CN1926151A - 治疗或预防细胞外基质积聚 - Google Patents

Abstract

一种用于治疗、预防、抑制或减少对象的身体组织或体液运输管路中细胞外基质积聚的治疗方法，包括向需要这种治疗的对象施用有效数量的组合物，所述组合物包括包括氨基酸序列LKKTET的肽剂、其保守性变体、或在组织中刺激产生LKKTET肽或其保守性变体的肽剂。

Description

治疗或预防细胞外基质积聚

                        发明背景

                    关联申请的交叉引用

本申请要求2004年3月5日提交的美国临时申请No.60/549,911的权益。

                        技术领域

本发明涉及治疗或预防细胞外基质在身体组织或体液运输导管中积聚的领域。

                        背景技术

斑块和细胞外基质在身体组织和血管，包括心肌和冠状脉管，中的积聚，可以是是严重的、威胁生命的问题。这种积聚可以归因于，但不限于，组织损伤、凝集异常、脉管阻塞、缺陷或异常及其它原因和事件。当在规定的时间框内给予时，有很多化合物、装置和方法可以用来减少或消除这种斑块或阻塞，然而，这经常只是暂时的。这些包括血管成形术和机械装置如支架，以及药物和饮食改变。不幸的是，在许多情况下，甚至在运用这些方法之后，斑块和细胞外基质分子的阻塞性积聚继续发生(再狭窄)。

本领域仍然需要治疗、预防、抑制或减少细胞外基质在身体组织或体液运输导管中积聚的方法。

                        发明内容

根据一个方面，用于在对象中治疗、预防、抑制或减少细胞外基质在身体组织或体液运输导管中积聚的治疗方法，包括向需要这种治疗的对象在所述组织中施用有效量的组合物，所述组合物包括包含氨基酸序列LKKTET的肽剂、其保守性变体、或刺激产生LKKTET肽的刺激剂或其保守性变体，以抑制细胞外基质在身体组织或体液运输管道中所述的积聚。

                        具体实施方式

不限于任何具体理论，肌动蛋白隔离肽(actin-sequestering peptide)，如胸腺素β4(Tβ4、Tβ₄或TB4)及其它试剂，包括肌动蛋白隔离肽或含有氨基酸序列LKKTET的肽片段或其保守性变体，促进细胞外基质在身体组织或体液运输管道中积聚的逆转或预防。

胸腺素β4早先被鉴定为一种在体外内皮细胞迁移和分化中被上调的蛋白。胸腺素β4最初从胸腺中分离，是一种43个氨基酸、分子量4.9kDa的广泛存在的多肽，可以在多种组织中鉴定到。已经认为这种蛋白具有几种作用，包括在内皮细胞分化和迁移、T细胞分化、肌动蛋白隔离、脉管形成和伤口愈合中的作用。

本发明也可用于治疗、预防、抑制或减少细胞外基质在身体组织如脑或神经组织中或上的积聚(例如，斑块积聚)。

已知Tβ4在几个啮齿动物模型中能诱导血管发生和降低炎症。Tβ4也可以隔离和调节肌动蛋白的聚合，并可以在创伤后刺激胶原合成和其它细胞外基质分子。然而，仍没有已知的征兆显示这些特性可用于治疗细胞外基质在身体组织或体液运输管道中的积聚，如冠状脉管和周围组织如心脏瓣膜和中隔的闭塞和再狭窄。诱导血管发生、降低炎症和解聚肌动蛋白的能力可用于治疗人的再狭窄和相似指征。

Tβ4和含有肌动蛋白结合基序及氨基酸序列LKKTET的其它肌动蛋白隔离肽调节趋化性内皮细胞并能加速伤口愈合和调控多种关键的炎性细胞因子如IL-1Bα、IL-18和趋化因子如MIP1-α₁、MIP-1β和MIP2。

当内皮细胞分化成毛细管或任何组织损伤之后，Tβ4基因被打开，细胞内和周围组织中的Tβ4mRNA和Tβ4水平被提高。Tβ4加速愈合，并能共价连接到纤维蛋白和其它细胞外分子如胶原。当在血管成形术之前、期间和/或之后共价偶联至支架和/或施用时，Tβ4和Tβ4类似物和含有氨基酸基序LKKTET的肌动蛋白隔离分子，能阻止或逆转再狭窄或狭窄。对于内皮细胞，Tβ4和其它含LKKTET基序的肽也作为趋化性和血管发生因子，因此能阻止或减少冠状脉管和周围组织中斑块的积聚。

在慢性创伤中和应用支架时的一个显著问题是损伤组织中产生过多的炎性细胞因子。Tβ4在正常和免疫抑制的动物中下调多种关键细胞因子和趋化因子并加速伤口愈合过程的能力可以在已预示有炎症、炎症中间体和白细胞浸润处抑制再狭窄。对于眼损伤，已经证明Tβ4导致多形核白细胞(PMN)浸润的显著减少和多种炎症细胞因子的显著减少。

通过施用治疗有效量的本文所述肽剂或刺激剂，本发明提供一种用于预防、治愈或减少斑块在冠状脉管和周围组织、心脏瓣膜和心脏中隔的积聚的方法，其中所述积聚是由于生理损伤、炎症、胆固醇、或在放置支架或血管成形术之后需要这种治疗的对象中可能发生的其它因素。

本发明包括共价或其它方式连接本文所述的肽剂或刺激剂至用于预防狭窄或再狭窄的支架或其它医疗装置或分子。

本发明包括在预防狭窄或再狭窄的冠状搭桥手术后，共价或其它方式连接本文所述的肽剂或刺激剂至生理接受的粘合剂如纤维蛋白胶或类似化合物。

本发明包括在预防或降低狭窄或再狭窄的治疗过程中，周期性地向一个部位施用治疗有效量的本文所述的肽剂或刺激剂。

本发明包括在预防狭窄或再狭窄的血管成形术之前、期间和/或之后施用本文所述的肽剂或刺激剂。

可用于增加血管中血流量的装置和方法包括，但不限于，动脉支架、静脉支架、心导管、颈动脉支架、主动脉支架、肺支架、血管成形术、心脏和/或其它旁路手术和/或神经外科。可以在应用一或多个这种装置和/或方法之前、期间和/或之后施用LKKTET肽。

根据一个实施方案，本发明是用于治疗、预防、抑制或减少对象中细胞外基质在身体组织或体液运输导管中积聚的治疗方法，包括向需要这种治疗的对象施用有效量的包含肽剂的组合物，所述肽剂可以是包含氨基酸序列LKKTET的多肽、或其具有细胞外基质积聚抑制活性的保守性变体，优选胸腺素β4、和/或Tβ4异构体、类似物或衍生物，包括KLKKTET、LKKTETQ、氧化的Tβ4、Tβ4亚砜、Tβ4的N-末端变体、Tβ4的C-末端变体、和Tβ4的激动剂或拮抗剂。

可以根据本发明应用的组合物包括肽剂如胸腺素β4(Tβ4)、和/或、或不同于Tβ4的肽剂如Tβ4异构体、类似物或衍生物，包括氧化的Tβ4、Tβ4亚砜、Tβ4的N-末端变体、Tβ4的C-末端变体和Tβ4的拮抗剂，包含氨基酸序列LKKTET或其保守性变体或基本由其组成的、具有细胞外基质积聚抑制活性的多肽或肽片段。序号为No.PCT/US99/17282的国际申请经引用并入本文，其公开了可用于本发明的Tβ4异构体以及氨基酸许类LKKTET及其保守性变体，它们可用于本发明。序号为No.PCT/GB99/00833(WO 99/49883)的国际申请经引用并入本文，其公开了可用于本发明的氧化的胸腺素β4。尽管在下文中主要就Tβ4和Tβ4异构体描述本发明，应该理解的是以下描述意图相等地适用于氨基酸序列LKKTET、包含氨基酸序列LKKTET或基本由其组成的肽和片段、其具有细胞外基质积聚抑制活性的保守性变体、和/或Tβ4异构体、类似物或衍生物，包括氧化的Tβ4、Tβ4亚砜、Tβ4的N-末端变体、Tβ4的C-末端变体、和Tβ4的拮抗剂。

在一个实施方案中，通过将含有效量的本文所述肽剂的组合物与组织相接触，本发明提供用于治疗、预防、抑制或减少细胞外基质在身体组织或体液运输导管中积聚的治疗方法。作为非限制的实例，所述组织可以选自对象的心脏组织如心脏瓣膜和/或心脏中隔、和血管如心肌和冠状脉管。所述接触可以是直接或系统性接触。直接施用的实例包括，例如，将组织、或待与组织接触的的支架或其它装置，与包含本文所述肽剂的基质、粘合剂、溶液、洗液(lotion)、药膏(salve)、凝胶、霜、糊、喷雾剂、悬液、分散液、水凝胶、油膏(ointment)、或油相接触。系统性施用包括，例如，吸入、和/或静脉内、腹膜内和/或肌肉内注射含本文所述肽剂的组合物，所述肽剂在药物接受的载体如注射用水中。

如本文所述，用于本发明的肽剂可以以任何有效量施用。例如，本文所述肽剂可以施用的剂量在约0.0001-1,000,000μg范围，优选量在约0.01-5,000μg范围，更优选约0.1-50μg，最优选约1-30μg范围。

根据一个特别优选的实施方案，本文所述肽剂的施用剂量在约0.1微克至约10mg/kg所述对象体重(BW)。根据一个实施方案，本文所述肽剂经静脉施用的剂量为约1-10mg/kg所述对象体重。

根据本发明的组合物可以作为单次给药、每天、每隔一天、每隔一周、每隔一月等来施用，其中每施用天中单次应用或多次应用，如每施用天应用2、3、4或更多次。

已经鉴定了很多Tβ4异构体，它们与已知的Tβ4氨基酸序列具有约70％、或约75％、或约80％或更多的同源性。这种异构体包括，例如，Tβ4^ala、Tβ9、Tβ10、Tβ11、Tβ12、Tβ13、Tβ14和Tβ15。与Tβ4相似，Tβ10和Tβ15异构体已经被证明可隔离肌动蛋白。Tβ4、Tβ10和Tβ15以及这些其它的异构体具有共同的氨基酸序列，LKKTET，其显示参与介导肌动蛋白的隔离或结合。Tβ4能调控肌动蛋白的聚合(例如，β-胸腺素表明通过隔离游离的G-肌动蛋白来解聚F-肌动蛋白)。Tβ4调控肌动蛋白聚合的能力可能是由于其经LKKTET序列结合或隔离肌动蛋白的能力。因此，如本文所述，正如Tβ4，抗炎和/或结合或隔离肌动蛋白、或调控肌动蛋白聚合的其它蛋白，包括具有氨基酸序列LKKTET的Tβ4异构体，单独或与Tβ4组合，可以是有效的。

本文所述肽剂，比如Tβ4，能通过上调代谢和信号传递酶如磷脂酰肌醇3-激酶(PI3-K)/Akt(蛋白激酶β)途径而影响组织。上调PI3-K/Akt和下游的磷酸化Bad和富含脯氨酸的Akt存活激酶保护某些细胞。除了本文所述肽剂，如Tβ4和Tβ4异构体或氧化型Tβ4通过它们下调炎性细胞因子如IL-18和趋化因子如IL-8和酶如caspace 2、3、8和9保护某些细胞。本文所述肽剂如Tβ4降低炎性趋化因子、细胞因子和capase活性。

因此，特别可以想到已知的Tβ4异构体，如Tβ4^ala、Tβ9、Tβ10、Tβ11、Tβ12、Tβ13、Tβ14和Tβ15，以及未鉴定的Tβ4异构体，可用于本发明方法中。同样地，Tβ4异构体可用于本发明方法中，包括在人对象中实施的方法。因此本发明进一步提供药物组合物，其中包含Tβ4以及Tβ4异构体Tβ4^ala、Tβ9、Tβ10、Tβ11、Tβ12、Tβ13、Tβ14和Tβ15、和制药接受的载体。

此外，经适当的隔离、结合、动员或聚合测试中证明的，或因存在介导肌动蛋白结合的氨基酸序列如LKKTET而鉴定的，具有抗炎活性和/或肌动蛋白隔离或结合能力、或能动员肌动蛋白或调控肌动蛋白聚合的其它试剂或蛋白，例如，可以相似地用于本发明方法中。这些蛋白可以包括，例如，凝溶胶蛋白、维生素D结合蛋白(DBP)、抑制蛋白(profilin)、切丝蛋白(cofilin)、蚕食蛋白(depactin)、DNA酶I(Dnasel)、绒毛蛋白(vilin)、片段化蛋白(fragmin)、肌割蛋白(severin)、加帽蛋白、β-辅肌动蛋白和acumentin。因为这些方法包括那些在对象中实施的方法，本发明进一步提供包含本文列出的凝溶胶蛋白、维生素D结合蛋白(DBP)、抑制蛋白、切丝蛋白、蚕食蛋白、DNA酶I、绒毛蛋白、片段化蛋白、肌割蛋白、加帽蛋白、β-辅肌动蛋白和acumcntin的药物组合物。因此，本发明包括包含氨基酸序列LKKTET及其保守性变体的多肽的用途。

正如在本文中使用的，术语“保守性变体”或其语法上的变形表示一个氨基酸残基替换为另一个生物学相似的残基。保守性变化的实例包括疏水残如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸之间的相互替换，极性残基的相互替换、如精氨酸替换为赖氨酸、或谷氨酸替换为天冬氨酸、或谷氨酰胺替换为天冬胺酰等等。

Tβ4已经被定位于多种组织和细胞类型中，因此刺激产生LKKTET肽如Tβ4或本文所述另一种肽剂的试剂，可以被加入或包含一种组合物，以从组织和/或细胞中产生肽剂。这种刺激剂可以包括生长因子家族的成员，如胰岛素样生长因子(IGF-1)、血小板来源生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子β(TGF-β)、碱性成纤维生长因子(bFGF)、胸腺素α″1(Tα″1)和血管内皮生长因子(VEGF)。更优选地，刺激剂是转化生长因子β(TGF-β)或其它的TGF-β超家族成员。

根据一个实施方案，用刺激在对象中产生本文所定义肽剂的刺激剂处理所述对象。

此外，有助于减少身体组织或体液运输导管中细胞外基质积聚的试剂可以与本文所述肽剂一起施用或与之一起加入组合物中。例如，但不限于，单独或组合的本文所述肽剂可以与任何一种或多种以下试剂以有效量一起施用或加入：斑块减缩剂如螯合剂(例如，EDTA)和胆固醇缩减剂、抗氧化剂、抗生素、VEGF、KGF、FGF、PDGF、TGFβ、IGF-1、IGF-2、IL-1、前胸腺素α″和/或胸腺素α″1。这些其它试剂优选的施用剂量范围为0.0001-1,000,000μg。

本发明也包括在制药接受载体中包含治疗有效量的本文所述肽剂的药物组合物。这些载体包括本文中所列的那些载体。

提供治疗的实际剂量或试剂、制剂或组合物可以依赖于很多因素，包括对象的大小和健康。然而，本领域的普通技术人员能够应用描述前述PCT/US99/17282中公开的确定临床剂量的方法和技术的教导，和其中引用的参考文献来确定适当的使用剂量。

合适的制剂可以包括本文所述肽剂，其浓度在约0.001-50％重量的范围内，更优选在约0.01-0.1％重量的范围内，最优选约0.05％重量。

本文所述治疗方法包括本文所述肽剂的不同施用或给药路径，包括任何传统的施用于对象的技术(例如，但不限于，直接施用、局部注射、吸入、系统性施用等)。使用或含有本文所述肽剂的方法和组合物可以通过与制药接受的无毒性赋形剂或载体混合而配制成药物组合物。

本发明包括与本文所述肽剂相互作用、增强或抑制本文所述肽剂的抗体的用途。提供基本由具有不同表位特异性的单克隆抗体合并而组成的抗体，以及明显不同的单克隆抗体制剂。根据前述PCT/US99/17282公开的本领域技术人员众所周知的方法，从含有所述蛋白质的片段的抗原制备单克隆抗体。在本发明中使用的术语抗体意思包括单克隆和多克隆抗体。

在另一个实施方案中，本发明提供通过施用有效量的、调控基因表达的刺激剂来处理对象的方法。术语“调控”表示，当本文所述肽剂被过表达时抑制或压制表达，和当本文所述肽剂被低表达时诱导表达。术语“有效量”表示刺激剂的量，所述量可有效调控基因表达，导致缩减身体组织或体液运输导管中细胞外基质的积聚。调控本文所述肽剂基因表达的刺激剂可以是，例如，多核苷酸。所述多核苷酸可以是反义多核苷酸、三链核酸剂或核酶。例如，可以利用指向本文所述肽剂的结构基因区或启动子区的反义多核苷酸。调控本文所述肽剂基因表达的刺激剂也可以是小干扰RNA(siRNAs)。

在另一个实施方案中，本发明提供调控本文所述肽剂活性的化合物的使用方法。影响本文所述肽剂活性的化合物(例如，拮抗剂和激动剂)包括肽、肽模拟物、多肽、化合物、无机物比如锌和生物剂。

筛选本文定义的刺激剂的方法，包括使身体组织或体液运输导管中表现细胞外基质积聚的组织与候选化合物接触；和测量所述组织中LKKTET肽的活性，其中与在缺乏所述候选化合物的相应组织中所述肽的活性水平比较，在所述组织中所述肽的活性增加，这指示所述化合物能诱导所述刺激剂。

筛选本文定义的肽剂的方法，包括使身体组织或体液运输导管中表现细胞外基质积聚的组织与候选化合物接触；和测量所述组织中所述细胞外基质积聚的缩减，其中与在缺乏所述候选化合物的相应组织中细胞外基质积聚比较，所述组织中所述细胞外基质的积聚缩减，这指示所述化合物能治疗、预防、抑制和缩减身体组织或体液运输导管中细胞外基质积聚。

实施例1

血管成形术后，立即经心导管施用每千克体重0.1-1μg的胸腺素B4(TB4)，和随后最多7天、每天2-4次、患者经静脉接受每千克体重(BW)600μg到6mg的TB4。治疗的量和持续时间依赖于急性心肌梗塞之后经心电图和核成像所测量的和患者最初住院期间心室的损伤程度。

实施例2：

血管成形术和/或支架植入后立即经心导管施用0.1μg-1μg每kg/BW的TB4。然后在MI之后至多7天的时间中、每天2-4次、患者经静脉施用600μg-6mg/kg BW。心肌的保护和再狭窄的降低经心电图测定并经核成像或其它诊断方法监控。

实施例3：

经静脉施用TB4，剂量为1mg-10mg/kg BW/天，最多30天，用来减少由于斑块形成引起的冠状动脉阻塞。

Claims (18)

1.用于治疗、预防、抑制或缩减治疗对象中身体组织或体液运输导管中细胞外基质积聚的治疗方法，包括向需要这种治疗的对象施用有效量的组合物，所述组合物包含包含氨基酸序列LKKTET的肽剂、其保守性变体，或在所述组织中刺激LKKTET肽或其保守性变体产生的刺激剂，从而抑制身体组织或体液运输导管中所述细胞外基质的积聚。

2.权利要求1的方法，其中所述肽剂包含胸腺素β4(Tβ4)、氨基酸序列KLKKTET、氨基酸序列LKKTETQ、Tβ4的N-末端变体、Tβ4的C-末端变体、Tβ4的异构体、氧化的Tβ4或Tβ4亚砜。

3.权利要求1的方法，其中向所述对象施用所述肽剂，其剂量在约1-10mg/kg所述对象体重的范围内。

4.权利要求1的方法，其中通过直接施用于所述组织、或经静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、吸入、透皮或经口施用将所述试剂施用于所述对象。

5.权利要求1的方法，其中所述组合物被系统性施用。

6.权利要求1的方法，其中所述组合物被直接施用。

7.权利要求1的方法，其中所述组合物由基质、粘合剂、溶液、凝胶、creme、糊、洗剂、喷剂、悬液、分散液、药膏、水凝胶或油膏制剂组成。

8.权利要求1的方法，其中所述肽剂是重组或合成肽。

9.权利要求1的方法，其中所述试剂是抗体。

10.权利要求1的方法，其中所述肽剂或所述刺激剂被施用并在所述对象中联合应用动脉支架、静脉支架、心脏导管、腐蚀的支架(corroded stent)、主动脉支架、肺支架、血管成形术、搭桥手术或神经手术中的至少一种。

11.权利要求1的方法，其中所述基质的积聚包含在所述对象的冠脉、心瓣或心隔中至少一种中存在的斑块。

12.权利要求1的方法，其中所述肽剂或所述刺激剂连接至生理接受的粘合剂。

13.权利要求1的方法，其中所述肽剂或刺激剂施用于所述对象以治疗、预防、抑制或缩减所述对象的狭窄或再狭窄。

14.权利要求13的方法，其中所述肽剂或所述刺激剂在血管成形术之前、期间或之后的至少一种在所述对象中施用。

15.筛选权利要求1定义的刺激剂的方法，包括使身体组织或体液运输导管中呈现细胞外基质积聚的组织与候选化合物接触；和测量所述组织中LKKTET肽的活性，其中与所述肽在缺少所述候选化合物的相应组织中的活性水平比较，所述肽在所述组织中的活性增加，这指示所述化合物能诱导所述刺激剂。

16.权利要求15的方法，其中所述LKKTET肽是胸腺素β4。

17.筛选权利要求1所述的肽剂的方法，包括使在所述组织中或所述组织的体液运输导管中呈现细胞外基质积聚的组织与候选化合物接触，和测量所述组织中所述细胞外基质积聚的缩减，其中与缺少所述候选化合物的相应组织中细胞外基质的积聚比较，所述组织中所述细胞外基质积聚的缩减，指示所述化合物能够治疗、预防、抑制或缩减身体组织或体液运输导管中细胞外基质的积聚。

18.权利要求1的方法，其中所述肽剂或所述刺激剂与至少一种斑块缩减剂或胆固醇缩减剂联合施用。