CN1834232A - 一种甲烷氧化混合菌的培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种甲烷氧化混合菌的培养方法。该方法是在甲烷氧化混合菌常规培养方法的基础上，在培养基中添加石蜡油。在用本发明的方法对甲烷氧化混合菌进行振荡培养过程中，石蜡油受到机械力的作用形成微小的分散液滴，这些液滴可以提高甲烷的溶解度，而且由于其与菌体细胞的亲和性，细胞可以在水相和有机相之间穿梭，强化了微生物利用甲烷的速度。与常规培养方法相比，本发明方法可以极大程度的提高甲烷氧化混合菌的生长速度和细胞密度，且培养方法简单，具有较高的工业化应用可行性。基于上述优点，本发明将在甲烷氧化菌及其相关产品的工业化生产中发挥巨大作用，应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明涉及微生物的培养方法，特别是涉及一种甲烷氧化混合菌的快速、高密度培养方法。
背景技术
甲烷氧化菌是自然界中一类特殊的微生物，它以甲烷为唯一碳源及能源。虽然某些甲烷氧化菌也可以同时利用甲醇，但所有的甲烷氧化菌都不能利用多碳化合物。甲烷氧化菌不但在全球甲烷温室气体控制方面起到重要作用，而且在水陆生态环境的元素循环中也发挥着不可忽视的作用。甲烷氧化菌以其多样的催化功能，在大宗化学品生产、新功能酶开发、瓦斯气体的安全预警、应急技术开发以及环境污染物的生物修复方面都具有极大的应用潜力。
纯培养是从自然界人工筛选单一微生物种，自然界存在的绝大多数微生物种群由于无法在人工环境中生存，因而无法在此过程获得。对于甲烷氧化菌的筛选和培养，目前仍然以纯培养为主，这不仅导致甲烷氧化菌纯培养生长极为缓慢，还会遗漏掉自然环境中存在的大量相关微生物的甲烷转化能力的开发应用。甲烷氧化混合菌是以甲烷氧化菌为主体的不同共生菌体的组合，具有下述纯菌所不具有的优势：1)以甲烷为唯一碳源的生理性能稳定；2)生长速度较快；3)可有效避免杂菌的污染；4)g服了单一菌种难以转化多种化合物的缺陷。甲烷氧化混合菌中的甲烷氧化菌是启动甲烷转化的主体微生物，使得底物转化为更适合于其他非甲烷氧化菌进一步转化利用的中间产物，因此可以形成利用甲烷的稳定微生物生态系，有利于其工业应用。研究表明，混合微生物培养法是处理复杂环境污染的最有效、最具前途的方法。因为许多复杂的物质降解必须借助于两种或两种以上的微生物种群的协同作用才能高效、彻底完成。
甲烷氧化菌利用甲烷的第一步是在甲烷单加氧酶(Methane monooxygenase，MMO)的作用下将甲烷直接转化为甲醇。甲烷单加氧酶是生物体系中唯一能够在常温常压下选择性氧化甲烷生成甲醇的酶系，具有转化效率高，选择性好的优点(Richard S.Hanson，Thomas E.Hanxon.Methanotrophic Bacteria.Microbiological Reviews.1996(60)：439-471)。利用含MMO的甲烷氧化菌不仅可以将甲烷部分氧化成中间代谢产物甲醇，进一步转化成二氧化碳，还可以催化C1-C20烷烃化合物羟基化和C2-C10烯烃化合物的环氧化。甲烷氧化菌的MMO还具有氧化三氯甲烷、三氯乙烯、二氯甲烷等卤代烃类化合物的特性，在难降解的有机化合物的污染治理方面应用前景广阔。目前，国外在利用甲烷氧化菌治理三氯乙烯的污染方面进行了应用(Laurence H.Smith，Peter K.Kitanidis，Perry L.M cCarty.Numerical Modeling and Uncertiantiesin Rate Coefficients for Methane Utilization and TCE Cometabolism by aMethane-Oxidizing Mixed Cuture.Biotechnol Bioeng 1997(53)：320-331.)。此外，甲烷氧化菌由于可以“吃掉”甲烷，对于煤矿和气田的瓦斯气体泄漏的处理也具有重要的应用价值。由于甲烷单加氧酶氧化甲烷生成甲醇的过程需要NADH，因此该酶价格昂贵，此外该酶的体外再生技术不成熟，纯化过程复杂，稳定性差，使得利用含MMO的甲烷氧化菌进行细胞催化成为上述工业应用的主要途径。纯培养的甲烷氧化菌增长缓慢、细胞密度底，正常条件下难以进行工业应用。与纯培养的甲烷氧化菌相比，甲烷氧化混合培养微生物生长稳定，而且由于微生物间的协同作用促使甲烷代谢加快，浓度高，有利于甲烷氧化能力的实际应用。
一般情况下，由于甲烷在水溶液中的溶解度较低，导致甲烷氧化菌生长速率慢、所得细胞浓度低，成为限制甲烷氧化菌及其混合菌工业化应用的瓶颈。提高气液传质是强化甲烷氧化菌生长和甲醇生产的关键技术之一。因此，如何强化气液传质，提高气液传质速率，是实现甲烷氧化菌及其混合菌高密度细胞培养首先需要解决的问题。传统的解决办法是增加气速和搅拌速率。但增加气速和搅拌速率，一方面将导致大量泡沫生成，从而降低反应器的使用效率；另一方面，气速和搅拌速率的增加，必然会增大动力消耗，增加操作成本。与培养一般好氧微生物细胞不同，在甲烷氧化菌的细胞培养过程中，不仅需要空气或氧气，而且需要甲烷气体。此外，当甲烷与空气或氧气的混合比例超过一定范围时还会有爆炸的危险；增大气流速度必然会使气体大量循环，导致工艺复杂，动力消耗增加。因此迫切需要一种甲烷氧化混合菌的快速、高密度培养方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种甲烷氧化混合菌较快速、高密度的培养方法。
本发明所提供的甲烷氧化混合菌的快速培养方法，是在常规培养甲烷氧化混合菌的液体培养基中添加石蜡油，以形成油水两相培养体系。
对甲烷氧化菌进行培养时，只需将石蜡油直接加入液体培养基中即可。石蜡油的使用量与培养容器的形状有关，其在培养基中的质量百分含量优选为0.1-20％。
为获得更高的培养效率，所述石蜡油优选为经甲烷饱和的石蜡油。
所述对石蜡油用甲烷进行饱和的方法，是将石蜡油置于充满甲烷和空气的密闭器皿中进行振荡，使甲烷和氧分子尽可能地溶解于石蜡油中。
本发明提供了一种甲烷氧化混合菌的培养方法。在用本发明的方法对甲烷氧化混合菌进行振荡培养过程中，石蜡油受到机械力的作用形成微小的分散液滴，这些液滴可以提高甲烷的溶解度，而且由于其与菌体细胞的亲和性，细胞可以在水相和有机相之间穿梭，强化了微生物利用甲烷的速度。与常规培养方法相比，本发明方法可以极大程度的提高甲烷氧化混合菌的生长速度和细胞密度，且培养方法简单，具有较高的工业化应用可行性。基于上述优点，本发明将在甲烷氧化菌及其相关产品的工业化生产中发挥巨大作用，应用前景广阔。
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
附图说明
图1为甲烷氧化菌液体培养装置示意图
图2为石蜡油对甲烷氧化菌生长速度影响的比较实验中1mL培养菌液中菌体湿重的统计结果
图3石蜡油对甲烷氧化菌生长速度影响的比较实验中1mL培养菌液中的菌体重悬后的OD600值测定结果
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所有百分比浓度均为质量百分比浓度，所有培养基中的溶剂均为去离子水。
NMS(Higgens nitrate minimal salt)培养基配方：每升培养基中含有NaNO3 0.85g，KH2PO4 0.53g，Na2HPO4 2.17g，K2SO4 0.17g，MgSO4·7H2O 0.037g，CaCl2·2H2O 0.007g，微量元素贮存液2mL，1mmol/L H2SO4 0.5毫升，FeSO4·7H2O 11.2毫g，CuSO4·5H2O 2.5毫g(固体培养基再添加1.5％的琼脂)，pH 7.0。
微量元素贮存液的配方为：每升溶液中含有ZnSO4·7H2O 0.2042g，MnSO4·4H2O0.223g，H3BO3 0.062g，Na2MoO4·2H2O 0.048g，CoCl2·6H2O 0.048g，KI 0.083g。
LB培养基配方：每升溶液中含有酵母粉5g；胰蛋白胨10g；氯化钠5g(固体培养基再添加1.5％的琼脂)。
实施例1、甲烷氧化混合菌的分离
现从重庆山区采样的农业土壤中分离甲烷氧化混合菌，具体过程包括以下步骤：
1)将土样碾碎后，称取0.2g放入20mL NMS培养基中，在30℃摇床上振荡培养，振速为170rpm；
2)2h后，取液体1mL作为种子接入分装了10mL NMS培养基的70mL玻璃培养瓶中，加盖橡胶塞，密封；
3)用已灭菌的医用注射器抽取瓶内一定体积的空气，通过已灭菌的气体过滤器(滤膜孔径为0.2μ)注入相同体积的甲烷，使瓶中空气与甲烷的体积比为1∶1，然后在30℃、170rpm下振荡培养；
4)振荡培养1-2周后，移取其中1mL培养液作为种子接入新鲜的NMS培养基中，如此选择性传代培养，得到以甲烷作为唯一碳源和能源的十分稳定的甲烷氧化混合菌。
经微生物学和分子生物学鉴定，此混合菌是由II型甲烷氧化菌该体系由II型甲烷氧化菌Methylosinus trichosporium和至少4种非甲烷氧化菌组成(Comamonastestosteroni，Cupriavidus metallidurans，Acinetobacter junii和Stenotrophomonasmaltophilia)。
实施例2、利用石蜡油进行甲烷氧化混合菌的培养及与甲烷氧化混合菌常规培养的比较
1、甲烷氧化混合菌的常规培养
1)在70mL的玻璃培养瓶中分装10mL NMS培养基，121℃高压灭菌15分钟；
2)接入400μl混合菌培养液(即接种量4％)，加盖橡胶塞，密封；
3)用已灭菌的医用注射器抽取瓶内一定体积的空气，然后通过已灭菌的气体过滤器(滤膜孔径为0.2μ)注入相同体积的甲烷，使瓶中空气与甲烷的体积比约为1∶1，实验装置如图1所示；
4)在30℃、170rpm下振荡培养，每24h重新充入混合气体(空气∶甲烷＝1∶1，v/v)，并在相同条件下继续培养。
2、利用石蜡油进行甲烷氧化混合菌的培养
在70mL的玻璃培养瓶中分装10mL NMS培养基，加入500微升石蜡油，高压蒸气灭菌后，用与上述步骤1中相同的培养方法进行培养。以按步骤1中常规培养方法培养的甲烷氧化混合菌为对照。培养5d后，实验组和对照组各取1mL菌液，充分离心后，称取湿重，菌体湿重的统计结果如图2所示。为了排除石蜡油对光密度的影响，各取1mL实验组菌液，离心，弃上清，用去离子水重悬后测600nm处的光密度值(最好换算为干重或湿重)，OD600值测定结果如图3所示。结果实验组的菌体湿重和OD600值均显著高于对照组的，表明本发明的培养方法可显著提高甲烷氧化混合菌的生长速率，从而可实现甲烷氧化混合菌的快速、高密度培养。
实施例3、利用经甲烷饱和的石蜡油进行甲烷氧化混合菌的培养
1、甲烷溶剂的饱和处理
取1个50毫升培养瓶，装入20毫升石蜡油，121℃高压灭菌15分钟后，通过气体过滤器(滤膜孔径为0.2μ)加入40毫升甲烷，在30℃、250rpm下振荡12小时(中间通过0.2μ的过滤器补充甲烷数次)，得到经甲烷饱和的石蜡油。
2、利用经甲烷饱和的石蜡油进行甲烷氧化混合菌的培养
在70mL的玻璃培养瓶中分装10mL NMS培养基，加入500微升经甲烷饱和的石蜡油石蜡油，高压蒸气灭菌后，用与实施例2中甲烷氧化混合菌常规培养方法中相同的培养条件进行培养。以按常规培养方法培养的甲烷氧化混合菌为对照。培养结束后测定实验组和对照组的菌体湿重和OD600值，结果实验组的菌体湿重和OD600值均显著高于对照组的，表明本发明的培养方法可显著提高甲烷氧化混合菌的生长速率，从而可实现甲烷氧化混合菌的快速、高密度培养。
Claims (4)
1、一种甲烷氧化混合菌的培养方法，是在常规培养甲烷氧化混合菌的液体培养基中添加石蜡油。
2、根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于：所述石蜡油在液体培养基中的质量百分含量为0.1-20％。
3、根据权利要求1或2所述的培养方法，其特征在于：所述石蜡油为经甲烷饱和的。
4、根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于：所述经甲烷饱和的石蜡油是将石蜡油置于充满甲烷的密闭器皿中进行振荡得到的。
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