CN1814786A - 一种rna印迹电响应水凝胶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
将酿母VI型RNA模板大分子包埋在2－丙烯酸氨基－2－甲基－1－丙烷磺酸和N，N′－亚甲基双丙烯酰胺共聚物中。水凝胶在外加电场作用下体积可逆地进行溶胀和收缩，促使模板大分子从聚合物中洗脱。水凝胶中残留的模板大分子的印迹可用来识别酿母VI型RNA。
Description
(一)技术领域：
本发明属于分子印迹技术，特别是一种核糖核酸(RNA)印迹电响应水凝胶及其制备方法，它是将一种核糖核酸(RNA)生物大分子作为模板来印迹聚合物，并为解决生物大分子印迹技术中模板难以脱出的问题而提供的一种方法。
(二)背景技术：
分子印迹技术(参见Wulff，G.Molecular imprinting in cross-linkedmaterials with the aid of molecular template a way towards artificialantibodies.Angew.Chem.Int.Ed.，1995，34：1821-1832)是将模板小分子溶于单体中，当单体聚合并交联后，模板分子就会包埋在聚合物网络中。然后，从聚合物中洗涤脱去模板分子，就会在聚合物内部形成大量与模板分子在形状上互补的空洞。这些空洞会专一性地识别模板分子。这一技术已经广泛地应用到传感器设计、手性分离的HPLC固定相、人工受体/抗体及高分子催化剂等领域。
对于小分子化合物模板，它们易于从聚合物中脱出，形成空洞。但是，像RNA这样的生物大分子模板就难以从聚合物中脱出，这是因为大分子的尺寸远大于聚合物的网格的缘故。聚合物表面印迹生物大分子虽然可以使大分子模板从聚合物表面顺利洗脱(参见Shi，H.&Ratner，B.D.Template recognition of protein-imprinted polymer surfaces.J.Biomed.Mater.Res.，2000，49：1-11)，但由于聚合物表面积太小以致不能对大分子进行有效的识别和分离。要获得大的比表面，就必须对聚合物本体内部进行印迹。而RNA大分子印迹的难点就在于如何将RNA模板从聚合物内部洗涤出来。
(三)发明内容：
本发明目的在于提供一种RNA印迹电响应水凝胶及其制备方法，它以电刺激-响应的智能水凝胶作为包埋RNA的聚合物，利用交变电场刺激水凝胶(参见Osada，Y；Okuzaki，H.& Hori，H.A polymer gelwith electrically driven motility.Nature，1992，355：242-244)，使其体积经历膨胀和收缩的往复变化，从而主动挤压大分子模板从聚合物内部脱出，这样，就可在一定程度上得到含义RNA印迹空洞的聚合物，并可在色谱固定相上对RNA分子进行识别。
本发明的技术方案：一种RNA印迹电响应水凝胶，其特征在于：(1)模板大分子是酿母VI型RNA；(2)水凝胶是2-丙烯酸氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸和N，N′-亚甲基双丙烯酰胺共聚物；(3)水凝胶具有交联结构。
上述所说的RNA印迹电响应水凝胶不溶于任何溶剂。
上述所说的RNA印迹电响应水凝胶在电场作用下可将部分模板大分子从水凝胶中洗涤出来。
一种RNA印迹电响应水凝胶的制备方法，其特征在于它是由以下步骤所构成：
(1)聚合物的制备：在5～10mL 60μg/mL的酿母VI型RNA的水溶液中加入3～5g的2-丙烯酸氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸和1～2g的N，N′-亚甲基双丙烯酰胺；溶液在5℃下孵化1～2h，以便在聚合前定向单体；在氮气保护下，以0.1～0.3g的过硫酸钾-亚硫酸氢钠引发自由基聚合反应，在5℃下强烈搅拌，直至体系交联固化；挤压碎胶冻体通过200目的筛网；
(2)模板的脱出：以蒸馏水反复洗涤被压碎固体3～5次，将部分RNA分子从聚合物中除去；将聚合物置于两个相距10～20mm的铂箔片电极之间；其间充满0.1M的氯化钠溶液；在电极之间施加10～30V的交变电信号，频率为50～103Hz；
(3)模板脱出量的检测：每间隔20min，用紫外-可见分光光度计测定260nm处的吸收值，直至吸收值不再增长为止；依照标准曲线，计算最终的RNA浓度；以原始浓度减去终态浓度就可推算出聚合物中印迹洞的数量；更换氯化钠溶液，进一步测量RNA分子的脱出量；
(4)高性能液相色谱：RNA印迹聚合物在15∶3体积比的氯仿-丙酮中匀浆，利用气动流体泵，在300巴的压强下，以丙酮为溶剂装载到不锈钢柱内；采用8∶1体积比的甲醇-醋酸洗提的方法从聚合物中吸附和萃取RNA；在室温下洗提，并用分光光度计在260nm处进行跟踪，计算RNA的含量。
本发明的工作原理在于：VI型RNA来源于酿母，它作为模板溶于单体2-丙烯酸氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸(AMPS)中。AMPS与N，N′-亚甲基双丙烯酰胺(EBA)共聚交联，形成聚合物网络，并将RNA大分子包埋其中。
由于RNA分子体积较大，难以从聚合物分子网络中溢出，不能形成RNA所印迹的聚合物纳米洞。这是大分子印迹的难题之一。本发明以智能水凝胶聚2-丙烯酸氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸(PAMPS)包埋RNA，目的是利用这种聚合物的体积可变性来促使模板分子的脱出。即是，交联的聚PAMPS具有在无电场时因吸收水分子而溶胀，而加入电场后则吐出水分子，从而导致收缩。水凝胶实际上是一种随电场变化的化学机械系统。
把包埋RNA的智能聚合物置于一个小电解槽中，在电极之间施加正弦变化的电场。水凝胶就会随电压绝对值的升高和降低而发生体积膨胀和收缩的变化。膨胀时，聚合物网络被撑开，其中充满的水分子。而收缩时，聚合物链折叠起来，网络紧缩，而网络间的孔道和缺陷由此而展开。随着电场的交替变化，电响应聚合物的内部结构就会处于“开”和“闭”状态之间不断的可逆变换之中。这种变换可在一定程度上从聚合物中挤榨出RNA分子。
RNA从聚合物中洗脱后，就会在聚合物中留下空洞。这些空洞与RNA分子的3D结构在形状上互补。聚合物PAMPS带有负电荷，与生物大分子表面上的正电荷互补。所以，这些印迹的空洞能够识别与模板相同的RNA。
被碾碎、过筛和萃取的聚合物用于高效液相色谱的固定相。装载在分析柱上的RNA印迹的和非印迹PAMPS分别来分辨RNA。后者在8.6min时RNA从聚合物中被洗提出来，而前者在相同的保留时间下并没有峰出现，这说明RAN倾向于结合那些在RNA印迹的聚合物。
本发明的优越性在于：利用电响应高分子材料在电刺激下的体积变化，促进RNA大分子从高分子材料中的脱出，在一定程度上解决了生物大分子难以从包埋的母体中脱出的问题。
(四)附图说明：
图1为本发明所涉一种RNA印迹电响应水凝胶制备方法示意图。
(五)具体实施方式：
实施例1：一种RNA印迹电响应水凝胶，其特征在于：(1)模板大分子是酿母VI型RNA；(2)水凝胶是2-丙烯酸氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸和N，N′-亚甲基双丙烯酰胺共聚物；(3)水凝胶具有交联结构。
上述所说的RNA印迹电响应水凝胶不溶于任何溶剂。
上述所说的RNA印迹电响应水凝胶在电场作用下可将部分模板大分子从水凝胶中洗涤出来。
一种RNA印迹电响应水凝胶的制备方法，其特征在于它是由以下步骤所构成：
1.聚合物的制备：
在5mL 60μg/mL的酿母VI型RNA的水溶液中加入3g的2-丙烯酸氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸和1g的N，N′-亚甲基双丙烯酰胺；溶液在5℃下孵化1h，以便在聚合前定向单体；在氮气保护下，以0.1g的过硫酸钾-亚硫酸氢钠引发自由基聚合反应，在5℃下强烈搅拌，直至体系交联固化；挤压碎胶冻体通过200目的筛网；
2.模板的脱出：
以蒸馏水反复洗涤被压碎固体3次，将部分RNA分子从聚合物中除去；将聚合物置于两个相距10mm的铂箔片电极之间；其间充满0.1M的氯化钠溶液；在电极之间施加12V的交变电信号，频率为103Hz；
3.模板脱出量的检测：
每间隔20min，用紫外-可见分光光度计测定260nm处的吸收值，直至吸收值不再增长为止；依照标准曲线，计算最终的RNA浓度；以原始浓度减去终态浓度就可推算出聚合物中印迹洞的数量；更换氯化钠溶液，进一步测量RNA分子的脱出量；
4.高性能液相色谱：
RNA印迹聚合物在氯仿-丙酮(15∶3体积比)中匀浆，利用气动流体泵，在300巴的压强下，以丙酮为溶剂装载到不锈钢柱内；采用甲醇-醋酸(8∶1体积比)洗提的方法从聚合物中吸附和萃取RNA；在室温下洗提，并用分光光度计在260nm处进行跟踪，计算RNA的含量。
实施例2：一种RNA印迹电响应水凝胶，其特征在于：(1)模板大分子是酿母VI型RNA；(2)水凝胶是2-丙烯酸氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸和N，N′-亚甲基双丙烯酰胺共聚物；(3)水凝胶具有交联结构。
上述所说的RNA印迹电响应水凝胶不溶于任何溶剂。
上述所说的RNA印迹电响应水凝胶在电场作用下可将部分模板大分子从水凝胶中洗涤出来。
一种RNA印迹电响应水凝胶的制备方法，其特征在于它是由以下步骤所构成：
1.聚合物的制备：
在10mL 60μg/mL的酿母VI型RNA的水溶液中加入5g的2-丙烯酸氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸和2g的N，N′-亚甲基双丙烯酰胺；溶液在5℃下孵化2h，以便在聚合前用RNA分子对单体进行定向；在氮气保护下，以0.3g的过硫酸钾-亚硫酸氢钠引发自由基聚合反应，在5℃下强烈搅拌，直至体系交联固化；挤压碎胶冻体通过200目的筛网；
2.模板的脱出：
以蒸馏水反复洗涤被压碎固体5次，将部分RNA分子从聚合物中除去；将聚合物置于两个相距20mm的铂箔片电极之间；其间充满0.1M的氯化钠溶液；在电极之间施加30V的交变电信号(频率50Hz)；
3.模板脱出量的检测：
每间隔20min，用紫外-可见分光光度计测定260nm处的吸收值，直至吸收值不再增长为止；依照标准曲线，计算最终的RNA浓度；以原始浓度减去终态浓度就可推算出聚合物中印迹洞的数量；更换氯化钠溶液，进一步测量RNA分子的脱出量；
4.高性能液相色谱：
RNA印迹聚合物在氯仿-丙酮(15∶3体积比)中匀浆，利用气动流体泵，在300巴的压强下，以丙酮为溶剂装载到不锈钢柱内；采用甲醇-醋酸(8∶1体积比)洗提的方法从聚合物中吸附和萃取RNA；在室温下洗提，并用分光光度计在260nm处进行跟踪，计算RNA的含量。
Claims (4)
1、一种RNA印迹电响应水凝胶，其特征在于：(1)模板大分子是酿母VI型RNA；(2)水凝胶是2-丙烯酸氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸和N，N′-亚甲基双丙烯酰胺共聚物；(3)水凝胶具有交联结构。
2、根据权利要求1所述的RNA印迹电响应水凝胶，其特征在于所说的RNA印迹电响应水凝胶不溶于任何溶剂。
3、根据权利要求1所述的RNA印迹电响应水凝胶，其特征在于所说的RNA印迹电响应水凝胶在电场作用下可将部分模板大分子从水凝胶中洗涤出来。
4、一种RNA印迹电响应水凝胶的制备方法，其特征在于它是由以下步骤所构成：
(1)聚合物的制备：在5～10mL 60μg/mL的酿母VI型RNA的水溶液中加入3～5g的2-丙烯酸氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸和1～2g的N，N′-亚甲基双丙烯酰胺；溶液在5下孵化1～2h，以便在聚合前定向单体；在氮气保护下，以0.1～0.3g的过硫酸钾-亚硫酸氢钠引发自由基聚合反应，在5下强烈搅拌，直至体系交联固化；挤压碎胶冻体通过200目的筛网；
(2)模板的脱出：以蒸馏水反复洗涤被压碎固体3～5次，将部分RNA分子从聚合物中除去；将聚合物置于两个相距10～20mm的铂箔片电极之间；其间充满0.1M的氯化钠溶液；在电极之间施加10～30V的交变电信号，频率为50～103Hz。
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