CN1962872A - 特异性切割血管内皮生长因子rna的核酶及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了特异性切割血管内皮细胞生长因子的信号肽区(VEGF，NCBI Database，Accession NO.NM_001025370))RNA的锤头型核酶，它具有在RNA稳定性水平和翻译水平上对所有含信号肽编码序列的VEGF剪切形式的表达抑制。本发明还提供了含有该种核酶的重组表达载体(质粒，腺病毒和逆转录病毒)、用该类载体来抑制肿瘤细胞VEGF的过度表达，继而遏制实体肿瘤的生长的方法以及上述核酶或重组表达载体在制备治疗与VEGF过度表达相关的疾病的应用。

Description

特异性切割血管内皮生长因子RNA的核酶及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学和医学领域，具体地说，本发明涉及新的专一性的抗VEGF的核酶及其在抗肿瘤基因治疗领域中的应用。

背景技术

血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)[1，2]通过对血管内皮细胞生长刺激和加强血管内皮的通透性[3，4]来影响血管的生成和功能，是研究最为清楚的促血管生成因子之一[2]。因而，通过对肿瘤中VEGF的过度表达进行抑制，早已成为抗肿瘤基因治疗的重要研究方向。抗VEGF抗体所介导的抗肿瘤临床治疗疗效显著，表明以VEGF为靶点的抗肿瘤目的思路是可行的[5]。其它以抗血管生成作为关键的抗肿瘤的分子生物学手段还包括：抑制VEGF及其受体的激酶活性的小分子药物[6]，和在其表达的转录[7]和转录后环节上的抑制。后者的手段包括反义核酸技术(反义RNA或DNA)[8]，RNA干扰[9]和核酶技术[10]。

核酶[11]是能够特异性地与靶RNA分子配对，继而在特定的位点切割后者，中止相应蛋白产生的核糖核酸分子。目前已知有七大类自然存在的核酶，即一类内含子(group I intron)、二类内含子(group II intron)、RNase P的RNA亚基(RNA subunit ofRNase P)、锤头状核酶(hammerhead ribozyme)、发夹型核酶(hairpin ribozyme)、肝炎δ病毒(hepatitis delta virus，HDV)核酶、和VS核酶(Neurospora Varkud satelliteribozyme)。在核酶家族[12]中，锤头状核酶(hammerhead ribozyme)为最小(长约40-50个核苷酸)，有结构简单和设计简易的优点，因而得到较广泛的重视[13]。

因此，通过能特异性地切割VEGF的核酶来抑制肿瘤中VEGF的过度表达，克服肿瘤血管生成和异常而达到抗肿瘤的作用是一有潜力的治疗手段。

发明内容

本发明的一个目的是提供对VEGF分泌肽区中有专一性核酶活性的核酶，尤其是锤头型核酶((Hammerhead)下简称核酶)。

本发明的另一个目的是用本发明的核酶来遏制VEGF高表达的肿瘤细胞在动物活体内成瘤的能力。

本发明还有一个目的是用本发明的核酶或其重组表达载体来制备治疗与VEGF过度表达有关疾病的药物。

本发明第一方面提供了一种分离的多核苷酸序列，它编码特异性切割VEGF信号肽编码区第+8位、+17位、+36位和+71位位点的核苷酸序列。在较佳的实施方案中，所述核苷酸序列选自一类内含子、二类内含子、RNase P的RNA亚基、锤头状核酶、发夹型核酶、肝炎δ病毒核酶和VS核酶。在更佳的实施方案中，所述多核苷酸序列为具有选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、4或SEQ ID NO：4所示序列的锤头型核酶。

本发明另一方面提供了一种重组表达载体，该载体含有上述的一种或多种多核苷酸序列以及与所述多核苷酸序列操作性相连的表达调控序列。在一个较佳的实施方案中，所述载体是含有上述一种或多种多核苷酸序列的腺病毒、腺病毒相关病毒、逆转录病毒及其可用的病毒表达质粒。

本发明另一方面涉及一种抑制VEGF表达过度的细胞生长的方法，该方法包括将上述重组表达载体导入所述VEGF表达过度的细胞的步骤。在一个较佳的实施方案中，是通过腺病毒、腺病毒相关病毒或逆转录病毒介导将所述重组表达载体导入所述细胞的。在另一较佳的实施方案中，所述VEGF表达过度的细胞是肿瘤细胞。

本发明另一方面涉及上述多核苷酸序列或重组表达载体在制备治疗与VEGF过度表达相关的疾病的药物中的应用。在较佳的实施方案中，所述与VEGF过度表达相关的疾病是癌症。

本发明另一方面涉及一种药物组合物，它包含上述多核苷酸序列或重组表达载体，以及药学上可接受的载体。

本发明提供了对VEGF信号肽区(+1到+123)mRNA区中3个位点有专一性核酶活性的锤头型的核酶。通过以质粒，逆转录病毒或腺病毒载体将核酶基因运载入受体细胞内表达后，致使VEGF的表达降低，从而使肿瘤细胞在活体中生长受抑。继而，这些核酶和技术可望成为肿瘤临床治疗的有价值的新手段。本发明的其它目的和优点将在下文的详细描述中有进一步揭示。

附图简述

图1显示了不同剪切形式的VEGF家族成员结构示意图。

图2显示了锤头状核酶的结构特征，其中锤头状核酶具有一个由13个保守碱基组成的催化区Helix II；两个与靶RNA序列互补配对的区域Helix I和Helix III。方框中的G为Mg2+结合的保守碱基，对于核酶行使催化功能十分重要。锤头状核酶结合靶RNA序列以后在箭头处切断靶RNA分子。

图3显示了VEGF编码区二级结构预测及锤头状核酶设计，其中图3A为MFOLD软件预测VEGF编码区二级结构示意图，所选择的核酶切割位点用圈标出；图3B为VEGF121mRNA序列及对应的锤头状核酶切割位点，切割位点以箭头指示，用于引物延伸实验的引物标记为vegfpe1和vegfpe2，前者用于扫描核酶1，2，3号的切割，后者用于扫描核酶4号的切割片断；图3C显示了RT-PCR引物结合位点vegf5’和vegf3’。

图4显示了克隆入pGVal载体中的核酶分子示意图。

图5显示了pGVal-Rz系列质粒的构建步骤示意图。

图6显示了pGVal-Rz质粒的鉴定图谱，其中图6A为pGVal-Rz和pGVal载体均分别用Pst I单酶切和Pst I/Hind III双酶切，以未酶切的质粒为对照。图中“+”表示加入相应的限制性内切酶；“-”表示未加入相应的限制性内切酶，^*所示Hind IIIMarker。pGVal-Rz因Pst I被突变而只能被Sal I单酶切线性化。

图7显示了VHL质粒的构建和鉴定，其中图7A为VHL结构图，VHL包含T7启动子在T7RNA聚合酶的作用下可以体外转录出HA-VEGF-Luc RNA，进一步被翻译成HA-VEGF-Luc融合蛋白；图7B为VHL的酶切鉴定图，条带如箭头所示；图7C为VHL体外翻译产物的Western印迹鉴定，条带如箭头所示。

图8显示了用引物延伸法评估试管内核酶酶切反应特异性和有效性，图A为引物延伸法对核酶切割特异性和效率进行评估：等克分子浓度的核酶和VEGF RNA底物在所需的条件下孵育后，通过引物延伸法对未被切割VEGF RNA底物进行分析。同时进行的以相同引物所作的序列分析(U，C，G和A)，图B-E分别为Rz1-Rz4的切割结果。箭头示出预期得被切割的VEGF RNA底物所产生的延伸片段。

图9显示了荧光素酶试验分析核酶切割效果。

图10显示了Western印迹分析核酶切割效果，其中图A为Western印迹结果；图B为光密度相对值柱状图。

图11显示了共转染实验验证锤头状核酶对外源转入的VEGF的抑制作用。以pGVal与VHL共转染组测定值为100％，其他组测定值与之相比得到抑制的相对值。

图12显示了pDC316-SLS-Rz/Val质粒的构建。图12A为SLS序列示意图，图中stemI/stem II及之间的Loop序列为核酶表达序列中必须的元件，本发明者保留了BamHI/Nhe I位点之间的序列，作为核酶表达序列的最小片段。图12B为pDC316-SLS-Rz/Val质粒的酶切鉴定图谱，Rz/Val为pDC316-SLS-Rz/Val的简写，+，EcoR I/SacI消化-，不加酶消化的对照^*DL2000标记。

图13显示了SLS-Rz病毒的PCR鉴定结果。图13A为SLS序列及SLS核酶表达序列结构示意图，PCR引物Lva-up(5’-accgcccgcgtgtcgaacccag-3’(SEQ ID NO：5)和Lva-down(5’-accgcccgcgtgtcgaacccag-3’(SEQ ID NO：6)结合序列如图中所示，扩增产物分别为110bp(SLS核酶)和77bp(SLS序列)；图13B为PCR产物琼脂糖电泳图，其中Val/Rz1-4为SLS空载腺病毒和SLS核酶腺病毒的简写，扩增产物如箭头所示，^*：DL2000标记。

图14显示表达核酶的腺病毒载体感染细胞导致中的VEGF mRNA水平下调。图14A为RT-PCR检测核酶介导的细胞内VEGF mRNA水平616bp条带为bata-actin扩增产物，340bp为VEGF扩增条带。图14B显示腺病毒感染后细胞内核酶的表达检测。采用核酶特异性引物Lva-up/down扩增，引物序列如前所述，Val/Rz为SLS-Val/Rz的简写，^*：DL2000标记。

图15显示腺病毒介导的核酶导入对细胞中VEGF基因表达的抑制。分别扫描每个样品的VEGF和bata-actin光密度，用VEGF光密度值比bata-actin光密度得到光密度相对值。以SLS-Val病毒感染后光密度比值为100％，其他样品与之相比得到抑制效率。

图16显示VEGF在肿瘤细胞系中表达情况，其中NL：正常肝组织^*：DL2000marker，其余条带及各泳道样品如图中所示。VEGF扩增得到340bp片段，β-actin扩增得到616bp片段，如图中箭头所示。

图17为稳定表达核酶单克隆细胞株中VEGF的表达水平检测，其中图17A显示稳定表达核酶单克隆细胞株中核酶的表达水平。未转染质粒的7721细胞中检测不到110bp/77bp的扩增条带，转染zPFB-Rz组可以检测到110bp扩增产物，转染zPFB-Val组检测到77bp扩增产物；图17B显示稳定表达核酶单克隆细胞株中VEGF的表达水平616bp条带为bata-actin扩增产物，340bp为VEGF扩增条带，引物序列如材料方法所述。

图18显示稳定表达核酶单克隆细胞株中VEGF的表达水平检测柱状图总结。将RT-PCR结果各条带进行光密度扫描，将同一样品的VEGF条带光密度和内参照β-actin条带的光密度扫描值相除消除实验差异得到相对的光密度值，以zPFB-Val单克隆细胞株的相对光密度值为100％其他各组与之相比得到VEGF mRNA相对水平，取两次实验平均值。

图19为稳定表达核酶的细胞株城瘤实验。其中图19A为MTT实验检验每个点的注射量：在注射动物的同时取计数的好的细胞按照1000，2000，4000和8000个每孔，贴壁后次日通过MTT法测定细胞量；图B：动物及相应的肿瘤照片；图C：瘤重比柱状图；D：瘤体积比柱状图。

具体实施方案

核酶切割RNA的效率取决于以下多个因素：a)核酶的构型，它的酶活性中心是否外露；b)底物RNA分子的二级结构，有关的核酶酶切位点是否充分暴露和c)核酶在细胞内表达的水平[4]。

Lieber利用腺病毒的VAI和RNA分子作为支架，将其中设计有暴露性结构的核酶插入[4]。VAI属pol III酶的基因家族，pol III是在生长迅速的细胞中活性极高，从而这一系统可以很好的解决上述三个问题中的第一和第三个问题。对底物RNA的核酶位点的暴露性问题的解决方式有两种：1)根据自由能计算来对其二级结构进行预测；2)对所预期到的核酶可切性进行试验。

本发明者通过对VEGF RNA信号肽(核苷酸序列1-75)分子处于暴露区的核酶切点进行选择，设计并合成了4种具有特异性切割VEGF活性的锤头型核酶，并以腺病毒和逆转录病毒等作为常用载体进行了细胞水平的试验，结果证实其在试管内和细胞和核瘤实验动物系统中有效地抑制VEGF的表达和肿瘤的生长。

本发明者的结果总结如下：1，设计和构建了对VEGF121mRNA二级结构水平上的暴露区(+8，+36，和+71位点：核酶1，3和4)和非暴露区(+17：核酶2)四个锤头状核酶(1-4)质粒；2，试管内切割检测表明，针对+8，+36，和+71位点的核酶(1，3和4)可以有效地在试管内对VEGF 121 RNA进行特异性切割，使其水平分别降至对照的61.7％，27.6％和44.8％(荧光色素酶活性)或66.3％，27.0％和30.0％(蛋白质水平)；3，将核酶表达质粒与VEGF-LUC模板质粒瞬时共转染入SMMC-7721肝癌细胞，核酶1，3和4VEGF-LUC水平分别降低到对照的81.4％，56.6％和69.1％；4，稳定表达针对VEGF的核酶1，3或4的SMMC-7721细胞株中，内源性VEGF RNA的水平降至对照水平的5％；5，构建了复制缺陷型腺病毒核酶导入系统；6，稳定表达核酶的细胞株裸鼠成瘤实验显示，核酶3号可以抑制肿瘤的生长。

综上，本发明者构建的分别针对VEGF121+8，+36，和+71位点锤头状核酶可有效地抑制VEGF的RNA水平，其中针对+36位设计的锤头状核酶抑制效果最好。

具体而言，本发明第一方面提供了一种分离的多核苷酸序列，它编码特异性切割VEGF信号肽编码区第+8位、+17位、+36位和+71位位点的核苷酸序列。在较佳的实施方案中，所述核苷酸序列选自一类内含子、二类内含子、RNase P的RNA亚基、锤头状核酶、发夹型核酶、肝炎δ病毒核酶和VS核酶。在更佳的实施方案中，所述多核苷酸序列为具有选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、4或SEQ IDNO：4所示序列的锤头型核酶。

VEGF特异性锤头状核酶序列

编号	正义/反义寡核苷酸序列
		Rz1	Sen1 5′tcgaagcagactgatgagtccgtgaggacgaaagttcatcttgca 3′(SEQ ID NO：1)Anti1 5′agatgaactttcgtcctcacggactcatcagtctgct 3′
Rz2	Sen2 5′tcgaacccaactgatgagtccgtgaggacgaaacatcagaatgca 3′(SEQ ID NO：2)Anti2 5′ttctgctgtttcgtcctcacggactcatcagttgggt 3′
		Rz3	Sen3 5′tcgacaaggcctgatgagtccgtgaggacgaaaggctccaatgca 3′(SEQ ID NO：3)Anti3 5′ttggagcctttcgtcctcacggactcatcaggccttg 3′
Rz4	Sen4 5’tcgagcctggctgatgagtccgtgaggacgaaaccacttggtgca 3’(SEQ ID NO：4)Anti4 5’ccaagtggtttcgtcctcacggactcatcagccaggc 3’

在本发明中，术语“分离的”在用于核酸或蛋白质时，表示核酸或蛋白质基本上不含其它在天然状态下相关的细胞成分，其最好呈均质状态，但也可以是干的或水溶液。纯度和均一性通常可用分析化学方法如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法来测定。术语“核苷酸序列/多核苷酸序列”可以互换使用，指脱氧核糖核酸或核糖核酸及其单链或双链形式的聚合物。除非另有特别限定，该术语包括含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，该核酸具有与参比核酸相似的结合性能。

本文所用的术语“锤头(型)核酶”具有本领域技术人员众所周知的含义，它是仅含约37个核苷酸的单链RNA。本发明中的所使用的试验技术都为常规的分子生物学研究技术，为本领域中专业人员所熟知。例如，直接用化学方法合成DNA序列，然后利用DNA重组技术连接到重组质粒中转录制得。继而在试管内对所设计的核酶对RNA底物分子的剪切特异性和效率的验证。另外，可用PCR技术来扩增RNA(Saiki，et al.Science 1985；230：1350-1354)。将核酶的基因克隆到质粒，腺病毒，或逆转录病毒载体中的过程等。

本发明另一方面涉及一种重组表达载体，该载体含有一种或多种上述多核苷酸序列以及与所述多核苷酸序列操作性相连的表达调控序列。

本文所用的术语“重组表达载体”指本领域熟知的质粒、粘粒、噬菌体、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体，例如但不局限于，在细菌中表达的基于T7的表达载体；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。然而，本发明范围并不局限于该载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。

这里所用的术语“表达调控序列”通常指参与控制核苷酸序列转录表达的序列。表达调控序列包括与目标核苷酸序列操作性相连的启动子和终止信号。典型的启动子例如有pol III启动子、T7启动子等。“操作性相连”是指线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果启动子或增强子增加了编码序列的转录，则它与编码序列是操作性相连的。在上述重组表达载体中也可根据需要加入选择性标记基因。

由于本发明的核酶对VEGF基因mRNA的位点有特异性切割活性的方法，该方法包括将上述重组表达载体导入所述VEGF表达过度的细胞。所述“VEGF表达过度的细胞”通常是真核细胞，更通常的是肿瘤细胞，例如肝肿瘤细胞。可将多种含有上述相同或不同核酶多核苷酸序列的重组表达载体分别或同时导入VEGF表达过度的细胞中。将上述重组表达载体导入目标细胞的技术是本领域普通技术人员所熟知的，例如，采用腺病毒和逆转录病毒介导的导入方法。然而，利用其它病毒载体或是利用其它方式来导入上述重组载体对于本领域技术人员来说是显而易见的。

本发明还涉及用上述多核苷酸序列或重组表达载体来制备治疗与VEGF过度表达相关的疾病的药物。在这里，所用的术语“疾病”表示可从上述处理获益的与VEGF表达过度有关的任何疾病，这些疾病不仅仅包括癌症，还包括老年化骨骼肌病(Age-related macular disease(ARMD)，(Klin Oczna，2005，107，334-9)，肺损伤和纤维化(J.Immunol，2005，105，1224-31)，糖尿病相关的视网膜等病变(proliferativediabetic retinopathy or proliferative vitreoretinopath)(Ophthalimic Res，2005，37，188-90)，视网膜和脉络心血管形成(retinal and choroidal neovascularization)(Mol Vis，2005，11，366-373)，角膜心血管生成(corneal neovascularization)(Gene Therpy2005，12，617-624，风湿型关节炎(包括幼儿先天性关节炎，juvenile idiopathic arthritis)(Rheumatology(Oxford)，2004，43，1091-6)等，其中“癌症”是指哺乳动物中以无控制性细胞生长为典型特征的生理性症状。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。除非另有描述，本发明的实施将采用分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些均是本领域技术人员所知的。这些技术在下列文献中有完整的描述：例如，Sambrook《分子克隆实验指南》第2版(1989)；《DNA克隆》第I和II卷(D.N.Glover编辑1985)；《寡核苷酸合成》(M.J.Gait编辑，1984)；《核酸杂交》(B.D.Hames和S.J.Higgins编辑.1984)；《蛋白质纯化：原理和实践》第2版(Springer-Verlag，N.Y.)，以及《实验免疫学手册》I-IV卷(D.C.Weir和C.C.Blackwell编辑1986)。或者，可按照试剂生产商所提供的说明书进行。

实施例1 VEGF RNA序列中靶点的选择

VEGF存在至少五种不同的剪切形式，编码的蛋白分子量在34-46KD之间。VEGF基因编码八个外显子，不同的外显子组合形成不同的剪切形式(图1)，都有着促进血管生成的能力。所有的VEGF多肽形式惟一共有的是含有该分子分泌到细胞外所必须的信号肽片段(第1-第75位核苷酸序列)。因此，本发明者选择在VEGF信号肽区域选择适合核酶切割的位点，旨以获得能对所有剪切形式的VEGF表达均有效的核酶。

如图2所示，锤头状核酶的结构包括三个部分：Helix I和Helix III为与靶RNA序列互补配对的区域，分别位于催化区两端；Helix II为具有13个保守碱基的催化区，形成颈环结构。阴影部分的G为镁离子结合位点[24]。

锤头状核酶催化的切割反应分为三个步骤，即核酶与底物RNA分子的识别，在催化位点的催化切割，切割后核酶从底物分子上的解离(如图2所示)。锤头状核酶识别RNA单链区中的NUH位点(其中N为任意单核苷酸，H为非T的单核苷酸)，并在H后切开RNA分子。

本发明者用加拿大科学院Zuker编写的MFOLD软件^[15]针对VEGF基因mRNA(NM_001025370)序列进行二级结构分析，并根据锤头状核酶特异性切割位点的NUH规律在VEGF信号肽区域选择四个合适的位点(为信号肽区域的8、17、36、71位点，以翻译起始位点为+1)，设计并和成针对这四个位点的核酶片段(表1)^[16]。所选择的靶序列经在Genebank中进行同源比较，在基因组中不存在与之相同的基因序列，保证了核酶识别序列的专一性。在核酶片段两端分别加入Sal I和Pst I位点方便克隆鉴定。

实施例2 锤头状核酶表达质粒pGVal-Rz的构建

锤头状核酶与底物配对结合区域长度为6～15个碱基，考虑到配对结合的特异性和与底物分子结合效率这两方面的因素，本发明者选择核酶的5’配对区为8个核苷酸，3’区为7个核苷酸。

pGVal质粒是1996年由Andre Lieber设计改造的专门用于锤头状核酶表达的载体[28]。它的特点是在腺病毒Val基因中插入一段非配对的Loop序列，锤头状核酶克隆在这段Loop序列中。位于Loop两端的腺病毒序列Val转录以后形成双链RNA二级结构可以对抗核酸酶的降解，保证了整个RNA分子的稳定性；Loop序列不会形成任何配对结构，从而保证了插入在Loop序列中的核酶分子可以折叠成正确的二级结构，并充分暴露于底物RNA分子，如图1-4所示。而且pGVal载体中包含T7启动子，可以利用T7 RNA聚合酶进行试管内转录得到有功能的核酶分子用于试管内实验；Val基因中的pol III启动子可以在真核细胞中启动下游基因的转录，使核酶分子可以在真核细胞中转录。

表1 VEGF特异性锤头状核酶序列(包括便于克隆的序列)

编号	正义/反义寡核苷酸序列
		Rz1	Sen1 5′tcgaagcagactgatgagtccgtgaggacgaaagttcatcttgca 3′(SEQ ID NO：1)Anti1 5′agatgaactttcgtcctcacggactcatcagtctgct 3′
Rz2	Sen2 5′tcgaacccaactgatgagtccgtgaggacgaaacatcagaatgca 3′(SEQ ID NO：2)Anti2 5′ttctgctgtttcgtcctcacggactcatcagttgggt 3′
		Rz3	Sen3 5′tcgacaaggcctgatgagtccgtgaggacgaaaggctccaatgca 3′(SEQ ID NO：3)Anti3 5′ttggagcctttcgtcctcacggactcatcaggccttg 3′
Rz4	Sen4 5’tcgagcctggctgatgagtccgtgaggacgaaaccacttggtgca 3’(SEQ ID NO：4)Anti4 5’ccaagtggtttcgtcctcacggactcatcagccaggc 3’

本发明者合成了四个设计的核酶的多聚核苷酸序列(如表1所示)。为了方便克隆，在序列两端加入Loop区的单酶切位点Sal I和Pst I，退火连接后克隆至pGVal载体中，具体方案如图4和图5所示。

本发明者在Pst I位点引入突变(Pst I位点碱基序列为CTGCAG，本发明者引入突变使连接后产生序列为GTGCAG而不能被Pst I识别)。核酶Rz1，Rz2和Rz4按照同样原理在Sal I位点引入突变，Rz3保留Sal I位点。重组子和载体均可以用Hind III线性化，而用Pst I仅能线性化载体。所有重组子经限制性内切酶消化鉴定后，经测序进一步确证。酶切鉴定结果如图6所示。

实施例3 VEGF-luc融合蛋白表达质粒的构建

为了便于分析，本发明者以pCDNA3载体为基础构建了其N端有HA标签三连体的VEGF(HA-VEGF)。本发明者通过定点突变而破坏了VEGF的中止密码子，继而将HA-VEGF以同相的翻译框的形式和萤火虫荧光色素酶相接成一融合蛋白(VHL)(图7)。由这一载体携带的基因均可通过T7 RNA聚合酶在试管中转录成其编码的RNA，并可通过体外翻译系统产生带有HA tag的VEGF-Luc的融和蛋白，便于荧光素酶活性检测或通过特异性抗体的WESTERN分析，来对所设计核酶的剪切效率进行半定量。VHL经BamH I，Xho I和Xba I消化鉴定得到440bp和1.8kb两条片段，证明构建正确。VHL体外翻译后进行Western印迹得到约82KD的条带；VHL体外翻译的蛋白加入荧光素酶底物测定荧光表明融合蛋白的催化活性较高(数据未给出)。综上VHL可以正确表达VEGF-荧光素酶融和蛋白。

实施例4 核酶介导的VEGF RNA体外切割实验

本发明者利用Promrga公司的试管内转录系统，对以VHL和pGVal-Rz为模板在试管内转录和成了VEGF-Luc RNA，和4个核酶的RNA，经RT-PCR定量后，将等克分子量的这两种RNA高温变性(95℃，1.5分钟)后37℃孵育60分钟(50mMTris.HCl，pH 7.5，1mM EDTA和10mM MgCl2)进行试管内切割。切割后用引物经酒精沉淀纯化后，透过引物延伸法确定切割位点。本发明者发现核酶1，3，4可以有效的切割底物RNA，形成与预期相同的特征条带，而核酶2则没有特异性条带出现，因此证明了这些核酶具有催化活性(图8)。

本发明者同时通过Promrga公司的试管内翻译系统对切割产物进行蛋白的生成，继而采用了荧光素酶荧光素酶检测系统对所产生的VEGF-荧光素酶融合蛋白的活性。如果在VEGF处被切断则无法产生融和蛋白，从而导致荧光减弱。因此可以从荧光素梅活性的高低来判断核酶的切割能力。

以pGVal RNA与底物VEGF-Luc RNA孵育组测定值为100％，其他各组测定值与之相比得到相对活性。结果显示：核酶Rz3和Rz4切割效果比较好，荧光素酶报告基因活性分别降低为对照的27.6％和44.8％，核酶Rz1有一定的切割效果，降低到对照的61.7％，核酶Rz2没有切割活性(如图9所示)。下表2中示出了荧光素酶试验结果：试管内转录得到HA-VEGF-Luc RNA和pGVal，pGVal-Rz RNA按照等摩尔混合，切割后试管内翻译，以pGVal RNA与底物RNA共孵育产物的Luc值为100％，其他组测定值与其相比。

表2

	对照	Rz1	Rz2	Rz3	Rz4
						荧光素酶活性(单位)与对照的比值(％)	497716100.0％	30732261.7％	44991390.4％	13733327.6％	22286344.8％

此外，本发明者采用Western印迹方法检测了试管内翻译产物中融和蛋白的含量，同样得到：在核酶Rz3，Rz4的作用下融和蛋白的量明显减少，分别降低为对照的31.9％和27.0％，核酶Rz1有一定的切割效果，降低到对照的66.3％，核酶Rz2基本上没有切割活性。与前面实验结果相符。下表3是Western印迹结果的量化表，将Western印迹结果进行光密度扫描，以对照组扫描值为100％，其他组与对照组的扫描值相比获得相对光密度比值比作图。图10显示了光密度相对值的柱状图。

表3

	对照	Rz1	Rz2	Rz3	Rz4
						光密度(单位)与对照的比值(％)	40.7100％	27.066.3％	39.897.8％	11.027.0％	13.030.0％

下表4为锤头状核酶体外切割实验总结。

表4

	Rz1	Rz2	Rz3	Rz4
					引物延伸法荧光素酶Western	+++	---	+++++++++	++++++

注：+表示有效，-表示无效。

实施例5 细胞系统中锤头状核酶对VEGF表达的抑制

A.通过将核酶表达质粒(Rz1-4中之一)与VHL表达质粒(图7)共转染(克分子量比例为4∶1比例)高表达VEGF的7721细胞(SMMC-7721细胞株，CellBankNo.TCHu68(China)，来源于人原发性肝细胞肝癌，属上皮细胞型)，分析细胞裂解物中荧光素酶活性来评估核酶的效应。具体是将核酶表达质粒与VEGF-Luc表达质粒按照共转染7721细胞，以renila为内参照(该质粒以CMV启动子启动海洋生物来源的萤光素酶，在多数细胞内稳定高表达，用作系统校正转染效率的内参照)。结果提示：核酶Rz1，Rz3，Rz4分别可以使共转染的融合蛋白荧光素酶报告基因活性降低到对照的82.6％，51.0％和66.9％，核酶Rz2无切割活性(图11)。

下表5列出了共转染试验的小结。

表5

	Rz1	Rz2	Rz3	Rz4
					共转染	+	-	+++	++

注：+表示有效，-表示无效。

实施例6 Admax-Rz腺病毒的构建及病毒包装

本发明者继而构建了以Admax腺病毒载体系统(Microbix Biosystem Company，Canada.)表达核酶基因(R1-R4或空载体)。该载体系统包括两个部分，即一个可以克隆外源基因的小质粒pDC-316质粒，该质粒的多克隆位点可以方便的进行外源基因的克隆；另一个为编码腺病毒大部分基因组的大质粒。

pDC316-Rz系列质粒的构建

将四个核酶(Rz1，Rz2，Rz3，Rz4)表达序列(Val-Loop-Rz-Loop-Val)从pShuttle-CMV-Rz系列质粒中亚克隆至pDC316质粒(图12)中，命名为pDC316-Rz(1-4)质粒。采用Bgl II/Hind III粘末端克隆，得到pDC316系列质粒。由于pGL载体中的VA同源序列的存在，以这一系列载体重组的腺病毒均缺失了编码核酶基因的部分。为了克服这一困难，本发明者又构建了缺失了VA序列大部的载体pDC316-SLS-Rz/Val。

本发明者采用BamH I/Nhe I(平)消化pDC316-Rz系列质粒，克隆入pDC316 Bgl II/HindIII(平)中，得到pDC316-SRS-Rz系列质粒EcoR I/SacI鉴定得到200bp条带(如图12所示)。

实施例7 SLS-Rz腺病毒的包装，扩增及鉴定

将纯化好的pDC316-SLS-Rz/Val质粒与编码大部分腺病毒基因组的Cre质粒共转染HEK293细胞。8-10天后可以观察到共转染组的细胞变圆漂起，收集上述病变细胞，反复冻融三次裂解细胞，收集病毒。对照组，即转染腺病毒全基因组组大约4-5天即出现明显病变。

将获得的腺病毒用特异性引物Val-up(5’-GGGCACTCTTCCGTGGTC-3’)/down(5’AAAGGAGCGCTCCCCCGTTG-3’)对其进行PCR扩增，获得了有预期的大小的核酶基因的片段：110bp或Val空载：77bp(图13)，继而通过DNA序列分析证实病毒身份正确。将上述病毒扩增，用于后续实验。

实施例8 携核酶基因的腺病毒感染7721细胞对内源性VEGF基因表达的影响

本发明者用携核酶基因的腺病毒(MOI100)感染7721细胞60小时，通过RT-PCR的方法检测细胞中VEGF的表达水平。结果显示核酶1，3，4号都可以降低细胞内VEGF mRNA水平，其中3号效果最好。混合感染效果与4号单独感染效果相近(图14)。

实施例9 稳定表达核酶的7721细胞系和核酶的效率

根据VEGF121基因编码序列(GeneBankNo.NM_003376.)，本发明者设计了跨外显子的一对引物VEGF-up(5’CCATCGATGCACCCATGGCAGAAGGAG-3’)和VEGF-down(5’GCTCTAGATCTTGCTCTATCTTTCTTTGGTCTG-3’)来特异性扩增细胞和组织cDNA中的VEGF基因(340bp)。以β-actin(β-肌动蛋白，5’-AAGTACTCCGTGTGGATCGG-3’和5‘-TCAAGTTGGGGGACAAAAAG-3’)产物(616bp)的量为内参照，在严格控制模扳量，循环次数等条件的情况下，用半定量RT-PCR方法检测了7种细胞株，1例人正常肝组织VEGF基因的表达情况。结果显示在肿瘤细胞株中(除7402外)，VEGF均有比较高的表达，而正常肝中VEGF表达量比较低。从而，本发明者以7721细胞作为细胞系统开展以下的研究。

本发明者pGVaL-Rz系列质粒经Xba I酶切，klenow酶补平，再经Mlu I酶切后，回收～570bp核酶片段(包括帮助核酶维持活性结构的Va I、Va II、Loop序列)。将此核酶片段克隆至在zpFB-neo质粒的5’EcoR I(补平)和3’Mlu I位点，采用HindIII/Bgl II鉴定，zPFB-Rz得到220bp/1000bp左右片段。用同样的方法从pGVaL质粒中切出VaL片段(仅含有Va I、Va II和Loop序列)，克隆到在zpFB-neo质粒中获得，采用HindIII/BglII鉴定得到600bp左右片段。将上述载体线性化转染7721细胞，用终浓度1000ng/ml的G418进行筛选两周后，得到混合克隆。继而从混合克隆中筛选到单克隆。采用RT-PCR方法进行鉴定。以Val-up/down引物扩增，选择得到110bp(zPFB-Rz)和77bp(zPFB-Val)的细胞株，通过RT-PCR的方法检测细胞株内VEGF的RNA水平。如图17和18所示，核酶1，3，4号都可以降低细胞内VEGF mRNA水平，其中3号效果最明显，致VEGF mRNA水平下降到对照组的10％左右。

实施例10 裸鼠成瘤实验研究VEGF抑制对于肿瘤形成的影响

本发明者将稳定表达不同核酶的7721细胞系的细胞(2^*10⁶/点)注射细到裸鼠的背则皮下。16-20天后杀鼠取肿瘤，量大小和称重。每组选取八只动物进行实验，每只裸鼠注射两点，左侧为对照组，右侧为实验组细胞，取瘤后用同只动物的实验组成瘤除以对照组成瘤，将商去掉一个最大值去掉一个最小值，求算平均值和方差。结果显示只有稳定表达3号核酶的细胞株表现出肿瘤生长抑制，如图19所示。注：对细胞生长的速率的分析表明，各个肿瘤细胞系间无明显的差别。

表5，动物实验研究VEGF特异性锤头状核酶对于肿瘤形成和生长的作用总结

	Rz1	Rz2	Rz3	Rz4
					瘤重抑制情况瘤体及抑制情况	--	--	--	++

注：+表示有效，-表示无效。

结论

1.本发明者首先利用MFOLD软件预测了VEGF121 mRNA二级结构，针对信号肽区域的+8，+17.+36，+71位点(以翻译起始位点的A为+1位)设计了四个锤头状核酶。

2.试管内切割实验结果显示针对+8，+36，+71设计的锤头状核酶具有切割底物VEGF RNA的能力。针对+36位设计的核酶(3号)切割效率最高。

3.细胞内实验结果显示针对+8，+36，+71设计的锤头状核酶具有降低VEGFmRNA水平的能力。针对+36位设计的核酶(3号)效果最好；针对+17位设计的核酶也表现出较低的抑制活性。

4.裸鼠成瘤实验显示针对+36位设计的核酶(3号)据有抑制肿瘤形成和生长的作用。

表6，锤头状核酶抑制效率总结

	Rz1	Rz2	Rz3	Rz4
					体外切割实验细胞实验动物实验	+++-	---	++++++++	++++-

注：+表示有效，-表示无效。

3号核酶(+46位)具有最高的切割活性，2号核酶则基本上没有切割活性，核酶1号和4号虽然在体外实验和细胞实验上都表现出一定的切割活性，但在成瘤实验中并为表现出使肿瘤体积减小的作用。

本发明中核酶1，3和4在试管内和细胞内均为最有效。这提示在相当程度上试管内的实验结果对有关何种核酶为优有很高的预见力。另外，可以通过联合使用2个或更多的核酶来提高疗效。譬如，核酶1，3和4可以串联的方式放入腺病毒，腺相关病毒或逆转录病毒载体中，而用这种含有复合核酶基因的病毒来感染肿瘤细胞，可以通过对细胞中存活素的表达抑制来杀死肿瘤细胞。

下面列出了在本发明中提及的所有参考文献，所有这些文献均纳入本文作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种变化或修改，这些变化或修改均包括在本申请所附权利要求书所限定的范围内。

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序列表

<110>上海市肿瘤研究所

<120>特异性切割血管内皮生长因子RNA的核酶及其应用

<130>058780

<160>6

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>锤头型核酶

<400>1

tcgaagcaga ctgatgagtc cgtgaggacg aaagttcatc ttgca     45

<210>2

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>锤头型核酶

<400>2

tcgaacccaa ctgatgagtc cgtgaggacg aaacatcaga atgca     45

<210>3

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>锤头型核酶

<400>3

tcgacaaggc ctgatgagtc cgtgaggacg aaaggctcca atgca     45

<210>4

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>锤头型核酶

<400>4

tcgagcctgg ctgatgagtc cgtgaggacg aaaccacttg gtgca     45

<210>5

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>5

accgcccgcg tgtcgaaccc ag                              22

<210>6

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>6

accgcccgcg tgtcgaaccc ag                              22

Claims (10)

1.一种分离的多核苷酸序列，其特征在于，它编码特异性切割VEGF信号肽编码区第+8位、+17位、+36位和+71位位点的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸序列，其中所述核酶选自一类内含子、二类内含子、RNase P的RNA亚基、锤头状核酶、发夹型核酶、肝炎δ病毒核酶和VS核酶。

3.根据权利要求1所述的多核苷酸序列，其特征在于，所述多核苷酸序列具有选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、4或SEQ ID NO：4所示的序列。

4.一种重组表达载体，其特征在于，该载体含有权利要求1所述的一种或多种多核苷酸序列以及与所述多核苷酸序列操作性相连的表达调控序列。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述载体是含有权利要求1所述的一种或多种多核苷酸序列的腺病毒、腺病毒相关病毒、逆转录病毒。

6.一种抑制VEGF表达过度的细胞生长的方法，其特征在于，将权利要求4所述的重组表达载体导入所述VEGF表达过度的细胞。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，通过腺病毒、腺病毒相关病毒或逆转录病毒介导将所述重组表达载体导入所述细胞。

8.一种治疗与VEGF过度表达相关的疾病的药物组合物，其特征在于，所述组合物含有权利要求1所述的多核苷酸序列或权利要求4所述的重组表达载体，以及药学上可接受的载体。

9.权利要求1所述的多核苷酸序列、权利要求4所述的重组表达载体在制备治疗与VEGF过度表达相关的疾病的药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述与VEGF过度表达相关的疾病是癌症。

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