CN1890386A - 遗传学参考材料 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了遗传学参考标准，它包括克隆至非人哺乳动物细胞系中的至少一个人类遗传学参考序列(包括人类DNA序列，该序列包括至少一个遗传学变体，变体在人类对象的DNA中的存在，是病理状态，病理状态的倾向，或对外部刺激的负面反应的倾向的指标，或者是患者可能对治疗干预出现反应的指标，即用于药物基因组学分析的变体)。还提供了这样的参考标准，其中，所述人类DNA通过同源重组靶定宿主基因组中的特定部位。本发明还提供了利用所述参考标准检测遗传学变体的方法。
Description
技术领域
本发明涉及生产和保持用作遗传学检测对照的遗传学参考材料的方法。
背景技术
在临床遗传学诊断中，检测结果的准确性是极其重要的。例如，在出生前诊断中，假阳性结果可能导致正常胎儿的终结，而且假阳性结果可能导致有缺陷的儿童的出生或对这种儿童的误诊。在临床设施中，遗传学检测的结果可能构成临床干预的基础，并且，获得非常好的结果是很重要的。遗传学检测被越来越多地从人群中鉴定具有发病倾向的个体。对发病倾向的了解，可能通过临床干预或者调整生活方式的手段进行有效的预防。
为了确保所述遗传学检测的可靠性，遗传学参考材料的使用，使得可以在每一次检测中使用正对照或负对照，因此确认所述结果。所述参考材料包括DNA，它们迄今为止是通过以下三种方法之一提供的：
1.PCR(聚合酶链反应)产物
2.质粒-克隆的PCR产物
3.人类基因组DNA。
尽管PCR-生产的DNA的使用看上去对于利用感兴趣的序列生产遗传学参考材料有吸引力，但是它同时具有多种缺点。通过这种技术生产的极大数量的DNA(其数量超过在典型的患者样品中出现的数量)在典型实验室中构成了重大的污染危险。另外，原始PCR-生产的DNA是不稳定的，导致在它的应用中缺乏精确性。出现的另一个问题是，通过这种技术生产的参考遗传学序列是在分离状态下生产的，即没有非目标DNA的背景，所述背景存在于来自患者的样品中。因此，所述标准被认为与测试样品不同，具有在分析中出现假象的危险。
质粒-克隆的PCR产物还可以通过将存在于质粒上的人类遗传学参考序列导入诸如大肠杆菌的有机体中生产。尽管这种机制可能比原始PCR-产生的产品更稳定，但基于要产生的高水平的DNA材料和与长期稳定性相关的问题，则仍然存在污染的风险。这种稳定性的缺乏，与其他问题一同，可能导致参考DNA的质量或数量的损失。
所述第三种方法，人类基因组DNA的使用与在前两种方法出现的污染和不稳定性的问题无关，但是具有它自身的众多缺陷。首先，人类细胞形式的任何人类基因组DNA样品(除非没有专门扩增)，在使用时会被迅速消耗，并因此需要′永生化的′细胞系。这种永生化过程是耗费时间的，并通常涉及对活的Epstein-Bar病毒的操作，会对操作者造成潜在的健康危险。用这种方法生产永生化的细胞系，还需要使用新鲜的来自患者的血液，这种血液通常是难于获得的。
当然上述所有三种方法都需要得到提供材料的患者的完全同意。
本发明的目的是提供可用于标准化遗传学测定的遗传学参考材料的替代来源。
发明概述
在以下的发明概述中，术语″人类遗传学参考序列″包括人类DNA序列，它包括至少一个遗传学变体，它在人类对象的DNA中的存在是病理状态，病理状态的倾向，或对外部刺激的有害反应的倾向的指标。所述遗传学变体包括相对人类群体中最常见的序列而言一个或多个碱基的改变，插入或缺失，并且包括单一核苷酸多态性(SNP)，突变，碱基或序列插入，或序列缺失和串联重复长度的改变。所述参考序列的特征是它的总长度至少为35个碱基，并且不超过30千碱基。对某些用途来说，参考序列的最低长度可能需要不超过100个碱基，以便允许在使用参考序列的测定中进行检测。对几乎所有用途来说，500个碱基的长度就足够了，不过，在本说明书中，有经验的读者能够通过常规实验，并且无须进一步的发明性思考方便地确定合适的长度。
本发明提供了遗传学参考标准，包括克隆至非人哺乳动物细胞系中的至少一个人类遗传学参考序列。
优选的是，所述动物细胞系是禽细胞系；更优选的是鸡(Gallusspp.)细胞系，最优选的是鸡DT40细胞系。同样最优选的是，所述禽细胞系是B-细胞系。
根据本发明的任意一个方面，将至少一个人类遗传学参考序列克隆到所述细胞基因组的非必要区。
另外，根据本发明的任意一个方面，将至少一个人类遗传学参考序列克隆到所述细胞基因组的非表达区。
另外，根据本发明的任意一个方面，所述克隆的细胞系相对人类遗传学参考序列而言是二倍体。
另外，根据本发明的任意一个方面，所述至少一个人类遗传学参考序列是多个人类遗传学参考序列。
另外，根据本发明的任意一个方面，所述或每一个人类遗传学参考序列不是功能性染色体。
还提供了在包括人类DNA的样品中检测遗传学变体的方法，包括：
在所述样品上对DNA序列进行检测；
对包括要检测的遗传学变体的参考样品进行相同的检测；
比较从所述样品和所述参考样品中获得的检测结果，以便确定所述遗传学变体的存在或缺乏；
其特征在于，所述参考样品是如本发明任意方面所述的遗传学参考标准。
下面将结合附图对本发明进行说明，其中：
附图说明
图1表示适合将人类遗传学参考序列导入合适的细胞系的导向载体。
图2表示适合将人类遗传学参考序列导入合适的细胞系的导向载体，以及由此产生的一系列细胞；和
图3表示导向载体和生产异型接合的细胞系的方案。
通过这种方法将DNA片段克隆至异源真核细胞系中，作为遗传学参考材料的中间形式。作为基因组型，所述材料应当是稳定的，并且不存在污染的风险。另外，通过不包括人类序列，所述背景DNA不太可能在人类测试方法中发生交叉反应。不需要患者血液，并且同样可以避免对致病性人类病毒的操作。
所需要的人类遗传学参考序列，可以来自具有与测试相关的基因型的患者。另外，所述序列可以从任何未受感染的个体中获得，并且进行人工修饰，以便DNA序列与突变型或罕见的形式匹配。因此，要克隆的PCR产物可以来自口腔拭子，并且，甚至不需要是来自患者体内的。另外，所述序列可来自正常的人类细胞系，并且通过工程方法导入所需要的变体。以这种方式使用来自匿名供体的细胞系，会消除征求已知供体同意的必要。另外，如果需要的人类遗传学参考序列的长度足够短，它还可以是根据对它的序列的了解合成的。
因此，人类遗传学参考材料可以通过将一个或多个DNA参考序列克隆到(异源)非哺乳动物细胞系生产。同源重组方法的采用，允许制备具有可控拷贝数量的特定人类DNA序列的细胞系。同源重组方法的使用，同样使得可以将人类DNA序列导向宿主基因组中的特定部位。
为了说明本发明的典型用途，我们考虑了本发明能够提供参考材料的很多遗传学筛选中的某一些。遗传学筛选可以为了多种目的而进行，如：
1.筛选能导致罕见疾病的突变；
2.筛选作为常见疾病诱因的DNA变体；和
3.筛选实现药物反应的DNA变体。
下面将提供以上三种类型中每一种的例子。在所引用的部分参考序列上，改变了的碱基通过使用小写字体表示。
I-导致遗传学疾病的基因突变或变体。
I(i)囊肿性纤维化
囊肿性纤维化在欧洲人群中是常见的(隐性)单基因疾病，在大约2500个出生的婴儿中会出现1例。存在多种致病性突变，不过在英国人群中，9号突变占CF突变的大约83％[DF508-75.3％；G551D-3.08％；G542X-1.68％；621+1(G＞T)-0.93％；1717-1(G＞A)-0.57％；1898+1)(G＞A)-0.46％；R117H-0.46％；N1303K 0.46％；R553X-0.46％]
DF508 DNA序列(TTT缺失)：
TCAGTTTTCCTGGATTATGCCTGGCACCATTAAAGAAAATATCATCtttGGTGTT
TCCTATGATGAATATAGATACAGAAGCGTCATCAAAGCATGCCAACTAGAAG
AGGACATCTCC
I(ii)镰状细胞贫血
镰状细胞贫血是遗传性血液疾病，主要以慢性贫血和周期性头痛为特征。镰状细胞贫血是由于β-血红蛋白基因(HBB)上的缺陷导致的常染色体隐性遗传学疾病。这种疾病在每500个美国黑人新生儿中出现大约1例，在每1000-1400个美籍西班牙新生儿中会出现1例。尽管有数百种HBB基因变体是已知的，镰状细胞贫血最常见的是通过血红蛋白变体Hb S导致的。在该变体(E6V)上，氨基酸缬氨酸取代了位于HBB多肽链的6号氨基酸位置上的谷氨酸。
NCBI SNP CLUSTER ID：rs334
ACCTCAAACAGACACCATGGTGCACCTGACTCCTGa/tGGAGAAGTCTGCCGTT
ACTGCCCTGTGGGG
I(iii)肌强直性营养不良
肌强直性营养不良是显性遗传疾病，其中，肌肉发生收缩，但是具有较弱的松弛能力。对这种疾病来说，肌肉同样会软弱并且日渐衰弱。未受感染的个体在蛋白激酶基因的3′非翻译区具有5-27个拷贝的′CTG三联体重复′。受到很小影响的肌强直性营养不良患者具有至少50个重复，而受到更严重影响的患者增加到数千个碱基对。
II造成疾病的基因变体
II(i)因子2(凝血酶原)
它是凝血酶原基因的3′非翻译区的20210号位置上的G→A的转变变异，它与较高的血浆凝血酶原水平相关，并且与较高的静脉血栓形成的风险相关。次要(A)等位基因出现的频率为大约1％，因此，所述变体的异型接合的个体出现的频率为大约2％。所述变体的同型接合的个体的出现更为罕见，频率为1∶10,000。
NCBI SNP CLUSTER ID：rsl 799963
GTTCCCAATA AAAGTGACTCTCAGCg/aAGCCTCAATGCTCCCAGTGCTATTC
II(ii)因子5
在1691号位置上的这种G→A变体，导致了从精氨酸对谷氨酰胺的氨基酸取代。同样，它与静脉血栓形成的风险相关。所述变体的异型接合的个体出现的频率为大约5％。并且所述变体的同型接合的个体出现的频率为1∶1650。
NCBI SNP CLUSTER ID：rs6025
TCTGTAAGAGCAGATCCCTGGACAGGCg/aAGGAATACAGGTATTTTGTCCTTGAAGTAA
II(iii)遗传性血色病
遗传性血色病是常见的(隐性)铁过量疾病。存在两种常见突变：C282Y和H63D。C282Y突变是由于在HFE基因的845号核苷酸上发生的G→A转变(845G→A)造成的，它产生了胱氨酸对蛋白产物的282号氨基酸位置上的酪氨酸的取代。在H63D突变中，G取代了该基因的187号核苷酸上的C(187C→G)，导致天冬氨酸取代了HFE蛋白的63号氨基酸位置上的组氨酸。所述变体的同型接合的个体或复合异型接合的个体具有出现铁过量疾病的较大的风险。在英国人群中，C282Y的等位基因频率为大约0.07，而H63D的等位基因频率为大约0.14。
H63D DNA序列：
GACCAGCTGTTCGTGTTCTATGATc/gATGAGAGTCGCCGTGTGGAGCCCCGA
C282Y DNA序列：
CCCTGGGGAAGAGCAGAGATATACGTg/aCCAGGTGGAGCACCCAGGCCTGGATCAGCC
III-影响药物反应的基因变体
III(i)硫代嘌呤S-甲基转移酶(TPMT)
TPMT基因变异会影响个体代谢硫代嘌呤药物的能力。研究业已表明，每300个个体中有一个(0.3％)具有低至缺乏水平的TPMT酶活性(同型接合的隐性)，11％具有中等水平的酶活性(异型接合的)，而89％具有正常至高水平的酶活性(同型接合的正常)。TPMT使得医生能够在开始治疗之前确定有出现硫代嘌呤类药物的急性中毒危险的患者。
业已鉴定了四种变体TPMT等位基因(TPMT*2，TPMT*3A，TPMT*3B，TPMT*3C)，它占具有低或中等TPMT活性的白种人的大约80％。TPMT*2包括位于238号核苷酸位置上的G→C取代，而TPMT*3A包括两个核苷酸转变突变(G460A和A719G)。TPMT*3B只具有G460A，而TPMT*3C只包括A719G。白种人等位基因频率为：TPMT*2-0.5％；*3A-4.5％；*3C-0.3％
这种遗传学筛选的例子，使得有技能的读者能够确定本发明的其他潜在的用途。尽管在上述例子中仅鉴定了短的序列，通过参考公开的序列数据可以方便地构建包括相同遗传学变体的较长的序列，如果这种序列在使用所述标准的任何测定中需要的话。所述遗传学变体(例如，SNP，突变，缺失，插入等)可方便地定位于人类遗传学参考序列上的任何位置，正如任何随后的测定所需要的。不过，对于某些测定来说，将所述变体定位于人类遗传学参考序列的中央是特别有利的。同样优选的是，所述人类遗传学参考序列不是功能性染色体(即不能独立于宿主基因组稳定地复制)，并且最优选的是非-着丝粒。
优选的是，可以将人类遗传学参考序列克隆到非哺乳动物真核细胞中，以便提供基因组DNA背景，它不大可能与所述遗传学检测发生交叉反应。潜在的物种包括鱼，蛙，昆虫，禽类和某些植物物种。在鱼类中，斑马鱼(Danio rerio)细胞系是特别合适的，因为有大量的遗传学技术可用于这一物种。在植物界，苔藓小立碗藓是特别有吸引力的目标，因为它具有天然的高同源重组效率(参见：Bernd R.的文章：″Homologous recombination and gene targeting in plantcells″.Int Rev Cytol.228：85-139，2003和Hohe A，Egener T，Lucht JM，Holtorf H，Reinhard C，Schween G & Reski R.的文章：″An improved and highly standardised transformation procedureallows efficient production of single and multiple targetedgene-knockouts in a moss，Physcomitrella patens.″Cun Genet.44：339-47，2004)。
可以采用提高重组频率的方法，并且对有技能的读者来说是显而易见的：其例子包括Cre/loxP系统的使用(例如，参见Koike H，Horie K，Fukuyama H，Kondoh G，Nagata S & TakedaJ.″Efficientbiallelic mutagenesis withCre/loxP-mediatedinter-chromosomal recombination″，EMBO Rep.3：433-7，2002；和Bode J，Schlake T，Iber M，Schubeler D，Seibler J，SnezhkovE & Nikolaev L.″Thetransgeneticist′s toolbox：novel methods forthe targeted modification of eukaryotic genome s″Biol Chem.381：801-13，2000)，以及诸如PARP抑制剂的化合物(Semionov A，Cournoyer D & Chow TY.″1，5-isoquinolinediol increases thefrequency of gene targeting by homologous recombination inmouse fibroblasts″，Biochem Cell Biol.81：17-24，2003)。
禽细胞系同样特别适用于这一目的，因为它的基因组DNA明显不同于人类的。在所述细胞系中，来自鸡(Gallus spp.)的细胞系是特别有利的异源宿主，因为这不仅因为鸡基因组DNA明显不同于人类的，而且还因为具有类似的大小(对于鸡来说大约为1.2千兆碱基，与它相比对于人来说为3.2千兆碱基)。
鸡B-细胞系DT40(Ba ba等，Virology 144：139-151，1985)是用于这一目的的特别有效的细胞系，因为它是高重组效率的，并且缺乏与随机整合相关的多整合拷贝和不稳定性的可能性。同样存在有关DT40的遗传学操作技术的大量现有文献。通过细胞重组机制，可以将一个DNA分子整合到特定位置，例如，通过使用导向臂。将在下面的实施方案中对所述技术进行说明。
为了模拟在来自人类患者的样品中可能遇到的情况，可以根据需要生产同型接合体和异形接合体。
为了便于构建多种操作的细胞系用于不同的遗传学检测，可以根据本文披露的方法构建单一的导向构建体，它可用于所有需要的DNA片段。另外，可以将具有相同的导向臂，但是具有不同的抗生素抗性基因的一对构建体(参见下文)用于生产异形接合体。最后，通过使用多重组位点，可以生产携带多个参考片段的一个细胞系。这一方法可以通过使用突变的LoxP位点实现，以便能够再利用抗生素抗性标记。
用于设计导向载体的方法是本领域的读者所公知的，并且，提供了以下材料作为参考：
Vasquez KM，Marburger K，Intody Z & Wilson JH.(2001)Manipulating the mammalian genome by homologous recombination.Proc Natl Acad Sci USA.98：8403-10.
Muller U.(1999)Ten years of gene targeting：targeted mousemutants，from vector design to phenotype analysis.Mech Dev.82：3-21.
Dickinson P，Kimber WL，Kilanowski FM，Stevenson BJ，PorteousDJ & Dorin JR.(1993)High frequency gene targeting usinginsertional vectors.Hum Mol Genet.2：1299-302.
Morrow B，Kucherlapati R.(1993)Gene targeting in mammaliancells by homologous recombination.Curr Opin Biotechnol.4：577-82.
Willnow TE & Herz J.(1994)Homologous recombination forgene replacement in mouse cell lines.Methods Cell Biol.1994；43 Pt A：305-34.
Bronson SK，Plaehn EG，Kluckman KD，Hagaman JR，Maeda N &SmithiesO.(1996)Single-copy transgenic mice with chosen-siteintegration.Proc Natl Acad Sci USA.93：9067-72.
JacenkoO.(1997)Strategies in generating transgenicmammals.Methods Mol Biol.62：399-424.
下面将说明本发明的实施方案。在这些实施例中，载体构建是通过使用基于体外技术的限制性内切核酸酶进行的，不过，还可以采用与所述方案不同的方法构建所述载体，并且通过大肠杆菌或酵母同源重组系统将人类序列插入载体。
实施方案1
本实施方案说明了本发明能够通过将人类遗传学参考序列插入鸡DT40细胞系基因组的非必要区制备遗传学参考标准的方法。
图1示意性地表示可用于实现本发明的导向载体。该载体，总体上用1表示，包括pBluescript序列2，它被用于构建导向质粒的细菌阶段，左侧导向臂3，被用作参考材料的人类DNA片段4，抗生素抗性基因5和右侧导向臂6。所述导向臂携带有用于同源重组的鸡DNA序列，使得所述人序列和抗生素抗性基因能够整合到DT40基因组的特定位点。抗生素抗性基因5的旁侧可以是突变型LoxP位点7，8。在图1所示例子中，存在LoxP RE变体7和LoxP LE变体8。所述LoxP位点使得能够通过利用酶CRE重组酶除掉抗生素抗性基因，一旦所述载体整合到鸡基因组中的话，这种技术由Arakawa等披露，BMC Biotechnology 2001，1：7。使突变型LoxP位点位于抗生素抗性基因旁侧使得随后能够除掉抗生素抗性基因，有利于所述抗生素选择标记在修饰过的细胞系中任何进一步的基因导向事件中再利用。导向载体还具有独特的限制酶位点9，使得该载体可以通过限制酶裂解线性化，然后通过电泳将它导入宿主DT40细胞系。其他转染方法对于本领域的读者来说是显而易见的。
通常，每一个导向臂3，6的大小为2-5千碱基。在人类DNA中，所述人类DNA片段的大小通常为1千碱基，并且所述变体碱基位于所述片段的中央。
在本实施例中，人类遗传学参考序列4被插入DT40基因组的非必要区。合适的非必要区是编码非组蛋白染色体蛋白的高迁移性A型(HMGA)家族的基因，它是由两个相关的基因HMGA1和HMGA2编码的。Beitzel和Bushman业已证实(″Construction and analysis ofcells lacking the HMGA gene family.″NucleicAcids Res.2003 Sep1：31(17)：5025-32.)，HMGA基因家族对于在DT40细胞中的生长来说不是必要的。在缺失了HMGA1或HMGA2中的一个或两个之后，它们在大约4,000个鸡基因中没有发现显著的活性变化。它们得出的结论是，HMGA不是DT40细胞中生长控制所必需的。因此，DT40基因组的该区是适合插入人类遗传学参考序列4的目标。通过参考所述文献或序列数据库，本领域的读者可以方便地发现其他结论(例如，参见Li Y，Strahler JR，Dodgson JB.″Neither HMG-14a norHMG-17gene function is required for growth of chiken DT40 cellsor maintenance of DNaseI-hypersensitive sites.″Nucleic AcidsRes.1997 Jan 15；25(2)：283-8)。
因此，可以通过参考公开的HMGA基因家族的序列构建所述左侧导向臂3和右侧导向臂6。因此，可以利用业已建立的pBluescript构建体，通过所述导向臂3和6以及人类遗传学参考序列4构建质粒14。合适的抗生素抗性标记5对于有技能的读者来说是显而易见的，并且包括，例如新霉素，嘌呤霉素或Plasticidin。所述抗生素抗性基因可以由鸡B-肌动蛋白启动子启动。构建所述质粒的详细方案在本领域的读者阅读本说明书之后可以马上了解。
在构建质粒1之后，本领域的读者能够方便地转化宿主DT40细胞，例如，通过用对限制位点9专一的限制酶使质粒1线性化，并且将线性化的构建体导入DT40，例如通过电穿孔。
实施方案2
该实施方案证实了如何将本发明用于制备双等位基因的遗传学参考标准。
图2表示细胞系构建方法中的第一部分。所示出的质粒14包括pBluescript序列2，左侧导向臂3和右侧导向臂6，以及具有合适启动子的抗生素抗性标记15。所述质粒还具有突变型LoxP位点7和8。构成所述等位基因之一的第一个人类遗传学参考序列用16表示。
要在第一个步骤中转化的宿主DT40细胞用11表示，在克隆位点上示出了两个天然的鸡DNA等位基因12和13。
在将质粒14导入宿主细胞11之后进行的重组之后，可能出现三种细胞类型。细胞类型17表示包括整合的人类遗传学参考序列16和其旁侧为两个突变型LoxP位点7和8的抗生素抗性标记15的半合子。还可以有人类遗传学参考序列16，抗生素抗性标记15和两个突变型LoxP位点7和8纯合的细胞18。最后，存在没有转化过的细胞群体19。
可以通过用合适的抗生素筛选消除未转化过的细胞19，留下半合子17和同型接合体18的混合的群体。还可能存在包括额外拷贝的通过随机整合由质粒产生的遗传学材料(即不是在目标位点上)的某些细胞(未示出)。例如，有技能的读者通过使用稀释技术或流式细胞计辅助的细胞分选用该混合培养物方便地生产克隆的亚群体。(如果需要使用流式细胞计生产克隆的亚群体的话，然后可以将编码绿色荧光蛋白-或类似荧光蛋白的基因-方便地结合在所述导向构建体的一端，以便它被固定，并且在随机整合体中表达，但是从目标整合体中消除，以便可以通过荧光辅助的细胞分选分离需要的细胞)。例如，所述克隆的细胞系随后可以利用PCR和Southern印迹方法筛选，以便选择人类遗传学参考序列16半纯合的细胞系17。
然后将这种半纯合的细胞系17用作所述方法第二阶段的宿主，如图3所示。将第二种质粒20用于该方法的这一阶段。它同样可以包括pBluescript因子2，左侧和右侧导向臂3和6，以及独特的限制位点9。所述第二质粒20还包括第二种抗生素抗性标记21，它与图2中所示的第一种标记15不同。第二种标记21的旁侧同样是突变型LoxP位点7和8。在第二个质粒20上包括第二个人类遗传学参考序列22。它可以与用于制备同型接合的细胞系的第一阶段的参考序列相同，或者可以是没有SNP的人类遗传学参考序列，以便制备异型接合的标准。
使用半纯合的细胞系17作为原始宿主，可以用第二种质粒20按前面所述方法进行重组。由此得到的主要的细胞类型是异形接合体23，它包括抗生素抗性标记15，21和人类遗传学参考序列16和22。对于第二种标记21和序列22来说的同型接合体24，其中，所述序列业已取代了在第一阶段插入的序列。同样存在是半纯合体17的细胞，即在第二阶段没有发生重组。这可能通过抗生素的存在进行选择。可以通过使用两种抗生素选择标记选择异型接合的细胞23。然后可以通过使用Cre重组酶将抗性标记15和21从异型接合的细胞23上去掉，以便产生遗传学参考标准细胞24，它仅包括两个参考序列和非-突变型LoxP位点25。
将在以下权利要求书对本发明进行说明，其中，术语″人类遗传学参考序列″包括人类DNA序列，它包括至少一个遗传学变体，它在人类对象的DNA中的存在，是病理状态，病理状态的倾向，或对外部刺激的不利反应的倾向的指标。所述遗传学变体还可以是患者有可能对治疗干预作出反应的指标，即，用于药物基因组学分析的变体。所述变体包括相对人类群体中最常见的序列而言一个或多个碱基的改变，插入，或缺失，并且包括单一核苷酸多态性(SNP)，突变，碱基或序列插入，碱基或序列缺失，以及串联重复长度的改变。在本发明的一种实施方案中，当所述标准被用作对照时，″变体″本身可以包括所述最常见的序列。所述参考序列的特征是它的总长度至少为35个碱基，并且不超过30千碱基。对某些用途来说，参考序列的最小长度可能需要超过100个碱基，以便能够在使用所述参考序列的分析中检测。500个碱基的长度对于几乎所有用途来说都足够了，不过，在本说明书披露的范围内，本领域的读者可通过常规实验，而无需进一步的发明性思考方便地确定合适的长度。
Claims (11)
1.一种遗传学参考标准，包括克隆在非人哺乳动物细胞系中的至少一个人类遗传学参考序列。
2.如权利要求1的遗传学参考标准，其中，所述动物细胞系是禽细胞系。
3.如权利要求2的遗传学参考标准，其中，所述细胞系是鸡细胞系。
4.如上述权利要求中任意一项的遗传学参考标准，其中，细胞系是B-细胞系。
5.如权利要求3的遗传学参考标准，其中，所述鸡细胞系是鸡DT40细胞系。
6.如上述权利要求中任意一项的遗传学参考标准，其中，将所述至少一个人类遗传学参考序列克隆到所述细胞基因组的非必要区。
7.如上述权利要求中任意一项的遗传学参考标准，其中，将所述至少一个人类遗传学参考序列克隆到所述细胞基因组的非表达区。
8.如上述权利要求中任意一项的遗传学参考标准，其中，所述克隆的细胞系相对人类遗传学参考序列而言是二倍体。
9.如上述权利要求中任意一项的遗传学参考标准，其中，所述至少一个人类遗传学参考序列是多个人类遗传学参考序列。
10.如上述权利要求中任意一项的遗传学参考标准，其中，所述或每一个人类遗传学参考序列不是功能性染色体。
11.一种在含有人类DNA的样品中检测遗传学变体的方法，包括：
对所述样品进行对DNA序列有反应的检测；
对包含了要检测的遗传学变体的参考样品进行相同的检测；
比较从所述样品和所述参考样品获得的检测结果，以便确定所述遗传学变体的存在或缺乏；
其特征在于，所述参考样品是如上述权利要求中任意一项的遗传学参考标准。
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