CN1910174B - 吲哚基马来酰亚胺衍生物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了式I化合物其中R、Ra、Rb、Rc、Rd和Re如说明书所定义；它们的制备方法、它们的用途、特别是在移植中的用途，以及包含它们的药物组合物。
Description
本发明涉及吲哚基马来酰亚胺衍生物、它们的制备方法以及包含它们的药物组合物。
更具体地，本发明提供了式I化合物
其中
Ra为H；C1-4烷基；或被OH、NH2、NHC1-4烷基或N(二-C1-4烷基)2取代的C1-4烷基；
Rb、Rc、Rd和Re之一为卤素；C1-4烷氧基；或C1-4烷基，且其他三个取代基各自为氢；或Rb、Rc、Rd和Re全为氢；且
R为式(a)的基团
其中
R1为-(CH2)n-NR3R4，其中
R3和R4各自独立为H或C1-4烷基；或R3和R4与它们所连接的氮原子一起形成杂环残基；
n为0、1或2；且
R2为H；卤素；C1-4烷基；CF3；OH；SH；NH2；NO2；C1-4烷氧基；C1-4烷硫基；NHC1-4烷基；N(二-C1-4烷基)2或CN。
式I化合物可为游离形式或盐形式。
烷基和烷氧基可为直链或支链。
卤素可为F、Cl、Br或I，优选F、Cl或Br。
杂环残基指3至8元、优选5至8元饱和、不饱和或芳族杂环，含有1或2个优选选自N、O和S的杂原子，并任选被取代。
适宜的R1实例包括例如吡啶基，如3-或4-吡啶基；哌啶基，如哌啶-1-基、3-或4-哌啶基、高哌啶基；哌嗪基、高哌嗪基、咪唑基、咪唑烷基、吡咯基、吡咯烷基或吗啉-4-基，任选被取代，如单或多取代。当杂环残基被取代时，取代可在一个或多个环碳原子上和/或当存在时的环氮原子上。环碳原子上取代基的实例包括例如C1-4烷基，如CH3；C3-6环烷基，如环丙基，任选进一步被C1-4烷基取代；其中p为1、2或3，优选1；CF3；卤素；NH2；-CH2-NR7R8，其中R7和R8各自独立地为H或C1-4烷基，或R7和R8与它们所连接的氮原子一起形成杂环残基或杂芳基；-CH2-OH；-CH2-O-C1-4烷基；-CH2-卤素；或-CH2-CH2-卤素。环氮原子上取代基的实例为例如C1-6烷基；酰基，如R’x-CO，其中R’x为H、C1-6烷基，或苯基，任选被C1-4烷基、C1-4烷氧基或氨基取代，例如甲酰基；C3-6环烷基；C3-6环烷基-C1-4烷基；苯基；苯基-C1-4烷基，如苄基；杂环残基，例如如上所公开，例如包含1或2个氮原子的芳族杂环残基；或式β的残基
-R5-Y’(β)
其中R5为被O中断的C2-4亚烷基或C1-4亚烷基，且Y’为OH、NH2、NH(C1-4烷基)或N(C1-4烷基)2。被O中断的C2-4亚烷基可为例如-CH2-CH2-O-CH2-CH2-。
式I化合物可以以游离形式或盐形式存在，例如与有机酸或无机酸、例如盐酸、乙酸、三氟乙酸的盐。
应该理解，式I化合物可以以光学异构体、外消旋物或非对映异构体形式存在。例如，哌嗪残基3位上带有取代基的环碳原子是不对称的，可具有R或S构型。应该理解，本发明包含所有的对映体和它们的混合物。对映体比外消旋体优选。类似的考虑也适用于显示如上所述不对称碳原子的原料。
在式I化合物中，优选单独或任何亚组合的下列含义：
1.Ra为H或甲基；
2.Rb、Rc、Rd和Re之一为甲基或乙基，且其他三个取代基各自为H；或Rb、Rc、Rd和Re全为H；
3.R2为H、Cl、NO2、CF3、F或甲基
4.n为1；且
5.R3和R4各自独立地为H、甲基、乙基或异丙基；或R3和R4与它们所连接的氮原子一起形成杂环残基，例如任选取代的哌嗪基或吡咯烷基。
本发明也包括式I化合物的制备方法，该方法包括：
使式II化合物
其中Ra、Rb、Rc、Rd和Re如上所定义，
与式HI化合物反应
R-CH2-CO-NH2(III)
其中R如上所定义，
并且如有需要，适当地将获得的游离形式的式I化合物转化为盐形式，或反之亦然。
该方法可方便地在强碱如t-BuOK存在下进行，如其内容在此处引用作为参考的WO02/38561或WO 03/08259所公开以及如实施例中所阐明。
式II和式III化合物可根据已知方法制备，如其内容在此处引用作为参考的WO02/38561或WO 03/08259所公开以及如实施例中所阐明。
在原料的制备没有具体描述的情况下，则该化合物是已知的或可类似于本领域已知方法或此后所述的方法制备。
下列实施例说明而非限制本发明。
RT＝室温
THF＝四氢呋喃
DMF＝二甲基甲酰胺
EtOAc＝乙酸乙酯
Pd2(dba)3＝Pd(0)-二(二亚苄基丙酮)
FCC＝快速柱色谱法
TLC＝薄层色谱法
实施例1：3-(2-氯-6-二甲基氨基甲基-萘-1-基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯-2，5-二酮
在氩气氛下，将经活化的3
分子筛(50mg)加入到2-(2-氯-6-二甲基氨基甲基-萘-1-基)-乙酰胺(54.6mmol，0.20mmol)和(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-氧代-乙酸甲酯(55.7mg，0.26mmol)在干燥THF(2.5ml)中的溶液中。然后在室温下一次性加入1.0M KOtBu在THF(0.59ml，0.59mmol)中的溶液。室温下30分钟后，TCL分析表明原料完全转化。将反应混合物用乙酸乙酯稀释并倾入饱和NH4Cl水溶液中。分离有机层，用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，并将有机溶剂蒸发。残余物经FCC纯化(EtOAc/AcOH/H2O700∶110∶90)，得到标题化合物。1H NMR(d6-DMSO，400MHz)：δ2.12(s，6H)，3.46(s，2H)，3.82(s，3H)，6.16(d，J＝8.8Hz，1H)，6.45-6.51(m，1H)，6.96-7.02(m，1H)，7.32-7.40(m，2H)，7.60-7.68(m，2H)，7.88(s，1H)，8.06(d，J＝10Hz，1H)，8.15(s，1H)。ES+-MS：445.5，446.6[M+H]+。
2-(2-氯-6-二甲基氨基甲基-萘-1-基)-乙酰胺的制备
在氩气氛下，将2-(2-氯-6-二甲基氨基甲基-萘-1-基)-乙酸(276mg，0.99mmol)溶解于DMF(3ml)中。加入1，1-羰基二咪唑(177mg，1.09mmol)，并将澄清的溶液在室温搅拌3小时。加入浓氨水溶液(25％，6ml)，在室温继续搅拌10分钟。TCL分析表明原料完全消耗。将反应混合物倾至水中。水层用乙酸乙酯萃取，然后用盐水洗涤并用Na2SO4干燥。在除去溶剂后，发现残余物为纯的标题化合物，无需纯化。1H NMR(d6-DMSO，400MHz)：δ2.18(s，6H)，3.53(s，2H)，4.08(s，2H)，6.96-7.08(br，2H)，7.48-7.68(m，2H)，7.78-7.86(m，2H)，7.96-8.00(d，J＝10Hz，1H)。ES+-MS：277.3，279.2[M+H]+。
(2-氯-6-二甲基氨基甲基-萘-1-基)-乙酸的制备
将(2-氯-6-二甲基氨基甲基-萘-1-基)-乙酸乙酯(223mg，0.73mmol)溶解于二噁烷(2.6ml)中。然后加入水(0.96ml)和氢氧化锂(21mg，0.88mmol)，将反应混合物温至60℃达4小时，HPLC分析表明原料完全转化。将反应用水稀释，通过加入1M NaHSO4水溶液将pH调节至6-7，并用乙酸乙酯萃取。然后浓缩水层，将固体残余物反复用甲醇萃取，得到纯的标题化合物。ES+-MS：278.3，280.1[M+H]+。
(2-氯-6-二甲基氨基甲基-萘-1-基)-乙酸乙酯的制备
在氩气氛下，将二甲胺(5.6M乙醇中的溶液，0.28ml，1.53mmol)加入到(2-氯-6-甲酰基-萘-1-基)-乙酸乙酯(284mg，1.02mmol)在THF(10ml)中的溶液中。将混合物在室温搅拌18小时，然后加入氰基氢硼化钠(78mg，1.23mmol)在甲醇(2ml)中的溶液和冰醋酸(0.29ml，5.13mmol)。在室温搅拌1小时后，TCL分析表明原料完全消耗。将反应混合物用水稀释并通过加入浓NaHCO3水溶液调节pH至8-9。用乙酸乙酯萃取，用盐水洗涤，用Na2SO4干燥并除去溶剂，得到反应产物粗品。通过FCC(CH2Cl2/EtOH/NH3190∶9∶1)纯化，得到标题化合物。1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ1.26(t，J＝9Hz，3H)，2.30(s，6H)，3.59(s，2H)，4.18(q，J＝9Hz，2H)，4.30(s，2H)，7.49(d，J＝10Hz，1H)，7.54-7.58(m，1H)，7.69-7.76(m，2H)，7.91(d，J＝10Hz，1H)。ES+-MS：306.4，308.3[M+H]+。
(2-氯-6-甲酰基-萘-1-基)-乙酸乙酯的制备
将(2-氯-6-氰基-萘-1-基)-乙酸乙酯(1.39g，5.07mmol)溶解于水(17ml)、吡啶(33ml)和冰醋酸(17ml)的混合物中。然后在室温加入次磷酸钠(4.30g，40.62mmol)和阮内镍(3.2g)。将反应混合物加热至100℃达1小时。TCL分析表明原料完全消耗。将反应混合物冷却至室温并通过硅藻土过滤。加入硅胶后，在旋转蒸发器中除去溶剂。通过FCC(己烷/乙酸乙酯5∶1)纯化，得到标题化合物。1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ1.17(t，J＝8Hz，3H)，4.10(q，J＝8Hz，2H)，4.24(s，2H)，7.52(d，J＝10Hz，1H)，7.82(d，J＝10Hz，1H)，7.94-7.98(m，2H)；8.26(s，1H)，10.09(s，1H)。ES--MS：275.2，277.3[M-H]-。
(2-氯-6-氰基-萘-1-基)-乙酸乙酯的制备
在氩气氛下，将(2-氯-6-三氟甲磺酰氧基-萘-1-基)-乙酸乙酯(3.59g，9.04mmol)溶于DMF(30ml)中。在加入四(三苯膦)钯(0)(418mg，0.36mmol)和氰化锌(II)(2.12g，18.09mmol)后，将反应混合物加热至125℃。1小时后，TCL分析表明原料完全消耗。将混悬液冷却至室温并倾入水中。用乙酸乙酯萃取，然后用1M HCl水溶液、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤有机层。用Na2SO4干燥并除去溶剂后，通过FCC(己烷/乙酸乙酯3∶1)纯化，得到标题化合物。1H NMR(d6-DMSO，400MHz)：δ1.06(t，J＝8Hz，3H)，3.98(q，J＝8Hz，2H)，4.24(s，2H)，7.66(d，J＝10Hz，1H)，7.79(d，J＝10Hz，1H)，7.96(d，J＝10Hz，1H)，8.13(d，J＝10Hz，1H)，8.54(s，1H)。
(2-氯-6-三氟甲磺酰氧基-萘-1-基)-乙酸乙酯的制备
在氩气氛下，将(2-氯-6-羟基-萘-1-基)-乙酸乙酯(3.39g，12.80mmol)溶于吡啶(35ml)中。冷却至0℃后，在15分钟内滴加三氟甲磺酸酐(2.32ml，14.08mmol)。在0℃搅拌15分钟和室温搅拌1小时后，TCL分析表明原料完全消耗。将反应混合物倾入1M NaHCO3水溶液中。用乙酸乙酯萃取后，用盐水洗涤并用Na2SO4干燥有机层，浓缩，生成反应产物的粗品。通过FCC(己烷/乙酸乙酯4∶1)纯化，得到标题化合物。1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ1.48(t，J＝9Hz，3H)，4.41(q，J＝9Hz，2H)，4.52(s，2H)，7.68(d，J＝10Hz，1H)，7.82(d，J＝10Hz，1H)，7.98-8.00(m，2H)，8.27(d，J＝10Hz，1H)。
(2-氯-6-羟基-萘-1-基)-乙酸乙酯的制备
在氩气氛下，将(2-氯-6-甲氧基-萘-1-基)-乙酸乙酯(5.43g，19.48mmol)和四丁基碘化铵(9.35g，25.32mmol)溶解于CH2Cl2(110ml)中。将反应混合物冷却至-78℃，在15分钟内加入1M BBr3的CH2Cl2溶液(48.7ml，48.7mmol)。在-78℃搅拌10分钟和室温搅拌10分钟后，TCL分析表明原料完全消耗。将反应混合物倾入浓NaHCO3水溶液中，并将混合物在室温剧烈搅拌20分钟。用CH2Cl2萃取后，有机层用盐水洗涤并用Na2SO4干燥。通过FCC(己烷/乙酸乙酯2∶1)纯化，得到标题化合物。1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ1.19(t，J＝9Hz，3H)，4.12(q，J＝9Hz，2H)，4.18(s，2H)，5.35-5.60(br，1H)，6.93(s，1H)，6.99(d，J＝10Hz，1H)，7.33(d，J＝10Hz，1H)，7.42(d，J＝10Hz，1H)，7.70(d，J＝10Hz，1H)。ES+-MS：265.2，266.8[M+H]+。
(2-氯-6-甲氧基-萘-1-基)-乙酸乙酯的制备
在氩气氛下，将(2-氯-6-甲氧基-萘-1-基)-乙酸乙酯和(2-氯-6-甲氧基-3，4-二氢-萘-1-基)-乙酸乙酯的混合物(4.07g，约14.6mmol)溶解于二噁烷(40ml)中。加入2，3-二氯-5，6-二氰基-对-苯醌(DDQ，7.30g，32mmol)，将反应混合物回流4小时。冷却至室温后，加入甲醇使得反应混合物均匀。加入硅胶，通过旋转蒸发除去溶剂。通过FCC(己烷/乙酸乙酯980∶20至960∶40)纯化，得到标题化合物。1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ1.32(t，J＝9Hz，3H)，4.00(s，3H)，4.26(q，J＝9Hz，3H)，4.34(s，2H)，7.21(s，1H)，7.30(d，J＝10Hz，1H)，7.52(d，J＝10Hz，1H)，7.71(d，J＝10Hz，1H)，7.92(d，J＝10Hz，1H)。ES+-MS：279.1，280.9[M+H]+。
(2-氯-6-甲氧基-萘-1-基)-乙酸乙酯和(2-氯-6-甲氧基-3，4-二氢-萘-1-基)-乙酸乙酯的制备
在氩气氛下，将(2-氯-1-羟基-6-甲氧基-1，2，3，4-四氢-萘-1-基)-乙酸乙酯(5.0g，16.64mmol)、1，1-二苯基乙烯(3.2ml)、1-甲基-萘(3ml)和披钯炭(10％，500mg)的混合物加热至180℃。3小时后，TCL分析表明原料完全消耗。将反应混合物冷却至室温，用乙酸乙酯稀释并过滤。除去乙酸乙酯并通过FCC(己烷100至己烷/乙酸乙酯980∶20至960∶40)纯化，得到标题化合物混合物。
(2-氯-1-羟基-6-甲氧基-1，2，3，4-四氢-萘-1-基)-乙酸乙酯的制备
在氩气氛、-78℃下，将乙酸乙酯(7.2ml，73.96mmol)在THF(20ml)中的溶液缓慢加入到二异丙胺锂(从10.5ml二异丙胺(73.96mmol)和46.2ml1.6M n-BuLi的己烷溶液(73.96mmol)制得)在THF(20ml)的溶液中。在-78℃搅拌30分钟后，在30分钟内缓慢加入2-氯-6-甲氧基-3，4-二氢-2H-萘-1-酮(7.79g，36.98mmol)在THF(20ml)中的溶液。将反应混合物在-78℃搅拌24小时。TCL分析表明原料完全转化。将反应混合物用乙酸乙酯稀释并倾入饱和NH4Cl水溶液中。分离有机层并用盐水洗涤。用Na2SO4干燥后，除去溶剂。通过FCC(己烷/乙酸乙酯920∶80至880∶120)纯化，得到标题化合物。1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ1.22(t，J＝9Hz，3H)，2.33-2.41(m，2H)，2.80-3.12(m，4H)；3.12(s，1H)，3.78(s，3H)，4.12(q，J＝9Hz，2H)，5.01-5.04(m，1H)，6.60-6.62(m，1H)，6.78-6.82(m，1H)，7.52(d，J＝10Hz，1H)。
2-氯-6-甲氧基-3，4-二氢-2H-萘-1-酮的制备
在氩气氛、-78℃下，将6-甲氧基-3，4-二氢-2H-萘-1-酮(5.0g，28.37mmol)在THF(25ml)中的溶液缓慢加入到二异丙胺锂在THF中的溶液中(25ml；从4.0ml二异丙胺(28.37mmol)和17.7ml 1.6M n-BuLi的己烷溶液(28.37mmol)制得)。在-78℃30分钟后，在20分钟内加入对-甲苯磺酰氯(5.41g，28.37mmol)在THF(25ml)中的溶液。移去干冰冷却浴，并任反应混合物升至室温。1小时后，TCL分析表明原料完全消耗。加入饱和NH4Cl水溶液(100ml)，并将混合物在室温搅拌15分钟。分离有机层，用盐水洗涤，用Na2SO4干燥并浓缩。通过FCC纯化(己烷/乙酸乙酯920∶80至880∶120)，得到标题化合物。1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ2.54-2.63(m，1H)，2.68-2.75(m，1H)，3.04-3.12(m，1H)，3.38-3.46(m，1H)，4.02(s，3H)；4.72-4.76(m，1H)，6.87(s，1H)，7.00-7.04(m，1H)，8.22(d，J＝10Hz，1H)。ES+-MS：279.1，280.9[M+H]+。
按照实施例1的方法，但使用适当的原料，可获得式A化合物，其中Ra、Rb、R2、R3和R4如下表2所示。
表2
| R<sub>2</sub> | R<sub>3</sub> | R<sub>4</sub> | R<sub>a</sub> | R<sub>b</sub> | MS | |
| 2. | H | H | H | CH<sub>3</sub> | H | MH<sup>+</sup>382 |
| 3. | H | H | H | H | CH<sub>3</sub> | MH<sup>+</sup>382 |
| 4. | Cl | CH<sub>3</sub> | CH<sub>3</sub> | H | H | MH<sup>+</sup>431 |
| 5. | Cl | CH<sub>3</sub> | CH<sub>3</sub> | H | CH<sub>3</sub> | MH<sup>+</sup>445 |
| 6. | Cl | H | CH<sub>3</sub> | H | H | MH<sup>+</sup>417 |
| 7. | Cl | H | CH<sub>3</sub> | H | CH<sub>3</sub> | MH<sup>+</sup>431 |
| 8. | H | H | H | H | H | MH<sup>+</sup>368 |
游离形式或可药用盐形式的式I化合物呈现有价值的药理性质，例如抑制蛋白激酶C(PKC)如PKC同工型如α、β、δ、ε、η或θ、抑制T细胞活化和增殖，例如通过抑制T细胞或细胞因子如IL-2的生成、通过抑制T细胞对细胞因子如IL-2的增殖反应，例如体外和体内实验所示，因此适应于治疗。
A.体外
1.蛋白激酶C测定
按照下列方法测定本发明化合物对不同PKC同工型的活性。测定在透明底、无结合表面的白色384孔微量滴定板中进行。反应混合物(25μl)在20mM Tris-HCl缓冲液pH7.4+0.1％BSA中含有1.5μM用丙氨酸→丝氨酸替换模拟PKCα假底物序列的十三肽受体底物、10μM 33P-ATP、10mMMg(NO3)2、0.2mM CaCl2、蛋白质浓度从25至400ng/ml的PKC(取决于使用的同工型)、最终脂质浓度为0.5mM的脂囊泡(含有30mol％磷脂酰丝氨酸、5mol％DAG和65mol％磷脂酰胆碱)。在室温进行孵育60分钟。加入50μl终止混合物(100mM EDTA、200μM ATP、0.1％Triton X-100、0.375mg/孔链霉抗生物素包衣的SPA珠，在膦酸盐缓冲的盐水w/o Ca、Mg中)，使反应停止。在室温孵育10分钟后，将混悬液在300g离心10分钟。在Trilux计数器中测定所掺入的放射活性达1分钟。通过孵育浓度为1-1000μM的抑制剂系列稀释液，基于常规进行IC50测定。IC50值用XL软件进行曲线拟合由图中计算。
2.蛋白激酶Cα测定
人重组PKCα得自Oxford Biomedical Research，并在上述A.1部分所述的测定条件下使用。在本测定中，式I化合物抑制PKCα的IC50≤1μM。例如，实施例6化合物抑制PKCα的IC50为1.1nM，实施例5化合物的IC50为0.9nM。
3.蛋白激酶Cβ1测定
人重组PKCβ1得自Oxford Biomedical Research，并在上述A.1部分所述的测定条件下使用。在本测定中，式I化合物抑制PKCβ1的IC50≤1μM。例如，实施例5化合物抑制PKCβ1的IC50为2.3nM，实施例7化合物的IC50为2.8nM。
4.蛋白激酶Cδ测定
人重组PKCδ得自Oxford Biomedical Research，并在上述A.1部分所述的测定条件下使用。在本测定中，式I化合物抑制PKCδ的IC50≤1μM。例如，实施例4化合物抑制PKCδ的IC50为9.4nM，实施例5化合物的IC50为4.5nM。
5.蛋白激酶Cε测定
人重组PKCε得自Oxford Biomedical Research，并在上述A.1部分所述的测定条件下使用。在本测定中，式I化合物抑制PKCε的IC50≤1μM。例如，实施例1化合物抑制PKCε的IC50为17.6nM，实施例6化合物的IC50为2.3nM。
6.蛋白激酶Cη测定
人重组PKCη得自PanVera，并在上述A.1部分所述的测定条件下使用。在本测定中，式I化合物抑制PKCη的IC50≤1μM。例如，实施例3的化合物抑制PKCη的IC50为53.9nM，实施例4化合物的IC50为7.2nM。
7.蛋白激酶Cθ测定
人重组PKCθ在以上所述的测定条件下使用。在本测定中，式I化合物抑制PKCθ的IC50≤1μM。例如，实施例1化合物抑制PKCθ的IC50为19.2nM，实施例7化合物的IC50为6.4nM。
8.CD28共刺激测定
使用经人白细胞介素-2启动子/报道基因构建体转染的Jurkat细胞进行测定，如Baumann G等人在Transplant.Proc.1992；24：43-8中所述，β-半乳糖苷酶报道基因被荧光素酶基因所替代(de Wet J.等人，Mol.Cell Biol.1987，7(2)，725-737)。如下通过固相偶联抗体或佛波醇豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)和Ca++离子载体离子霉素刺激细胞。对于抗体介导的刺激，将Microlite TM1微量滴定板(Dynatech)用含3μg/ml山羊抗鼠IgG Fc抗体(Jachson)的55μl磷酸盐缓冲盐水(PBS)/每孔在室温包被3小时。除去抗体后，通过与含2％牛血清白蛋白(BAS)的PBS(300μl每孔)于室温孵育2小时将板封闭。每孔用300μl PBS洗涤3次后，加入50μl 2％BSA/PBS中的10ng/ml抗T细胞受体抗体(WT31，Becton&Dickinson)和300ng/ml抗CD28抗体(15E8)作为刺激抗体，并在4℃孵育过夜。最后，将板中每孔用300μl PBS洗涤三次。在单独的板中制备供试化合物在测定介质(PRMI1640/10％胎牛血清(FCS)，含有50μM 2-巯基乙醇、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素)中的7份3倍系列稀释液，一式两份，与转染的Jurkat细胞(克隆K22 290_H23)混合并在37℃、5％CO2中孵育30分钟。然后将含有1x105个细胞的100μl该混合物转移至抗体包被的测定板。平行地将100μl与40ng/ml PMA和2μM离子霉素孵育。在37℃、5％CO2中孵育5.5小时后，通过生物发光法确定荧光素酶的水平。将板在500g离心10分钟，轻轻拂去上清液。加入溶胞缓冲液，其含有25mM Tris-磷酸盐pH7.8、2mMDTT、2mM 1.2-二氨基环己烷-N，N，N’，N-四乙酸、10％(v/v)甘油和1％(v/v)Triton X-100(20μl每孔)。在持续振摇中将板在室温孵育10分钟。在自动添加50μl每孔荧光素酶反应缓冲液后，用生物发光读取器(Labsystem，Helsinki，芬兰)评价荧光素酶活性，所述缓冲液含有20mM Tricine、1.07mM(MgCO3)4Mg(OH)2x5H2O、2.67mM MgSO4、0.1mM EDTA、33.3mM DTT、270μM辅酶A、470μM荧光素(Chemie Brunschwig AG)、530μM ATP pH7.8。延迟时间为0.5秒，总测定时间为1或2秒。低对照值为经抗T细胞受体或PMA刺激的细胞的光单位，高对照来自无任何供试样品的经抗T细胞受体/抗CD28-或PMA/离子霉素刺激的细胞。从所有值中减去低对照值。在供试化合物存在下获得的抑制计算为高对照的抑制百分数。产生50％抑制的供试化合物浓度(IC50)由剂量反应曲线确定。在本测定中，式I化合物抑制抗T细胞受体/抗CD28和PMA/离子霉素刺激的Jurkat细胞，其IC50≤1μM。
例如，实施例5化合物抑制抗T细胞受体/抗CD28和PMA/离子霉素刺激的Jurkat细胞，IC50为11.5nM，实施例7化合物的IC50为27.5nM。
9.同种异体混合淋巴细胞反应(MLR)
根据标准方法(J.Immunol.Methods，1973，2，279和Meo T.等人，Immunological Methods，纽约，Academic Press，1979，227-39)进行双向MLR。简言之，将来自CBA和BALB/c小鼠的脾细胞(在平底组织培养微量滴定板中每个细胞株每孔含有1.6×105个细胞，共计3.2×105个细胞)在RPMI介质中孵育，所述介质含有10％FCS、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素(Gibco BRL，Basel，瑞士)、50μM 2-巯基乙醇(Fluka，Buchs，瑞士)和连续稀释的化合物。每种供试化合物进行7个3倍稀释步骤，一式两份。孵育4天后，加入1μCi 3H-胸苷。在额外5个小时的孵育期后，收获细胞，根据标准方法确定掺入的3H-胸苷。MLR的背景值(低对照)是单独BALB/c细胞的增殖。从所有值中减去低对照。无任何样品的高对照作为100％增殖。计算样品的抑制百分数，并确定50％抑制所需浓度(IC50值)。
例如，实施例5化合物抑制的IC50为183nM，实施例7化合物的IC50为528nM。
B.体内
大鼠心脏移植
使用的品系组合：雄性Lewis(RT1单倍型)和BN(RT1单倍型)。使用吸入性异氟烷麻醉动物。通过腹部下腔静脉、同时经由主动脉放血将供体大鼠肝素化后，打开胸腔，将心脏迅速冷却。于第一分枝远端结扎主动脉并离断，在第一分岔离断头臂干。结扎左肺动脉并离断，右侧离断但左侧开放。所有其他血管自由切开、结扎并离断，并将供体心脏移至冰盐水中。
通过解剖和交叉夹紧肾下腹部主动脉和腔静脉准备受体。使用10/0单丝缝合线，在供体头臂干和受体主动脉之间以及供体右肺动脉至受体腔静脉之间，以末端到侧面吻合植入移植物。除去夹子，移植物栓系于后腹，腹部内容物用热盐水冲洗，闭合动物并令其在加热灯下恢复。移植物的存活通过每日腹壁触诊搏动的供体心脏而监测。当心脏搏动停止时视为完全排斥。在用式I化合物以日剂量1至100mg/kg bid、优选1至30mg/kg bid口服施用处理的动物中获得了移植物存活的增加。
移植物抗宿主模型
将来自Wistar/F大鼠的脾细胞皮下注射入F1杂交大鼠的右后足垫(Wistar/F x Fischer 344)。左足垫不予处理。连续4天(0-3)用供试化合物处理动物。在第7天移去腿弯部淋巴结，确定两个相应的淋巴结之间重量的差别。结果以淋巴结扩大的抑制表示(以百分数表示)，其比较了在试验组中淋巴结重量的差别与相应的未用供试化合物处理组动物中淋巴结重量之间的差别。用式I化合物以日剂量1至100mg/kg bid口服施用的动物中获得了对淋巴结扩大的作用。
因此，式I化合物可用于治疗和/或预防由T淋巴细胞和/或PKC介导的疾病或病症，例如器官或组织同种或异种移植物的急性或慢性排斥、移植物抗宿主疾病、动脉粥样硬化、由于血管损伤如血管成形术造成的血管阻塞、再狭窄、肥胖症、X综合症、葡萄糖耐量受损、多囊卵巢综合征、高血压、心力衰竭、慢性阻塞性肺疾病、CNS疾病如阿尔茨海默病或肌萎缩侧索硬化、癌症、感染性疾病如AIDS、脓毒性休克或成人呼吸窘迫综合征、缺血/再灌注损伤如心肌梗塞、中风、肠道缺血、肾衰竭或出血性休克，或创伤性休克如外伤性脑损伤。式I化合物也可用于治疗和/或预防由T-细胞介导的急性或慢性炎性疾病或病症或自身免疫疾病，例如类风湿性关节炎、骨关节炎、系统性红斑狼疮、桥本甲状腺炎、多发性硬化症、重症肌无力、I型或H型糖尿病以及与其有关的病症、呼吸疾病如哮喘或炎性肺损伤、炎性肝损伤、炎性肾小球损伤、免疫学介导的病症或疾病的皮肤表现、炎性和高增殖性皮肤疾病(如牛皮癣、特应性皮炎、变应接触性皮炎、刺激性接触性皮炎以及湿疹性皮炎、脂溢性皮炎)、炎性眼病如斯耶格伦综合征、角膜结膜炎或葡萄膜炎、炎性肠病、局限性回肠炎或溃疡性结肠炎。对于上述用途，所要求的剂量当然取决于施用的方式、待治疗的具体病症和所需效果而异。通常，约0.1至约100mg/kg体重的日剂量可系统地获得满意的效果。在较大的哺乳动物如人中，适用的日剂量约0.5mg至约2000mg，以不超过一日四次的分剂量或以延迟形式方便地施用。
式I化合物可以通过任何常规的途径施用，尤其是经肠，如口服，例如以片剂或胶囊的形式；或经肠胃外，例如以注射溶液或混悬液形式；经局部，例如以洗剂、凝胶剂、软膏剂或乳膏剂形式，或以鼻用或栓剂形式。包含游离形式或可药用盐形式的式I化合物以及至少一种可药用载体或稀释剂的药物组合物可以以常规方式、通过与可药用载体或稀释剂混合而制备。口服施用的单位剂型含有例如约0.1mg至约500mg的活性物质。
局部施用例如用于皮肤。局部施用另外的形式是用于眼部。
式I化合物可以以游离形式或可药用盐形式施用，如上所述。这类盐可以以常规方式制备，并呈现与游离化合物相同级别的活性。
根据前述内容，本发明还提供：
1.1在需要这种治疗的个体中预防或治疗由T淋巴细胞和/或PKC介导的病症或疾病(例如如上所示)的方法，该方法包括向所述个体施用有效量的式I化合物或其可药用盐；
1.2在需要这种治疗的个体中预防或治疗急性或慢性移植排斥或由T细胞介导的炎性或自身免疫疾病(例如如上所示)的方法，该方法包括向所述个体施用有效量的式I化合物或其可药用盐；
2.用作药物的游离形式或可药用盐形式的式I化合物，例如在1.1和1.2中所述的任何方法中。
3.药物组合物，例如用于上述1.1和1.2的任何方法中的药物组合物，包含游离形式或可药用盐形式的式I化合物以及可药用的稀释剂或载体。
4.式I化合物或其可药用盐，用于制备用于上述1.1和1.2中任意方法中的药物组合物。
式I化合物可作为唯一的活性成分或与免疫调节治疗方案中的其他药物或其他的抗炎剂一起施用，例如用于治疗或预防同种或异种移植物急性或慢性排斥或炎性或自身免疫病症。例如，它们可以与以下药物联合使用：环孢菌素或子囊霉素或它们的免疫抑制类似物或衍生物，例如环孢菌素A、ISA Tx247、FK-506、ABT-281、ASM 981；mTOR抑制剂，例如雷帕霉素、40-O-(2-羟乙基)-雷帕霉素、CCI779、ABT578，或雷帕霉素类似物，例如AP23573、AP23464、AP23675、AP23841、TAFA-93、biolimus 7或biolimus 9等；皮质类固醇；环磷酰胺；硫唑嘌呤；甲氨蝶呤；具有促进淋巴细胞归巢性质的EDG受体激动剂，例如FTY 720或其类似物；来氟洛米或其类似物；咪唑立宾；麦可酚酸或其盐，例如钠盐；麦可酚酸吗啉乙酯；15-脱氧精胍菌素或其类似物；免疫抑制单克隆抗体，例如对白细胞受体的单克隆抗体，例如MHC、CD2、CD3、CD4、CD 11a/CD18、CD7、CD25、CD 27、B7、CD40、CD45、CD58、CD 137、ICOS、CD150(SLAM)、OX40、4-1BB或它们的配体，例如CD154；或其他免疫调节化合物，例如重组结合分子，其具有CTLA4或其突变体的至少部分细胞外结构域，例如结合至非CTLA4蛋白质序列如CTLA4Ig(例如指定的ATCC 68629)或其突变体如LEA29Y的CTLA4或其突变体的至少细胞外部分，或其他粘着分子抑制剂，例如mAbs，或低分子量抑制剂，包括LFA-1拮抗剂、选择蛋白拮抗剂和VLA-4拮抗剂。式I化合物也可与抗增殖药物共同施用，如用于癌症治疗的化疗药，包括但并不限于芳香酶抑制剂、抗雌激素剂、拓扑异构酶I抑制剂、拓扑异构酶II抑制剂、微管活性剂、烷化剂、组蛋白脱乙酰酶抑制剂、法呢基转移酶抑制剂、COX-2抑制剂、MMP抑制剂、mTOR抑制剂、抗肿瘤抗代谢物、铂化合物、降低蛋白激酶活性的化合物以及抗血管生成的化合物、促性腺激素释放因子激动剂、抗雄激素剂、bengamides、双膦酸类、抗增殖抗体和替莫唑胺，或在糖尿病治疗中与抗糖尿病药物、胰岛素促分泌素或胰岛素分泌促进剂一起使用，如磺酰脲，例如甲苯磺丁脲、氯磺丙脲、妥拉磺脲、醋磺己脲、4-氯-N-[(1-吡咯烷基氨基)羰基]-苯磺酰胺(glycopyramide)、格列苯脲(优降糖)、格列齐特、1-丁基-3-间氨基苯磺酰脲、氨磺丁脲、格脲、格列吡嗪、格列喹酮、格列派特、格列丁唑、glibuzole、格列茚脲、格列嘧啶、氯磺氮脲、苯磺丁脲或甲苯基醋磺环己脲(tolylcyclamide)；口服促胰岛素剂衍生物，例如短效胰岛素增强剂，例如氯茴苯酸、瑞格列奈；苯基乙酸衍生物，例如纳格列奈；DPP IV抑制剂，例如1-{2-[(5-氰基吡啶-2-基)氨基]乙基氨基}乙酰基-(2S)-氰基-吡咯烷二盐酸盐、LAF237、GLP-1或GLP-1激动剂类似物；或胰岛素增敏剂，例如过氧化物酶体增殖物激活受体γ激动剂(PPARγ)，例如格列酮(glitazone)、非格列酮类如N-(2-苯甲酰基苯基)-L-酪氨酸类似物，例如GI-262570；或oxolidinedione，例如JTT501；双重PPARγ/PPARα激动剂，例如DRF-554158、NC-2100或NN-622；类视色素X受体激动剂或rexinoid，例如2-[1-(3，5，5，8，8-五甲基-5，6，7，8-四氢-2-萘基)-环丙基]-吡啶-5-羧酸、4-[(3，5，5，8，8-五甲基-5，6，7，8-四氢-2-萘基)-2-羰基]-苯甲酸、9-顺视黄酸或类似物、衍生物或其可药用盐。
5.如上所定义的方法，包括共同施用、例如同时(concomitantly)或依次施用治疗有效量的PKC或T细胞活化和增殖抑制剂、例如游离形式或可药用盐形式的式I化合物以及第二种药物物质，所述第二种药物物质为免疫抑制剂、免疫调节剂、抗炎剂、抗增殖剂或抗糖尿病药物，例如如上所述。
6.治疗组合，例如药盒，包含a)PKC或T细胞活化和增殖的抑制剂，例如游离形式或可药用盐形式的式I化合物，和b)至少一种第二种活性剂，选自免疫抑制剂、免疫调节剂、抗炎剂、抗增殖剂和抗糖尿病药物。组分a)和组分b)可同时使用或依次使用。该药盒可包括施用说明书。
当PKC或T细胞活化和增殖抑制剂如式I化合物与其他免疫抑制/免疫调节剂、抗炎剂、抗增殖剂或抗糖尿病治疗联合施用时，例如用于预防或治疗以上指定的急性或慢性移植物排斥或炎性或自身免疫病症时，共同施用的免疫抑制剂、免疫调节剂、抗炎剂、抗增殖剂或抗糖尿病化合物的剂量当然取决于所应用的共同药的类型，例如其是甾体还是环孢菌素；所应用的特定药物、所治疗的病症等等而变化。
式I化合物拥有令人关注的药动学特性以及令人关注的体外和体内活性。
Claims (8)
1.式I化合物
其中
Ra为H；或C1-4烷基；
Rb、Rc、Rd和Re之一为C1-4烷基；且其他三个取代基为氢；或Rb、Rc、Rd和Re全为氢；且
R为式(a)的基团
其中
R1为-(CH2)n-NR3R4，其中
R3和R4各自独立地为H或C1-4烷基；
n为1或2；且
R2为H；卤素；CF3；NO2；或CN；
或其盐。
2.根据权利要求1的化合物或其盐，其中Ra为H或甲基；Rb、Rc、Rd和Re之一为甲基或乙基，且其他三个取代基为H；或Rb、Rc、Rd和Re全为H；R2为H、Cl或NO2；n为1；且R3和R4各自独立地为H、甲基、乙基或异丙基。
3.根据权利要求1或2的化合物，其选自
3-(2-氯-6-二甲基氨基甲基-萘-1-基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯-2，5-二酮；
3-(2-氯-6-甲基氨基甲基-萘-1-基)-4-(1H-吲哚-3-基)-吡咯-2，5-二酮；
3-(6-氨基甲基-萘-1-基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯-2，5-二酮；
3-(2-氯-6-二甲基氨基甲基-萘-1-基)-4-(1H-吲哚-3-基)-吡咯-2，5-二酮；
3-(2-氯-6-二甲基氨基甲基-萘-1-基)-4-(7-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯-2，5-二酮；
3-(2-氯-6-甲基氨基甲基-萘-1-基)-4-(7-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯-2，5-二酮；
3-(6-氨基甲基-萘-1-基)-4-(1H-吲哚-3-基)-吡咯-2，5-二酮；
3-(6-氨基甲基-萘-1-基)-4-(7-甲基-1H-吲哚-3-基)-吡咯-2，5-二酮；
或其盐。
4.药物组合物，包含根据权利要求1至3任一项的游离形式或可药用盐形式的化合物，以及可药用的稀释剂或载体。
5.根据权利要求1至3任一项的游离形式或可药用盐形式的化合物或根据权利要求5的药物组合物在制备用于治疗或预防由T淋巴细胞和/或PKC介导的疾病或病症的药物中的用途。
6.根据权利要求1至3任一项的游离形式或可药用盐形式的化合物或根据权利要求5的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗和/或预防T淋巴细胞介导的急性或慢性炎症疾病或病症、自身免疫疾病、移植物排斥、癌症或感染性疾病。
7.药物组合，包含根据权利要求1至3任一项的游离形式或可药用盐形式的化合物，以及进一步的活性剂，所述进一步的活性剂选自免疫抑制剂、免疫调节剂、抗炎剂、化疗剂、抗增殖剂和抗糖尿病剂。
8.根据权利要求1或权利要求2的式I化合物的制备方法，该方法包括：
使式II化合物
其中Ra、Rb、Rc、Rd和Re如权利要求1或权利要求2所定义，
与式III化合物反应，
R-CH2-CO-NH2 (III)
其中R如权利要求1或权利要求2所定义，
并且如有需要，适当地将获得的游离形式的式I化合物转化为盐形式，或反之亦然。
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