CN1824307A - 一种治疗b细胞淋巴瘤的药物组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种治疗B细胞淋巴瘤的药物组合物，该药物由利妥昔(Rituximab，Rituxan，美罗华)和SAHA(suberoylanilide hydroxamicacid，辛二酰苯胺氧肟酸)组成，该药物有明显协同作用，较单用可显著抑制B淋巴瘤细胞生长增殖，协同诱导凋亡，协同抑制NF－κB活性和下调BCL－XL表达。两药组合在提高疗效的同时可大幅降低治疗费用。
Description
技术领域
本发明涉及一种治疗癌症的药物组合物，尤其涉及一种治疗B细胞淋巴瘤的药物组合物。
背景技术
淋巴瘤是一种起源于淋巴组织的恶性肿瘤，近年来在世界范围内的发病率几乎增长了一倍，严重危害人类的健康。B细胞淋巴瘤是最常见的淋巴瘤种类，约占淋巴瘤的50-60％。除早期、局限性、低度恶性的B细胞淋巴瘤可单纯使用放射治疗外，目前主要的治疗方式仍为联合化疗。采用联合化疗可使约50-60％的患者获得疾病缓解，20-30％的患者获得长期生存，但大部分患者对治疗无效或治疗后迅速复发，疾病进展快，预后差。更重要的是，化疗的毒副反应大，患者尤其是老年或合并其它疾病患者不能耐受。
CD20广泛表达于B细胞淋巴瘤细胞表面，是开展免疫治疗的理想靶点。近年来，人-鼠嵌合性抗CD20单克隆抗体利妥昔(Rituximab，Rituxan，美罗华)已成功应用于临床，通过抗体介导的针对细胞特异表面标记的免疫治疗，具有低毒，低骨髓抑制和较高特异性的特点，为B细胞淋巴瘤的治疗开辟了新途径。然而患者的治疗费用昂贵，部分患者在治疗早期或疾病复发时发生耐药。因此，研究利妥昔和其他药物联合应用的可行性对于提高疗效、降低费用具有重要意义。
组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)抑制剂可通过抑制HDAC，阻断由于HDAC募集功能紊乱而导致的基因表达受抑，有显著的抗肿瘤效应。其中SAHA(suberoylanilide hydroxamic acid，辛二酰苯胺氧肟酸)已进入II期临床，治疗复发的B细胞淋巴瘤患者有一定的疗效，是一种极具潜力的靶向治疗药物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种治疗B细胞淋巴瘤的药物组合物。
本发明的目的是通过以下技术方法来实现的：本发明一种治疗B细胞淋巴瘤的药物组合物，该药物由利妥昔和SAHA组成。利妥昔用量为1-100μg/ml，SAHA用量为1-10μM。利妥昔用量可为1-50μg/ml，SAHA用量可为1-5μM。利妥昔用量优选为20μg/ml，SAHA用量优选为2.5μM。
本发明应用了以下两种人的细胞株：对利妥昔敏感的滤泡型淋巴瘤SU-DHL-4细胞株，和对利妥昔耐药的Burkitt’s淋巴瘤Daudi细胞株。该两种人的细胞株分别经不同浓度的利妥昔(0、1、20、50、100μg/ml)和SAHA(0、1、2.5、5、10μM)联合处理，进行了MTT实验、流式细胞仪检测annexin-V和线粒体跨膜电位实验、免疫印迹分析实验及核蛋白胶电泳转移检测实验。
本发明所公开的一种治疗B细胞淋巴瘤的药物组合物，其优点表现在：通过使用本发明的药物组合物，发挥两种药的协同作用，可以协同抑制B淋巴瘤细胞生长增殖，协同诱导B淋巴瘤细胞凋亡，协同抑制NF-κB活性和下调BCL-XL表达。两药组合在提高疗效的同时下可大幅降低费用。
附图说明
图1A显示单用利妥昔抑制B淋巴瘤细胞生长的效果图。
图1B显示单用SAHA抑制B淋巴瘤细胞生长的效果图。
图1C显示合用利妥昔、SAHA抑制B淋巴瘤细胞生长的效果图。
图2A显示流式细胞仪检测滤泡型淋巴瘤SU-DHL-4细胞株凋亡对照组的效果图。
图2B显示单用利妥昔诱导滤泡型淋巴瘤SU-DHL-4细胞株凋亡的效果图。
图2C显示单用SAHA诱导滤泡型淋巴瘤SU-DHL-4细胞株凋亡的效果图。
图2D显示合用利妥昔、SAHA诱导滤泡型淋巴瘤SU-DHL-4细胞株凋亡的效果图。
图2E显示合用利妥昔、SAHA诱导滤泡型淋巴瘤SU-DHL-4细胞株凋亡的协同指数效果图。
图2F显示用流式细胞仪检测Burkitt’s淋巴瘤Daudi细胞株凋亡对照组的效果图。
图2G显示单用利妥昔诱导Burkitt’s淋巴瘤Daudi细胞株凋亡的效果图。
图2H显示单用SAHA诱导Burkitt’s淋巴瘤Daudi细胞株凋亡的效果图。
图2I显示合用利妥昔、SAHA诱导Burkitt’s淋巴瘤Daudi细胞株凋亡的效果图。
图2J显示合用利妥昔、SAHA诱导Burkitt’s淋巴瘤Daudi细胞株凋亡的协同指数效果图。
图3显示单用及合用利妥昔或SAHA作用24小时线粒体跨膜电位的结果图。
图4A显示单用及合用利妥昔或SAHA对滤泡型淋巴瘤SU-DHL-4细胞株Caspase-3、PARP和BCL-XL影响的结果图。
图4B显示显示单用及合用利妥昔或SAHA对Burkitt’s淋巴瘤Daudi细胞株Caspase-3、PARP和BCL-XL影响的结果图。
图5显示单用及合用利妥昔或SAHA对B淋巴瘤细胞NF-κB活性影响的结果图
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述。
实施例1
一种治疗B细胞淋巴瘤的药物组合物制备
本发明一种治疗B细胞淋巴瘤的药物组合物，该药物由利妥昔和SAHA按照一定的浓度比例混合制得。其中利妥昔用量为20μg/ml，SAHA用量为2.5μM。
实施例2
一种治疗B细胞淋巴瘤的药物组合物制备
本发明一种治疗B细胞淋巴瘤的药物组合物，该药物由利妥昔和SAHA按照一定的浓度比例混合制得。其中利妥昔用量为1μg/ml，SAHA用量为10μM。
实施例3
一种治疗B细胞淋巴瘤的药物组合物制备
本发明一种治疗B细胞淋巴瘤的药物组合物，该药物由利妥昔和SAHA按照一定的浓度比例混合制得。其中利妥昔用量为100μg/ml，SAHA用量为1μM。
实施例4
一种治疗B细胞淋巴瘤的药物组合物药效评价
(一)试剂：
利妥昔购自上海罗氏公司，-4℃保存。SAHA由上海默沙东赠送，溶解于DMSO中，储存液浓度为100mM，-20℃保存。MTT、碘化丙啶(PI)、rhodamine 123(Rh123)、二硫苏糖醇购自Sigma公司。抗PARP、caspase-3、BCL-XL、NF-κB(P65)、过氧化物酶偶联的羊抗鼠二抗和羊抗兔二抗均购自Santa Cruz公司。抗β-actin购自Abcam公司。
(二)细胞培养，细胞存活和细胞形态学：
本研究应用了以下两种人的细胞株：滤泡型淋巴瘤SU-DHL-4细胞株，对利妥昔敏感，Burkitt’s淋巴瘤Daudi细胞株，对利妥昔耐药。淋巴瘤细胞在5％CO2-95％空气，饱和湿度以及37℃的条件下，培养于RPMI-1640培养液中(Gibco/BRL)，并加入10％胎牛血清。在每次实验中，细胞接种密度为2×105/ml。细胞的存活率采用台盼兰拒染实验检测。细胞形态学观察采用瑞氏染色法。
(三)MTT实验：
在96孔板中，用不同浓度利妥昔或SAHA处理细胞。72小时后，向每孔中加入0.1mg MTT，在37℃下孵育4小时后，在分光光度计570nm处测量标本吸光度值。
(四)流式细胞仪检测annexin-V和线粒体跨膜电位：
细胞凋亡用ApoAlert Annexin V-FITC Apoptosis kit(BD)进行分析。在检测线粒体跨膜电位中，细胞用PBS洗后，在37℃下与10μg/mlRh123孵育30分钟，然后再用50μg/ml PI染色。荧光强度用流式细胞仪进行测量。
(五)免疫印迹分析：
用200ml Laemmli裂解缓冲液(0.5M Tris-HCl，pH6.8，2mM EDTA，10％glycerol，2％SDS and 5％β-mercaptoethanol)裂解5×106细胞。蛋白裂解物(20μg)用于10％聚丙烯酰胺凝胶电泳，再转移至硝酸纤维素膜上。硝酸纤维素膜在溶于TBS/0.05％Tween 20的5％脱脂牛奶中封闭，之后与一抗在室温孵育2小时，与辣根过氧化物酶标记的二抗孵育1小时。免疫复合物用辣根过氧化物酶化学发光检测试剂盒检测。
(六)核蛋白分离：
1×107细胞与不含NP-40的裂解缓冲液(10mM HEPES，10mM KCl，1.5mM MgCl2，0.5mM DTT，pH7.9)洗后，重悬于提取缓冲液(20mM HEPES，pH7.9，420mM NaCl，0.5mM DTT，0.2mM EDTA and 25％甘油)中，冰上孵育20分钟。12000×g离心10分钟后，上清即为核蛋白。
(七)胶电泳转移检测实验：
Daudi细胞核蛋白提取物用考马斯亮蓝试剂(Pierce)定量。核蛋白(10μg)与32P标记的双链NF-κB(5’-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3’)共有序列孵育，然后用4％非变性PAGE凝胶分离，用放射自显影检测被标记的条带。
(八)统计分析：
实验结果用三次独立实验的平均值和标准差表示，用t检验来比较差异。P值小于0.05则认为具有统计学差异。所有的统计采用SAS8.2软件。
(九)结果：
采用CD20阳性B淋巴瘤细胞系SU-DHL-4和Daudi细胞进行培养，通过分析生长曲线观察利妥昔、SAHA单独及联合应用对细胞生长增殖的影响。B淋巴瘤细胞分别经不同浓度的利妥昔(0、1、20、50、100μg/ml)和SAHA(0、1、2.5、5、10μM)联合处理。单用和合用不同剂量利妥昔或SAHA对B淋巴瘤细胞的抑制作用见图1A、图1B、图1C，利妥昔(20μg/ml)联合SAHA(2.5μM)应用48小时可显著抑制SU-DHL-4和Daudi细胞的增殖。
用流式细胞仪检测单用及合用药后B淋巴瘤细胞的凋亡(Annexin V和PI双染法)。SU-DHL-4经利妥昔20μg/mL、SAHA 2.5μM及利妥昔20μg/mL与SAHA 2.5μM联合处理的48小时后，Annexin V阳性细胞分别为：对照组3.4％(见图2A)；利妥昔组17.3％(见图2B)；SAHA组26.3％(见图2C)；利妥昔与SAHA合用组56.7％(见图2D)。在Daudi细胞中：对照组3.0％(见图2F)；利妥昔组4.2％(见图2G)；SAHA组24.4％(见图2H)；利妥昔与SAHA合用组61.7％(见图2I)。同时我们应用Berenbaum建立的等效应线图法分析利妥昔与SAHA的联合应用是协同、相加或拮抗。将利妥昔与SAHA单用与合用Annexin V阳性率取30％±5％，计算两者合用的协同指数(combined index，CI)：CI＝d1/D1+d2/D2。D1、D2代表单用药物1和2时产生30％±5％效应时所需的药物剂量，d1、d2代表联合应用药物1和2时产生同等效应时的药物剂量。CI＞1，图形为凸形，两者联合应用为拮抗作用，CI＝1，图形为一直线，两者联合应用为相加作用，CI＜1，图形为凹形，两者联合应用为协同作用。利妥昔与SAHA作用于SU-DHL-4和Daudi细胞，图形均为凹型(见图2E、图2J)，证明两者为协同作用。
用亲脂阴离子染料Rh123和PI双染色检测单个细胞可获得线粒体跨膜电位(Δψm)和细胞膜的完整性，前者由于线粒体摄取量与线粒体Δψm成正比，摄取量减少表示Δψm下降；PI不能通过完整的细胞膜，细胞发生凋亡早期细胞膜仍保持完整，PI不能进入细胞，反之，坏死细胞膜破坏早期即发生PI染色增加。请参阅见图3，经利妥昔(20μg/ml)联合SAHA(2.5μM)合用24小时后出现了Δψm的下降。
利妥昔与SAHA单用或合用SU-DHL-4细胞和Daudi细胞蛋白表达变化见图4A、图4B示。利妥昔单用Caspase-3活化不明显，SAHA单用可以诱导Caspase-3表达增加，相应的其底物PARP剪切成89KD的片段，不能发挥正常功能，导致细胞凋亡，利妥昔和SAHA合用时这种效应更明显。因此，利妥昔诱导B淋巴瘤细胞系凋亡无需激活的Caspases参与，而SAHA诱导B淋巴瘤细胞系凋亡通过激活的Caspases进行，这也可以部分解释两者协同作用的机制。BCL-XL是BCL-2家族的重要的凋亡抑制因子，可通过稳定线粒体膜通透性，减少凋亡因子的释放，抑制细胞凋亡。利妥昔和SAHA可以下调BCL-XL蛋白表达，合用组BCL-XL的下调更明显，从而促进淋巴瘤细胞凋亡(图4A和图4B)。
NF-κB是一个信号传导家族，多以异源性二聚体形式发挥作用，在细胞核内调节与细胞恶性转化、免疫以及炎症反应有关的许多基因的表达。BCL-XL是NF-κB的靶基因，NF-κB激活可上调BCL-XL的表达。在利妥昔(20μg/ml)联合SAHA(2.5μM)应用48小时可抑制NF-κB的表达(图5A)。在Daudi细胞中，核蛋白胶电泳转移检测进一步证实两者合用可导致NF-κB转录活性的减低(图5B)。
综上所述，抗CD20单克隆抗体利妥昔与组蛋白去乙酰化酶抑制剂合用能够抑制NF-κB活性，下调BCL-XL表达，协同抑制淋巴瘤细胞凋亡，可能成为B细胞淋巴瘤的又一种有效治疗方法。
Claims (4)
1、一种治疗B细胞淋巴瘤的药物组合物，其特征在于该药物由利妥昔和SAHA组成。
2、如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于利妥昔用量为1-100μg/ml，SAHA用量为1-10μM。
3、如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于利妥昔用量为1-50μg/ml，SAHA用量为1-5μM。
4、如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于利妥昔用量为20μg/ml，SAHA用量为2.5μM。
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