CN1916185A - 猪只检测引子、探针及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明是关于猪只检测的引子、探针及其应用，由基因库搜寻合适的标的基因序列，再设计其对应的引子，利用此引子增幅标的基因后，利用设计的探针观察标的基因型。本发明可应用于种猪基因筛选，结合芯片技术可达到快速与大量样品筛选。

Description

猪只检测引子、探针及其应用

技术领域

本发明是关于猪只基因型检测的引子及探针。

背景技术

猪肉质量高低受到遗传上的影响已有文献可以证实，目前已知的包括心脏脂肪酸结合蛋白(heart fatty acid-binding protein，H-FABP)基因是影响肉质高低的基因之一，此基因位于猪的第六染色体上，基因的表现与肌肉内脂肪(intramuscular fat)的含量有关，呈现与肉的柔嫩度、多汁性及良好风味为正相关。过去的研究还指出，利用此基因的多型态性来进行高质量猪肉的筛选时，使得高价位的背最长肌中脂肪含量不随着选拔精肉型猪而下降，因此该基因为筛选优良猪肉质量的另一重要标记基因，若能在猪群中筛选此基因，进行选种改良，将对提高猪肉质量有相当大的帮助。

目前的研究指出，猪心脏脂肪酸结合蛋白基因的多型态性位于基因的5’端上游区片段及Intron 2片段各有1及2处。利用聚合酶链锁反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增心脏脂肪酸结合蛋白基因序列片段后，结合限制酶片段长度多型态性分析(restriction fragment lengthpolymorphism，RFLP)的PCR-RFLP法，可以判定不同的基因型。其中，经聚合酶链锁反应扩增出5’端上游区基因片段以限制酶HinfI切割的结果可区别为HH，Hh，hh三种基因型，而Intron 2基因片段分别以限制酶Hae III及Msp I切割的结果可分别区别为DD，Dd，dd及AA，Aa，aa等不同的基因型(参考下表1)，而基因型同为HH，dd，aa者，猪肉质量最佳。

表1、H-FABP基因型与变异点序列的关系：

核酸位置	核酸序列→基因型
				Intron 2：1489	CC→AA	CT→Aa	TT→aa
Intron 2：1811	CC→DD	CG→Dd	GG→dd
				5′UTR：103	TT→HH	TC→Hh	CC→hh

概括而言，虽然心脏脂肪酸结合蛋白基因的筛检可利用PCR-FRLP法进行基因型的辨识，但繁复的聚合酶链锁反应、接续的限制酶切割反应及后端的电泳分析等判读工作，加上复杂的基因型态，实际的执行操作相当费时费力，不但容易产生人为的分析误判，而且可能在操作过程中造成检体间的交叉污染，甚至因而降低经济效益。

除前述的心脏脂肪酸结合蛋白基因外，紧迫敏感基因也是与猪肉肉质相关的基因。紧迫敏感基因是隐性遗传基因，携带隐性紧迫敏感基因的猪只往往因受到交配的兴奋、运输屠宰的紧迫、并栏驱赶、打斗及生理紧迫等因素，引发呼吸急促、心律不整、肌肉痉挛等受迫反应，甚至突然休克死亡。若于屠宰前引发紧迫而造成肌肉痉挛，屠体肌肉将呈苍白且软性的水样肉，不受消费者欢迎。因此，选育不具紧迫敏感基因的猪只将可降低饲养期间及运输的紧迫死亡损失，并提高猪肉质量。

猪只紧迫敏感基因的传统检测法是以卤乙烷诱发四肢僵直的反应程度进行测试，因此紧迫敏感基因早期又名卤乙烷基因(halothane gene，Hal)，但基因座的位置早期并未确定。真正以DNA检测技术分离隐性紧迫敏感基因变异的是Fujii等人的研究(1991年)，他们发现钙离子释放管道(ryanodine receptor，rynl)基因在核酸序列第1843个核苷酸位置由C置换为T，会导致猪只紧迫现象。随后Rempel等人(1993年)分析猪只rynl基因的变异并与卤乙烷诱发四肢僵直的反应相比较，发现虽有少数差异，但基本上利用分子检测分析rynl基因在第1843个核苷酸的变异可以预测紧迫敏感基因的遗传型态。依此原理发展出来的检测法则称为Hal-1843 DNA检验技术，目前利用PCR扩增rynl基因序列片段后，结合限制酶Hha I进行RFLP，依其切割片段大小判定不同的基因型。基因型为TT型的猪只为紧迫敏感猪，CT型为紧迫敏感基因杂合型猪只，而CC型则视为抗紧迫猪。

台湾农委会自公元1996年起执行种猪抗紧迫敏感基因DNA筛选计划，当时紧迫敏感猪(TT型)高达3.37％，紧迫敏感基因(T)在所筛选猪群的频率为18.35％，至公元2000年10月底紧迫敏感猪占1.59％，紧迫敏感基因(T)频率为12.59％，目前紧迫敏感猪已降至1.2％以下，达到国际抗紧迫猪群选育的完成阶段，而台湾农委会也因此停止筛选计划，不再补助养猪户检测费用。虽然如此，紧迫敏感基因检测仍是现在种猪筛选的要项之一，每只种猪的检测费用约新台币600元以上，对养猪户而言是一项负担。

猪只动情素接受体(estrogen receptor，ESR)的B对偶基因为猪只多产性状有关的基因之一。由Rothschild等人(1996年)研究发现AB和BB的种猪窝仔数比AA基因型多1.5至2.3头。近年来台湾种猪的产仔数有逐年下降的趋势，平均约在13头以下，对照1963年的15头，少了2头左右。虽然相关单位已着手进行基因筛选，然而因成本昂贵，且只以母猪为筛选对象，造成目前台湾种公猪的ESR B对偶基因频率偏低，杜洛克公猪甚至只有5.6％左右(畜产种源信息网)，因此新生的母猪B对偶基因频率仍无法提高。

目前的检测方式为利用PCR-RFLP检测猪动情素接受体基因，基因的多型态性位于T1665G(Rothschild等人，1996年)。利用PCR扩增动情素接受体基因序列片段(Short等人，1997年)，经限制酶PvuII切割的结果可区分为AA，AB，BB三种基因型(为了与H-FABP基因区隔，多产基因型前面加上「E」)，片段长度分别如下：

表2、ESR基因型利用限制酵素切割的结果与片段长度

基因型	限制酵素	基因型的片段长度(bp，base pair，碱基对)
					EA/EB	PvuII	EAA	EAB	EBB
120	1206555	6555

目前动情素接受体基因检测价格约为每头猪只六百元，故饲主不主动进行ESR基因检测。此外，检测需时：PCR增幅2小时、电泳确定PCR产物1小时、限制酵素切割6小时及电泳确定切割长度1小时，共约10小时，耗时太长。

基因芯片检测的原理在于利用核酸分子间能共轭互补的结合的特性。我们知道基因上的碱基序列具有「独特」与「专一」两大特性，在特定的条件下，唯有互补的核酸序列存在时，核酸分子间才能完整地杂交而结合成双股螺旋分子。因为这样的结合具有专一性，所以只要依基因上独特的序列，制成互补序列核酸探针，便可应用此探针检测样品中的基因序列，进行该基因的多型态分析。基因芯片于生物技术的发展上为关键性的研究，芯片的体积小所需消耗的检体以及试剂都较少，且一片芯片可容纳多种核酸探针，一次检验可侦测多种标记基因，故应用基因芯片于种猪基因型的筛检将是未来的发展趋势。因此，若能找到心脏脂肪酸结合蛋白基因、紧迫敏感基因及动情素接受体基因反应条件相同的检测引子，以及于一芯片载体上固定耦合反应条件相同的探针，将可同时快速检测此五种基因型，降低成本，大幅提升种猪繁殖性能的效率。

发明内容

有鉴于公知技术的缺失，本发明运用分子生物原理与技术，先萃取猪只基因体核酸，然后于单一试管内同步进行数个核酸片段的放大与标示反应，再利用基因芯片上排列的多种标记基因的核酸探针，经杂交反应分析心脏脂肪酸结合蛋白基因、紧迫敏感基因及动情素接受体基因的多型态性。

本发明的目的在于提供一种用以增幅受试样品中猪只基因的组合物。

本发明的次一目的在于提供一种用于鉴定猪只基因型的寡核苷酸序列。

本发明的另一目的在于提供一种用于鉴定猪只基因型的生物芯片。

本发明的又一目的在于提供一种鉴定猪只基因型的方法。

为实现上述目的，本发明提供的用以增幅受试样品中猪只基因的组合物，该组合物包含至少一组成对的寡核苷酸引子，前述引子对选自包含以下的寡核苷酸序列的群组：

引子对1：SEQ ID NO.1

         SEQ ID NO.2

引子对2：SEQ ID NO.3

         SEQ ID NO.4

引子对3：SEQ ID NO.5

         SEQ ID NO.6

引子对4：SEQ ID NO.7

         SEQ ID NO.8

引子对5：SEQ ID NO.9

         SEQ ID NO.10

所述的组合物，其中前述引子对1(SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2)、引子对2(SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4)或引子对3(SEQ ID NO.5、SEQID NO.6)是用于增幅猪只心脏脂肪酸结合蛋白基因片段。

所述的组合物，其中前述引子对4(SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8)是用于增幅猪只动情素接受体基因片段。

所述的组合物，其中前述引子对5(SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10)是用于增幅猪只猪只紧迫敏感基因片段。

所述的组合物，其中前述衍生物是指于前述序列或其互补股的3’端或5’端修饰其它核苷酸序列，使其仍和原序列具有70％或以上相似性的寡核苷酸序列。

本发明提供的用于鉴定猪只基因型的寡核苷酸序列，其选自包含以下寡核苷酸序列的群组：SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13及SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQID NO.18、SEQ ID NO.19及SEQ ID NO.20所示的序列、其互补股或衍生物。

所述的寡核苷酸序列，其中前述SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQID NO.13及SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16所示的序列、其互补股或衍生物是用于鉴定猪只心脏脂肪酸结合基因型。

所述的寡核苷酸序列，其中前述SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18所示的序列、其互补股或衍生物是用于鉴定猪只动情素接受体基因型。

所述的寡核苷酸序列，其中前述SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20所示的序列、其互补股或衍生物是用于鉴定猪只紧迫敏感基因型。

所述的寡核苷酸序列，其中前述衍生物是指于前述序列或其互补股的3’端或5’端修饰其它核苷酸序列，使其仍和原序列具有70％或以上相似性的寡核苷酸序列。

本发明提供的用于鉴定猪只基因型的生物芯片，于该芯片上固定有复数个探针，其中前述探针可选自下列群组包括：SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19及SEQ ID NO.20所示的序列、其互补股或衍生物。

所述的生物芯片，其中前述衍生物是指于前述序列或其互补股的3’端或5’端修饰其它核苷酸序列，使其仍和原序列具有70％或以上相似性的寡核苷酸序列。

本发明提供的鉴定猪只基因型的方法，包括下列步骤：

(a)由猪只样品中萃取DNA；

(b)利用至少一寡核苷酸杂交步骤(a)的DNA，前述寡核苷酸选自权利要求8的寡核苷酸群组；及

(c)侦测杂交结果判断猪只的基因型。

所述的方法，其中步骤(a)与步骤(b)间可进一步包含一增幅步骤增幅猪只DNA，该增幅步骤利用至少一引子对增幅猪只DNA。

所述的方法，其中前述引子对选自权利要求1所述的寡核苷酸序列的群组，该群组包含以下引子对：引子对1(SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2)、引子对2(SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4)、引子对3(SEQ ID NO.5、SEQID NO.6)、引子对4(SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8)及引子对5(SEQ IDNO.9、SEQ ID NO.10)。

本发明提供的鉴定猪只基因型的方法，包含下列步骤：

(a)由猪只样品中萃取DNA；

(b)提供一权利要求11所述的生物芯片与步骤(a)的产物接触；及

(c)侦测芯片表面探针的杂交结果判断猪只的基因型。

所述的方法，其中步骤(a)与步骤(b)间可进一步包含一增幅步骤增幅猪只DNA，该增幅步骤系利用至少一引子对增幅猪只DNA。

所述的方法，其中前述引子对选自权利要求1所述的寡核苷酸序列的群组，该群组包含以下引子对：引子对1(SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2)、引子对2(SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4)、引子对3(SEQ ID NO.5、SEQID NO.6)、引子对4(SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8)及引子对5(SEQ IDNO.9、SEQ ID NO.10)。

附图说明

图1为本发明利用芯片分析猪只基因型的PCR增幅产物电泳分析图。

图2A为本发明的芯片与探针打点态样。

图2B是将图2A的20点分别标上坐标。

图2C是将图2A的20点分别标上相对应的基因型。

图3A为猪只基因型为Hh/Aa/Dd/EAA/CT型的芯片呈色影像图。

图3A-1为其重绘的示意图。

图3B为猪只基因型为HH/aa/dd/EAA/CC型的芯片呈色影像图。

图3B-1为其重绘的示意图。

图3C为猪只基因型为hh/AA/DD/EAA/TT型的芯片呈色影像图。

图3C-1为其重绘的示意图。

图4为利用公知PCR-RFLP法分析猪只心脏脂肪酸结合蛋白基因型的PCR增幅产物电泳分析图。

图5A为公知PCR-RFLP法中以限制酵素HinfI切割PCR增幅产物的电泳分析图。

图5B为公知PCR-RFLP法中以限制酵素MspI切割PCR增幅产物的电泳分析图。

图5C为公知PCR-RFLP法中以限制酵素HaeIII切割PCR增幅产物的电泳分析图。

具体实施方式

猪只基因核酸序列数据分析与标的基因的标准选殖株(standard clone)的建构与定序是利用NCBI基因库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi/db＝Nucleotide)为搜寻数据库，并针对基因核酸序列数据进行搜集并寻找合适的标的基因序列，之后再通过Primer3(http：//frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi)网站的分析软件，进行设计合适的核酸探针及核酸引子。经分析筛选及测试，本发明设计可用以增幅受试样品中猪只基因的成对寡核苷酸引子如下：引子对1(SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2)、引子对2(SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4)、引子对3(SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6)、引子对4(SEQID NO.7、SEQ ID NO.8)及引子对5(SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10)，其中前述引子对1、引子对2及引子对3是用于增幅猪只心脏脂肪酸结合蛋白基因片段，引子对4是用于增幅猪只动情素接受体基因片段，引子对5是用于增幅猪只紧迫敏感基因片段，前述五对引子对的重要特征可于单次反应条件中单独或同时任选两对以上引子来增幅其目标基因序列。

本发明所称的”增幅”是指利用本技术领域所知悉的利用引子放大基因片段的方法，其一实施态样是利用聚合酶链锁反应，其操作步骤及参考条件如下，首先PCR反应的试剂最终浓度为：2U Taq聚合酵素、10倍的Taq聚合酵素缓冲液、0.2mM寡核苷酸(deoxynucleoside triphosphate，dNTP)混合物、0.5μM引子对及至少10ng的DNA模板。PCR反应条件为变性温度及时间为94℃5分钟，增幅温度及时间为94℃30秒后50至60℃30秒，之后72℃60秒，重复30个循环；延长(elongation)的反应温度及时间为72℃10分钟；最后置于4℃环境中停止反应。

将样品DNA增幅后，利用胶体电泳呈相鉴定结果的方法属于公知技术，操作步骤的一态样配置3％Agarose和Tris-borate EDTA胶片，在110V电压下泳动40分钟，以染剂溴化乙锭(ethidium bromide)过染10分钟，再以UV灯照射显相拍照。

本发明还进一步设计用于鉴定猪只基因型的寡核苷酸序列群组，其包含SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13及SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ IDNO.19及SEQ ID NO.20所示的序列、其互补股或衍生物。其中SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13及SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15及SEQ ID NO.16所示的序列可用以辨识利用引子对1、引子对2及引子对3增幅所得的寡核苷酸序列；SEQ ID NO.17及SEQ ID NO.18所示的序列可用以辨识利用引子对4增幅所得的寡核苷酸序列，SEQ ID NO.19及SEQ ID NO.20所示的序列可用以辨识利用引子对5增幅所得的寡核苷酸序列。前述用于鉴定猪只基因型的寡核苷酸序列可固定于基材上形成具有探针的生物芯片，基材的材质可为本技术领域所熟知可用以固定寡核苷酸的基材，例如尼龙薄膜、硅芯片、高分子塑料材料或其它具有相同功效的材质。

具有探针的生物芯片其检测方法同本技术领域中观察基因芯片杂交结果的技术。其先将具有探针的生物芯片与样品接触进行杂交反应，之后通过例如呈色反应或原子力电子显微镜等观察芯片表面的杂交结果判读样品的基因型态。

以下实施例是用于进一步了解本发明的优点，并非用于限制本发明的申请专利范围。

实施例1.利用本发明的引子与具有探针的生物芯片检测猪只基因型

DNA样品制备

以核酸纯化套组(Roche)萃取猪血的基因体核酸(genomic DNA，gDNA)，并稀释保存于1倍的TE缓冲溶液(10mM of Tris-HCl及10mMof EDTA，pH8.0)。

PCR样品增幅

样品利用PCR增幅的条件为：10倍稀释的gDNA 6μl、2U Taq聚合酵素(GeneMark)、4μl Taq聚合酵素缓冲液、25mM寡核苷酸混合物0.32μl、10μM的引子对1、引子对2、引子对3、引子对4及引子对5的混合物共20μl及水8.68μl，补至总体积40μl。PCR增幅的条件为，94℃加热5分钟，94℃30秒、50至60℃30秒及72℃60秒重复循环30次，最终以72℃加热10分钟(Biorad Genecycler)。以3％的琼脂洋菜胶体电泳(agarose gelelectrophoresis)，其结果如图1所示，图中M为100bp marker的缩写，意指100bp DNA分子量标记。NC为negative control的缩写，意指无DNA的空白对照组，产物长度分别为122bp、174bp、172bp、140bp及204bp，其中174bp、172bp及122bp、140bp二个片段因距离靠近，故无法从胶体中区分。而约500bp附近的片段为引子SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.6的产物，而50bp附近为引子自身合成的产物，并不影响后续反应。经确定PCR产物后即可用于杂合反应。

杂合反应

以UV光照3分钟将核酸探针SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQID NO.13及SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19及SEQ ID NO.20固定于尼龙膜片(Hybond-N+membrane，Amersham)上(长×宽，为1×1公分)，左上截角作为标记，共打20点，探针固定于芯片上的打点态样系可参照图2A所示，而图2B是将图2A的20点分别标上坐标。参考图2C，其中第一排为「H/h」基因型、第二排为「A/a」基因型、第三排为「D/d」基因型、第四排为「EA/EB」基因型，而第五排为「CC/TT」基因型。如杂交后坐标1a、1b讯号有反应表示「H」基因型；坐标1c、1d讯号表示「h」基因型；坐标2a、2b讯号表示「A」基因型，以此类推。将上步骤PCR产物取5μl与400μl的杂合缓冲液(hybridization buffer：5％Dextran sulfate及10mMpH9.0 Tris buffer)混合，于95℃水浴5分钟，迅速放置冰上10分钟。接着与有固定探针的尼龙膜于40-60℃杂合1小时，接着洗去未结合的PCR产物，以链霉菌抗生物素蛋白-碱性磷酸酶(streptavidin-alkaline-phosphatase)为抗体，因链霉菌抗生物素蛋白-碱性磷酸酶会与PCR产物5′端标定的生物素(biotin)结合，由NBT-BCIP(nitroblue tetrazolium/5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate)呈色反应，可由五对探针的颜色显示的型态反应样品的基因型。

实际样品依照前述操作的显色结果系如图3A、图3B及图3C所示，其中图3A(图3A-1为依图3A结果重绘的示意图)其第一排的「H/h」基因型1a、1b与1c、1d的讯号颜色不相上下，故可判定为Hh；第二排的「A/a」基因型2a、2b与2c、2d的讯号颜色亦相近，故可判定为Aa；第三排的「D/d」基因型3a、3b与3c、3d亦有相同状况，故可判定为Dd；此乃因其三对基因型皆为杂合子，故两等位基因讯号量相等所致；而第四排的「EA/EB」基因型只出现4a、4b的灰色讯号，故为EAA；第五排的「CC/TT」基因型5a、5b、5c、5d的讯号量相等，故为CT。综上所述，图3A样品的五对基因型式为Hh/Aa/Dd/EAA/CT。以此类推，图3B样品的基因型为HH/aa/dd/EAA/CC(图3B-1为依图3B结果重绘的示意图)。而图3C样品的基因型为hh/AA/DD/EAA/TT(图3C-1为依图3C结果重绘的示意图)。由此证实，利用杂合反应可于一张尼龙薄膜上轻易以肉眼判读五对等位基因型式。

比较例1：以公知PCR-RFLP方法检测猪只心脏脂肪酸结合蛋白基因型

PCR样品增幅

将样品以公知PCR-RFLP进行测试，其分析方法为，由血液样品制备的genomic DNA(gDNA)稀释10倍后进行PCR反应，其PCR反应物浓度与杂合反应的PCR增幅步骤相同，而PCR条件为，94℃加热1分30秒，94℃15秒、50至60℃20秒及72℃30秒重复循环30次(BioradGenecycler)。使用的引子如下表3所示：

表3：公知PCR-RFLP引子序列

基因型	引子	序列
			A/a，D/d	pA1	ATT gCT TCg gTg TgT TTg Ag
pA2	TCA ggA ATg ggA gTT ATT gg
		H/h		N1	ggA CCC AAg ATg CCT ACg CCg
N2	CTg CAT CTT TgA CCA AgA gg

以3％的琼脂洋菜胶体电泳确定PCR产物，其结果参考图4所示，其中pA1/pA2及N1/N2为所使用的引子对名称，引子对pA1/pA2可增幅基因型A/a及D/d，产物长度为816bp；引子N1/N2可增幅基因型H/h，产物长度为705bp。M为100bp marker的缩写，意指100bp DNA分子量标记。NC为negative control的缩写，意指无DNA的空白对照组。当结果如图4所示时，即可用于限制酵素切割反应。

限制酵素切割与电泳分析

将PCR增幅产物取10μl分别以1U限制酵素MspI(C↓CGG)、HaeIII(GG↓CC)及HinfI(G↓ANTC)(Promega)进行切割反应，加入2μg BSA(bovine serum albumin，10mg/ml)，加水至总体积15μl，放置于37℃3小时，以3％的琼脂洋菜胶体电泳鉴定切割片段长度，并依此判定其基因型(如图5A、图5B及图5C)，判断依据参照下表4：

表4、基因型与限制酵素切割结果的对应关系

基因型	限制酵素	基因型的片段长度(bp)
					A/a	MspI	AA	Aa	aa

		72789	81672989	816
					D/d	Hae III	DD	Dd	dd
699117	699405294117	405294117
			H/h	HinfI			HH	Hh	hh
33919711059	33925619711059	339256110

参考图5A，其中M为100bp marker的缩写，意指100bp DNA分子量标记。NC为negative control的缩写，意指无DNA的空白对照组。实验结果样品编号767及908以限制酵素HinfI切割后的后出现339、197及110bp(较弱)，但无256bp，判定为基因型HH；而样品编号36及47出现339、256、197及110bp，判定基因型Hh。参考图5B，样品编号51、872、873及882以MspI切割后有727及89bp(较弱)，因此为基因型AA；样品编号914、15、891、895及916出现816、729及89bp(较弱)，基因型为Aa。参考图5C，样品编号887、914、891及899以HaeIII切割后有699、405、294及117bp，其基因型为Dd；样品编号895无699bp，所以其基因型为dd。

比较例2：公知PCR-RFLP法及芯片杂合反应法的正确率比较

此部分是针对猪只心脏脂肪酸结合蛋白基因型，比较公知PCR-RFLP法与杂合反应法的检测敏感准确度，以基因定序结果作为比较的基准。在110个样品中，以公知PCR-RFLP法检测的正确样品数为97个，正确率为88.2％；而杂合反应有107个判断正确，其正确率为97.3％，证实本发明的具专一性探针的生物芯片，利用杂交反应检测猪只基因型的方法，确实能提高传统方式的检测准确性达9.1个百分点。

综合上述，就检测时间而言，若以检测三对猪心脏脂肪酸结合蛋白基因来讲，公知PCR-RFLP方法检测一对基因需花费：PCR增幅2小时、电泳确定PCR产物1小时、限制酵素切割3小时及电泳确定切割长度1小时，共约7小时，而有三对基因所以共需21小时，这还不包含另外单独检测紧迫敏感基因型及动情素接受体基因型的时间(此两组基因各需花费7小时及10小时)；然而利用生物芯片进行杂合反应则需：PCR 2小时、电泳确定PCR产物1小时及杂合反应2小时，共需约5小时即可完成。因此，心脏脂肪酸结合蛋白基因型(三对)加上紧迫敏感基因型及动情素接受体基因型同时检测，可节省至少4个工作天的人力浪费。另外，习知PCR-RFLP方法若同时进行五对基因检测，则会因为样品数目过多，造成操作者容易于实验过程中产生误差，故实验结果的重复性不高，容易判断错误。就材料成本而言，因公知PCR-RFLP法需使用至少五种限制酵素，故成本高于只需使用核酸探针的杂合反应。此外，目前猪只紧迫敏感基因检测约为每头六百元，心脏脂肪酸结合蛋白基因约为每头一千八百元，多产基因约为每头六百元，然而平均每头猪的饲养成本约为三千元，故额外的基因检测会提高养猪成本，一般养猪户经济上无法负担，造成台湾猪种质量提升缓慢。就这些层面看来，本发明确实能改善传统方式的缺点，并且能提高检测敏感度。

其它实施态样

本发明的实施方法已详述于前述实施例中，任何熟悉本技术领域的人士皆可依本发明的说明，在不背离本发明的精神与范围内视需要更动、修饰本发明，因此，其它实施态样亦包含在本发明的申请专利范围中。

                          序列表

<110>睿嘉生物科技股份有限公司

<120>猪只检测引子、探针及其应用

<130>05P0055

<160>20

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>猪只心脏脂肪酸结合蛋白基因引子(H/h)

<400>1

ggaccaggaa accgaagatg t                                             21

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>猪只心脏脂肪酸结合蛋白基因引子(H/h)

<400>2

cccagcctgc cgaaagag                                                 18

<210>3

<211>22

<212>DNA

<213>猪只心脏脂肪酸结合蛋白基因引子(A/a)

<400>3

attgccttcg gtgtgtttga gt                                            22

<210>4

<211>24

<212>DNA

<213>猪只心脏脂肪酸结合蛋白基因引子(A/a)

<400>4

gtagagagca aacctcccag ttct                                          24

<210>5

<211>23

<212>DNA

<213>猪只心脏脂肪酸结合蛋白基因引子(D/d)

<400>5

aggggcaaga aatccaatta aac                                           23

<210>6

<211>24

<212>DNA

<213>猪只心脏脂肪酸结合蛋白基因引子(D/d)

<400>6

gcaggcttaa taggagaatc tgaa                                          24

<210>7

<211>18

<212>DNA

<213>猪只动情素接受体基因引子(EA/EB)

<400>7

gctggagatg ctggacgc                                                 18

<210>8

<211>24

<212>DNA

<213>猪只动情素接受体基因引子(EA/EB)

<400>8

tcccctgtga tgtaatacat ttgc                                          24

<210>9

<211>21

<212>DNA

<213>猪只紧迫敏感基因引子(C/T)

<400>9

gccctcacac cttgacctct g                                             21

<210>10

<211>23

<212>DNA

<213>猪只紧迫敏感基因引子(C/T)

<400>10

cagggagcaa gttctcagta atg                                           23

<210>11

<211>22

<212>DNA

<213>猪只心脏脂肪酸结合蛋白基因探针(H)

<400>11

gctcttcgga atctgagaag ga                                            22

<210>12

<211>21

<212>DNA

<213>猪只心脏脂肪酸结合蛋白基因探针(h)

<400>12

cgctcttcgg atctgagaag g                                             21

<210>13

<211>18

<212>DNA

<213>猪只心脏脂肪酸结合蛋白基因探针(A)

<400>13

tctctcagga ccggctac                                                 18

<210>14

<211>20

<212>DNA

<213>猪只心脏脂肪酸结合蛋白基因型(a)

<400>14

tctctcagga tcggctaccc                                               20

<210>15

<211>17

<212>DNA

<213>猪只心脏脂肪酸结合蛋白基因探针(D)

<400>15

agcctgggca tcccata                                                  17

<210>16

<211>16

<212>DNA

<213>猪只心脏脂肪酸结合蛋白基因探针(d)

<400>16

agcctggcca tcccat                                                   16

<210>17

<211>17

<212>DNA

<213>猪只动情素接受体基因探针(EA)

<400>17

caaccaacct tgggggc                                                  17

<210>18

<211>16

<212>DNA

<213>猪只动情素接受体基因探针(EB)

<400>18

aaccaacctc gggggc                                                   16

<210>19

<211>14

<212>DNA

<213>猪只紧迫敏感基因探针(T)

<400>19

gccgtgtgct ccaa                                                     14

<210>20

<211>14

<212>DNA

<213>猪只紧迫敏感基因探针(C)

<400>20

gccgtgcgct ccaa                                                     14

Claims (18)

1.一种用以增幅受试样品中猪只基因的组合物，该组合物包含至少一组成对的寡核苷酸引子，前述引子对选自包含以下的寡核苷酸序列的群组：

引子对1：SEQ ID NO.1

         SEQ ID NO.2

引子对2：SEQ ID NO.3

         SEQ ID NO.4

引子对3：SEQ ID NO.5

         SEQ ID NO.6

引子对4：SEQ ID NO.7

         SEQ ID NO.8

引子对5：SEQ ID NO.9

         SEQ ID NO.10

2.如权利要求1所述的组合物，其中前述引子对1(SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2)、引子对2(SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4)或引子对3(SEQID NO.5、SEQ ID NO.6)是用于增幅猪只心脏脂肪酸结合蛋白基因片段。

3.如权利要求1所述的组合物，其中前述引子对4(SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8)是用于增幅猪只动情素接受体基因片段。

4.如权利要求1所述的组合物，其中前述引子对5(SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10)是用于增幅猪只猪只紧迫敏感基因片段。

5.如权利要求1所述的组合物，其中前述衍生物是指于前述序列或其互补股的3’端或5’端修饰其它核苷酸序列，使其仍和原序列具有70％或以上相似性的寡核苷酸序列。

6.一种用于鉴定猪只基因型的寡核苷酸序列，其选自包含以下寡核苷酸序列的群组：SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13及SEQ IDNO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19及SEQ ID NO.20所示的序列、其互补股或衍生物。

7.如权利要求6所述的寡核苷酸序列，其中前述SEQ ID NO.11、SEQID NO.12、SEQ ID NO.13及SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16所示的序列、其互补股或衍生物是用于鉴定猪只心脏脂肪酸结合基因型。

8.如权利要求6所述的寡核苷酸序列，其中前述SEQ ID NO.17、SEQID NO.18所示的序列、其互补股或衍生物是用于鉴定猪只动情素接受体基因型。

9.如权利要求6所述的寡核苷酸序列，其中前述SEQ ID NO.19、SEQID NO.20所示的序列、其互补股或衍生物是用于鉴定猪只紧迫敏感基因型。

10.如权利要求6所述的寡核苷酸序列，其中前述衍生物是指于前述序列或其互补股的3’端或5’端修饰其它核苷酸序列，使其仍和原序列具有70％或以上相似性的寡核苷酸序列。

11.一种用于鉴定猪只基因型的生物芯片，于该芯片上固定有复数个探针，其中前述探针可选自下列群组包括：SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ IDNO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19及SEQ ID NO.20所示的序列、其互补股或衍生物。

12.如权利要求11所述的生物芯片，其中前述衍生物是指于前述序列或其互补股的3’端或5’端修饰其它核苷酸序列，使其仍和原序列具有70％或以上相似性的寡核苷酸序列。

13.一种鉴定猪只基因型的方法，包括下列步骤：

(a)由猪只样品中萃取DNA；

(b)利用至少一寡核苷酸杂交步骤(a)的DNA，前述寡核苷酸选自权利要求8的寡核苷酸群组；及

(c)侦测杂交结果判断猪只的基因型。

14.如权利要求13所述的方法，其中步骤(a)与步骤(b)间可进一步包含一增幅步骤增幅猪只DNA，该增幅步骤利用至少一引子对增幅猪只DNA。

15.如权利要要求14所述的方法，其中前述引子对选自权利要求1所述的寡核苷酸序列的群组，该群组包含以下引子对：引子对1(SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2)、引子对2(SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4)、引子对3(SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6)、引子对4(SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8)及引子对5(SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10)。

16.一种鉴定猪只基因型的方法，包含下列步骤：

(a)由猪只样品中萃取DNA；

(b)提供一权利要求11所述的生物芯片与步骤(a)的产物接触；及

(c)侦测芯片表面探针的杂交结果判断猪只的基因型。

17.如权利要求16所述的方法，其中步骤(a)与步骤(b)间可进一步包含一增幅步骤增幅猪只DNA，该增幅步骤系利用至少一引子对增幅猪只DNA。

18.如权利要求17所述的方法，其中前述引子对选自权利要求1所述的寡核苷酸序列的群组，该群组包含以下引子对：引子对1(SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2)、引子对2(SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4)、引子对3(SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6)、引子对4(SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8)及引子对5(SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10)。

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