CN1971280B - 一种透明的温度可程序控制的生物芯片 - Google Patents

Abstract

一种透明和温度可程序控制的生物芯片，属于生物芯片技术领域，该生物芯片系统由温控芯片、冷却风扇和温度控制部分组成，采用氧化铟锡透明导电玻璃为芯片基材，每个温控单元由基材导电面上互相平行的两条引线划分确定，引线由导电性比导电膜材料好的材料构成，在芯片接线处沉积导电金属层，用导电胶将金属片与沉积导电金属层粘接，芯片上每个温控单元和温度控制系统之间至多通过两条引线连接，生化试验直接在温控单元的温控区/面上进行。本发明的生物芯片无需外加温度传感器即可在透明和开放条件下实现对芯片微区温度的实时程序控制；电热效率高，功耗低，升降温速度快。本发明在涉及温度控制的芯片生化试验中将有广泛应用。

Description

一种透明的温度可程序控制的生物芯片 

技术领域

本发明涉及生物芯片技术领域，具体涉及生物芯片(阵列和微流控)系统中微区温度实时控制和微型生化分析仪器领域。 

背景技术

生物芯片技术的发展为高通量生物信息的获得创造了条件，在个性化医药，临床护理诊断，食品分析及检疫等领域有重要应用。生物芯片技术(阵列芯片和微流控芯片)已经取得了很大的进展，并已经逐步实现了商品化，特别是阵列芯片。然而专业人员在使用中发现，仅仅基于分子识别相互作用的阵列芯片给出的信息虽然通量很大，但可靠性较差。因此在现有芯片技术基础上提高数据的重现性和可靠性成为生物芯片技术商品化过程中的重要环节。酶链聚合反应(PCR)由于高选择性引物和探针的使用，加之PCR本身具有的放大作用，使分析灵敏度和可靠性大大增加。利用其特异性和扩增放大特性，PCR不仅被广泛的用于核酸分析，实时定量PCR与抗体结合还被用于低丰度蛋白的定量分析，在提高生物芯片分析灵敏度和可靠性中具有非常重要的意义。无论是传统的生化试验还是PCR衍生的相关生化分析方法，温度控制均是关键条件之一，尤其以PCR芯片最具有代表性。即便恒温扩增也需要温度控制(Notomi T et al，Nucleic Acids Res，2000，28：63)。 

现有芯片温度控制技术主要有两种方式，一个是温度的空间程序控制，一个是给定空间温度的时间程序控制。后者同时具有集成性好，开放性好和空间利用率高的特点。本发明主要与后者有关。温度控制技术中普遍采用的方法是加热和传感单元分立的反馈控制。加热手段主要有电阻加热，半导体热泵(Peltier)，红外线非接触加热。温度传感方法涉及热电阻，热电偶，也有利用温度敏感的光谱特征的非接触传感方法等。利用电热效应和温阻效应的加热和传感方法简单实用，因此成为应用最多的主流方法。利用微加工的方法可将加热单元和温度传感单元集成从而提高控制的可靠性和温度测定的实时性(Lee Dae-Sik et al，Sensorsand materials，2005，17：125-137；El-Ali J et al，Sens Actuators A，2004，110：3)。但是微加工往往涉及复杂的工序和专门的设备，导致芯片的成本大大增加。针对此，有人直接利用透明ITO玻璃上的导电膜分别进行加热和温度传感，用于空间定温控制，并用于连续流通型PCR(Kai S et al，Sens Actuators B，2002，84：283)。以ITO玻璃为基材进行芯片温度时间程序控制并进行生化反应的未见报道。另外对于加热和传感分立的系统，至少需要4个引线连接芯片和控制系统。除了微加工以外，引线多对于尺寸有限的芯片的封装是不利的。针对此有人提出利用加热单元温阻特性实现自身加热和传感的温度控制方法。Dasgupta等用PEFE管道中的Pt丝对管路中的溶液温度进行恒温控制(Dasgupta P K et al，Anal Chem，2003，75：3924)。Friedman等人在毛细管外淀积的ITO同时作为加热和传感单元用于PCR反应(Friedman N A et al，Anal Chem，1998，70：2997)。该方法虽然时下了一体化控制，但是需要用专门设备在毛细管上沉积均匀的导电涂层。如上两种方法不适用于平面上进行高通量芯片生化反应。Shen等采用覆铜的PCB板通过光刻工艺加工得到的铜导线图形同时作为加热和温度传感单元，实现了加热和温度传感一体化控制(Shen K等，Sens Actuators B，2005，105：251)。该方法涉及光刻工序，而且加热芯片基材为透明和导热性较差的聚合物材料。

发明内容

针对上述生物芯片存在的问题，本发明提供一种透明性好，加工方法简单且具有自身传感特点的时间程序控制温度的生物芯片。 

本发明利用透明导电玻璃为芯片基材(总厚度0.2～1.5毫米，方阻10～100欧姆)，可以无需任何微加工工序，直接利用其上的导电膜进行加热和温度传感，实现了芯片微区温度时间程序控制，并直接在芯片上实现了PCR(酶链聚合反应)。 

生物芯片系统主要由温控芯片、冷却风扇和温度控制系统三部分构成，如图1所示。温度控制器用于对温控芯片上给定区域的温度进行实时控制。冷却风扇也通过温度控制系统控制。温控芯片上的温控单元不限于一个。在芯片接线处沉积导电金属层，再用导电胶将金属片与导电金属层粘接，温控芯片通过与金属片焊接的导线与温控系统连接。芯片基材上的每个温控单元由基材导电面上互相平行的两条引线划分确定，每两条引线划分出一个温控单元，引线由导电性比基材导电膜材料好的材料(金，银，铜，铝等金属或导电胶等)构成。每个温控单元和温度控制系统通过两条导线连通，其中一条地线可以和其它温控单元共享。温控芯片上的加热/传感引线通过导电性好的金属层(金，银，铜，铝等金属或导电胶等)引出，结构如图2所示。每个温控单元上的电阻值由该两个平行连线间限定的矩形长宽比和所用ITO玻璃的方阻特性确定，电阻值为5～150欧姆。可将微型传感器用导热胶固定在温控芯片上，用于监测温度程序变化结果或者用于控制传感。该温控芯片上的温控单元的温度既可用其它温度传感器进行控制，也可以不依赖于外部传感器，直接利用加热层的温阻关系实现对微区温度的实时控制。 

温度控制部分通过与负载(即温控芯片上的温控单元)连接的两条导线实现芯片的电加热和温度传感。温度控制系统可采用模拟电路，单片机或计算机及程序。温度传感通过在线测定电阻值，利用加热材料本身的温阻关系转换为温度。利用如上方法测定的温度与设定的温度进行比较，根据比较结果通过模拟比较器、PID算法或模糊算法决定加热与否和加热功率的大小，实现对温控单元温控区温度的程序控制，包括恒定温度，阶梯变化，线性变化等方式的动态控制。冷却风扇主要用于加速冷却过程，或用变速操作进行辅助温度调节，冷却风扇在降温阶段开启，而在升温和温度精密调节阶段风扇处于停止状态。 

以基于PC机的脉宽调制(PWM)控制和ITO玻璃(方阻60欧姆，基材厚度1.1mm)组成的系统为例具体说明如下。系统由温控芯片，接口电路，计算机数据采集卡(DAQ)，计算机控制程序组成。通过A/D，D/A，I/O与接口电路连接，用于功率，冷却风扇工作状态的控制。接口电路主要由恒流源，伺服电源和电子程序开关组成。温度程序控制用脉宽调制方法，每个控制周期分为两个时段，分别用于加热和温度测量操作。温度测量期间，用恒流源注入负载恒定的电流(1mA)，测定负载上的电压降，将该电压降通过DAQA/D转换为数字信号，通过温阻关系换算为实时温度。如上方法得到的实时温度与设定温度比较，再基于PID算法或模糊计算算法确定加热期的时间(脉宽)和功率大小(伺服电源电压水平)。利用如上控制方法实现芯片温控单元上给定微区温度的动态实时程序控制。 

芯片上的生化试验方法包括三种方式，如图3所示。(1)将生物兼容性的聚合物柱形反应池(直径50微米到5毫米)直接粘接在温度控制区，将反应溶液(25微升以下)加入后覆以石蜡油(20微升以下)即可在芯片上直接进行生化实验(如图3A所示)。亦可将柱形反应池置于载玻片上，然后直接将其置于温控区上进行生化试验。(2)对玻璃表面进行疏水处理后直接将反应试剂滴加在芯片上，然后在其上覆以石蜡油在温控区上形成液滴型反应池进行实验(如图3 B所示)。(3)用常用的微加工和封接方法直接在温控区上形成玻璃或聚合物材质的微反应通道，将反应溶液引入通道后，将进出口覆盖以石蜡油，然后进行涉及温度控制的生化实验(如图3C所示)。如上三种试验形式既可以阵列化进行，也可以单独进行。加热芯片的任一一面均可以作为生化反应工作面。一面作为工作面时，另一面保持敞开，并面向风扇产生的冷却气流方向。利用ITO加热面作为工作面时需要在其上旋涂或者压印透明聚合物形成的绝缘层。在工作面的背面用绝缘导热胶粘贴导热性好的材料(例如10～100微米厚的铜，铝等金属片)形成热沉可改善工作区温度的均匀性。在非透明的热沉上打孔(直径在5～1000微米之间)以保持光路的通畅。 

如上方法实现的具有温控功能的生物芯片具有如下明显的特点：芯片每个温度控制区的电接点最多两个，无需外加温度传感器即可在透明和开放条件下实现对芯片微区温度的实时程序控制；电热效率高，功耗低，升降温速度快(使用厚度0.7毫米以下的基材时升降温速度可达10℃/秒以上)；可不用任何微加工步骤，芯片材料导热较好，透明，绝缘，生物兼容性优良；操作方便，容易与其它分离和检测单元，特别是光学检测单元连接；材料便宜易得，即可重复使用，也容易实现一次性使用从而避免生化试验的交叉污染和感染。本发明在涉及温度控制的芯片生化试验中，例如PCR，实时荧光定量PCR，DNA杂交，ELISA，温度变性电泳以及芯片气相色谱等试验中将有广泛应用。 

附图说明

图1为温度控制系统示意图。 

图2为温控芯片(单工作单元)示意图。 

图3为PCR反应池与温控芯片的连接方式示意图(侧视图)。(a)-柱形反应池阵列；(b) -液滴形反应池阵列；C-微通道反应池阵列。 

图4为ITO玻璃芯片的温阻关系曲线，ITO玻璃方阻60欧姆，厚0.7mm。 

图5为温度时间程序控制曲线。(a)-温度三台阶循环控制；(b)-温度线性程序控制。 

图6为芯片PCR产物凝胶电泳图。(a)-双柱反应池芯片三温循环PCR电泳图，其中CK+为台式PCR仪得到的阳性对照，CK-为芯片PCR的阴性对照，1为芯片PCR，M为DNA标准。(b)-液滴型双反应池双温循环PCR产物电泳图，温控区表面经过PDMS处理，其中1，2泳道为液滴反应池PCR产物，M为DNA标准；(c)-2×4阵列柱反应池PCR产物电泳图，其中M为DNA标准，CK+和CK-分别为台式PCR仪试验得到阳性和阴性对照结果，1-8泳道为芯片上八个微柱反应池中扩增得到的PCR产物。 

图7为双链DNA与SYBR Green I(荧光染料)混合体系的荧光随温度的实时变化曲线。 

图中：1-温控芯片负载；2-冷却风扇；3-温度控制器；4-芯片基材；5-导电层(下)；6-电接点；7-温控区/面；8-反应溶液；9-石蜡油；10-温控芯片。 

具体实施方式

实施例 

图5是ITO玻璃的温阻关系曲线。采用ITO玻璃(康达克应用薄膜中心，金坛，江苏)为芯片基材，60欧姆方阻，电接点之间20×20mm见方，0.7mm厚。用镍电镀液(硫酸镍240g/L，氯化镍40g/L，硼酸45g/L，PH 4.5)在芯片接线处电镀沉积镍金属层，后用银导电胶(DAD-40，上海合成树脂研究所)将约100微米厚的紫铜片与电镀金属层粘接后于恒温箱中100℃固化1小时。将微贴片型Pt100传感器用导热胶(HZ-DR3219，无锡百合花胶粘剂厂)固定在温控芯片上后置于精密恒温箱(DHG-9030A，上海精密试验设备有限公司)中，温度平衡后对电阻和温度进行测定。所用ITO玻璃的温阻关系在室温到100℃范围内有很好的线性关系。因此用ITO玻璃导电层作为温度传感是可行的。 

利用ITO本身的温阻特性对芯片温度进行时间程序控制，得到的温度控制曲线参见图6A。数据采集卡DAQ  (PCI 1711，延华(中国)公司)，冷却用风扇(12V，0.195A)，ITO玻璃(康达克应用薄膜中心，金坛，江苏)厚度1.1mm，方阻60欧姆，芯片尺寸20×20mm见方。温度程序控制用LabView 5.0(National Instrument，美国)进行。测温用恒流源电流1.0mA。由图可见在典型PCR三个温度进行循环时温度得到了可靠的控制。同上体系，线型程序升温控制的结果如图6B，在3分钟内温控区温度从40℃线型升温到50℃的温度曲线。 

同以上体系，将两个内径3.5mm高约3mm的聚丙烯塑料管用PDMS(Sylgard 184，Dow Corning)直接粘接于温控芯片导电层的背面，分别加入10微升Tag酶(天根生化科技有限公司，北京)，DNA模版(宝生物工程有限公司，大连)和一对引物(赛百盛基因技术有限公司，北京)的混合试剂，后加入15微升石蜡油覆盖。阴性对照中无模版DNA加入。温度程序95℃变性5分钟，后以95℃30秒，55℃45秒和72℃60秒循环30次后70℃延伸5分钟进行扩增。同样的反应体系(25微升)在台式PCR仪(PTC-200，BioRad公司)中 进行扩增作为对照。琼脂糖凝胶电泳(六一仪器设备厂)分离表征电泳(103V，35分钟)EB染色的CCD电泳图参见图6A，芯片反应池得到了目标阳性扩增产物，扩增效率与台式系统相当。直接用PDMS在芯片工作面上制作液滴型反应池，加入4微升PCR反应试剂，后覆盖15微升石蜡油后进行双温度循环扩增，预变性，具体温度程序如下：94℃ 100秒，94℃20秒，55℃40秒，70℃延伸200秒，循环次数30。反应产物凝胶电泳分离103伏25分钟，结果参见图6B，温控区中的两个反应池中的目标DNA均得到了有效扩增。将8个柱反应池粘接在250微米厚的载玻片上，每个池中分别加入5微升反应溶液并覆盖15微升石蜡油后置于温控芯片上，94℃预变性200秒，然后94℃ 30秒，54℃ 45秒70℃60秒30个循环，70℃延伸200秒，103伏25分钟电泳分离结果如图6C所示，八个反应池中均得到了扩增产物。 

直接将温控芯片置于倒置荧光显微镜(IBE2000，重庆光电仪器有限公司)载物台上，蓝色发光极管代替原配高压汞灯光源，用蓝色滤光片组，光电倍增管(CR131，北京滨松光电子技术股份有限公司)在线检测反应池中荧光染料(SYBR Green I，东盛生物科技有限公司，广东)和dsDNA混合物的荧光随温度的实时变化如图7所示。柱反应池中加入10微升溶液体系，其中含有dsDNA标准500纳克，20×SRBR Green I2微升。倒置荧光显微镜物镜10倍，蓝色滤光片组，3W蓝色发光二极管激发光源驱动电流200mA，光电倍增管高压600V，温度在98℃和55℃间程序变化。利用该芯片自身温控和透明的特点，可实时观测DNA与染料嵌合物的荧光强度随温度变化。 

Claims (10)

1.一种透明的温度可程序控制的生物芯片，其特征在于由温控芯片、冷却风扇和温度控制系统三部分构成，采用透明导电玻璃为芯片基材，温控芯片上的每个温控单元由基材导电面上互相平行的两条引线划分确定，在芯片接线处沉积导电金属层，将金属片与沉积的导电金属层粘接，温控单元通过与金属片焊接的导线与温度控制系统连接，每个温控单元和温度控制系统之间通过两条导线连通。

2.按照权利要求1所述的透明的温度可程序控制的生物芯片，其特征在于芯片基材总厚度0.2～1.5毫米，方阻10～100欧姆。

3.按照权利要求1所述的透明的温度可程序控制的生物芯片，其特征在于引线由导电性比基材导电膜材料好的金、银、铜、铝或导电胶构成。

4.按照权利要求1所述的透明的温度可程序控制的生物芯片，其特征在于每个温控单元其中一条地线和其它温控单元共享。

5.按照权利要求1所述的透明的温度可程序控制的生物芯片，其特征在于每个温控单元的电阻值为5～150欧姆。

6.按照权利要求1所述的透明的温度可程序控制的生物芯片，其特征在于将微型温度传感器用导热胶固定在温控芯片上。

7.按照权利要求1所述的透明的温度可程序控制的生物芯片，其特征在于将生物兼容性材料形成的直径50微米到5毫米的聚合物柱形反应池直接粘接在温度控制区，或在温控面上设置微反应通道。

8.利用权利要求1所述的生物芯片控制温度的方法，其特征在于温度控制系统通过与芯片上的温控单元连接的两条导线实现芯片的电加热和温度传感，温度控制采用模拟电路、单片机或计算机进行程序控制，温度传感通过在线测定电阻值，利用加热材料本身的温阻关系转换为温度，利用如上方法测定的温度与设定的温度进行比较，根据比较结果通过模拟比较器、PID算法或模糊算法决定加热与否和加热功率的大小，实现对芯片温控单元微区温度的程序控制，包括恒定温度，阶梯变化，线性变化方式的动态控制。

9.按照权利要求8所述的方法，其特征在于冷却风扇在降温阶段开启，而在升温和温度精密调节阶段风扇处于停止状态。

10.采用权利要求1所述的生物芯片上进行生化试验的方法，其特征在于芯片上的生化试验方法包括三种方式：

(1)将生物兼容性材料形成的直径50微米到5毫米的聚合物柱形反应池直接粘接在温度控制区，将25微升以下的反应溶液加入后覆以20微升以下的石蜡油，在芯片上直接进行生化实验；或将柱形反应池置于载玻片上，然后将其置于温控区上进行生化试验；

(2)通过对玻璃表面进行疏水处理，直接将反应试剂滴加在芯片上，然后在其上覆以石蜡油在温控区上形成液滴型反应池，进行生化实验；

(3)用常用的玻璃和聚合物基材的微加工和封接方法在温控面上制成微反应通道，将反应溶液引入通道后将进出口覆盖以石蜡油，然后进行涉及温度控制的生化实验。

如上三种实验方法阵列化进行，或单独进行，加热芯片的一面作为工作面时，另一面保持敞开，并面向风扇产生的冷却气流方向，利用透明导电玻璃加热面作为工作面时要在其上旋涂或者压印透明聚合物形成的绝缘层，在工作面的背面用绝缘导热胶粘贴导热性好的材料形成热沉，改善工作区温度的均匀性，在非透明的热沉片上打直径为5～1000微米的孔以保持光路的通畅。

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