CN1948334A

CN1948334A - 白念珠菌细胞壁粘附因子基因及其用途

Info

Publication number: CN1948334A
Application number: CN 200510030525
Authority: CN
Inventors: 陈江野; 李砚东
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Priority date: 2005-10-14
Filing date: 2005-10-14
Publication date: 2007-04-18

Abstract

本发明提供了一种新的白念珠菌的细胞壁粘附因子CaFlo11蛋白，编码CaFlo11蛋白的多核苷酸和经重组技术产生这种CaFlo11蛋白的方法。本发明还公开了编码这种CaFlo11蛋白的多核苷酸的用途。在酿酒酵母中高表达CaFLO11基因可以增强酵母细胞之间的粘附加快絮状沉淀的形成，同时赋予酿酒酵母细胞粘附于明胶的能力。在白念珠菌中敲除CaFLO11基因构建Caflo11基因缺失株用于功能分析。在口腔表皮粘附试验中，CaFLO11的过表达促进白念珠菌与上皮细胞的粘附，而且在白念珠菌中高表达CaFLO11可增强絮凝沉淀反应，这说明CaFLO11在细胞粘附过程有重要功能，因而是一种细胞壁粘附因子。

Description

白念珠菌细胞壁粘附因子基因及其用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及新的编码白念珠菌细胞壁粘附因子CaFLO11的多核苷酸，以及此多核苷酸编码的多肽。本发明还涉及此多核苷酸和多肽的用途和制备。

背景技术

白念珠菌也称为白色念珠菌(Candida albicans)，它是一种临床上分离到的一种机会性人体致病真菌，在免疫下调的病人中，如器官移植病人，艾滋病毒感染者等，可以引起广泛的浅部和深部系统感染，感染部位包括口腔，女性阴道等，引起鹅口疮，阴道炎等疾病，也可以侵入表皮和内皮细胞进入血液到达内脏器官，如肾脏，脑部等，导致败血症，严重可以导致死亡(Odds，F.C.1994.J Am Acad Dermatol.31：S2-S5.)。

白念珠菌在不同的生长条件下，有不同的生长形态，包括菌体(yeast form)，假菌丝(pseudohyphae)和菌丝(hyphae)。这种形态转化能力直接影响白念珠菌的致病能力(Odds，F.C.1985.Crit Rev Microbiol.12：45-93；Brown，A.J.P.et al.1999.Trends Microbiol.7：334-338.)，菌丝生长缺陷的菌株其系统感染能力大大下降或消失(Lo，H.J.et al，Cell 90：939-949.)。

许多培养条件可以引起白念珠菌的形态转换，包括血清，温度，pH值，氮源利用以及氧压等等。调节白念珠菌的形态转换的细胞内分子机制主要有MAPK途径(mitoge-actlvaied protein kinase pathway)和cAMP/PKA途径(cAMP-dependentprotein kinase A pathway)。同时还发现Cph2介导的，Efg1介导的以及pH应答的信号途径也都和白念珠菌的形态发生相关(Stoldt，V.R.，et al.EMBO J.16：1982-1991；El Barkani A et al.Mol.Cell.Biol.20：4635-4647.)。

在白念珠菌中还存在抑制效应的信号途径，主要是Tup1介导的信号途径，依靠抑制因子Rfg1，Nrg1等来发挥作用(Kadosh D et al.Mol.Cell.Biol.21：2496-2505；Braun BR et al EMBO J.20：4753-4761.)。这些调控网络最终会把信号传递给效应器即分泌蛋白或者细胞壁蛋白，通过这些蛋白与宿主细胞发挥作用表现白念珠菌的毒性。现在已经分离到许多编码粘附毒性因子的细胞壁蛋白基因，如ALS1，ALA1，和HWP1等(Fu Y et al.1998.Infect Immun.66：1783-1786，Garu P et al.1997.Infect Immun.65：5289-5294，Staab et al.1999.Science.283：1535-1538)。ALA1和ALS1能够赋予酿酒酵母细胞附着于细胞外基质和对人类内皮细胞的粘附能力。HWP1编码一种粘附素，是哺乳动物细胞转谷氨酰胺转移酶的作用底物。

然而，迄今为止还没有报道过白念珠菌中存在的细胞壁粘附因子。

由于白念珠菌会严重威胁人们的身体健康，因此，本领域迫切需要开发与白念珠菌的生长、感染过程或毒性有关的各种蛋白或因子，以便更好地防治白念珠菌引起的感染。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的与白念珠菌感染有关的细胞壁粘附因子CaFlo11蛋白以及其片段、类似物和衍生物。

本发明的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。

本发明的另一目的是提供生产这些多肽的方法以及该多肽和编码序列的用途。

在本发明的第一方面，提供了一种新颖的、分离出的白念珠菌细胞壁粘附因子CaFlo11多肽，它包括：具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。

较佳地，该多肽选自下组：

(a)具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO：2氨基酸序列经过一个或多个(如1-50个，较佳地1-20个，更佳地1-10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，并且具有促进白念珠菌粘附于上皮细胞的功能的由(a)衍生的多肽。

更佳地，该多肽是具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽。

在本发明的第二方面，提供编码分离的这些多肽的多核苷酸，该多核苷酸包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少70％相同性：(a)编码上述白念珠菌CaFlo11多肽的多核苷酸；和(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，该多核苷酸的序列是选自下组的一种：(a)具有SEQ ID NO：1中1-3363位的序列；(b)具有SEQ IDNO：1中1-3366位的序列。

在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。

在本发明的第四方面，提供了制备具有白念珠菌CaFlo11蛋白活性的多肽的方法，该方法包含：(a)在适合表达白念珠菌CaFlo11蛋白的条件下，培养上述被转化或转导的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有白念珠菌CaFlo11蛋白活性的多肽。

在本发明的第五方面，提供了与上述的白念珠菌CaFlo11多肽特异性结合的抗体。

在本发明的第六方面，提供了模拟、促进、拮抗白念珠菌CaFlo11多肽活性的化合物，以及抑制白念珠菌CaFlo11多肽的表达的化合物。还提供了筛选和/或制备这些化合物的方法。较佳地，该化合物是白念珠菌CaFlo11多肽的编码序列或其片段的反义序列。

在本发明的第七方面，提供了检测样品中是否存在CaFlo11蛋白的方法，它包括：将样品与CaFlo11蛋白的特异性抗体接触，观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在CaFlo11蛋白。

在本发明的第八方面，提供了一种检测与白念珠菌CaFlo11多肽异常表达相关的疾病或疾病易感性的方法，该方法包括：检测编码所述多肽的核酸序列中是否存在突变。

在本发明的第九方面，提供了本发明多肽和编码序列的用途。本发明多肽可被用于筛选促进白念珠菌CaFlo11多肽活性的激动剂，或者筛选抑制白念珠菌CaFlo11多肽活性的拮抗剂、或者被用于肽指纹图谱鉴定。本发明的白念珠菌CaFlo11蛋白的编码序列或其片段，可被作为引物用于PCR扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列。

在一个优选例中，白念珠菌CaFlo11多肽或基因被用于制备检测白念珠菌的试剂，或者筛选抑制CaFLO11表达或活性的抑制剂或拮抗剂，或作为筛选抑制CaFLO11表达或活性的靶点。

在本发明的第十方面，提供了一种药物组合物，它含有安全有效量(如0.001-99.99wt％)的本发明的白念珠菌CaFlo11多肽的拮抗剂或抑制剂或抗体以及药学上可接受的载体。这些药物组合物可治疗白念珠菌感染等病症。

本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1显示了白念珠菌CaFLO11基因开放阅读框的脱氧核糖核苷酸序列。

图2A显示了白念珠菌CaFLO11基因推导的氨基酸序列。

图2B显示了白念珠菌CaFlo11蛋白的结构域特征。

图3A显示了白念珠菌CaFLO11基因在双倍体酿酒酵母Scflo11缺失株中高表达可以互补该缺失株的菌丝形成缺陷。

图3B显示了白念珠菌CaFLO11基因在单倍体酿酒酵母Scflo11缺失株中高表达可以互补该缺失株的侵入生长缺陷。

图3C显示了白念珠菌CaFLO11基因在单倍体酿酒酵母Scflo11缺失株中高表达可以互补该缺失株的絮凝缺陷。

图4A显示了白念珠菌CaFLO11基因的敲除策略。

图4B显示了用PCR方法对CaFLO11基因敲除结果的鉴定。

图4C显示了用Northern方法对CaFLO11基因敲除结果的鉴定。

图5显示了白念珠菌CaFLO11基因的表达受多种转录调控因子Efg1，Tec1，Tup1和Nrg1的影响。

图6A显示了白念珠菌CaFLO11基因受到菌丝生长激活因子Cph1的正调控作用。

图6B显示了在CPH1高表达的菌株中CaFLO11能促进絮凝反应的进行。

图7A显示了CaFLO11高表达可以赋予酿酒酵母附着于明胶的能力。

图7B显示了CaFLO11的高表达能促进白念珠菌细胞与人类口腔上皮细胞的粘附。图中，内吞的多少反映了白念珠菌对宿主细胞的侵入能力。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，首次在白念珠菌中克隆了一种细胞壁粘附因子，具体地，本发明人从白念珠菌的基因组文库中分离到一个新基因，该基因可以互补酿酒酵母(Sacchromyces cerevisiae)FLO11(ScFLO11)基因的多种功能，二者编码的蛋白具有相似的结构特征，因此命名为CaFLO11。在酿酒酵母中高表达CaFLO11基因可以增强酵母细胞之间的粘附(flocculation)加快絮状沉淀的形成，同时可以赋予酿酒酵母细胞粘附于明胶的能力。在白念珠菌中敲除CaFLO11基因构建Caflo11基因缺失株用于功能分析。在口腔表皮粘附试验中，CaFLO11的过表达促进白念珠菌与上皮细胞的粘附，而且在白念珠菌中高表达CaFLO11可以增强絮凝沉淀反应，这说明CaFLO11是一种细胞壁粘附因子，在细胞粘附过程有重要功能。另外，在分子水平上检测发现CaFLO11的表达受多种转录调控因子如Efg1，Tec1和Cph1的影响。在此基础上完成了本发明。

在本发明中，术语“CaFlo11蛋白”、“CaFlo11多肽”或“细胞壁粘附因子CaFlo11”可互换使用，都指具有白念珠菌细胞壁粘附因子CaFlo11氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的细胞壁粘附因子CaFlo11。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的CaFlo11蛋白或多肽”是指CaFlo11多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化CaFlo11蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括白念珠菌CaFlo11蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然白念珠菌CaFlo11蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“白念珠菌CaFlo11多肽”指具有白念珠菌CaFlo11蛋白活性的SEQ ID NO：2序列的多肽。该术语还包括具有与白念珠菌CaFlo11蛋白相同功能的、SEQ ID NO：2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括白念珠菌CaFlo11蛋白的活性片段和活性衍生物。该术语还包括与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％序列相同性，并且具有促进白念珠菌粘附于上皮细胞的功能的多肽。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与白念珠菌CaFLO11 DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗白念珠菌CaFlo11多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含白念珠菌CaFlo11多肽或其片段的融合蛋白(如与GST、6His等形成的融合蛋白)。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了白念珠菌CaFlo11多肽的可溶性片段。通常，该片段具有白念珠菌CaFlo11多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

本发明发明还提供白念珠菌CaFlo11蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然白念珠菌CaFlo11多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“白念珠菌CaFlo11蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
最初的残基	代表性的取代	优选的取代	Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys	Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys	Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu	Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu	Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn	Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn	Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala	Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala	His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu	His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu	Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg	Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg	Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu	Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu	Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr	Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr	Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr	Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr	Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu	Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ IDNO：2的蛋白质，但与SEQ ID NO：1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO：2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO：2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码CaFlo11蛋白的多聚核苷酸。

本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

本发明的白念珠菌CaFLO11核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明的CaFlo11蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明的CaFlo11蛋白序列中。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；230：1350-1354)被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或CaFlo11蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的CaFlo11多肽。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码白念珠菌CaFlo11多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，白念珠菌CaFLO11多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达的基于T7的表达载体(Rosenberg，et al.Gene，1987，56：125)；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(Lee and Nathans，J Bio Chem.263：3521，1988)和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含白念珠菌CaFLO11编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a Laboratory Manual，coldSpring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

重组的白念珠菌CaFlo11蛋白或多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)：用于筛选促进或对抗CaFlo11蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。用表达的重组白念珠菌CaFlo11蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能抑制白念珠菌CaFlo11蛋白功能的多肽分子。

另一方面，本发明还包括对白念珠菌CaFLO11 DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。“特异性”是指抗体能结合于白念珠菌CaFLO11基因产物或片段。较佳地，指那些能与白念珠菌CaFLO11基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制白念珠菌CaFlo11蛋白的分子，也包括那些并不影响白念珠菌CaFlo11蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的白念珠菌CaFLO11基因产物结合的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的白念珠菌CaFLO11基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达白念珠菌CaFlo11蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人， Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人， Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人， In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断白念珠菌CaFlo11蛋白功能的抗体以及不影响白念珠菌CaFlo11蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用白念珠菌CaFLO11基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与白念珠菌CaFLO11基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

抗白念珠菌CaFlo11蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的白念珠菌CaFlo11蛋白。

本发明中的抗体可用于治疗或预防与白念珠菌CaFlo11蛋白相关的疾病。给予适当剂量的抗体可以刺激或阻断白念珠菌CaFlo11蛋白的产生或活性。

抗体也可用于设计成针对体内某一特殊部位的免疫毒素。如白念珠菌CaFlo11蛋白高亲和性的单克隆抗体可与细菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，红豆碱等)共价结合。一种通常的方法是用巯基交联剂如SPDP，攻击抗体的氨基，通过二硫键的交换，将毒素结合于抗体上，这种杂交抗体可用于杀灭表达CaFlo11蛋白的白念珠菌。

多克隆抗体的生产可用白念珠菌CaFlo11蛋白或多肽免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。

利用本发明的CaFlo11蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与CaFlo11蛋白发生相互作用的物质，如抗体、抑制剂、激动剂或拮抗剂等。

本发明的CaFlo11蛋白的抗体、抑制剂、或拮抗剂等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：口腔内、阴道内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。

例如，本发明的CaFlo11蛋白的抗体、抑制剂、或拮抗剂可直接用于疾病治疗，例如，用于抑制白念珠菌的正常生长，进而减轻白念珠菌造成的感染。在使用本发明CaFlo11蛋白时，还可同时使用其他治疗剂，如其他抗真菌剂氟康唑等。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的抗CaFlo11多肽的抗体或其拮抗剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是将安全有效量的CaFlo11蛋白的拮抗剂或抗体施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

能与白念珠菌CaFlo11蛋白结合的多肽分子可通过筛选由各种可能组合的氨基酸结合于固相物组成的随机多肽库而获得。筛选时，宜对白念珠菌CaFlo11蛋白分子进行标记。

本发明还涉及定量和定位检测白念珠菌CaFlo11蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。试验中所检测的白念珠菌CaFlo11蛋白水平，可以用作判断白念珠菌是否会造成严重的感染。

一种检测检测样品中是否存在CaFlo11蛋白的方法是利用CaFlo11蛋白的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与CaFlo11蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在CaFlo11蛋白。

CaFlo11蛋白的多聚核苷酸可用于CaFlo11蛋白相关疾病的诊断。在诊断方面，CaFlo11蛋白的多聚核苷酸可用于检测CaFlo11蛋白的表达与否。如CaFLO11 DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断CaFlo11蛋白的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用CaFlo11蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测CaFlo11蛋白的转录产物。

检测CaFLO11基因的突变也可用于诊断CaFlo11蛋白相关的疾病。CaFlo11蛋白突变的形式包括与正常野生型CaFLO11 DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。

在本发明的一个实例中，提供了一种分离的多核苷酸，它编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽。本发明的多核苷酸是从白念珠菌cDNA文库中分离出的。其序列如SEQ ID NO：1所示，它包含的多核苷酸序列全长为3366个碱基，其开放读框位于1-3363位，编码全长为1121个氨基酸的白念珠菌CaFlo11蛋白(SEQ ID NO：2)。CaFlo11蛋白为预防和治疗白念珠菌感染提供新的治疗途径，具有潜在的应用前景。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例

材料

限制性内切酶、T4 DNA连接酶、探针标记试剂盒均购自美国Invitrogen公司；消解酶(Zymolyase 100T)购自日本Seikagaku公司；用于PCR扩增的KOD plus购自日本的Toyobo公司。

通用方法：

(1)白念珠菌基因组DNA抽提

白念珠菌培养过夜用ddH₂O洗1次，悬浮在500μl溶液A中(1M山梨醇，100mMEDTA pH8.0)，加入5μl 20mg/ml的消解酶(Zymolase)，37℃放置1小时后，高速离心去上清，细胞用500μlTE缓冲液(20mM Tris·HCl pH7.5，1mM EDTA)洗一次，悬浮在350μlTE缓冲液中，并加入90μl溶液B(250mM EDTA pH8.0，400mM Tris·HCl pH8.0，2％SDS)，65℃放置30分钟，加入80μl 5M KAc，冰上放置1小时，高速离心5分钟，吸取上清并加入1ml的无水乙醇，-20℃放置20分钟，高速离心5分钟，沉淀用70％乙醇洗一次，离心后烘干。

(2)Southern分析

白念珠菌基因组DNA抽提后，基因组DNA用PvuII完全酶切，电泳完成后的琼脂糖胶分别用变性液和中和液浸泡45min，尼龙膜用双蒸水或10×SSC浸透，搭好转膜平台，胶与膜间用Parafilm封闭，加一个500g砝码。以10×SSC为转膜液转移过夜，第二天漂洗晾干交联。交联后的膜装入杂交管，加入10ml预杂交液(6×SSC，5xdenhardt’s Reagent，0.5％SDS，100μg/ml鱼精DNA于42℃预杂交12h，探针在100℃变性5min，加入150μl(约1/3所标记的探例)42℃杂交10-16h。0.1×SSC，0.1％SDS洗两到三次，每次40min，取出膜，晾干，室温或-70℃压片。探针标记用Invitrogene公司的随机引物标记试剂盒，照其说明操作。将含25ng DNA的溶液于100℃加热变性5-10min，置于冰浴中，再依次加入随机引物缓冲液混合物(Random Primers BufferMixture)，2μl dCTP，2μl dGTP，2μl dTTP，3μl[α-³²P]-dATP(10μCi/μl)，混匀后加入1μl Klenow酶，于25℃保温1h，以Sephadex G-25柱以3000rpm离心4min，收集离心液，即为纯化后的探针溶液。探针于100℃变性5min冰上冷却后加入杂交体系中。

(3)Northern分析

用热酚法抽提白念珠菌总RNA，以及Northern杂交分析方法参照文献(37)。各菌株在YPD，30℃中培养至对数生长期后期，转接至YPD+10％血清，或者Lee’s培养基，起始OD＝0.05，并在相应温度下培养指定时间，用热酚法抽提白念珠菌总RNA。20μl上样量包括RNA样品12μl(25μg)，4μl甲醛，2μl 10×MOPS，2μl上样缓冲液、65℃加热10min，0℃冷却2min，离心5s，上样。电泳在含甲醛的变性胶上进行(1g琼脂糖，10ml 10×MOPS，87mI DEPC处理水，加热融化稍冷后加入2.7ml 37％甲醛)。电泳条件为100mA，50-70V，5-7h电泳完成后同样用毛细法转膜，转膜液用5×SSC。转膜过夜后，取出膜，不能使膜干透，用Bio-Ra GS Gene Linker C3 protocol紫外交联，加入10ml预杂交液，65℃，2h后更换为10ml杂交液，加入探针65℃杂交过夜，用2×SSC，0.1％SDS，65℃洗膜两次，每次30min。杂交好的膜不要晾干，用保鲜膜包好后-70℃压片。重杂交洗膜用0.5％SDS，90-100℃加热5-10min，或按照Clontech推荐用0.5％SDS，90-100℃加热10min后让其自然冷却10min后取出备用，若不立即使用，用保鲜膜包好后置于-20℃保存。

(4)白念珠菌和酿酒酵母的转化

准备PEG/LiAc溶液(pH 7.5)10ml；在1.5mI Eppendof管中依次加入质粒(如果转酿酒酵母，质粒0.1μg，如果转白念珠菌，线形化质粒大约5μg)，10μl 10mg/ml鱼精DNA，混匀；加入0.1ml感受态细胞和0.6ml PEG/LiAc，votex混匀；30℃200rpm培养30min；加入70μl DMSO，轻轻混匀；42℃热冲击15min，期间不时轻轻摇匀；冰浴～2min：高速离心15s，吸掉上清，用0.2ml TE重悬细胞；涂布于适当的营养筛选SD平板上。

(5)絮凝沉淀反应

所需菌在SD液体培养基里培养过夜，使之达到饱和状态。转至试管中剧烈摇晃后，静置10分钟，观察照相。

(6)单倍体酵母菌的侵入生长及细胞形态观察

挑取单个酵母菌落，均匀涂布于YPD平板，30℃培养3天，用灭菌的绒布转印到多块YPD及SD平板上，30℃培养3-5天。用均匀的水冲洗平板表面，未能侵入生长的细胞被洗去而侵入琼脂内的细胞会保留下来。在冲洗前后分别拍照。

(7)细胞粘附实验

粘附实验操作于12孔聚苯乙烯平板，每孔接种量2×10⁵上皮细胞于37℃，5％CO₂的培养箱中培养过夜。第二天去掉培养基，加入1ml含有2×10²静止相的白念珠菌细胞的KSFM。经过0，0.5，2，4和6小时培养后，于水平摇床上200rpm摇动2min然后将每孔培养物涂布于YPD固体平板。接着，向12孔平板每孔加入1mlKSFM刮下上皮细胞涂布于YPD固体平板。YPD平板室温培养48小时后，根据两次涂布的平板长出的克隆数(CFU)分析白念珠菌未粘附和粘附于上皮细胞的比例。

实施例1

白念珠菌CaFLO11基因的获得及序列分析

利用功能互补原理，将常规方法构建的白念珠菌基因组DNA文库转入常规的单倍体酿酒酵母flo8缺失株中，筛选那些能够校正该缺失株对琼脂侵入生长缺陷的基因。在这次筛选中，得到一个能够强烈校正flo8缺失株侵入生长缺陷的克隆。对该克隆经过酶切图谱分析和序列测定分析比较，并从网上BLASTn和白念珠菌基因组数据库得知该克隆含有一个3363bp的阅读框(图1)。

根据比较结果，合成以下引物：

上游引物：

CGCATCGATATGAAAGTTTCTCAAATTTTACCATTAGCTGG(SEQ ID NO：3)

下游引物：

GTCATCGATTCACATAAAGTAGACTAATGCAGCCACTGCTAAACCG(SEQ ID NO：4)

以野生型白念珠菌基因组DNA为模板，通过常规的PCR反应获得长度约3.4Kb的扩增产物。

通过合成一系列引物对扩增产物所含的DNA序列进行双向测定。计算机分析表明，该扩增产物所含的全长DNA是一个新的DNA序列(如SEQ ID NO：1和图1所示)，编码一个新的1121个氨基酸的蛋白质(如SEQ ID NO：2和图2A所示)。

从氨基酸序列比较分析预测这个蛋白是一个细胞壁蛋白，其氨基酸组成富含丝氨酸、脯氨酸和苏氨酸，N端有信号肽序列，C端具有GPI锚同源序列，中部有多个由丝氨酸和苏氨酸组成的串联重复序列(图2B)。这些结构特点和酿酒酵母Flo11蛋白相同，因此将该基因命名为CaFLO11。

白念珠菌CaFLO11基因的核苷酸序列已送GenBank登录，在本申请之前尚未公开。

实施例2

白念珠菌CaFLO11基因能互补酿酒酵母flo11缺失株的功能

在酿酒酵母中，Scflo11基因的缺失导致双倍体细胞不能形成菌丝，单倍体细胞不能进行侵入生长，不能形成絮凝沉淀。为了验证CaFLO11与ScFLO11的关系，在本实施例中，利用PCR的方法，利用上游引物5’TTGAGGTACCCTGCGCTGACTAAGATCGTCAA 3’(SEQ ID NO：5)和下游引物5’CGCAGAGCTCGCTGTCCATGCTATTTATATTGGG 3’(SEQ ID NO：6)扩增，然后将扩增产物插入表达载体Yeplac181(美国专利5,674,721或5,759,833；或美国专利申请20020081684或20030064436)中，得到表达质粒Yeplac181-CaFLO11。

把质粒Yeplac181-CaFLO11转化到常规的酿酒酵母flo11双倍体缺失株和单倍体缺失株。结果显示在氮源缺乏的条件下，外源表达CaFLO11能够显著地促进该缺失株的假菌丝形成(图3A)和侵入生长(图3B)。

利用上述的单倍体转化菌株观察絮凝沉淀反应，导入CaFLO11的菌株较野生型更快地发生絮凝，而Scflo11缺失株基本不发生絮凝沉淀(图3C)。

这些结果说明，CaFLO11能够互补Scflo11缺失株的絮凝作用。从以上结果可以看出，CaFLO11从多个角度互补ScFLO11的功能，结合二者结构特征的相似性，提示CaFLO11是ScFLO11的同源基因。

实施例3

白念珠菌基因CaFLO11的敲除

为了研究CaFLO11基因在白念珠菌形态发生中的功能和作用，本实施例利用PCR法敲除CaFLO11基因。敲除策略见图4A。具体方法如下：

利用5’引物：TGTGATGGCGGTTCTTGTTCTCATACAGCAGTAACTACGGGTGTCACTATCATCACCGTCGTTTTCCCAGTCACGACGTT(SEQ ID NO：7)

和3’引物：TTGAAAGAACACTGGAAGAAGCTTCAACTTCAGGACCATTGGTAGGAACTGATGGGCTGGTGTGGAATTGTGAGCGGATA(SEQID NO：8)

(其中每个引物的5’端的60个碱基和CaFLO11基因同源，3’端的20个碱基和用于PCR扩增模板质粒中的DNA配对)

以常规载体pGEM-HIS1，pGEM-URA3和pGEM-ARG4(R.Bryce Wilson，DanaDavis，and Aaron P.Mitchell，Journal of Bacteriology，March 1999，p.1868-1874，Vol.181，No.6；Marcus E.Marvin，Robert P.Mason and Annette M.Cashmore，Microbiology 150(2004)，2197-2208；DOI 10.1099/mic.0.27004-0；或US专利申请20030175712)为模板，扩增出两端含有与白念珠菌CaFLO11基因60bp同源序列的产物HIS1，URA3和ARG4。将所得的PCR产物分别转化白念珠菌，可以得到CaFLO11基因被筛选标记基因HIS1，URA3和ARG4替换的转化子。

CaFLO11基因的敲除分别用PCR和Northern杂交技术检测与鉴定，结果表明经过两轮的敲除，两个拷贝的CaFLO11基因分别被ARG4和HIS1所替代，得到Caflo11缺失株(图4B，C)。

实施例4

菌丝生长激活因子和抑制因子对CaFLO11表达的影响

本发明人通过Northern印迹法分析在菌丝诱导和酵母生长条件下CaFLO11表达量上的差异。结果表明CaFLO11能转录出2kb和4kb两个转录本，而且它们的表达量不受形态转变的影响。

为了研究CaFLO11基因的表达是否受菌丝生长相关因子的调控，以4kb CaFLO11片段为探针分别检测了多个正调控因子和负调控因子缺失株中CaFLO11的转录水平。结果显示在所有正调控因子缺失株中4kb的CaFLO11转录本表达量恒定，但是在crk1，efg1，tec1缺失株中2kb的CaFLO11的转录本的表达量减少或消失(图5)，说明Crk1，Efg1，Tec1因子可能作用于2kb的CaFLO11基因拷贝的启动子区，激活CaFLO11的转录。在tup1和nrg1缺失株中，CaFLO11的两个转录本的表达量都大幅上调，说明这两个转录抑制因子能抑制CaFLO11的表达。

Efg1和Tec1是白念珠菌两个在菌丝生长中起重要作用的转录因子，在CaFLO11的启动子序列可以找到Efg1和Tec1的结合位点，说明两个因子可能结合于启动子区对CaFLO11的转录起正调控作用。

在白念珠菌中Tup1和Nrg1是两个重要的转录抑制因子抑制菌丝生长特异性基因的表达。这两个因子任何一个的缺失都可以使白念珠菌组成型形成菌丝。Tup1没有DNA结合结构域，它通常以Tup1-Ssn6复合体的形式与结合于启动子序列的某些蛋白作用进而起到抑制这个基因的转录。Nrg1可以结合到DNA上，募集Tup1共同抑制下游基因的转录，它也可以通过其它机制对基因的转录进行抑制。序列分析表明在CaFLO11启动子上游1500bp区域内共发现有9个Nrg1结合元件的NRE序列，说明Nrg1可能结合于CaFLO11的启动子而对其转录起抑制作用。

实施例5

转录激活因子Cph1的过表达可以促进CaFLO11基因的转录

(a)本发明人还检测了CPH1、CPH2、TEC1、EFG1高表达菌株中CaFLO11的表达情况。

结果如图6A所示。结果显示在Cph1基因的高表达菌种中CaFLO11的表达量大量增加，尤其是在MTLa型菌株中这种转录激活作用更为明显。而其它几个因子的高表达对CaFLO11的转录没有产生明显的影响。

(b)利用上述结果，本实施例中还检测了在CPH1高表达的背景下，CaFLO11的表达量高低对絮凝沉淀的影响。

结果表明CaFLO11过表达的菌株可以在10分钟内快速的絮凝而野生型没有明显的沉降(图6B)。说明在白念珠菌中CaFLO11在细胞之间的粘附中发挥重要的功能作用。

实施例6

CaFLO11的表达促进白念珠菌与上皮细胞的粘附

对宿主上皮细胞和内皮细胞的粘附和侵入能力被认为是白念珠菌致病性的一个关键步骤。本实施例中，将CaFLO11基因表达质粒Yeplac181-CaFLO11导入酿酒酵母细胞，在对明胶的粘附实验(即将酵母细胞培养液缓慢流过明胶后检测明胶上附着酵母细胞数的实验)中发现，异源表达的CaFlo11可以赋予酿酒酵母细胞粘附到明胶表面的能力，而野生型酿酒酵母细胞则没有明显的粘附能力(图7A)。

在白念珠菌中敲除CaFLO11基因(方法同实施例3)用于功能研究；该缺失株，回复株和野生型白念珠菌在与口腔上皮细胞共培养0，2，4，6小时后将培养液涂布于YPD平板检测长出的克隆数，同时刮下培养的上皮细胞也涂布于YPD固体平板观察长出的克隆数。根据两种涂板长出的克隆数分析，虽然与野生型白念珠菌相比Caflo11缺失株的粘附能力没有明显的变化，但是在该缺失株中过表达CaFLO11可以明显的增强菌株与上皮细胞的粘附(图7B)，说明CaFLO11介导了白念珠菌和宿主细胞之间的粘附作用，是一个重要的粘附因子。

实施例7

CaFLO11蛋白重组表达和纯化

在该实施例中，以实施例1中的PCR扩增产物为模板，用序列如下的5’和3’端的PCR寡核苷酸引物进行扩增，获得白念珠菌CaFLO11 DNA作为插入片段。

PCR反应中使用的5’端寡核苷酸引物序列为：

5’-CGGGATCCATGAAAGTTTCTCAAATTTTACCA-3’(SEQ ID NO：9)

该引物含有BamHI限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是由起始密码子开始的部分编码序列；

3’端引物序列为：

5’-CGGGATCCTCACATAAAGTAGACTAATGCAGC-3’(SEQ ID NO：10)

该引物含有BamHI限制性内切酶的酶切位点、翻译终止子和白念珠菌CaFLO11的部分编码序列。

白念珠菌CaFlo11蛋白cDNA PCR产物纯化后经BamHI酶切再与质粒pGEX-2T(购于美国Invitrogen公司)按常规方法重组形成载体pGEX-2T-CaFLO11并转化至感受态大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆用EcoRI酶切鉴定插入方向，酶切产物在0.8％琼脂糖凝胶电泳分析。鉴定后纯化并测序(ABI公司的377型测序仪，BigDye Terminator试剂盒，PE公司)。经测序证实，已插入了完整的CaFLO11编码序列。

挑表达CaFLO11的阳性DH5α克隆接种于100ml 2×YTA培养基中，37℃300rpm振荡培养12-15hr，1∶10稀释于预热的2×YTA培养基继续振荡培养1.5hr，加100mMIPTG至0.1mM后30℃诱导2-6hr，5,000g 4℃离心10min去上清，置冰上用50ml1×PBS(0.14M NaCl，2.7mM KCl，10.1mM Na₂HPO₄，1.8mM KH₂PO₄，pH7.3)重悬，超声(B.Braun Labsonic U)破碎后再加入20％Triton X-100至1％轻摇30min，然后12,000g4℃离心10min，上清用0.8μm滤膜过滤后，过1ml 50％谷胱甘肽Sepharose 4B层析柱，1×PBS充分洗涤后，加入500ul谷胱甘肽洗脱缓冲液(10mM谷胱甘肽，50mM Tris-HCl，pH8.0)室温静置30分钟后收集洗脱液，重复洗脱2-3次，得到白念珠菌CaFlo11蛋白。

实施例8

抗CaFLO11蛋白抗体的产生

将实施例7中获得的重组白念珠菌CaFlo11蛋白用来免疫动物以产生抗体，具体方法如下。重组分子用层析法进行分离后备用。也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下，并用等体积的完全Freund’s佐剂乳化。用50-100μg/0.2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund’s佐剂乳化的同样抗原，对小鼠以50-100μg/0.2ml的剂量进行腹膜内注射以加强免疫。每隔14天进行一次加强免疫，至少进行三次。获得的抗血清的特异反应活性用它在体外沉淀白念珠菌CaFlo11蛋白基因翻译产物的能力加以评估。结果发现，抗体可特异性地与本发明的CaFlo11蛋白发生结合。

讨论

白念珠菌(Candida albicans)是一种人体机会性致病真菌，能引起广泛的深部和浅部感染，但是其真正的致病因子和致病机理没有完全研究清楚。

ScFlo11是酿酒酵母一个重要的细胞壁蛋白，它的作用领域涉及到絮凝沉淀，菌丝形成，侵入生长，细胞间粘附和交配等(Bing Guo et al.PNAs，2000，vol 97no.22)，在酿酒酵母中是一个非常重要的蛋白。MAPK途径和cAMP途径的调控因子最终作用于ScFLO11的启动子区域应答不同的外界信号(Rupp S et al.EMBO1999，18：1257-1269)。

本发明人从白念珠菌的基因组文库中分离到一个新基因，该基因可以互补酿酒酵母(Sacchromyces cerevisiae)FLO11(ScFLO11)基因的多种功能，二者编码的蛋白具有相似的结构特征，因此命名为CaFLO11。在酿酒酵母中高表达CaFLO11基因可以增强酵母细胞之间的粘附(flocculation)加快絮状沉淀的形成，同时可以赋予酿酒酵母细胞粘附于明胶的能力。在白念珠菌中敲除CaFLO11基因构建Caflo11基因缺失株用于功能分析。在口腔表皮粘附试验中，CaFLO11的过表达促进白念珠菌与上皮细胞的粘附，而且在白念珠菌中高表达CaFLO11可以增强絮凝沉淀反应，这说明CaFLO11是一种细胞壁粘附因子，在细胞粘附过程有重要功能。

另外，在分子水平上检测发现CaFLO11的表达受多种转录调控因子如Efg1，Tec1和Cph1的影响。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院

<120>白念珠菌细胞壁粘附因子基因及其用途

<130>057912

<160>10

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>3366

<212>DNA

<213>白念珠菌(Candida albicans)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(3363)

<400>1

atgaaagttt ctcaaatttt accattagct ggtgctatat ccgttgcatc aggtttttgg 60

attcctgatt ttctgaacaa acaaaattca aattcctacc caggccaata caaaggcaaa 120

ggtggctatc aagatgactg tggggatgat tacaagaaag gttataaaag caaaacctac 180

tccaaggtca agcccattac tagcactgat tgtaccactc caattcaacc aacagggacc 240

accaccgggt atacaaaaga cgttgttgaa tctacctcct acacgactga cactgcttat 300

actaccacag ttataactgt caccaaatgt gatggcggtt cttgttctca tacagcagta 360

actacgggtg tcactatcat caccgtcact accaatgatg ttattactga atacactact 420

tattgtccat tgacatcaac tccagctact gagtctacac cggctactga atctacacca 480

gctattgagt ctaccccatg tactacaagt actgaaacca ctccagctac tgaaagtact 540

ccagctactg aatctacacc agctactgaa tctaccccat gtactacaag tactgaaagt 600

actcctgcta ctgaatctac tccagctacc gagtctactc cagctaccga gtctactcca 660

gctactgaat ctactccagc tactgaatct acaccagcta ccgagtccac accagctact 720

aaatctactc cagctaccga gtctactcca gctaccgagt ctactcctgc tactgaatct 780

accccatgta ctacaagtac tgaaagtact cctgctactg agtctactcc tgctaccgag 840

tctactcctg ctactgagtc cactccagct accgagtcca ccccagctac tgaatctact 900

ccagctactg aatctactcc tgctactgag tctactcctg ctactgagtc tactcctgct 960

actgagtcta ctccagctac cgagtccact ccatgtacta caagtactga aagtactcct 1020

gctactgagt ctactccagc taccgagtct actcctgcta ctgagtccac tccagctact 1080

gaatctactc cagctactga atctacccca tgtactacaa gtactgaaag tactcctgct 1140

actgagtcta ctcctgctac cgagtctact cctgctactg agtccactcc agctaccgag 1200

tccaccccag ctactgaatc tactccagct actgaatcta ccccatgtac tacaagtact 1260

gaaagtactc ctgctactga gtctactcca gctaccgagt ctactcctgc tactgagtcc 1320

actccagcta ctgaatctac tccagctacc gagtctacac cagctactga atctacccca 1380

tgtactacaa gtactgaaag tactcctgct actgaatcta caccagctac cgagtctact 1440

cctgctactg agtccactcc agctaccgag tccactccag ctactgaatc tactccagct 1500

actgaatcta ccccatgtac tacaagtact gaaagtactc ctgctactga gtctactcct 1560

gctaccgagt ctactcctgc tactgagtcc actcctgcta ccgagtctac tcctgctact 1620

gagtccactc cagctaccga gtccacccca gctactgaat ctactccagc tactgaatct 1680

actcctgcta ctgagtctac tcctgctact gagtctactc ctgctactga gtctactcct 1740

gctaccgagt ctactccagc tactgaatct actccagcta ccgagtccac accagctact 1800

gaatctaccc catgtactac aagtactgaa accactccag ctactgaaag tactccagct 1860

actgagtcca ctccagctac tgagtctact cctgctactg aatctacacc agctaccgag 1920

tccactccag ctactgaatc tactccagct accgagtcta caccagctac tgaatctacc 1980

ccatgtacta caagtactga aaccactcca gctactgaaa gtactgcatc cactgagaca 2040

gcttccagta caccagttga gtctacagta attgttccaa gtacaactgt tataacagta 2100

agttcgtgtt atgaggataa gtgttcggtt tcatcagtta ccactggagt tgttaccatc 2160

tcatctgaag aaacaattta tactacttac tgtcctatta catccagtat aactattcca 2220

gttcctaaca cgtccacacc agctgctcca ggtactccag tggaatctca accagttatc 2280

ccaggtactg aaactactcc agctgctcca ggtactccag tagaatctca acccgttatc 2340

ccaggtactg aaactacccc agctgctcca ggtactccag tagaatctca acccgttatc 2400

ccaggcactg aaactactcc agctgctcca ggtactccag tagaatctca accagctact 2460

acaccagttg ccccaggtac tgaaaccact ccagctgctc caggtactcc agtagaatct 2520

caaccagcta ctacaccagt tgccccaggt actgaaacta ccccagctgc tccaggtact 2580

ccagtagaat ctcaacccgt tatcccaggc actgaaacta ctccagctgc tccaggtact 2640

ccagtagaat ctcaaccagc tactacacca gttgccccag gtactgaaac cactccagct 2700

gctccaggta ctccagtaga atctcaacca gctactacac cagttgcccc aggtactgaa 2760

accactccag ctgctccagg tactccagtg gaatctcaac cagctactac accagttgcc 2820

ccaggtactg aaactacccc agctgctcca ggtactccag tggaatctca accagctact 2880

acaccagtta ctccaggcac tgaaactact ccagctgctc caggcactcc agtggactct 2940

caaccagtta ccccaggtac tgaaactact ccagctgcac caggtactcc aggcactgaa 3000

gctactccag ttactactca accagtttca gtacttagta ctctgcaagt tgttactgca 3060

agtggcgaat tttctacagt tactgctcac tcaacttcaa ttgtcgctag ctgtcccgaa 3120

ggtggatgtg ttccagaagg acaacaaact gaaaccagcc catcagttcc taccaatggt 3180

cctgaagttg aagcttcttc cagtgttctt tcaatcccag tttcatctgt tactacaagt 3240

acaatagcaa gttctagtga gacttctgta ccaccagctc aagtttccac ttttgaagga 3300

tctggctctg cacttaaaaa accatactac ggtttagcag tggctgcatt agtctacttt 3360

atgtga 3366

<210>2

<211>1121

<212>PRT

<213>白念珠菌(Candida albicans)

<400>2

Met Lys Val Ser Gln Ile Leu Pro Leu Ala Gly Ala Ile Ser Val Ala

1 5 10 15

Ser Gly Phe Trp Ile Pro Asp Phe Leu Asn Lys Gln Asn Ser Asn Ser

20 25 30

Tyr Pro Gly Gln Tyr Lys Gly Lys Gly Gly Tyr Gln Asp Asp Cys Gly

35 40 45

Asp Asp Tyr Lys Lys Gly Tyr Lys Ser Lys Thr Tyr Ser Lys Val Lys

50 55 60

Pro Ile Thr Ser Thr Asp Cys Thr Thr Pro Ile Gln Pro Thr Gly Thr

65 70 75 80

Thr Thr Gly Tyr Thr Lys Asp Val Val Glu Ser Thr Ser Tyr Thr Thr

85 90 95

Asp Thr Ala Tyr Thr Thr Thr Val Ile Thr Val Thr Lys Cys Asp Gly

100 105 110

Gly Ser Cys Ser His Thr Ala Val Thr Thr Gly Val Thr Ile Ile Thr

115 120 125

Val Thr Thr Asn Asp Val Ile Thr Glu Tyr Thr Thr Tyr Cys Pro Leu

130 135 140

Thr Ser Thr Pro Ala Thr Glu Ser Thr Pro Ala Thr Glu Ser Thr Pro

145 150 155 160

Ala Ile Glu Ser Thr Pro Cys Thr Thr Ser Thr Glu Thr Thr Pro Ala

165 170 175

Thr Glu Ser Thr Pro Ala Thr Glu Ser Thr Pro Ala Thr Glu Ser Thr

180 185 190

Pro Cys Thr Thr Ser Thr Glu Ser Thr Pro Ala Thr Glu Ser Thr Pro

195 200 205

Ala Thr Glu Ser Thr Pro Ala Thr Glu Ser Thr Pro Ala Thr Glu Ser

210 215 220

Thr Pro Ala Thr Glu Ser Thr Pro Ala Thr Glu Ser Thr Pro Ala Thr

225 230 235 240

Lys Ser Thr Pro Ala Thr Glu Ser Thr Pro Ala Thr Glu Ser Thr Pro

245 250 255

Ala Thr Glu Ser Thr Pro Cys Thr Thr Ser Thr Glu Ser Thr Pro Ala

260 265 270

Thr Glu Ser Thr Pro Ala Thr Glu Ser Thr Pro Ala Thr Glu Ser Thr

275 280 285

Pro Ala Thr Glu Ser Thr Pro Ala Thr Glu Ser Thr Pro Ala Thr Glu

290 295 300

Ser Thr Pro Ala Thr Glu Ser Thr Pro Ala Thr Glu Ser Thr Pro Ala

305 310 315 320

Thr Glu Ser Thr Pro Ala Thr Glu Ser Thr Pro Cys Thr Thr Ser Thr

325 330 335

Glu Ser Thr Pro Ala Thr Glu Ser Thr Pro Ala Thr Glu Ser Thr Pro

340 345 350

Ala Thr Glu Ser Thr Pro Ala Thr Glu Ser Thr Pro Ala Thr Glu Ser

355 360 365

Thr Pro Cys Thr Thr Ser Thr Glu Ser Thr Pro Ala Thr Glu Ser Thr

370 375 380

Pro Ala Thr Glu Ser Thr Pro Ala Thr Glu Ser Thr Pro Ala Thr Glu

385 390 395 400

Ser Thr Pro Ala Thr Glu Ser Thr Pro Ala Thr Glu Ser Thr Pro Cys

405 410 415

Thr Thr Ser Thr Glu Ser Thr Pro Ala Thr Glu Ser Thr Pro Ala Thr

420 425 430

Glu Ser Thr Pro Ala Thr Glu Ser Thr Pro Ala Thr Glu Ser Thr Pro

435 440 445

Ala Thr Glu Ser Thr Pro Ala Thr Glu Ser Thr Pro Cys Thr Thr Ser

450 455 460

Thr Glu Ser Thr Pro Ala Thr Glu Ser Thr Pro Ala Thr Glu Ser Thr

465 470 475 480

Pro Ala Thr Glu Ser Thr Pro Ala Thr Glu Ser Thr Pro Ala Thr Glu

485 490 495

Ser Thr Pro Ala Thr Glu Ser Thr Pro Cys Thr Thr Ser Thr Glu Ser

500 505 510

Thr Pro Ala Thr Glu Ser Thr Pro Ala Thr Glu Ser Thr Pro Ala Thr

515 520 525

Glu Ser Thr Pro Ala Thr Glu Ser Thr Pro Ala Thr Glu Ser Thr Pro

530 535 540

Ala Thr Glu Ser Thr Pro Ala Thr Glu Ser Thr Pro Ala Thr Glu Ser

545 550 555 560

Thr Pro Ala Thr Glu Ser Thr Pro Ala Thr Glu Ser Thr Pro Ala Thr

565 570 575

Glu Ser Thr Pro Ala Thr Glu Ser Thr Pro Ala Thr Glu Ser Thr Pro

580 585 590

Ala Thr Glu Ser Thr Pro Ala Thr Glu Ser Thr Pro Cys Thr Thr Ser

595 600 605

Thr Glu Thr Thr Pro Ala Thr Glu Ser Thr Pro Ala Thr Glu Ser Thr

6l0 615 620

Pro Ala Thr Glu Ser Thr Pro Ala Thr Glu Ser Thr Pro Ala Thr Glu

625 630 635 640

Ser Thr Pro Ala Thr Glu Ser Thr Pro Ala Thr Glu Ser Thr Pro Ala

645 650 655

Thr Glu Ser Thr Pro Cys Thr Thr Ser Thr Glu Thr Thr Pro Ala Thr

660 665 670

Glu Ser Thr Ala Ser Thr Glu Thr Ala Ser Ser Thr Pro Val Glu Ser

675 680 685

Thr Val Ile Val Pro Ser Thr Thr Val Ile Thr Val Ser Ser Cys Tyr

690 695 700

Glu Asp Lys Cys Ser Val Ser Ser Val Thr Thr Gly Val Val Thr Ile

705 710 715 720

Ser Ser Glu Glu Thr Ile Tyr Thr Thr Tyr Cys Pro Ile Thr Ser Ser

725 730 735

Ile Thr Ile Pro Val Pro Asn Thr Ser Thr Pro Ala Ala Pro Gly Thr

740 745 750

Pro Val Glu Ser Gln Pro Val Ile Pro Gly Thr Glu Thr Thr Pro Ala

755 760 765

Ala Pro Gly Thr Pro Val Glu Ser Gln Pro Val Ile Pro Gly Thr Glu

770 775 780

Thr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Thr Pro Val Glu Ser Gln Pro Val Ile

785 790 795 800

Pro Gly Thr Glu Thr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Thr Pro Val Glu Ser

805 810 815

Gln Pro Ala Thr Thr Pro Val Ala Pro Gly Thr Glu Thr Thr Pro Ala

820 825 830

Ala Pro Gly Thr Pro Val Glu Ser Gln Pro Ala Thr Thr Pro Val Ala

835 840 845

Pro Gly Thr Glu Thr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Thr Pro Val Glu Ser

850 855 860

Gln Pro Val Ile Pro Gly Thr Glu Thr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Thr

865 870 875 880

Pro Val Glu Ser Gln Pro Ala Thr Thr Pro Val Ala Pro Gly Thr Glu

885 890 895

Thr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Thr Pro Val Glu Ser Gln Pro Ala Thr

900 905 910

Thr Pro Val Ala Pro Gly Thr Glu Thr Thr Pro Ala Ala Pro GIy Thr

915 920 925

Pro Val Glu Ser Gln Pro Ala Thr Thr Pro Val Ala Pro Gly Thr Glu

930 935 940

Thr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Thr Pro Val Glu Ser Gln Pro Ala Thr

945 950 955 960

Thr Pro Val Thr Pro Gly Thr Glu Thr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Thr

965 970 975

Pro Val Asp Ser Gln Pro Val Thr Pro Gly Thr Glu Thr Thr Pro Ala

980 985 990

Ala Pro Gly Thr Pro Gly Thr Glu Ala Thr Pro Val Thr Thr Gln Pro

995 1000 1005

Val Ser Val Leu Ser Thr Leu Gln Val Val Thr Ala Ser Gly Glu

1010 1015 1020

Phe Ser Thr Val Thr Ala His Ser Thr Ser Ile Val Ala Ser Cys

1025 1030 1035

Pro Glu Gly Gly Cys Val Pro Glu Gly Gln Gln Thr Glu Thr Ser

1040 1045 1050

Pro Ser Val Pro Thr Asn Gly Pro Glu Val Glu Ala Ser Ser Ser

1055 1060 1065

Val Leu Ser Ile Pro Val Ser Ser Val Thr Thr Ser Thr Ile Ala

1070 1075 1080

Ser Ser Ser Glu Thr Ser Val Pro Pro Ala Gln Val Ser Thr Phe

1085 1090 1095

Glu Gly Ser Gly Ser Ala Leu Lys Lys Pro Tyr Tyr Gly Leu Ala

1100 1105 1110

Val Ala Ala Leu Val Tyr Phe Met

1115 1120

<210>3

<211>41

<212>DNA

<213>寡核苷酸

<400>3

cgcatcgata tgaaagtttc tcaaatttta ccattagctg g 41

<210>4

<211>46

<212>DNA

<213>寡核苷酸

<400>4

gtcatcgatt cacataaagt agactaatgc agccactgct aaaccg 46

<210>5

<211>32

<212>DNA

<213>寡核苷酸

<400>5

ttgaggtacc ctgcgctgac taagatcgtc aa 32

<210>6

<211>34

<212>DNA

<213>寡核苷酸

<400>6

cgcagagctc gctgtccatg ctatttatat tggg 34

<210>7

<211>80

<212>DNA

<213>寡核苷酸

<400>7

tgtgatggcg gttcttgttc tcatacagca gtaactacgg gtgtcactat catcaccgtc 60

gttttcccag tcacgacgtt 80

<210>8

<211>80

<212>DNA

<213>寡核苷酸

<400>8

ttgaaagaac actggaagaa gcttcaactt caggaccatt ggtaggaact gatgggctgg 60

tgtggaattg tgagcggata 80

<210>9

<211>32

<212>DNA

<213>寡核苷酸

<400>9

cgggatccat gaaagtttct caaattttac ca 32

<210>10

<211>32

<212>DNA

<213>寡核苷酸

<400>10

cgggatcctc acataaagta gactaatgca gc 32

Claims

1.一种分离的白念珠菌CaFlo11多肽，其特征在于，该多肽选自下组：

(a)具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO：2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，并且具有促进白念珠菌粘附于上皮细胞的功能的由(a)衍生的多肽。

2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽。

3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组：

(a)编码如权利要求1所述多肽的多核苷酸；

(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。

4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码具有SEQ IDNO：2所示氨基酸序列的多肽。

5.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的序列选自下组的一种：

(a)具有SEQ ID NO：1中1-3363位的序列；

(b)具有SEQ ID NO：1中1-3366位的序列。

6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。

7.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求6所述的载体。

8.一种多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含：

(a)在适合表达的条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出白念珠菌CaFlo11蛋白多肽。

9.一种能与权利要求1所述的白念珠菌CaFlo11蛋白特异性结合的抗体。

10.一种检测样品中是否存在CaFlo11蛋白的方法，其特征在于，包括：

将样品与权利要求9所述的抗体接触，

观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在CaFlo11蛋白。