25
gtg aaa cca gta acg tta tac gat gtc gca gag tat gcc ggt gtc tct      48
Val Lys Pro Val Thr Leu Tyr Asp Val Ala Glu Tyr Ala Gly Val Ser
1               5                   10                  15
tat cag acc gtt tcc cgc gtg gtg aac cag gcc agc cac gtt tct gcg      96
Tyr Gln Thr Val Ser Arg Val Val Asn Gln Ala Ser His Val Ser Ala
            20                  25                  30
aaa acg cgg gaa aaa gtg gaa gcg gcg atg gcg gag ctg aat tac att      144
Lys Thr Arg Glu Lys Val Glu Ala Ala Met Ala Glu Leu Asn Tyr Ile
        35                  40                  45
ccc aac cgc gtg gca caa caa ctg gcg ggc aaa cag tcg ttg ctg att      192
Pro Asn Arg Val Ala Gln Gln Leu Ala Gly Lys Gln Ser Leu Leu Ile
    50                  55                  60
ggc gtt gcc acc tcc agt ctg gcc ctg cac gcg ccg tcg caa att gtc      240
Gly Val Ala Thr Ser Ser Leu Ala Leu His Ala Pro Ser Gln Ile Val
65                  70                  75                  80
gcg gcg att aaa tct cgc gcc gat caa ctg ggt gcc agc gtg gtg gtg      288
Ala Ala Ile Lys Ser Arg Ala Asp Gln Leu Gly Ala Ser Val Val Val
                85                  90                  95
tcg atg gta gaa cga agc ggc gtc gaa gcc tgt aaa gcg gcg gtg cac      336
Ser Met Val Glu Arg Ser Gly Val Glu Ala Cys Lys Ala Ala Val His
            100                 105                 110
aat ctt ctc gcg caa cgc gtc agt ggg ctg atc att aac tat ccg ctg      384
Asn Leu Leu Ala Gln Arg Val Ser Gly Leu Ile Ile Asn Tyr Pro Leu
        115                 120                 125
gat gac cag gat gcc att gct gtg gaa gct gcc tgc act aat gtt ccg      432
Asp Asp Gln Asp Ala Ile Ala Val Glu Ala Ala Cys Thr Ash Val Pro
    130                 135                 140
gcg tta ttt ctt gat gtc tct gac cag aca ccc atc aac agt att att      480
Ala Leu Phe Leu Asp Val Ser Asp Gln Thr Pro Ile Asn Ser Ile Ile
145                 150                 155                 160
ttc tcc cat gaa gac ggt acg cga ctg ggc gtg gag cat ctg gtc gca      528
Phe Ser His Glu Asp Gly Thr Arg Leu Gly Val Glu His Leu Val Ala
                165                 170                 175
ttg ggt cac cag caa atc gcg ctg tta gcg ggc cca tta agt tct gtc      576
Leu Gly His Gln Gln Ile Ala Leu Leu Ala Gly Pro Leu Ser Ser Val
            180                 185                 190
tcg gcg cgt ctg cgt ctg gct ggc tgg cat aaa tat ctc act cgc aat      624
Ser Ala Arg Leu Arg Leu Ala Gly Trp His Lys Tyr Leu Thr Arg Asn
        195                 200                 205
caa att cag ccg ata gcg gaa cgg gaa ggc gac tgg agt gcc atg tcc      672
Gln Ile Gln Pro Ile Ala Glu Arg Glu Gly Asp Trp Ser Ala Met Ser
    210                 215                 220
ggt ttt caa caa acc atg caa atg ctg aat gag ggc atc gtt ccc act      720
Gly Phe Gln Gln Thr Met Gln Met Leu Asn Glu Gly Ile Val Pro Thr
225                 230                 235                 240
gcg atg ctg gtt gcc aac gat cag atg gcg ctg ggc gca atg cgc gcc      768
Ala Met Leu Val Ala Asn Asp Gln Met Ala Leu Gly Ala Met Arg Ala
                245                 250                 255
att acc gag tcc ggg ctg cgc gtt ggt gcg gat atc tcg gta gtg gga      816
Ile Thr Glu Ser Gly Leu Arg Val Gly Ala Asp Ile Ser Val Val Gly
            260                 265                 270
tac gac gat acc gaa gac agc tca tgt tat atc ccg ccg tta acc acc      864
Tyr Asp Asp Thr Glu Asp Ser Ser Cys Tyr Ile Pro Pro Leu Thr Thr
        275                 280                 285
atc aaa cag gat ttt cgc ctg ctg ggg caa acc agc gtg gac cgc ttg    912
Ile Lys Gln Asp Phe Arg Leu Leu Gly Gln Thr Ser Val Asp Arg Leu
    290                 295                 300
ctg caa ctc tct cag ggc cag gcg gtg aag ggc aat cag ctg ttg ccc    960
Leu Gln Leu Ser Gln Gly Gln Ala Val Lys Gly Asn Gln Leu Leu Pro
305                 310                 315                 320
gtc tca ctg gtg aaa aga aaa acc acc ctg gcg ccc aat acg caa acc    1008
Val Ser Leu Val Lys Arg Lys Thr Thr Leu Ala Pro Asn Thr Gln Thr
                325                 330                 335
gcc tct ccc cgc gcg ttg gcc gat tca tta atg cag ctg gca cga cag    1056
Ala Ser Pro Arg Ala Leu Ala Asp Ser Leu Met Gln Leu Ala Arg Gln
            340                 345                 350
gtt tcc cga ctg gaa agc ggg cag tga                                1083
Val Ser Arg Leu Glu Ser Gly Gln
        355                 360
<210>26
<211>360
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<400>26
Val Lys Pro Val Thr Leu Tyr Asp Val Ala Glu Tyr Ala Gly Val Ser
1               5                   10                  15
Tyr Gln Thr Val Ser Arg Val Val Asn Gln Ala Ser His Val Ser Ala
            20                  25                  30
Lys Thr Arg Glu Lys Val Glu Ala Ala Met Ala Glu Leu Asn Tyr Ile
        35                  40                  45
Pro Asn Arg Val Ala Gln Gln Leu Ala Gly Lys Gln Ser Leu Leu lle
    50                  55                  60
Gly Val Ala Thr Ser Ser Leu Ala Leu His Ala Pro Ser Gln Ile Val
65                  70                  75                  80
Ala Ala Ile Lys Ser Arg Ala Asp Gln Leu Gly Ala Ser Val Val Val
                85                  90                  95
Ser Met Val Glu Arg Ser Gly Val Glu Ala Cys Lys Ala Ala Val His
            100                 105                 110
Asn Leu Leu Ala Gln Arg Val Ser Gly Leu Ile Ile Asn Tyr Pro Leu
        115                 120                 125
Asp Asp Gln Asp Ala Ile Ala Val Glu Ala Ala Cys Thr Asn Val Pro
    130                 135                 140
Ala Leu Phe Leu Asp Val Ser Asp Gln Thr Pro Ile Asn Ser Ile Ile
145                 150                 155                 160
Phe Ser His Glu Asp Gly Thr Arg Leu Gly Val Glu His Leu Val Ala
                165                 170                 175
Leu Gly His Gln Gln Ile Ala Leu Leu Ala Gly Pro Leu Ser Ser Val
            180                 185                 190
Ser Ala Arg Leu Arg Leu Ala Gly Trp His Lys Tyr Leu Thr Arg Asn
        195                 200                 205
Gln Ile Gln Pro Ile Ala Glu Arg Glu Gly Asp Trp Ser Ala Met Ser
    210                 215                 220
Gly Phe Gln Gln Thr Met Gln Met Leu Asn Glu Gly Ile Val Pro Thr
225                 230                 235                 240
Ala Met Leu Val Ala Asn Asp Gln Met Ala Leu Gly Ala Met Arg Ala
                245                 250                 255
Ile Thr Glu Ser Gly Leu Arg Val Gly Ala Asp Ile Ser Val Val Gly
            260                 265                 270
Tyr Asp Asp Thr Glu Asp Ser Ser Cys Tyr Ile Pro Pro Leu Thr Thr
        275                 280                 285
Ile Lys Gln Asp Phe Arg Leu Leu Gly Gln Thr Ser Val Asp Arg Leu
    290                 295                 300
Leu Gln Leu Ser Gln Gly Gln Ala Val Lys Gly Asn Gln Leu Leu Pro
305                 310                 315                 320
Val Ser Leu Val Lys Arg Lys Thr Thr Leu Ala Pro Asn Thr Gln Thr
                325                 330                 335
Ala Ser Pro Arg Ala Leu Ala Asp Ser Leu Met Gln Leu Ala Arg Gln
            340                 345                 350
Val Ser Arg Leu Glu Ser Gly Gln
        355                 360
<210>27
<211>6864
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>基因
<222>(196)..(990)
<223>thyA
<220>
<221>CDS
<222>(196)..(990)
<223>thyA
<220>
<221>启动子
<222>(2162)..(2250)
<223>PlacUV5
<220>
<221>基因
<222>(2295)..(3377)
<223>lacI
<220>
<221>基因
<222>(3397)..(4368)
<223>repB
<220>
<221>基因
<222>(4429)..(4651)
<223>orfE
<220>
<221>基因
<222>(4643)..(4849)
<223>orfF
<220>
<221>基因
<222>(4879)..(5718)
<223>repA
<220>
<221>基因
<222>(5705)..(6556)
<223>repC
<400>27
gaattcctga ttggttacgg cgcgtttcgc atcattgttg agtttttccg ccagcccgac    60
gcgcagttta ccggtgcctg ggtgcatgat ataatcatgg ggcaaattct ttccatcccg    120
atgattgtcg cgggtgtgat catgatggtc tgggcatatc gtcgcagccc acagcaacac    180
gtttcctgag gaacc atg aaa cag tat tta gaa ctg atg caa aaa gtg ctc     231
                 Met Lys Gln Tyr Leu Glu Leu Met Gln Lys Val Leu
                 1               5                   10
gac gaa ggc aca cag aaa aac gac cgt acc gga acc gga acg ctt tcc      279
Asp Glu Gly Thr Gln Lys Asn Asp Arg Thr Gly Thr Gly Thr Leu Ser
        15                  20                  25
att ttt ggt cat cag atg cgt ttt aac ctg caa gat gga ttc ccg ctg      327
Ile Phe Gly His Gln Met Arg Phe Asn Leu Gln Asp Gly Phe Pro Leu
    30                  35                  40
gtg aca act aaa cgt tgc cac ctg cgt tcc atc atc cat gaa ctg ctg      375
Val Thr Thr Lys Arg Cys His Leu Arg Ser Ile Ile His Glu Leu Leu
45                  50                  55                  60
tgg ttt ctc cag ggc gac act aac att gct tat cta cac gaa aac aat      423
Trp Phe Leu Gln Gly Asp Thr Asn Ile Ala Tyr Leu His Glu Asn Asn
                65                  70                  75
gtc acc atc tgg gac gaa tgg gcc gat gaa aac ggc gac ctc ggg cca      471
Val Thr Ile Trp Asp Glu Trp Ala Asp Glu Asn Gly Asp Leu Gly Pro
            80                  85                  90
gtg tat ggt aaa cag tgg cgc gcc tgg cca acg cea gat ggt cgt cat      519
Val Tyr Gly Lys Gln Trp Arg Ala Trp Pro Thr Pro Asp Gly Arg His
        95                  100                 105
att gac cag atc act acg gta ctg aac cag ctg aaa aac gac ccg gat      567
Ile Asp Gln Ile Thr Thr Val Leu Asn Gln Leu Lys Asn Asp Pro Asp
    110                 115                 120
tcg cgc cgc att att gtt tca gcg tgg aac gta ggc gaa ctg gat aaa      615
Ser Arg Arg Ile Ile Val Ser Ala Trp Asn Val Gly Glu Leu Asp Lys
125                 130                 135                 140
atg gcg ctg gca ccg tgc cat gca ttc ttc cag ttc tat gtg gca gac      663
Met Ala Leu Ala Pro Cys His Ala Phe Phe Gln Phe Tyr Val Ala Asp
                145                 150                 155
ggc aaa ctc tct tgc cag ctt tat cag cgc tcc tgt gac gtc ttc ctc      711
Gly Lys Leu Ser Cys Gln Leu Tyr Gln Arg Ser Cys Asp Val Phe Leu
            160                 165                 170
ggc ctg ccg ttc aac att gcc agc tac gcg tta ttg gtg cat atg atg      759
Gly Leu Pro Phe Asn Ile Ala Ser Tyr Ala Leu Leu Val His Met Met
        175                 180                 185
gcg cag cag tgc gat ctg gaa gtg ggt gat ttt gtc tgg acc ggt ggc      807
Ala Gln Gln Cys Asp Leu Glu Val Gly Asp Phe Val Trp Thr Gly Gly
    190                 195                 200
gac acg cat ctg tac age aac cat atg gat caa act cat ctg caa tta      855
Asp Thr His Leu Tyr Ser Asn His Met Asp G1n Thr His Leu Gln Leu
205                 210                 215                 220
agc egc gaa ccg cgt ccg ctg ccg aag ttg att atc aaa cgt aaa ccc      903
Ser Arg Glu Pro Arg Pro Leu Pro Lys Leu Ile Ile Lys Arg Lys Pro
                225                 230                 235
gaa tcc atc ttc gac tac cgt ttc gaa gac ttt gag att gaa ggc tac      951
Glu Ser Ile Phe Asp Tyr Arg Phe Glu Asp Phe Glu Ile Glu Gly Tyr
            240                 245                 250
gat ccg cat ccg ggc att aaa gcg ccg gtg gct atc taa ttacgaagct      1000
Asp Pro His Pro Gly Ile Lys Ala Pro Val Ala Ile
        255                 260
tgcggccgcg atcaagcagg tgcgacagac gtcatactag atatcaagcg acttctccta   1060
tcccctggga acacatcaat ctcaccggag aatatcgctg gccaaagcct tagcgtagga   1120
ttccgcccct tcccgcaaac gaccccaaac aggaaacgca gctgaaacgg gaagctcaac   1180
acccactgac gcatgggttg ttcaggcagt acttcatcaa ccagcaaggc ggcactttcg   1240
gccatccgcc gcgccccaca gctcgggcag aaaccgcgac gcttacagct gaaagcgacc   1300
aggtgctcgg cgtggcaaga ctcgcagcga acccgtagaa agccatgctc cagccgcccg   1360
cattggagaa attcttcaaa ttcccgttgc acatagcccg gcaattcctt tccctgctct   1420
gccataagcg cagcgaatgc cgggtaatac tcgtcaacga tctgatagag aagggtttgc   1480
tcgggtcggt ggctctggta acgaccagta tcccgatccc ggctggccgt cctggccgcc   1540
acatgaggca tgttccgcgt ccttgcaata ctgtgtttac atacagtcta tcgcttagcg   1600
gaaagttctt ttaccctcag ccgaaatgcc tgccgttgct agacattgcc agccagtgcc   1660
cgtcactccc gtactaactg tcacgaaccc ctgcaataac tgtcacgccc ccctgcaata   1720
actgtcacga acccctgcaa taactgtcac gcccccaaac ctgcaaaccc agcaggggcg   1780
ggggctggcg gggtgttgga aaaatccatc catgattatc taagaataat ccactaggcg   1840
cggttatcag cgcccttgtg gggcgctgct gcccttgccc aatatgcccg gccagaggcc   1900
ggatagctgg tctattcgct gcgctaggct acacaccgcc ccaccgctgc gcggcagggg   1960
gaaaggcggg caaagcccgc taaaccccac accaaacccc gcagaaatac gctggagcgc   2020
ttttagccgc tttagcggcc tttcccccta cccgaagggt gggggcgcgt gtgcagcccc   2080
gcagggcctg tctcggtcga tcattcagcc cggctcatag atctgcgggc agtgagcgca   2140
acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc   2200
cggctcgtat aatgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga tctagaaata   2260
attttgttta actttaagaa ggagatatac atatgtgaaa ccagtaacgt tatacgatgt   2320
cgcagagtat gccggtgtct cttatcagac cgtttcccgc gtggtgaacc aggccagcca   2380
cgtttctgcg aaaacgcggg aaaaagtgga agcggcgatg gcggagctga attacattcc   2440
caaccgcgtg gcacaacaac tggcgggcaa accgtcgaag cctgtaaagc ggcggtgcac   2500
aatcttctcg cgcaacgcgt cagtgggctg atagtcgttg ctgattggcg ttgccacctc   2560
cagtctggcc ctgcacgcgc cgtcgcaaat tgtcgcggcg attaaatctc gcgccgatca   2620
actgggtgcc agcgtggtgg tgtcgatggt agaacgaagc ggcattaact atccgctgga   2680
tgaccaggat gccattgctg tggaagctgc ctgcactaat gttccggcgt tatttcttga   2740
tgtctctgac cagacaccca tcaacagtat tattttctcc catgaagacg gtacgcgact   2800
gggcgtggag catctggtcg cattgggtca ccagcaaatc gcgctgttag cgggcccatt   2860
aagttctgtc tcggcgcgtc tgcgtctggc tggctggcat aaatatctca ctcgcaatca   2920
aattcagccg atagcggaac gggaaggcga ctggagtgcc atgtccggtt ttcaacaaac   2980
catgcaaatg ctgaatgagg gcatcgttcc cactgcgatg ctggttgcca acgatcagat   3040
ggcgctgggc gcaatgcgcg ccattaccga gtccgggctg cgcgttggtg cggatatctc   3100
ggtagtggga tacgacgata ccgaagacag ctcatgttat atcccgccgt taaccaccat   3160
caaacaggat tttcgcctgc tggggcaaac cagcgtggac cgcttgctgc aactctctca   3220
gggccaggcg gtgaagggca atcagctgtt gcccgtctca ctggtgaaaa gaaaaaccac   3280
cctggcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat taatgcagct   3340
ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagga tccggggggt ggcccgatga   3400
agaacgacag gactttgcag gccataggcc gacagctcaa ggccatgggc tgtgagcgct   3460
tcgatatcgg cgtcagggac gccaccaccg gccagatgat gaaccgggaa tggtcagccg   3520
ccgaagtgct ccagaacacg ccatggctca agcggatgaa tgcccagggc aatgacgtgt   3580
atatcaggcc cgccgagcag gagcggcatg gtctggtgct ggtggacgac ctcagcgagt   3640
ttgacctgga tgacatgaaa gccgagggcc gggagcctgc cctggtagtg gaaaccagcc   3700
cgaagaacta tcaggcatgg gtcaaggtgg ccgacgccgc aggcggtgaa cttcgggggc   3760
agattgcccg gacgctggcc agcgagtacg acgccgaccc ggccagcgcc gacagccgcc   3820
actatggccg cttggcgggc ttcaccaacc gcaaggacaa gcacaccacc cgcgccggtt   3880
atcagccgtg ggtgctgctg cgtgaatcca agggcaagac cgccaccgct ggcccggcgc   3940
tggtgcagca ggctggccag cagatcgagc aggcccagcg gcagcaggag aaggcccgca   4000
ggctggccag cctcgaactg cccgagcggc agcttagccg ccaccggcgc acggcgctgg   4060
acgagtaccg cagcgagatg gccgggctgg tcaagcgctt cggtgatgac ctcagcaagt   4120
gcgactttat cgccgcgcag aagctggcca gccggggccg cagtgccgag gaaatcggca   4180
aggccatggc cgaggccagc ccagcgctgg cagagcgcaa gcccggccac gaagcggatt   4240
acatcgagcg caccgtcagc aaggtcatgg gtctgcccag cgtccagctt gcgcgggccg   4300
agctggcacg ggcaccggca ccccgccagc gaggcatgga caggggcggg ccagatttca   4360
gcatgtagtg cttgcgttgg tactcacgcc tgttatacta tgagtactca cgcacagaag   4420
ggggttttat ggaatacgaa aaaagcgctt cagggtcggt ctacctgatc aaaagtgaca   4480
agggctattg gttgcccggt ggctttggtt atacgtcaaa caaggccgag gctggccgct   4540
tttcagtcgc tgatatggcc agccttaacc ttgacggctg caccttgtcc ttgttccgcg   4600
aagacaagcc tttcggcccc ggcaagtttc tcggtgactg atatgaaaga ccaaaaggac   4660
aagcagaccg gcgacctgct ggccagccct gacgctgtac gccaagcgcg atatgccgag   4720
cgcatgaagg ccaaagggat gcgtcagcgc aagttctggc tgaccgacga cgaatacgag   4780
gcgctgcgcg agtgcctgga agaactcaga gcggcgcagg gcgggggtag tgaccccgcc   4840
agcgcctaac caccaactgc ctgcaaagga ggcaatcaat ggctacccat aagcctatca   4900
atattctgga ggcgttcgca gcagcgccgc caccgctgga ctacgttttg cccaacatgg   4960
tggccggtac ggtcggggcg ctggtgtcgc ccggtggtgc cggtaaatcc atgctggccc   5020
tgcaactggc cgcacagatt gcaggcgggc cggatctgct ggaggtgggc gaactgccca   5080
ccggcccggt gatctacctg cccgccgaag acccgcccac cgccattcat caccgcctgc   5140
acgcccttgg ggcgcacctc agcgccgagg aacggcaagc cgtggctgac ggcctgctga   5200
tccagccgct gatcggcagc ctgcccaaca tcatggcccc ggagtggttc gacggcctca   5260
agcgcgccgc cgagggccgc cgcctgatgg tgctggacac gctgcgccgg ttccacatcg   5320
aggaagaaaa cgccagcggc cccatggccc aggtcatcgg tcgcatggag gccatcgccg   5380
ccgataccgg gtgctctatc gtgttcctgc accatgccag caagggcgcg gccatgatgg   5440
gcgcaggcga ccagcagcag gccagccggg gcagctcggt actggtcgat aacatccgct   5500
ggcagtccta cctgtcgagc atgaccagcg ccgaggccga ggaatggggt gtggacgacg   5560
accagcgccg gttcttcgtc cgcttcggtg tgagcaaggc caactatggc gcaccgttcg   5620
ctgatcggtg gttcaggcgg catgacggcg gggtgctcaa gcccgccgtg ctggagaggc   5680
agcgcaagag caagggggtg ccccgtggtg aagcctaaga acaagcacag cctcagccac   5740
gtccggcacg acccggcgca ctgtctggcc cccggcctgt tccgtgccct caagcggggc   5800
gagcgcaagc gcagcaagct ggacgtgacg tatgactacg gcgacggcaa gcggatcgag   5860
ttcagcggcc cggagccgct gggcgctgat gatctgcgca tcctgcaagg gctggtggcc   5920
atggctgggc ctaatggcct agtgcttggc ccggaaccca agaccgaagg cggacggcag   5980
ctccggctgt tcctggaacc caagtgggag gccgtcaccg ctgaatgcca tgtggtcaaa   6040
ggtagctatc gggcgctggc aaaggaaatc ggggcagagg tcgatagtgg tggggcgctc   6100
aagcacatac aggactgcat cgagcgcctt tggaaggtat ccatcatcgc ccagaatggc   6160
cgcaagcggc aggggtttcg gctgctgtcg gagtacgcca gcgacgaggc ggacgggcgc   6220
ctgtacgtgg ccctgaaccc cttgatcgcg caggccgtca tgggtggcgg ccagcatgtg   6280
cgcatcagca tggacgaggt gcgggcgctg gacagcgaaa ccgcccgcct gctgcaccag   6340
cggctgtgtg gctggatcga ccccggcaaa accggcaagg cttccataga taccttgtgc   6400
ggctatgtct ggccgtcaga ggccagtggt tcgaccatgc gcaagcgccg ccagcgggtg   6460
cgcgaggcgt tgccggagct ggtcgcgctg ggctggacgg taaccgagtt cgcggcgggc   6520
aagtacgaca tcacccggcc caaggcggca ggctgacccc ccccactcta ttgtaaacaa   6580
gacattttta tcttttatat tcaatggctt attttcctgc taattggtaa taccatgaaa   6640
aataccatgc tcagaaaagg cttaacaata ttttgaaaaa ttgcctactg agcgctgccg   6700
cacagctcca taggccgctt tcctggcttt gcttccagat gtatgctctt ctgctcctgc   6760
agagcttgcc gccgccgcag gtggagctga cttcatccgc acacacgagc cgcgcccctt   6820
gcgcgacggg ctggcggtat tggcggcgct gaaagaaacc gcaa                    6864
<210>28
<211>264
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<400>28
Met Lys Gln Tyr Leu Glu Leu Met Gln Lys Val Leu Asp Glu Gly Thr
1               5                   10                  15
Gln Lys Asn Asp Arg Thr Gly Thr Gly Thr Leu Ser Ile Phe Gly His
            20                  25                  30
Gln Met Arg Phe Asn Leu Gln Asp Gly Phe Pro Leu Val Thr Thr Lys
        35                  40                  45
Arg Cys His Leu Arg Ser Ile Ile His Glu Leu Leu Trp Phe Leu Gln
    50                  55                  60
Gly Asp Thr Asn Ile Ala Tyr Leu His Glu Asn Asn Val Thr Ile Trp
65                  70                  75                  80
Asp Glu Trp Ala Asp Glu Asn Gly Asp Leu Gly Pro Val Tyr Gly Lys
                85                  90                  95
Gln Trp Arg Ala Trp Pro Thr Pro Asp Gly Arg His Ile Asp Gln Ile
            100                 105                 110
Thr Thr Val Leu Asn Gln Leu Lys Asn Asp Pro Asp Ser Arg Arg Ile
        115                 120                 125
Ile Val Ser Ala Trp Asn Val Gly Glu Leu Asp Lys Met Ala Leu Ala
    130                 135                 140
Pro Cys His Ala Phe Phe Gln Phe Tyr Val Ala Asp Gly Lys Leu Ser
145                 150                 155                 160
Cys Gln Leu Tyr Gln Arg Ser Cys Asp Val Phe Leu Gly Leu Pro Phe
                165                 170                 175
Asn Ile Ala Ser Tyr Ala Leu Leu Val His Met Met Ala Gln Gln Cys
            180                 185                 190
Asp Leu Glu Val Gly Asp Phe Val Trp Thr Gly Gly Asp Thr His Leu
        195                 200                 205
Tyr Ser Asn His Met Asp Gln Thr His Leu Gln Leu Ser Arg Glu Pro
    210                 215                 220
Arg Pro Leu Pro Lys Leu Ile Ile Lys Arg Lys Pro Glu Ser Ile Phe
225                 230                 235                 240
Asp Tyr Arg Phe Glu Asp Phe Glu Ile Glu Gly Tyr Asp Pro His Pro
                245                 250                 255
Gly Ile Lys Ala Pro Val Ala Ile
            260
<210>29
<211>37
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>P1
<400>29
cctttggtac cagatctgcg ggcagtgagc gcaacgc   37
<210>30
<211>36
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>P2
<400>30
aattgggatc cgctcactgc ccgctttcca gtcggg    36
<210>31
<211>38
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>P3
<400>31
cgcttggatc cggggggtgg cccgatgaag aacgacag  38
<210>32
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>P4
<400>32
ctcttggtac cgcctgatat acacgtcatt gcc    33
<210>33
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>P5
<400>33
tagcgagatc tctgatgtcc ggcggtgctt ttg    33
<210>34
<211>32
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>P6
<400>34
aaaaagagct cttacgcccc gccctgccac tc     32
<210>35
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>P7
<400>35
cctttgagct cgcgggcagt gagcgcaacg c      31
<210>36
<211>34
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>P8
<400>36
ctgtttctag atcctgtgtg aaattgttat ccgc   34
<210>37
<211>61
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>P9
<400>37
gcagggcctg tctcggtcga tcattcagcc cggctcatag atctctgatg tccggcggtg   60
c                                                                   61
<210>38
<211>26
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>ThyA1
<400>38
cggaattcct gattggttac ggcgcg                                        26
<210>39
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>ThyA2
<400>39
cccaagcttc gtaattagat agccaccgg                                     29
<210>40
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>ThyA4
<400>40
ggtgcctggg tgcatgatat aatcatgggg caa                                33
<210>41
<211>28
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>ThyA5
<400>41
gccccatgat aatatcatgc acccaggc                                      28
<210>42
<211>28
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>ThyA16
<400>42
ctgtggtttc tccagggcga cactaaca                                     28
<210>43
<211>28
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>ThyA17
<400>43
tgttagtgtc gccctggaga aaccacag                                     28
<210>44
<211>795
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(795)
<223>thyA
<400>44
atg aaa cag tat tta gaa ctg atg caa aaa gtg ctc gac gaa ggc aca    48
Met Lys Gln Tyr Leu Glu Leu Met Gln Lys Val Leu Asp Glu Gly Thr
1               5                   10                  15
cag aaa aac gac cgt acc gga acc gga acg ctt tcc att ttt ggt cat    96
Gln Lys Asn Asp Arg Thr Gly Thr Gly Thr Leu Ser Ile Phe Gly His
            20                  25                  30
cag atg cgt ttt aac ctg caa gat gga ttc ccg ctg gtg aca act aaa    144
Gln Met Arg Phe Asn Leu Gln Asp Gly Phe Pro Leu Val Thr Thr Lys
        35                  40                  45
cgt tgc cac ctg cgt tcc atc atc cat gaa ctg ctg tgg ttt ctg cag    192
Arg Cys His Leu Arg Ser Ile Ile His Glu Leu Leu Trp Phe Leu Gln
    50                  55                  60
ggc gac act aac att gct tat cta cac gaa aac aat gtc acc atc tgg    240
Gly Asp Thr Asn Ile Ala Tyr Leu His Glu Asn Asn Val Thr Ile Trp
65                  70                  75                  80
gac gaa tgg gcc gat gaa aac ggc gac ctc ggg cca gtg tat ggt aaa    288
Asp Glu Trp Ala Asp Glu Asn Gly Asp Leu Gly Pro Val Tyr Gly Lys
                85                  90                  95
cag tgg cgc gcc tgg cca acg cca gat ggt cgt cat att gac cag atc    336
Gln Trp Arg Ala Trp Pro Thr Pro Asp Gly Arg His Ile Asp Gln Ile
            100                 105                 110
act acg gta ctg aac cag ctg aaa aac gac ccg gat tcg cgc cgc att    384
Thr Thr Val Leu Asn Gln Leu Lys Asn Asp Pro Asp Ser Arg Arg Ile
        115                 120                 125
att gtt tca gcg tgg aac gta ggc gaa ctg gat aaa atg gcg ctg gca    432
Ile Val Ser Ala Trp Asn Val Gly Glu Leu Asp Lys Met Ala Leu Ala
    130                 135                 140
ccg tgc cat gca ttc ttc cag ttc tat gtg gca gac ggc aaa ctc tct    480
Pro Cys His Ala Phe Phe Gln Phe Tyr Val Ala Asp Gly Lys Leu Ser
145                 150                 155                 160
tgc cag ctt tat cag cgc tcc tgt gac gtc ttc ctc ggc ctg ccg ttc    528
Cys Gln Leu Tyr Gln Arg Ser Cys Asp Val Phe Leu Gly Leu Pro Phe
                165                 170                 175
aac att gcc agc tac gcg tta ttg gtg cat atg atg gcg cag cag tgc    576
Asn Ile Ala Ser Tyr Ala Leu Leu Val His Met Met Ala Gln Gln Cys
            180                 185                 190
gat ctg gaa gtg ggt gat ttt gtc tgg acc ggt ggc gac acg cat ctg    624
Asp Leu Glu Val Gly Asp Phe Val Trp Thr Gly Gly Asp Thr His Leu
        195                 200                 205
tac agc aac cat atg gat caa act cat ctg caa tta agc cgc gaa ccg    672
Tyr Ser Asn His Met Asp Gln Thr His Leu Gln Leu Ser Arg Glu Pro
    210                 215                 220
cgt ccg ctg ccg aag ttg att atc aaa cgt aaa ccc gaa tcc atc ttc    720
Arg Pro Leu Pro Lys Leu Ile Ile Lys Arg Lys Pro Glu Ser Ile Phe
225                 230                 235                 240
gac tac cgt ttc gaa gac ttt gag att gaa ggc tac gat ccg cat ccg    768
Asp Tyr Arg Phe Glu Asp Phe Glu Ile Glu Gly Tyr Asp Pro His Pro
                245                 250                 255
ggc att aaa gcg ccg gtg gct atc taa                                795
Gly Ile Lys Ala Pro Val Ala Ile
            260
<210>45
<211>264
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<400>45
Met Lys Gln Tyr Leu Glu Leu Met Gln Lys Val Leu Asp Glu Gly Thr
1               5                   10                  15
Gln Lys Asn Asp Arg Thr Gly Thr Gly Thr Leu Ser Ile Phe Gly His
            20                  25                  30
Gln Met Arg Phe Asn Leu Gln Asp Gly Phe Pro Leu Val Thr Thr Lys
        35                  40                  45
Arg Cys His Leu Arg Ser Ile Ile His Glu Leu Leu Trp Phe Leu Gln
    50                  55                  60
Gly Asp Thr Asn Ile Ala Tyr Leu His Glu Asn Asn Val Thr Ile Trp
65                  70                  75                  80
Asp Glu Trp Ala Asp Glu Asn Gly Asp Leu Gly Pro Val Tyr Gly Lys
                85                  90                  95
Gln Trp Arg Ala Trp Pro Thr Pro Asp Gly Arg His Ile Asp Gln Ile
            100                 105                 110
Thr Thr Val Leu Asn Gln Leu Lys Asn Asp Pro Asp Ser Arg Arg Ile
        115                 120                 125
Ile Val Ser Ala Trp Asn Val Gly Glu Leu Asp Lys Met Ala Leu Ala
    130                 135                 140
Pro Cys His Ala Phe Phe Gln Phe Tyr Val Ala Asp Gly Lys Leu Ser
145                 150                 155                 160
Cys Gln Leu Tyr Gln Arg Ser Cys Asp Val Phe Leu Gly Leu Pro Phe
                165                 170                 175
Asn Ile Ala Ser Tyr Ala Leu Leu Val His Met Met Ala Gln Gln Cys
            180                 185                 190
Asp Leu Glu Val Gly Asp Phe Val Trp Thr Gly Gly Asp Thr His Leu
        195                 200                 205
Tyr Ser Asn His Met Asp Gln Thr His Leu Gln Leu Ser Arg Glu Pro
    210                 215                 220
Arg Pro Leu Pro Lys Leu Ile Ile Lys Arg Lys Pro Glu Ser Ile Phe
225                 230                 235                 240
Asp Tyr Arg Phe Glu Asp Phe Glu Ile Glu Gly Tyr Asp Pro His Pro
                245                 250                 255
Gly Ile Lys Ala Pro Val Ala Ile
            260
<210>46
<211>618
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(618)
<223>tdk
<400>46
atg gca cag cta tat ttc tac tat tcc gca atg aat gcg ggt aag tct    48
Met Ala Gln Leu Tyr Phe Tyr Tyr Ser Ala Met Asn Ala Gly Lys Ser
1               5                   10                  15
aca gca ttg ttg caa tct tca tac aat tac cag gaa cgc ggc atg cgc      96
Thr Ala Leu Leu Gln Ser Ser Tyr Asn Tyr Gln Glu Arg Gly Met Arg
            20                  25                  30
act gtc gta tat acg gca gaa att gat gat cgc ttt ggt gcc ggg aaa      144
Thr Val Val Tyr Thr Ala Glu Ile Asp Asp Arg Phe Gly Ala Gly Lys
        35                  40                  45
gtc agt tcg cgt ata ggt ttg tca tcg cct gca aaa tta ttt aac caa      192
Val Ser Ser Arg Ile Gly Leu Ser Ser Pro Ala Lys Leu Phe Asn Gln
    50                  55                  60
aat tca tca tta ttt gat gag att cgt gcg gaa cat gaa cag cag gca      240
Asn Ser Ser Leu Phe Asp Glu lle Arg Ala Glu His Glu Gln Gln Ala
65                  70                  75                  80
att cat tgc gta ctg gtt gat gaa tgc cag ttt tta acc aga caa caa      288
Ile His Cys Val Leu Val Asp Glu Cys Gln Phe Leu Thr Arg Gln Gln
                85                  90                  95
gta tat gaa tta tcg gag gtt gtc gat caa ctc gat ata ccc gta ctt      336
Val Tyr Glu Leu Ser Glu Val Val Asp Gln Leu Asp Ile Pro Val Leu
            100                 105                 110
tgt tat ggt tta cgt acc gat ttt cga ggt gaa tta ttt att ggc agc      384
Cys Tyr Gly Leu Arg Thr Asp Phe Arg Gly Glu Leu Phe Ile Gly Ser
        115                 120                 125
caa tac tta ctg gca tgg tcc gac aaa ctg gtt gaa tta aaa acc atc      432
Gln Tyr Leu Leu Ala Trp Ser Asp Lys Leu Val Glu Leu Lys Thr Ile
    130                 135                 140
tgt ttt tgt ggc cgt aaa gca agc atg gtg ctg cgt ctt gar caa gca      480
Cys Phe Cys Gly Arg Lys Ala Ser Met Val Leu Arg Leu Asp Gln Ala
145                 150                 155                 160
ggc aga cct tat aac gaa ggt gag cag gtg gta att ggt ggt aat gaa      528
Gly Arg Pro Tyr Asn Glu Gly Glu Gln Val Val Ile Gly Gly Asn Glu
                165                 170                 175
cga tac gtt tct gta tgc cgt aaa cac tat aaa gag gcg tta caa gtc      576
Arg Tyr Val Ser Val Cys Arg Lys His Tyr Lys Glu Ala Leu Gln Val
            180                 185                 190
gac tca tta acg gct att cag gaa agg cat cgc cac gat taa              618
Asp Ser Leu Thr Ala Ile Gln Glu Arg His Arg His Asp
        195                 200                 205
<210>47
<211>205
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<400>47
Met Ala Gln Leu Tyr Phe Tyr Tyr Ser Ala Met Asn Ala Gly Lys Ser
1               5                   10                  15
Thr Ala Leu Leu Gln Ser Ser Tyr Asn Tyr Gln Glu Arg Gly Met Arg
            20                  25                  30
Thr Val Val Tyr Thr Ala Glu Ile Asp Asp Arg Phe Gly Ala Gly Lys
        35                  40                  45
Val Ser Ser Arg Ile Gly Leu Ser Ser Pro Ala Lys Leu Phe Asn Gln
    50                  55                  60
Asn Ser Ser Leu Phe Asp Glu Ile Arg Ala Glu His Glu Gln Gln Ala
65                  70                  75                  80
Ile His Cys Val Leu Val Asp Glu Cys Gln Phe Leu Thr Arg Gln Gln
                85                  90                  95
Val Tyr Glu Leu Ser Glu Val Val Asp Gln Leu Asp Ile Pro Val Leu
            100                 105                 110
Cys Tyr Gly Leu Arg Thr Asp Phe Arg Gly Glu Leu Phe Ile Gly Ser
        115                 120                 125
Gln Tyr Leu Leu Ala Trp Ser Asp Lys Leu Val Glu Leu Lys Thr Ile
    130                 135                 140
Cys Phe Cys Gly Arg Lys Ala Ser Met Val Leu Arg Leu Asp Gln Ala
145                 150                 155                 160
Gly Arg Pro Tyr Asn Glu Gly Glu Gln Val Val Ile Gly Gly Asn Glu
                165                 170                 175
Arg Tyr Val Ser Val Cys Arg Lys His Tyr Lys Glu Ala Leu Gln Val
            180                 185                 190
Asp Ser Leu Thr Ala Ile Gln Glu Arg His Arg His Asp
        195                 200                 205
<210>48
<211>7965
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<400>48
aactgcacat tcgggatatt tctctatatt cgcgcttcat cagaaaactg aaggaacctc    60
cattgaatcg aactaatatt ttttttggtg aatcgcattc tgactggttg cctgtcagag    120
gcggagaatc tggtgatttt gtttttcgac gtggtgacgg gcatgccttc gcgaaaatcg    180
cacctgcttc ccgccgcggt gagctcgctg gagagcgtga ccgcctcatt tggctcaaag    240
gtcgaggtgt ggcttgcccc gaggtcatca actggcagga ggaacaggag ggtgcatgct    300
tggtgataac ggcaattccg ggagtaccgg cggctgatct gtctggagcg gatttgctca    360
aagcgtggcc gtcaatgggg cagcaacttg gcgctgttca cagcctatcg gttgatcaat    420
gtccgtttga gcgcaggctg tcgcgaatgt tcggacgcgc cgttgatgtg gtgtcccgca    480
atgccgtcaa tcccgacttc ttaccggacg aggacaagag tacgccgctg cacgatcttt    540
tggctcgtgt cgaacgagag ctaccggtgc ggctcgacca agagcgcacc gatatggttg    600
tttgccatgg tgatccctgc atgccgaact tcatggtgga ccctaaaact cttcaatgca    660
cgggtctgat cgaccttggg cggctcggaa cagcagatcg ctatgccgat ttggcactca    720
tgattgctaa cgccgaagag aactgggcag cgccagatga agcagagcgc gccttcgctg    780
tcctattcaa tgtattgggg atcgaagccc ccgaccgcga acgccttgcc ttctatctgc    840
gattggaccc tctgacttgg ggttgatgtt catgccgcct gtttttcctg ctcattggca    900
cgtttcgcaa cctgttctca ttgcggacac cttttccagc ctcgtttgga aagtttcatt    960
gccagacggg actcctgcaa tcgtcaaggg attgaaacct atagaagaca ttgctgatga    1020
actgcgcggg gccgactatc tggtatggcg caatgggagg ggagcagtcc ggttgctcgg    1080
tcgtgagaac aatctgatgt tgctcgaata tgccggggag cgaatgctct ctcacatcgt    1140
tgccgagcac ggcgactacc aggcgaccga aattgcagcg gaactaatgg cgaagctgta    1200
tgccgcatct gaggaacccc tgccttctgc ccttctcccg atccgggatc gctttgcagc    1260
tttgtttcag cgggcgcgcg atgatcaaaa cgcaggttgt caaactgact acgtccacgc    1320
ggcgattata gccgatcaaa tgatgagcaa tgcctcggaa ctgcgtgggc tacatggcga    1380
tctgcatcat gaaaacatca tgttctccag tcgcggctgg ctggtgatag atcccgtcgg    1440
tctggtcggt gaagtgggct ttggcgccgc caatatgttc tacgatccgg ctgacagaga    1500
cgacctttgt ctcgatccta gacgcattgc acagatggcg gacgcattct ctcgtgcgct    1560
ggacgtcgat ccgcgtcgcc tgctcgacca ggcgtacgct tatgggtgcc tttccgcagc    1620
ttggaacgcg gatggagaag aggagcaacg cgatctagct atcgcggccg cgatcaagca    1680
ggtgcgacag acgtcatact agatatcaag cgacttctcc tatcccctgg gaacacatca    1740
atctcaccgg agaatatcgc tggccaaagc cttagcgtag gattccgccc cttcccgcaa    1800
acgaccccaa acaggaaacg cagctgaaac gggaagctca acacccactg acgcatgggt    1860
tgttcaggca gtacttcatc aaccagcaag gcggcacttt cggccatccg ccgcgcccca    1920
cagctcgggc agaaaccgcg acgcttacag ctgaaagcga ccaggtgctc ggcgtggcaa    1980
gactcgcagc gaacccgtag aaagccatgc tccagccgcc cgcattggag aaattcttca    2040
aattcccgtt gcacatagcc cggcaattcc tttccctgct ctgccataag cgcagcgaat    2100
gccgggtaat actcgtcaac gatctgatag agaagggttt gctcgggtcg gtggctctgg    2160
taacgaccag tatcccgatc ccggctggcc gtcctggccg ccacatgagg catgttccgc    2220
gtccttgcaa tactgtgttt acatacagtc tatcgcttag cggaaagttc ttttaccctc    2280
agccgaaatg cctgccgttg ctagacattg ccagccagtg cccgtcactc ccgtactaac   2340
tgtcacgaac ccctgcaata actgtcacgc ccccctgcaa taactgtcac gaacccctgc   2400
aataactgtc acgcccccaa acctgcaaac ccagcagggg cgggggctgg cggggtgttg   2460
gaaaaatcca tccatgatta tctaagaata atccactagg cgcggttatc agcgcccttg   2520
tggggcgctg ctgcccttgc ccaatatgcc cggccagagg ccggatagct ggtctattcg   2580
ctgcgctagg ctacacaccg ccccaccgct gcgcggcagg gggaaaggcg ggcaaagccc   2640
gctaaacccc acaccaaacc ccgcagaaat acgctggagc gcttttagcc gctttagcgg   2700
cctttccccc tacccgaagg gtgggggcgc gtgtgcagcc ccgcagggcc tgtctcggtc   2760
gatcattcag cccggctcat agatctgcgg gcagtgagcg caacgcaatt aatgtgagtt   2820
agctcactca ttaggcaccc caggctttac actttatgct tccggctcgt ataatgtgtg   2880
gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gatctagaaa taattttgtt taactttaag   2940
aaggagatat acatatgtga aaccagtaac gttatacgat gtcgcagagt atgccggtgt   3000
ctcttatcag accgtttccc gcgtggtgaa ccaggccagc cacgtttctg cgaaaacgcg   3060
ggaaaaagtg gaagcggcga tggcggagct gaattacatt cccaaccgcg tggcacaaca   3120
actggcgggc aaaccgtcga agcctgtaaa gcggcggtgc acaatcttct cgcgcaacgc   3180
gtcagtgggc tgatagtcgt tgctgattgg cgttgccacc tccagtctgg ccctgcacgc   3240
gccgtcgcaa attgtcgcgg cgattaaatc tcgcgccgat caactgggtg ccagcgtggt   3300
ggtgtcgatg gtagaacgaa gcggcattaa ctatccgctg gatgaccagg atgccattgc   3360
tgtggaagct gcctgcacta atgttccggc gttatttctt gatgtctctg accagacacc   3420
catcaacagt attattttct cccatgaaga cggtacgcga ctgggcgtgg agcatctggt   3480
cgcattgggt caccagcaaa tcgcgctgtt agcgggccca ttaagttctg tctcggcgcg   3540
tctgcgtctg gctggctggc ataaatatct cactcgcaat caaattcagc cgatagcgga   3600
acgggaaggc gactggagtg ccatgtccgg ttttcaacaa accatgcaaa tgctgaatga   3660
gggcatcgtt cccactgcga tgctggttgc caacgatcag atggcgctgg gcgcaatgcg   3720
cgccattacc gagtccgggc tgcgcgttgg tgcggatatc ggcgtcaggg acgccaccac   3780
cggccagatg atgaaccggg aatggtcagc cgccgaagtg ctccagaaca cgccatggct   3840
caagcggatg aatgcccagg gcaatgacgt gtatatcagg cccgccgagc aggagcggca   3900
tggtctggtg ctggtggacg acctcagcga gtttgacctg gatgacatga aagccgaggg   3960
ccgggagcct gccctggtag tggaaaccag cccgaagaac tatcaggcat gggtcaaggt   4020
ggccgacgcc gcaggcggtg aacttcgggg gcagattgcc cggacgctgg ccagcgagta   4080
cgacgccgac ccggccagcg ccgacagccg ccactatggc cgcttggcgg gcttcaccaa   4140
ccgcaaggac aagcacacca cccgcgccgg ttatcagccg tgggtgctgc tgcgtgaatc   4200
caagggcaag accgccaccg ctggcccggc gctggtgcag caggctggcc agcagatcga   4260
gcaggcccag cggcagcagg agaaggcccg caggctggcc agcctcgaac tgcccgagcg   4320
gcagcttagc cgccaccggc gcacggcgct ggacgagtac cgcagcgaga tggccgggct   4380
ggtcaagcgc ttcggtgatg acctcagcaa gtgcgacttt atcgccgcgc agaagctggc   4440
cagccggggc cgcagtgccg aggaaatcgg caaggccatg gccgaggcca gcccagcgct   4500
ggcagagcgc aagcccggcc acgaagcgga ttacatcgag cgcaccgtca gcaaggtcat   4560
gggtctgccc agcgtccagc ttgcgcgggc cgagctggca cgggcaccgg caccccgcca   4620
gcgaggcatg gacaggggcg ggccagattt cagcatgtag tgcttgcgtt ggtactcacg   4680
cctgttatac tatgagtact cacgcacaga agggggtttt atggaatacg aaaaaagcgc   4740
ttcagggtcg gtctacctga tcaaaagtga caagggctat tggttgcccg gtggctttgg   4800
ttatacgtca aacaaggccg aggctggccg cttttcagtc gctgatatgg ccagccttaa   4860
ccttgacggc tgcaccttgt ccttgttccg cgaagacaag cctttcggcc ccggcaagtt   4920
tctcggtgac tgatatgaaa gaccaaaagg acaagcagac cggcgacctg ctggccagcc   4980
ctgacgctgt acgccaagcg cgatatgccg agcgcatgaa ggccaaaggg atgcgtcagc   5040
gcaagttctg gctgaccgac gacgaatacg aggcgctgcg cgagtgcctg gaagaactca   5100
gagcggcgca gggcgggggt agtgaccccg ccagcgccta accaccaact gcctgcaaag   5160
gaggcaatca atggctaccc ataagcctat caatattctg gaggcgttcg cagcagcgcc   5220
gccaccgctg gactacgttt tgcccaacat ggtggccggt acggtcgggg cgctggtgtc   5280
gcccggtggt gccggtaaat ccatgctggc cctgcaactg gccgcacaga ttgcaggcgg   5340
gccggatctg ctggaggtgg gcgaactgcc caccggcccg gtgatctacc tgcccgccga   5400
agacccgccc accgccattc atcaccgcct gcacgccctt ggggcgcacc tcagcgccga   5460
ggaacggcaa gccgtggctg acggcctgct gatccagccg ctgatcggca gcctgcccaa   5520
catcatggcc ccggagtggt tcgacggcct caagcgcgcc gccgagggcc gccgcctgat   5580
ggtgctggac acgctgcgcc ggttccacat cgaggaagaa aacgccagcg gccccatggc   5640
ccaggtcatc ggtcgcatgg aggccatcgc cgccgatacc gggtgctcta tcgtgttcct   5700
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cgccgaggcc gaggaatggg gtgtggacga cgaccagcgc cggttcttcg tccgcttcgg   5880
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cggggtgctc aagcccgccg tgctggagag gcagcgcaag agcaaggggg tgccccgtgg   6000
tgaagcctaa gaacaagcac agcctcagcc acgtccggca cgacccggcg cactgtctgg   6060
cccccggcct gttccgtgcc ctcaagcggg gcgagcgcaa gcgcagcaag ctggacgtga   6120
cgtatgacta cggcgacggc aagcggatcg agttcagcgg cccggagccg ctgggcgctg   6180
atgatctgcg catcctgcaa gggctggtgg ccatggctgg gcctaatggc ctagtgcttg   6240
gcccggaacc caagaccgaa ggcggacggc agctccggct gttcctggaa cccaagtggg   6300
aggccgtcac cgctgaatgc catgtggtca aaggtagcta tcgggcgctg gcaaaggaaa   6360
tcggggcaga ggtcgatagt ggtggggcgc tcaagcacat acaggactgc atcgagcgcc   6420
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cggagtacgc cagcgacgag gcggacgggc gcctgtacgt ggccctgaac cccttgatcg   6540
cgcaggccgt catgggtggc ggccagcatg tgcgcatcag catggacgag gtgcgggcgc   6600
tggacagcga aaccgcccgc ctgctgcacc agcggctgtg tggctggatc gaccccggca   6660
aaaccggcaa ggcttccata gataccttgt gcggctatgt ctggccgtca gaggccagtg   6720
gttcgaccat gcgcaagcgc cgccagcggg tgcgcgaggc gttgccggag ctggtcgcgc   6780
tgggctggac ggtaaccgag ttcgcggcgg gcaagtacga catcacccgg cccaaggcgg   6840
caggctgacc ccccccactc tattgtaaac aagacatttt tatcttttat attcaatggc   6900
ttattttcct gctaattggt aataccatga aaaataccat gctcagaaaa ggcttaacaa   6960
tattttgaaa aattgcctac tgagcgctgc cgcacagctc cataggccgc tttcctggct   7020
ttgcttccag atgtatgctc ttctgctcct gcagctaatg gatcaccgca aacaggttac   7080
tcgcctgggg attccctttc gacccgagca tccgtatgat actcatgctc gattattatt   7140
attatagaag cccccatgaa taaatcgctc atcattttcg gcatcgtcaa cataacctcg   7200
gacagtttct ccgatggagg ccggtatctg gcgccagacg cagccattgc gcaggcgcgt   7260
aagctgatgg ccgagggggc agatgtgatc gacctggtcc ggcatccagc aatcccgacg   7320
ccgcgcctgt ttcgtccgac acagaaatcg cgcgtatgcg ccggtgctgg acgcgctcag   7380
gcagatggca ttcccgtctc gctcgacagt tatcaacccg cgacgcaagc ctatgccttg   7440
tcgcgtggtg tggcctatct caatgatatt cgcggttttc cagacgctgc gttctatccg   7500
caattggcga aatcatctgc caaactcgtc gttatgcatt cggtgcaaga cgggcaggca   7560
gatcggcgcg aggcacccgc tggcgacatc atggatcaca ttgcggcgtt ctttgacgcg   7620
cgcatcgcgg cgctgacggg tgccggtatc aaacgcaacc gccttgtcct tgatcccggc   7680
atggggtttt ttctgggggc tgctcccgaa acctcgctct cggtgctggc gcggttcgat   7740
gaattgcggc tgcgcttcga tttgccggtg cttctgtctg tttcgcgcaa atcctttctg   7800
cgcgcgctca caggccgtgg tccgggggtg tcggggccgc gacactcgct gcagagcttg   7860
ccgccgccgc aggtggagct gacttcatcc gcacacacga gccgcgcccc ttgcgcgacg   7920
ggctggcggt attggcggcg ctgaaagaaa ccgcaagaat tcgtt                   7965

Claims (13)

1.RSF1010衍生的Mob-质粒，其中所述质粒选自下组：SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：27、和SEQ ID NO：48，以及与SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：27、和SEQ ID NO：48至少95％同源的SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：27、和SEQ IDNO：48的变体，并且其中所述质粒经过修饰以使与转移能力有关的一种或多种基因失活。
2.根据权利要求1的质粒，其中所述质粒经修饰以使抗生素抗性基因失活。
3.根据权利要求1的质粒，其中所述质粒经修饰以增加所述质粒的拷贝数。
4.根据权利要求1的质粒，其包含PlacUV5启动子和来自不含mob基因座的RSF1010的复制起点。
5.根据权利要求1的质粒，其还包含胸苷酸合酶基因。
6.根据权利要求1的质粒，其还包含目标基因。
7.包含权利要求1的质粒的细菌。
8.根据权利要求7的细菌，其中所述细菌为革兰氏阴性细菌。
9.根据权利要求8的细菌，其中所述细菌缺乏活性胸苷酸合酶并缺乏活性胸苷激酶。
10.根据权利要求9的细菌，其中所述细菌具有生产有用代谢物的能力。
11.根据权利要求10的细菌，其中所述有用代谢物选自下组：天然或重组的蛋白质、酶、L-氨基酸、核苷、核苷酸、有机酸和维生素。
12.生产有用代谢物的方法，包括(a)在培养基中培养根据权利要求10的细菌和(b)从所述培养基收集所述有用代谢物。
13.根据权利要求12的方法，其中所述有用代谢物选自下组：天然或重组的蛋白质、酶、L-氨基酸、核苷、核苷酸、有机酸和维生素。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111471685A (zh) * 2020-05-21 2020-07-31 中国科学院水生生物研究所 一种喇叭虫rna干扰表达载体与构建方法及其应用

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2229513C2 (ru) * 2001-11-23 2004-05-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" Способ получения l-аминокислот, штамм escherichia coli - продуцент l-аминокислоты (варианты)
GB0207021D0 (en) * 2002-03-25 2002-05-08 Univ Warwick Anti-bacterial agents
RU2004124226A (ru) 2004-08-10 2006-01-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) Использование фосфокетолазы для продукции полезных метаболитов
US7915018B2 (en) 2004-10-22 2011-03-29 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing L-amino acids using bacteria of the Enterobacteriaceae family
ATE417119T1 (de) 2005-02-18 2008-12-15 Ajinomoto Kk Verfahren zur herstellung einer nichtaromatischen l-aminosäure unter verwendung eines bakteriums der familie enterobacteriaceae mit abgeschwächter expression des csra-gens
WO2006088235A1 (en) 2005-02-18 2006-08-24 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing an l-amino acid using a bacterium of the enterobacteriaceae family
EP1907529A1 (en) * 2005-07-25 2008-04-09 Ajinomoto Co., Inc. A METHOD FOR PRODUCING AN L-AMINO ACID USING A BACTERIUM OF THE ENTEROBACTERIACEAE FAMILY WITH ATTENUATED EXPRESSION OF THE cpxR GENE
WO2007018310A1 (en) * 2005-08-09 2007-02-15 Ajinomoto Co., Inc. A METHOD FOR PRODUCING AN L-AMINO ACID USING A BACTERIUM OF THE ENTEROBACTERIACEAE FAMILY WITH ATTENUATED EXPRESSION OF THE ybiV GENE
EP2004803A2 (en) 2006-03-23 2008-12-24 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing an l-amino acid using bacterium of theenterobacteriaceae family with attenuated expression of a gene coding for small rna
WO2007119890A1 (en) 2006-04-18 2007-10-25 Ajinomoto Co., Inc. A METHOD FOR PRODUCING AN L-AMINO ACID USING A BACTERIUM OF THE ENTEROBACTERIACEAE FAMILY WITH ATTENUATED EXPRESSION OF THE sfmACDFH-fimZ CLUSTER OR THE fimZ GENE
RU2006129690A (ru) 2006-08-16 2008-02-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИЙ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА ydiN, ГЕНА ydiB ИЛИ ИХ КОМБИНАЦИИ
US8318481B2 (en) * 2007-12-07 2012-11-27 Pfenex Inc. High copy number self-replicating plasmids in pseudomonas
RU2008105793A (ru) * 2008-02-19 2009-08-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) Способ конструирования оперонов, содержащих трансляционно сопряженные гены, бактерия, содержащая такой оперон, способ продукции полезного метаболита и способ мониторинга экспрессии гена
CN115109791B (zh) * 2022-06-22 2023-09-01 华南农业大学 一种基于IncQ型质粒泛宿主的功能基因递送载体、构建方法和应用

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4912046A (en) * 1983-06-27 1990-03-27 Genentech, Inc. Portable inducible control system
IE892131A1 (en) * 1989-06-30 1991-01-02 Univ Cork Marker genes for genetic manipulation
US5670343A (en) * 1990-04-24 1997-09-23 Rhone Poulenc Biochimie Cloning and/or expression vectors, preparation method and their use
US6916646B1 (en) * 1997-06-23 2005-07-12 Genencor International, Inc. Enterobacteriaceae fermentation strains
RU2212447C2 (ru) * 2000-04-26 2003-09-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" Штамм escherichia coli - продуцент аминокислоты (варианты) и способ получения аминокислот (варианты)
RU2229513C2 (ru) * 2001-11-23 2004-05-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" Способ получения l-аминокислот, штамм escherichia coli - продуцент l-аминокислоты (варианты)
BRPI0407555A (pt) * 2003-02-21 2006-02-14 Kaneka Corp vetor inédito
US20050191684A1 (en) * 2004-02-25 2005-09-01 Zimenkov Danila V. Method for producing L-amino acids

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111471685A (zh) * 2020-05-21 2020-07-31 中国科学院水生生物研究所 一种喇叭虫rna干扰表达载体与构建方法及其应用

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