CN1865929A - 乙酰胆碱酯酶抑制剂筛选方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种乙酰胆碱酯酶抑制剂的筛选方法和应用,该方法系电泳介导的微分析技术,在毛细管中用酶催化水解底物的一步反应,然后在紫外230nm处直接测定产物峰面积实现酶活的测定和酶抑制剂的筛选方法;该方法不仅具有快速简便、重复性好、试剂消耗少、准确性高,而且,适用于乙酰胆碱酯酶酶抑制剂的筛选和分析,尤其适用于如中药粗提液等混合化合物样品中乙酰胆碱酯酶酶抑制剂的筛选和临床快速诊断与乙酰胆碱酯酶相关的疾病。
Description
技术领域
本发明属于酶抑制剂筛选方法,特别涉及的是乙酰胆碱酯酶抑制剂的筛选方法和应用,可以用于药物或包括杀虫剂等在内的农药的高通量筛选、临床诊断等方面。
背景技术
阿尔茨海默病(AD)是一种多发生于老年人中的神经退化疾病,俗称老年性痴呆病。随着人口的不断老龄化,AD成为了威胁老年人身体健康的主要疾病之一。由于该病的关键性症状为神经化学递质乙酰胆碱的合成量减少,故乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制剂如他克林、安理申、利伐斯狄明及加兰它敏等是目前临床上常用的用于改善AD患者认知障碍的药物。但是由于此类药物所具有的副作用很大程度上限制了它们的应用,因此研发具有更好疗效且副作用小的新药用于AD的治疗受到了广泛关注。此外,目前常用的氨基甲酸酯类杀虫剂以及基于有机磷的农业化学品也属于乙酰胆碱酯酶的抑制剂。由此可见,建立高效、快速及低成本的乙酰胆碱酯酶抑制剂筛选方法对于包括药物或杀虫剂等农药在内的新药的研制是非常重要的。
目前,该酶抑制剂的筛选方法有,Ellman等人提出的紫外分光光度法测定乙酰胆碱酯酶的活性,即文献1:Ellman,G.L.,Courtney,K.D.,Andres J.V.,Featherstone,R.M.,Biochem.Pharmacol.1961,7,88-95.该方法通过在412nm处测定由Ellman试剂即5,5’-二硫双(2-硝基苯甲酸)与硫代胆碱(AChE催化底物硫代乙酰胆碱所得产物)反应生成的黄色化合物5-硫-2-硝基苯甲酸,进而间接实现对乙酰胆碱酯酶的活性测定。但是将其运用于酶抑制剂筛选时,往往会因待筛选化合物表现出的对Ellman试剂与硫代胆碱反应的抑制作用而导致假阳性结果的出现。于是文献2:Rhee,I.K.,Appels,N.,Luijendijk,T.,Irth,H.,Verpoorte,R.,Phytochem.Anal.2003,14,145-149.采用荧光法对AChE酶活进行测定并用于该酶抑制剂的筛选,不仅提供了一种新的AChE酶抑制剂筛选方法,同时也提高了分析的灵敏度。此外,分离分析的方法如薄层色谱(文献3:Kiely,J.S.,Moos,W.H.,Pavia,M.R.,Schwarz,R.D.,Woodard,G.L.,Anal.Biochem.1991,196,439-442.)、高效液相色谱(文献4:Ingkaninan,K.,de Best,C.M.,van der Heijden,R.,Hofte,A.J.P.,Karabatak,B.,Irth,H.,Tjaden,U.R.,vna der Greef,J.,Verpoorte,R.,J.Chromatogr.A 2000,872,61-73.)等与Ellman方法相结合也被报道用于AChE抑制剂的筛选。但无论是Ellman方法还是荧光法,都是通过两步或两步以上的衍生反应间接实现AChE活性的测定,同时因为衍生试剂的使用很大程度上增加了假阳性筛选结果的出现。
电泳介导的微分析技术(简称EMMA技术)是由Bao和Regnier于1992年首先提出的,即文献5:Bao,J.,Regnier,F.E.,J.Chromatogr.1992,608,217-224.报道了利用该技术在线测定6-磷酸葡萄糖脱氢酶的活性,即先将底物和酶溶液依次导入毛细管一端,形成两个区带;当加上一定电压后,酶和底物的溶液区带因其迁移速度不同而发生混合,孵育一段时间使其发生反应并生成产物;然后再加上一定的电压,使得产物、酶及底物根据各自不同的电泳淌度而实现分离。该方法将毛细管电泳精确的纳升级溶液的操作性能和高效快速的分离及检测技术相结合,具有样品消耗量少、分析结果准确、分析速度快、易于自动化等优点;故特别适用于体积微量的酶的活性测定和酶性质的研究,酶的活性可方便地从反应后所生成的产物和剩余底物的量直接读出。目前尚无采用EMMA技术进行乙酰胆碱酯酶的活性测定和抑制剂筛选的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种乙酰胆碱酯酶抑制剂的快速筛选方法。即利用该酶催化水解底物的一步反应,运用电泳介导的微分析技术在紫外230nm处直接测定产物峰面积实现酶活的测定和酶抑制剂的筛选。
本发明的又一目的是应用上述方法,快速、准确的确定抑制剂化合物的半数抑制浓度即IC50值及抑制常数Ki值,从而为包括药物或杀虫剂等农药在内的新药的开发提供先导化合物。同时还可将本发明用于涉及乙酰胆碱酯酶的临床诊断中。
本发明中所述的酶主要为乙酰胆碱酯酶(AChE),但由于丁基胆碱酯酶在酶作用底物及酶反应的机理上都与乙酰胆碱酯酶相似,故本发明同样适用于丁基胆碱酯酶的酶活测定和抑制剂筛选。
本发明中所述的AChE底物可以为各类硫代胆碱类化合物,如硫代乙酰胆碱(AThCh)、硫代丙酰胆碱,硫代丁基胆碱等。
本发明中所述的电泳介导的微分析技术属于毛细管电泳技术的一种模式,所用的仪器设备为毛细管电泳仪,推荐采用安捷伦毛细管电泳仪。
所述的毛细管柱总长是20-100cm,柱内径为25-100μm。优选长度30-80cm,内径25-75μm。
本发明的酶活测定和抑制剂筛选通过如下步骤来实现,其示意图如图1所示:1)将酶溶液和底物溶液分别以1-100纳升体积依次导入毛细管一端,所述的底物溶液可以含或不含待筛选化合物,可测的酶的浓度范围为0-5mg/mL,推荐酶的浓度范围为0.1-1mg/mL,底物的浓度范围为0-200mM;为了提高酶活性,底物溶液中可以含有无机镁离子的盐,通常为硫酸镁或氯化镁,浓度为0-100mM;2)加上一定的电压使两者混合,通常电压为1千伏至30千伏,混合时间一般为1-300秒;之后断开电压,使酶和底物反应一定时间,一般为0-2小时;3)再加上一定的电压使酶、未反应底物及产物根据其电泳淌度的不同来实现分离,通常电压为1千伏至30千伏。酶活用230nm处产物的峰面积表示。待筛选化合物可根据产物峰面积的变化来判定其是否具有抑制酶的活性。通常电泳分离采用pH为2-12的缓冲液,最好采用pH为6-9的缓冲液,其浓度为10-300mmol/L,所用的缓冲液可以为硼酸盐、磷酸盐、三(羟甲基)氨基甲烷及N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸等和磷酸、硼酸或盐酸的缓冲液。。
本发明可用于酶抑制作用的研究。通过在不同底物浓度、不同抑制剂浓度条件下分别测反应产物的量,得到相应的米氏曲线和Lineweaver-Burk曲线,从而求得抑制常数Ki。而抑制作用百分比可根据式(1)来计算得到:
方程式(1)中x为抑制剂存在时所测得的产物的量,blank为没有抑制剂时反应所生成的产物的量。将抑制剂的浓度与抑制作用百分比作图就可得到抑制剂对酶的抑制曲线,抑制剂的半数抑制浓度(IC50)即可通过抑制曲线中当抑制作用百分比为50%时所对应的抑制剂浓度求得。
将本发明运用于中药粗提液中乙酰胆碱酯酶抑制剂的筛选。首先用已知的酶抑制剂对方法的可行性进行验证,再将待筛选的中药粗提液加入底物溶液中进行酶抑制剂的筛选。由于本发明具有毛细管电泳高的分离选择性的优点,因此在进行混合化合物样品如中药粗提液的筛选时,可以有效的消除由于样品基质或各化合物组分对检测带来的干扰。此外,与毛细管阵列电泳仪相结合,本发明很容易实现酶抑制剂筛选的高通量。
本发明还可以进行其它有关乙酰胆碱酯酶方面的应用。如在基于有机磷的农业化学品或氨基甲酸酯类杀虫剂所致的中毒病例中,可运用本发明快速的检测乙酰胆碱酯酶的活性变化,以此作为临床诊断的有利依据。此外,也可通过本发明测定血清中胆碱酯酶的活性是否提高作为临床诊断肾病综合症的依据之一。本发明的积极效果及优点:
1)方法简便,只需酶催化水解底物的一步反应就可完成酶活的测定,从而避免了传统方法中因使用Ellman试剂等衍生试剂而出现的假阳性结果。
2)毛细管电泳的高分离选择性消除了由于复杂样品基质对于活性物质检测带来的干扰,故特别适用于混合化合物样品(如中药粗提液)的酶抑制剂筛选。
3)方法稳定可靠,天内、天与天之间酶活重复性良好。
4)分析速度快(酶和底物经过15秒的在线混合及1.5分钟的分离过程便可实现乙酰胆碱酯酶活性的测定及抑制剂的筛选)
5)样品及试剂消耗少(实验中使用的毛细管柱内径为50μm,其用样量只有几个纳升。)
附图说明
图1.电泳介导的微分析技术的示意图
图2.底物溶液中硫酸镁浓度对酶活的影响
图3.混合时间对酶反应产率的影响
图4.反应时间对酶反应产率的影响
图5.他克林的抑制曲线(1)和Lineweaver-Burk曲线(2)
图6.安理申的抑制曲线
图7.石杉碱甲的抑制曲线
附图中mM表示毫摩尔/升,μM表示微摩尔/升,v表示酶反应速度,[AThCh]表示底物浓度。
具体实施方式
通过下述实施例将有助于理解本发明,但并不限制本发明的内容。
实例以硫代乙酰胆碱作为乙酰胆碱酯酶的作用底物,进行酶反应条件的优化、酶活的测定、酶抑制作用研究及酶抑制剂的筛选。此外,本发明也可应用于涉及乙酰胆碱酯酶的临床诊断中。
实施例1 筛选方法的建立
1.首先对毛细管壁用0.1mol/L氢氧化钠预处理5分钟,接着用去离子水、背景电解质(30mM硼砂,pH=8)分别冲洗2分钟、3分钟,其中背景电解质的配制过程如下:称取1.441g硼砂固体,用去离子水使之溶解,再用0.1mol/L磷酸调pH,在pH计监测下将pH调至8,接着用容量瓶定容至100mL;之后将0.4mg/mL AChE溶液及含20mM硫酸镁的10mM底物溶液分别以20mbar*4sec压力进样导入毛细管进口端,形成两个明显的溶液区带;在毛细管两端加上电压1kV使酶和底物混合,混合时间为15秒,反应温度为37℃;再在毛细管两端加上15kV的电压以实现各反应物的分离,最终根据230nm处所测得的产物硫代胆碱(TCh)的峰面积实现对酶活的直接测定。对于酶抑制剂的筛选,只需将各待筛选化合物加入到底物溶液中,运用上述相同的方法测定相应的产物峰面积,通过与空白值(即不含待筛选化合物的底物样品溶液所测得的产物峰面积)对照,来判定待筛选化合物是否具有抑制酶的活性。乙酰胆碱酯酶催化水解硫代乙酰胆碱的反应方程式如下:
Acetylthiocholine(AThCh) Acetic Acid Thiocholine(TCh)
其中,Acetic Acid表示醋酸,Thiocholine(TCh)表示硫代胆碱。
2.酶反应条件的优化及酶活重现性考察:对于上述1的筛选方法,分别考察了底物溶液中硫酸镁浓度、混合时间和反应时间对酶活的影响,最终在优化所得的最佳条件下对酶活进行重现性考察。
由于乙酰胆碱酯酶为镁离子依赖型的水解酶,因此底物溶液中硫酸镁浓度对酶活有着很大的影响,见图2,横坐标为底物溶液中硫酸镁的浓度,纵坐标为酶活(产物峰面积);底物浓度为10mM;酶浓度为0.4mg/mL;混合时间为15sec;反应时间为0min;其电泳条件为:缓冲液为30mM硼砂,压力进样,20mbar*4sec,电压15kV,电流60μA,检测波长230nm,柱温37℃,毛细管柱总长34.5cm,有效长度26cm,柱内径50μm。由图可知,一定浓度范围内AChE活性随着底物溶液中硫酸镁浓度的提高而提高,但由于过高浓度的硫酸镁反而使酶活降低,故实验中将硫酸镁浓度定为20mM。图3为混合时间对酶反应产率的影响,其横坐标为混合时间,纵坐标为酶活(产物峰面积);底物浓度为含20mM硫酸镁的10mM;酶浓度为0.4mg/mL;反应时间为0min;电泳条件同图2。从图中可以看出,酶活在混合时间为15sec时可达到最高的水平,因此之后的实验中将混合时间定为15sec。图4为反应时间对酶反应产率的影响,其横坐标为反应时间,纵坐标为酶活(产物峰面积);底物浓度为含20mM硫酸镁的10mM;酶浓度为0.4mg/mL;混合时间为15sec;电泳条件同图2。从图中可以看出,AChE酶活在反应时间为1min时就可达到较高的水平;而当反应时间为0min时,由于加电压的混合过程也可使酶活达到最高值的80%,这样的酶活水平已经足够进行酶抑制剂的筛选,因此,后面的实验均省去了混合后反应物的孵育过程,即反应时间为0min。
经过上述反应条件的优化,在所得最佳条件下对AChE酶活重现性进行考察,如表1所示,其中底物浓度为含20mM硫酸镁的10mM;酶浓度为0.4mg/mL;混合时间为15sec;反应时间为0min;电泳条件同图2。由表可知,本发明测得产物TCh的校正峰面积及迁移时间在天内、天与天之间都表现出良好的重现性,从而也说明了本方法具有一定的可靠性和良好的重现性。
表1.酶活重现行考察
参数 | RSD% |
天内重复性(n=6)TCh的校正峰面积TCh的迁移时间天与天的重复性(n=6)TCh的校正峰面积TCh的迁移时间 | 1.2%0.2%2.5%1.9% |
实施例2已知的AChE抑制剂他克林的IC50和Ki值的测定
运用实施例1的筛选方法,在不同他克林浓度下对AChE酶活进行测定,得到如图5-(1)所示的抑制曲线,其横坐标为他克林的浓度,纵坐标为抑制作用百分比,底物浓度为含20mM硫酸镁的10mM;酶浓度为0.4mg/mL;反应时间为0min;混合时间为15sec;电泳条件同图2。根据所得抑制曲线即可知他克林的IC50为0.83μM。又在不同底物浓度及不同抑制剂浓度下进行酶活测定,得到如图5-(2)所示的Lineweaver-Burk曲线。他克林浓度分别为(■)0μM;(○)5μM;(▲)10μM,底物浓度为含20mM硫酸镁的0-30mM;酶浓度为0.4mg/mL;反应时间为0min;混合时间为15sec;电泳条件同图2。由此可得,他克林的Ki为9μM。
实施例3已知AChE抑制剂安理申的IC50值测定
运用实施例1的筛选方法,配制含不同安理申浓度的底物样品溶液,并分别对酶活进行测定,得到如图6所示的抑制曲线,其横坐标为安理申的浓度,纵坐标为抑制作用百分比,底物浓度为含20mM氯化镁的10mM;酶浓度为0.4mg/mL;反应时间为0min;混合时间为15sec;电泳条件同图2。根据所得抑制曲线即可知安理申的IC50为1.9μM。
实施例4已知的AChE抑制剂石杉碱甲的IC50值测定
运用实施例1的筛选方法,配制含不同石杉碱甲浓度的底物样品溶液,并分别对酶活进行测定,得到如图7所示的抑制曲线,其横坐标为石杉碱甲的浓度,纵坐标为抑制作用百分比,底物浓度为10mM(其中含20mM硫酸镁);酶浓度为0.4mg/mL;反应时间为0min;混合时间为15sec;电泳条件同图2。根据所得抑制曲线即可知石杉碱甲的IC50为0.76μM
实施例5中药粗提液中乙酰胆碱酯酶抑制剂的筛选
运用实施例1的筛选方法,筛选了如表2所列的4个已知乙酰胆碱酯酶抑制剂及32个中药粗提液的化合物样品,实验测得在一定化合物浓度下的抑制作用百分比见表2。其中底物浓度为10mM(其中含20mM硫酸镁);酶浓度为0.4mg/mL;混合时间为15sec;反应时间为0min;电泳条件同图2。通过筛选,化合物库中黄柏和黄连粗提液在0.5mg/mL浓度下对AChE均有不同程度的抑制作用。又据文献报道,黄柏和黄连粗提液的主要成分小檗碱对AChE有抑制活性,且其IC50为0.98μM。由此证实了本发明可用于识别中药粗提液中有抑制活性的化合物组分。
表2.用于酶抑制剂筛选的化合物及其在一定浓度下的抑制百分比
化合物名称 | 抑制百分比(%) | 化合物名称 | 抑制百分比(%) |
小檗碱*皂刺黄柏安理申*红花金银花枳壳枳实山楂连翘栀子五味子白花蛇舌草半支莲泽兰石杉碱甲*降香当归 | 9.4055.174.10000000000075.000 | 刺五加大黄黄芪红参三七麦冬赤芍丹参黄芩桂枝石菖蒲川芎黄连莪术金荞麦薏苡仁枣仁他克林* | 00000000000081.4000087.0 |
*为已知的AChE抑制剂,浓度为10μM;中药粗提液的浓度为0.5mg/mL. |
实施例7其它涉及乙酰胆碱酯酶的应用
运用实施例1的筛选方法对乙酰胆碱酯酶的性质及活性进行研究,通过测定所得乙酰胆碱酯酶的活性高低,可用于临床诊断与该酶相关的疾病。表3列出了部分与乙酰胆碱酯酶活性相关的疾病及相应的乙酰胆碱酯酶活性变化。
表3.乙酰胆碱酯酶活性变化及相关的疾病
相关的疾病名称 | 乙酰胆碱酯酶活性变化(与正常值相比) |
慢性肝实质如肝硬化和慢性肝炎有机磷农业化学品或氨基甲酸酯类杀虫剂所致的中毒肾病综合症阿尔茨海默病 | 活性降低活性急剧降低活性显著升高活性升高 |
Claims (9)
1,一种乙酰胆碱酯酶抑制剂的筛选方法,其特征是采用电泳介导的微分析技术,在毛细管中用酶催化水解底物的一步反应,然后在紫外230nm处直接测定产物峰面积实现酶活的测定和酶抑制剂的筛选方法;
所述的酶为乙酰胆碱酯酶或丁基胆碱酯酶;
所述的底物为硫代乙酰胆碱、硫代丙酰胆碱或硫代丁基胆碱。
2,如权利要求1所述的一种乙酰胆碱酯酶抑制剂的筛选方法,其特征是
1)将酶溶液和底物溶液分别以1-100纳升体积依次导入经过缓冲液处理过的毛细管,所述的酶的浓度范围为0-5mg/mL,底物的浓度范围为0-200mM,所述的底物溶液含或不含待筛选化合物、并含有浓度为0-100mM的无机镁盐,通常为硫酸镁或氯化镁;
2)在1千伏至30千伏下使两者混合1-300秒;
3)断开电压,使酶和底物反应0-1小时;
4)再加上1千伏至30千伏电压进行电泳分离;酶活用230nm处产物的峰面积表示;
所述的缓冲液pH为2-12的缓冲液。
3,如权利要求2所述的一种乙酰胆碱酯酶抑制剂的筛选方法,其特征是所述的缓冲液是pH为6-9的缓冲液。
4,如权利要求2所述的一种乙酰胆碱酯酶抑制剂的筛选方法,其特征是所述的缓冲液是采用硼酸盐、磷酸盐、三(羟甲基)氨基甲烷或N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸,和磷酸、硼酸或盐酸的缓冲液。
5,如权利要求2所述的一种乙酰胆碱酯酶抑制剂的筛选方法,其特征是所述的盐的浓度为10-300mmol/L。
6,如权利要求2所述的一种乙酰胆碱酯酶抑制剂的筛选方法,其特征是所述的酶的浓度范围为0.1-1mg/mL。
7,如权利要求1或2所述的一种乙酰胆碱酯酶抑制剂的筛选方法的应用,其特征是用于乙酰胆碱酯酶酶抑制剂的筛选。
8,如权利要求7所述的一种乙酰胆碱酯酶抑制剂的筛选方法的应用,其特征是用于中药粗提液中乙酰胆碱酯酶抑制剂的筛选。
9,如权利要求7所述的一种乙酰胆碱酯酶抑制剂的筛选方法的应用,其特征是用于临床诊断与乙酰胆碱酯酶相关的疾病。
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