CN1813901A - 五味子及其提取物治疗肿瘤多药耐药的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及中药五味子、五味子提取物作为多药耐药逆转剂的新用途，特别是与抗肿瘤药物合用治疗有多药耐药性的肿瘤，提高肿瘤细胞对抗癌药的敏感性以及抗肿瘤的新用途。

Description

五味子及其提取物治疗肿瘤多药耐药的用途

技术领域

本发明涉及五味子、五味子提取物作为多药耐药逆转剂的新用途，特别是与抗肿瘤药物合用治疗有多药耐药性的肿瘤，提高肿瘤细胞对抗癌药的敏感性的新用途。本发明还涉及五味子抗肿瘤的新用途。

背景技术

肿瘤细胞经过化疗后产生的获得性耐药以及某些肿瘤细胞本身具有内在耐药性仍然是肿瘤化疗失败的重要原因之一。产生多药耐药的机制非常复杂，存在于肿瘤细胞膜上的多药耐药糖蛋白(P-gp)的过度表达为主要机制，许多化疗药物都是P-gp的底物，例如长春碱类、蒽环类、表鬼臼毒素类、紫杉烷类等。逆转肿瘤细胞的多药耐药性从而使肿瘤细胞恢复对化疗剂的敏感性具有非常重要的临床应用价值。迄今已经发现不少化合物在体外及体内动物实验中具有很强的肿瘤多药耐药逆转作用，如包括维拉帕米的钙通道阻滞剂、钙调蛋白拮抗剂、环孢菌素类、喹啉类、抗雌激素类，然而运用到临床上，除对某些血液系统的肿瘤耐药有较为肯定的逆转作用外，对实体瘤耐药的逆转作用很不理想。一般认为，这些化合物在人体可耐受剂量下在体内不能达到有效的逆转浓度，而一旦加大剂量使其血药浓度到达体外试验中具有逆转活性的浓度时，就会产生严重的毒副作用，或者逆转剂与抗肿瘤药物合用时会改变抗肿瘤药物的药代动力学参数，从而产生不可预见的毒副反应。例如，本发明中作为阳性对照的维拉帕米，虽然在体外有很强的肿瘤耐药逆转活性，但是应用到体内却发现在未达逆转耐药浓度时就产生了心血管毒性，因而限制了其在临床上的使用。所以，开发作用强且毒副作用小的多药耐药逆转剂仍然是研究的主要方向。

五味子是民间常用的中药，具收敛固涩，益气生津，补肾宁心功效，药用价值很高，是不可多得的滋补品，其主要化学成份为五味子素、挥发油类、苯果酸等。它能调节心血管系统，改善血液循环，促进肝细胞再生，增强肝脏的解毒能力，是主治精神衰弱、泻痢、盗汗以及肝脏疾病的良药。它还对人的中枢神精系统有兴奋作用，对不正常的血压有调整作用。此外，服五味子还可以提高视力，并有助于治疗眼疾。研究发现，五味子多种成份能保护肝脏免受一些化学毒物的损害，并能拮抗氧自由基损伤，刺激肝脏的合成代谢和增强细胞色素P450的活性，五味子属中的28种成分中五味子乙素、丙素、醇乙、酯乙、酯丙、酯丁等为降转氨酶的有效成分。临床现在常用的护肝片(双鹤制药)、降酶灵胶囊(湖南亚太制药)、复方乙肝灵(双鹤药业)等均具有良好的降酶和保肝活性。

近来还有研究表明，五味子能增强大脑皮层兴奋和抑制过程，使其相互平衡。五味子提取物有明显镇静作用，与戊巴比妥钠、氯丙嗪等协用能够拮抗兴奋药引起的惊厥，有安定药的特点。生脉注射液(太行制药)的主要成分也为五味子，临床主要用于气阴两亏，脉虚欲脱的心悸、气短、四肢很冷、汗出、脉欲绝及心肌梗塞、心源性休克、感染性休克等具有上述证候者。

发明内容

为了克服现有技术的不足之处，本发明的主要目的在于提供一种五味子提取物在制备肿瘤多药耐药逆转剂中的新用途。

本发明的另一目的在于提供一种五味子提取物及和抗肿瘤药物的联用。

所述的抗肿瘤药物包括为P-gp底物的抗肿瘤药物。所述的P-gp底物的抗肿瘤药物包括蒽环类、长春碱类、紫杉烷类、鬼臼类，以及米托蒽醌、放线菌素D、丝裂霉素C。所述的肿瘤包括具有P-gp过度表达的内在多药耐药性以及在化疗过程产生获得多药耐药性的实体肿瘤和血液系统肿瘤。

因此，本发明涉及的五味子提取物可以用于预防和治疗逆转肿瘤的多药耐药性。换言之，将含有五味子的药用组合物向需要预防和/或治疗的病人给药。

KBv200细胞为人口腔上皮癌KB细胞经长春新碱筛选得到的多药耐药细胞株，对长春新碱的获得耐药性是敏感KB细胞的230倍，对阿霉素和紫杉醇的交叉耐药性分别为11和148倍。五味子提取物能逆转KBv200细胞对长春新碱的获得耐药性以及对阿霉素和紫杉醇的交叉耐药性，并呈现明显的剂量依赖关系。25μg/ml的五味子提取物使KBv200细胞长春新碱的半数抑制浓度(IC₅₀)由2479nmol/L降至4nmol/L，逆转倍数为637倍；使阿霉素的IC₅₀由667nmol/L降至48nmol/L，逆转倍数为14倍；使紫杉醇的IC₅₀由1243ng/ml降至逆转倍数为187。而在敏感的KB细胞，相同剂量下的五味子提取物对上述抗肿瘤药的IC₅₀影响很小。

MCF-7/Adr细胞为人乳腺癌MCF-7细胞经阿霉素筛选得到的一种多药耐药细胞株，对阿霉素的获得耐药性是MCF-7细胞的140倍。五味子提取物能逆转MCF-7/Adr细胞对阿霉素的耐药性，并呈现明显的剂量依赖关系。25μg/ml五味子提取物使MCF-7/Adr细胞阿霉素的IC₅₀由45241nmol/L降至401nmol/L，逆转倍数为27倍。同样，对于敏感的MCF-7细胞，上述浓度的五味子提取物对阿霉素的敏感性影响较小。

由此可见，五味子提取物能够逆转肿瘤细胞的获得性多药耐药性。对于内在多药耐药性的肿瘤细胞，五味子提取物也有很强的逆转作用，并且也具有明显的剂量依赖性。人肝癌Bel₇₄₀₂细胞株具有内在多药耐药性，五味子提取物使得Bel₇₄₀₂细胞对长春新碱和阿霉素的敏感性增加，其中25μg/ml五味子提取物使Bel₇₄₀₂细胞长春新碱的IC₅₀由1776.8nmol/L降至1.2nmol/L，逆转倍数为1563倍，使阿霉素的IC₅₀由761nmol/L降至82nmol/L，逆转倍数为9倍。

归纳以上结果，五味子提取物逆转多种肿瘤细胞药物耐药的倍数见下表：

细胞系	药物	逆转倍数
							五味子提取物(μmol/L)				维拉帕米
		50	25	12.5	6.25	10(μmol/L)
							KBv200MCF-7/AdrBel7402	长春新碱阿霉素紫杉醇阿霉素长春新碱阿霉素	63714187275639	699319696	1129684	512574	3881520649

注：耐药逆转倍数＝IC₅₀(抗肿瘤药)/IC₅₀(抗肿瘤药+受试逆转药)

裸鼠试验表明，本发明的五味子提取物在动物体内同样表现出良好的逆转肿瘤多药耐药活性。我们用裸鼠建立了对长春新碱耐药的移植性人类肿瘤模型(KBv200移植性实体瘤)，结果发现，单独腹腔注射长春新碱0.4mg/Kg，每两天一次，共5次，对耐药的KBv200移植性肿瘤仅有微弱的抑制作用(与空白对照组相比抑瘤率为12.7％)。五味子提取物口服，每天一次，共14次，能够显著增强长春新碱对KBv200移植性肿瘤的抑制作用，其中，100、200和300mg/Kg五味子提取物与长春新碱合用，抑瘤率分别为27.6％、25.2％和41.9％，说明五味子提取物与长春新碱合用，能显著增加耐药肿瘤对长春新碱的敏感性。测定各组裸鼠体重发现，治疗前后各组体重均没有明显下降，说明五味子提取物与长春新碱合用治疗耐药肿瘤是安全而有效的。

五味子提取物在较高剂量下本身还具有抗肿瘤活性，400和600mg/Kg五味子提取物能够显著抑制H22肝癌的生长，400mg/Kg五味子提取物还能显著抑制S180肉瘤的生长。

本发明的进一步研究表明五味子提取物逆转肿瘤细胞多药耐药性的机理，是与其抑制多药耐药糖蛋白(P-gp)的活性和表达有密切关系。

抑制P-gp药物外排泵的活性，进而增加肿瘤细胞内抗癌药的蓄积量，是耐药逆转剂增加抗癌药的化疗敏感性的重要机制之一。阿霉素为蒽环类的抗癌药，能够自发荧光，因此应用荧光分光光度计可以检测阿霉素的荧光强度，从而确定阿霉素的含量。在给阿霉素的同时加入五味子提取物25μg/ml与Bel₇₄₀₂细胞共同作用3小时，可使细胞内阿霉素的蓄积量增加2～3倍，与20μmol/L维拉帕米作用相似，经统计分析均有极显著差异。说明五味子提取物能够增加抗肿瘤药物在耐药肿瘤细胞内的蓄积从而具有逆转多药耐药的活性。

综上所述，五味子提取物逆转多药耐药的机制与抑制P-gp的活性和过度表达，而增加了抗癌药在耐药肿瘤细胞内蓄积有关。

根据本发明的实施方案，所述的五味子提取物是药效学上可接受的，应用任何方法提取的五味子提取物。

本发明还涉及含有五味子提取物和抗肿瘤药物的药物组合物。为实现本发明的目的，优选的抗肿瘤药物包括为P-gp底物的抗肿瘤药物；优选的P-gp底物的抗肿瘤药物包括蒽环类、长春碱类、紫杉烷类、鬼臼类，以及米托蒽醌、放线菌素D、丝裂霉素C；更优选的P-gp底物的抗肿瘤药物包括长春新碱、阿霉素、紫杉醇。

五味子粗提物300mg/Kg单独给药，对S180肉瘤有30-32％的抑瘤率。长春新碱、紫杉醇、阿霉素在所用剂量下对S180肉瘤均有一定的抑瘤作用，抑瘤率分别为：43.43％、32.11％和43.87％。五味子粗提物300mg/Kg与上述三种抗肿瘤药物合用对抗肿瘤药物的抑瘤作用均有一定程度的增强，抑瘤率分别为：51.66％、38.11％和53.05。

五味子300mg/kg能显著保护阿霉素引起的白细胞下降，说明其对抗肿瘤药物引起的骨髓毒性有一定的保护作用。五味子300、400mg/kg对阿霉素引起的免疫功能下降亦有一定的保护作用。

本发明因此还涉及含有五味子提取物和常规药物赋形剂或辅剂的药物组合物。通常本发明药物组合物含有0.1-99％重量的五味子提取物，或0.1-99％重量的五味子提取物和抗肿瘤药物。

本发明的药物组合物可根据本领域已知的方法制备。用于此目的时，如果需要，可将有效成分与一种或多种固体或液体药物赋形剂和/或辅剂结合，制成可作为人药使用的适当施用形式或剂量形式。

本发明的的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮肤、腹膜或直肠等。

本发明的药物组合物的给药途径可为注射给药。注射包括静脉注射、肌肉注射、皮下注射、皮内注射和穴位注射等。

给药剂型可以是液体剂型、固体剂型。如液体剂型可以是真溶液类、胶体类、微粒剂型、乳剂剂型、混悬剂型。其他剂型例如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、栓剂、冻干粉针剂等。

本发明的药物组合物可以制成普通制剂、也可以是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。

为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。

为了将给药单元制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高岭土、滑石粉等；粘合剂，如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。

为了将给药单元制成栓剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酯、明胶、半合成甘油酯等。

为了将给药单元制成胶囊，将有效成分与上述的各种载体混合，并将由此得到的混合物置于硬的明胶胶囊或软胶囊中。也可将有效成分制成微囊剂，混悬于水性介质中形成混悬剂，亦可装入硬胶囊中或制成注射剂应用。

例如，将本发明的组合物制成注射用制剂，如溶液剂、混悬剂溶液剂、乳剂、冻干粉针剂，这种制剂可以是含水或非水的，可含一种和/或多种药效学上可接受的载体、稀释剂、粘合剂、润滑剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂。如稀释剂可选自水、乙醇、聚乙二醇、1，3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。这些辅料是本领域常用的

此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。

本发明的组合物能用于治疗具有P-gp过度表达的内在多药耐药性以及在化疗过程产生获得多药耐药性的实体肿瘤和血液系统肿瘤。

本发明五味子提取物之药用组合物的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重、性格及个体反应，给药途径、给药次数等，因此本发明的治疗剂量可以有大范围的变化。一般来讲，本发明中药学成分的使用剂量是本领域技术人员公知的。可以根据本发明五味子提取物之药用组合物中最后的制剂中所含有的实际有效药物数量，加以适当的调整，以达到其治疗有效量的要求，完成本发明的逆转肿瘤多药耐药的目的。通常对体重约75公斤患者，所给五味子提取物的日剂量为0.001mg/kg体重～1000mg/kg体重，优选100mg/kg体重～500mg/kg体重。上述剂量可以单一剂量形式或分成几个，例如二、三或四个剂量形式给药，这受限于给药医生的临床经验以及包括运用化疗、放疗手段的给药方案。

附图说明

图1.五味子提取物对Bel₇₄₀₂细胞内阿霉素蓄积的影响。(***：与对照相比p＜0.001)

图2.五味子提取物对长春新碱对裸鼠耐药的KBv200移植性肿瘤抑制作用的影响。

图3.五味子粗提物与长春新碱合用对S180肉瘤的抑瘤作用。XX表示味子粗提物。

图4.五味子粗提物与Taxol合用对S180肉瘤的抑瘤作用。XX表示味子粗提物。

图5.五味子粗提物与阿霉素合用对S180肉瘤的抑瘤作用。XX表示味子粗提物。

具体实施方式

下面的实施例用来进一步说明本发明，但这并不意味着对本发明有任何限制。

实施例1

取对数生长期的KB、KBv200、MCF-7、MCF-7/Adr、Bel₇₄₀₂细胞，接种于96孔培养板(Coster)内，培养24小时后，加入梯度浓度的抗癌药、逆转剂以及对照溶剂。继续培养72小时，之后弃去培养液，每孔加入0.5mg/ml噻唑兰(MTT)100μl(用不含血清的RPMI 1640培养液稀释)，继续培养4小时，弃去噻唑兰，每孔加入二甲基亚砜150μl，轻微振荡使沉淀溶解，于酶标仪(Bio-Rad 450型)570nm处测定吸光度。每组设三至四个复孔取其平均值，计算IC₅₀。以10μmol/L维拉帕米作为阳性对照。具体结果见表1-10。

表1.五味子提取物对KBv200细胞对长春新碱敏感性的影响

药物	浓度	细胞存活率(％)	长春新碱的半数抑制浓度(nmol/L)	逆转倍数
					对照维拉帕米五味子提取物	-10μmol/L25μg/ml12.5μg/ml6.25μg/ml3.125μg/ml	--81±1184±582±582±6	2479±42365±534±336±4229±164451±326	-3863769115

表2.五味子提取物对KB细胞对长春新碱敏感性的影响

药物	浓度	细胞存活率(％)	长春新碱的半数抑制浓度(nmol/L)	逆转倍数
					对照维拉帕米五味子提取物	-10μmol/L12.5μg/ml6.25μg/ml3.125μg/ml	-94±682±796±394±4	9.1±2.36.4±1.40.4±0.11.3±0.97.0±2.2	-12371

表3.五味子提取物对Bel₇₄₀₂细胞对长春新碱敏感性的影响

药物	浓度	细胞存活率(％)	长春新碱的半数有效浓度(nmol/L)	逆转倍数
					对照维拉帕米五味子提取物	-10μmol/L25μg/ml12.5μg/ml6.25μg/ml3.125μg/ml	--91±6104±7110±1691±17	1776.8±695.427.8±31.31.2±1.125.9±16.1214.0±86.7240.7±50.8	-6415636987

表4.五味子提取物对KBv200细胞对阿霉素敏感性的影响

药物	浓度	细胞存活率(％)	阿霉素的半数抑制浓度(nmol/L)	逆转倍数
					对照维拉帕米五味子提取物	-10μmol/L25μg/ml12.5μg/ml6.25μg/ml3.125μg/ml	--78±877±5105±10119±15	667±8782±4748±1377±10283±161482±142	-8.114.08.72.41.4

表5.五味子提取物对KB细胞对阿霉素敏感性的影响

药物	浓度	细胞存活率(％)	阿霉素的半数抑制浓度(nmol/L)	逆转倍数
					对照维拉帕米五味子提取物	-10μmol/L25μg/ml12.5μg/ml6.25μg/ml3.125μg/ml	--62±780±484±297±3	61.3±26.051.0±25.46.5±1.216.7±2.711.0±0.433.8±7.2	-1.29.42.75.61.8

表6.五味子提取物对KBv200细胞对紫杉醇敏感性的影响

药物	浓度	细胞存活率(％)	紫杉醇的半数抑制浓度(ng/ml)	逆转倍数
					对照维拉帕米五味子提取物	-10μmol/L25μg/ml12.5μg/ml6.25μg/ml3.125μg/ml	--84±487±398±8105±11	1243±34486±357±240±21142±58622±335	-151873192

表7.五味子提取物对KB细胞对紫杉醇敏感性的影响

药物	浓度	细胞存活率(％)	紫杉醇的半数抑制浓度(ng/ml)	逆转倍数
					对照维拉帕米五味子提取物	-10μmol/L25μg/ml12.5μg/ml6.25μg/ml3.125μg/ml	--80±1098±290±4101±3	15.2±1.99.6±6.01.4±0.49.6±6.016.2±2.112.1±4.2	-1.710.71.60.91.3

表8.五味子提取物对MCF-7/Adr细胞对阿霉素敏感性的影响

药物	浓度	细胞存活率(％)	阿霉素的半数抑制浓度(nmol/L)	逆转倍数
					对照维拉帕米五味子提取物	-10μmol/L25μg/ml12.5μg/ml6.25μg/ml3.125μg/ml	--82±393±789±293±7	45241±208462282±11071648±11394877±35097258±16309970±2685	-2027965

表9.五味子提取物对MCF-7细胞对阿霉素敏感性的影响

药物	浓度	细胞存活率(％)	阿霉素的半数抑制浓度(nmol/L)	逆转倍数
					对照维拉帕米五味子提取物	-10μmol/L25μg/ml12.5μg/ml6.25μg/ml3.125μg/ml	--79±1299±1399±189±16	401±307237±104165±104180±207155±106169±144	-22232

表10.五味子提取物对Bel₇₄₀₂细胞对阿霉素敏感性的影响

药物	浓度	细胞存活率(％)	阿霉素的半数抑制浓度(nmol/L)	逆转倍数
					对照维拉帕米五味子提取物	-10μmol/L25μg/ml12.5μg/ml6.25μg/ml3.125μg/ml	--89±484±1181±2389±2	761±8989±4082±30128±12205±77209±6	-99644

实施例2

取对数生长期Bel₇₄₀₂细胞，待细胞铺满瓶底的70-80％时，更换含阿霉素10μmol/L的RPMI 1640培养液，并加入终浓度为25μg/ml五味子提取物，以10μmol/L维拉帕米为阳性对照，每组设三个平行样品，37℃、5％ CO₂继续培养3小时，用冰冷的PBS(pH 7.4)洗三遍后收集细胞，取一定数量细胞，用1.2ml盐酸(0.3N)-乙醇(50％)悬浮细胞，并于超声波仪上打碎细胞后，10,000rpm离心15分钟，取上清液1.0ml加入2.0ml上述盐酸-乙醇溶液，用荧光分光光度计测定阿霉素的荧光值，激发波长为470nm，发射波长为580nm，用阿霉素含量-荧光度标准曲线计算10⁶个细胞中阿霉素的含量。结果见图1。

实施例3

选生长状态良好的腹水型S180肉瘤和H22肝癌昆明小鼠，拉颈处死，腹部皮肤用碘酒、酒精消毒后，无菌条件下抽吸腹水，注入无菌锥形瓶内(冰浴)，加生理盐水稀释到合适浓度。昆明小鼠右前肢碘酒、酒精皮肤消毒后，腋部皮下接种，0.2ml瘤液/只，次日，随即分组给药，每组8-10只，10天后，处死，剥瘤称重。给药方式如下：对于S180肉瘤，五味子提取物，200和400mg/Kg，对于H22肝癌，五味子提取物400和600mg/Kg，口服，每天一次，共10次，口服体积：10ml/Kg，溶剂对照，吐温80，口服，每天一次，共10次，口服体积：10ml/Kg；阳性对照环磷酰胺，60mg/Kg，腹腔注射，一次，体积：10mg/Kg。

表11.五味子提取物对昆明小鼠H22肝癌生长的抑制作用

组别	体重(g)		瘤重(g)	抑制率(％)
					给药前	给药后
	对照2％吐温-80五味子提取物400mg/Kg五味子提取物600mg/Kg	19.7±1.220.3±0.819.8±0.720.3±1.0					21.8±1.423.6±2.223.3±1.521.8±1.7	1.10±0.391.08±0.450.77±0.29*0.72±0.23*	-2.530.034.9

*：与2％吐温-80相比P＜0.05

表12.五味子提取物对昆明小鼠S180肉瘤生长的抑制作用

组别	体重(g)		瘤种(g)	抑制率(％)
					给药前	给药后
	对照0.6％吐温-80五味子提取物200mg/Kg五味子提取物400mg/Kg环磷酰胺	19.4±1.319.1±0.919.6±1.019.8±1.419.1±1.1					27.0±0.927.0±1.925.6±1.425.6±2.824.6±1.9	1.63±0.521.56±0.451.28±0.610.90±0.44**0.75±0.39***	-4.321.544.854.0

与对照相比，**：P＜0.01；***：P＜0.001

实施例4

无菌条件下，收集KBv200细胞，稀释于生理盐水中，每裸鼠皮下接种1×10⁸个于腋下，待肿瘤长至直径约1cm时，在无菌条件下选择生长良好的瘤块切成约30～40mm³的小块，用套管针接种到裸鼠的腋下以进行KBv200移植性实体肿瘤的传代。

进行五味子提取物体内逆转肿瘤耐药实验时，取生长良好的KBv200切成小块，接种到裸鼠的右腋下。待接种的KBv200肿瘤增殖到直径为7～15mm时(大约两周)随机分组给药，此时为第1天，每组7～8只。共分6组，空白对照组：不做任何处理；长春新碱(VCR)组：长春新碱0.4mg/Kg，第二天开始腹腔注射(i.p.)，每两天一次，共5天；溶剂对照组：3％吐温-80，口服，每天一次，连续14天；长春新碱(VCR)+五味子提取物100mg/Kg、长春新碱(VCR)+五味子提取物200mg/Kg和长春新碱(VCR)+五味子提取物300mg/Kg，口服，每天一次，连续14天，长春新碱给法同单给长春新碱组，3％吐温80以及各剂量的五味子提取物口服体积为10ml/Kg，并且与长春新碱腹腔注射的时间间隔为3小时。长春新碱溶于无菌生理盐水，五味子提取物先用吐温80(体积为3％)助溶，然后用蒸馏水稀释到所需浓度。每两天测定裸鼠的体重以及肿瘤的长和宽，用公式V＝a²×b/2(其中a为宽，b为长，单位：mm)计算肿瘤的体积，用公式RTV＝V_X/V₁将不同组肿瘤大小标准化，其中RTV为相对肿瘤体积，V_X为第X天时测量的肿瘤体积，V₁为治疗第一天测量的肿瘤体积。用相对抑瘤率(RIR)来评价五味子提取物的作用，RIR＝(空白对照组RTV的平均值-治疗组RTV的平均值)/对照组RTV的平均值×100％。具体结果见表13和图2。

表13.给药第15天五味子提取物对长春新碱对KBv200移植性肿瘤抑制作用的影响

组别	体重增加百分率(％)	相对生长体积	RIR(％)
				空白对照溶剂对照仅给VCR提取物100mg/Kg+VCR提取物200mg/Kg+VCR提取物300mg/Kg+VCR	1.1-2.93.20.47.3-6.6	5.68±2.575.01±1.404.96±1.094.11±1.284.25±0.873.30±1.00*	11.812.727.625.241.9

与仅给VCR相比，^*：P＜0.05。

实施例5五味子粗提物与抗肿瘤药物合用对S180肉瘤的抑制作用动物：昆明种小鼠，雌性，中国医学科学院实验动物研究所提供。药品：注射用盐酸阿霉素(DOX)：深圳万乐药业有限公司，批号：0212E1

注射用硫酸长春新碱(VCR)：上海华联制药有限公司，批号：020802A

紫杉醇注射液(Taxol)：北京协和药厂，批号：991012

以上药品均用生理盐水稀释成所有浓度。

方法：选生长状态良好的腹水型S180肉瘤昆明种小鼠，拉颈处死，腹部皮肤用碘酒、酒精消毒，无菌条件下抽吸腹水，注入无菌锥形瓶种(冰浴)，加生理盐水稀释到合适浓度。小鼠右前肢消毒后，腋部皮下接种，0.2mL瘤液/只，次日，随机分组给药，10日后，处死，剥瘤称重。

分组及给药方式：(给药量均为10ml/Kg)

(1).溶剂对照组：上午口服2％Tween80液，每日一次，共10次；下午腹腔注射生理盐水，每日一次，第五日停药，共9次。

(2).五味子粗提物300mg/Kg组：上午口服五味子粗提物300mg/Kg液，每日一次，共10次；下午腹腔注射生理盐水，每日一次，第五日停药，共9次。

(3).长春新碱0.4mg/Kg组：上午同溶剂对照组；下午腹腔注射0.4mg/Kg长春新碱液，每两日一次，共5次。

(4).紫杉醇6mg/Kg组：上午同溶剂对照组；下午腹腔注射6mg/Kg紫杉醇液，每日一次，第五日停药，共9次。

(5).阿霉素2mg/Kg组：上午同溶剂对照组；下午腹腔注射2mg/Kg阿霉素液，每日一次，第六日停药，共9次。

(6).五味子粗提物+长春新碱组：上午同五味子粗提物300mg/Kg组；下午同长春新碱0.4mg/Kg组。

(7).五味子粗提物+紫杉醇组：上午同五味子粗提物300mg/Kg组；下午同紫杉醇6mg/Kg组。

(8).五味子粗提物+阿霉素组：上午同五味子粗提物300mg/Kg组；下午同阿霉素2mg/Kg组。

结果：五味子粗提物300mg/Kg单独给药，对S180肉瘤有30-32％的抑瘤率。长春新碱、紫杉醇、阿霉素在所用剂量下对S180肉瘤均有一定的抑瘤作用，抑瘤率分别为：43.43％、32.11％和43.87％。五味子粗提物300mg/Kg与上述三种抗肿瘤药物合用对抗肿瘤药物的抑瘤作用均有一定程度的增强，抑瘤率分别为：51.66％、38.11％和53.05。见图3、4、5。

实施例6五味子粗提物对阿霉素引起血液毒性的保护作用动物：C57/BL小鼠，雌性，中国医学科学院实验动物研究所提供。药品：注射用盐酸阿霉素(DOX)：深圳万乐药业有限公司，批号：0212E1

重组人粒细胞集落刺激因子注射液(rhG-CSF)：杭州九洲基因工程有限公司，批号：20021001

方法：无菌条件下取Lewis肺癌瘤块，用手动匀浆器与无菌生理盐水中研磨，使成瘤液。C57/BL小鼠右前肢消毒后，腋部皮下接种，0.2mL瘤液/只，次日，随机分组给药。于接种后第12日称重，摘眼球取血(1％肝素抗凝)，剥瘤，取脾、胸腺称重，用日本光电血液分析仪(MEK5108型)分析血象，同时计算脾脏指数，胸腺指数。

分组及给药方式：(给药量均为10ml/Kg)

(1)溶剂对照组：2％Tween80，口服给药，每日一次。共10次。

(2)五味子300mg/kg+阿霉素10mg/kg组：上午五味子300mg/kg，口服给药，每日一次。共10次。于接种后第8日下午腹腔注射阿霉素10mg/kg，给药一次。

(3)五味子400mg/kg+阿霉素10mg/kg组：上午五味子400mg/kg，口服给药，每日一次。共10次。于接种后第8日下午腹腔注射阿霉素10mg/kg，给药一次。

(4)+阿霉素10mg/kg组：上午2％Tween80，口服给药，每日一次。共10次。于接种后第8日下午腹腔注射阿霉素10mg/kg，给药一次。

(5)rhG-CSF阳性对照组：上午2％Tween80，口服给药，每日一次。共10次。于接种后第8日下午腹腔注射阿霉素10mg/kg，给药一次。第9，10，11日腹腔注射rhG-CSF100μg/kg，给药3次。

结果：五味子300mg/kg能显著保护阿霉素引起的白细胞下降，说明其对抗肿瘤药物引起的骨髓毒性有一定的保护作用。五味子300、400mg/kg对阿霉素引起的免疫功能下降亦有一定的保护作用。

五味子粗提物对阿霉素引起血液毒性的保护作用(一)

组别	WBC(109/L)	RBC(1012/L)	HGB(g/L)	HCT(％)	PLT(109/L)
						对照DOX10mg/kg五味子300mg/kg+DOX五味子400mg/kg+DOXrhG-CSF100ug/kg+DOX	14.91±3.585.4±2.53c7.63±1.35c*6.98±2.34c10.64±5.67*	4.91±0.543.31±1.57b3.61±0.44c3.6±0.49c3.57±0.62c	116.91±11.5692.38±33.06a96.64±12.79c100.78±15.62a100.80±13.14b	27.15±3.9117.73±8.59b19.14±2.21c18.93±2.62c19.15±3.31c	376.90±54.83419.88±133.26442.45±170.88522.56±86.35c371.11±90.06

a，b，c：与control组相应指标比较分别表示P＜0.05 P＜0.01 P＜0.001

*：与dox模型组比较：P＜0.05

Claims (13)

1.中药五味子在制备逆转肿瘤多药耐药的药物中的应用。

2.中药五味子提取物在制备逆转肿瘤多药耐药的药物中的应用。

3.根据权利要求1、2所述的应用，其特征在于所述的肿瘤包括内在多药耐药性、获得性多药耐药性的肿瘤。

4.根据权利要求1、2所述的应用，其特征在于所述的肿瘤包括P-糖蛋白过度表达的肿瘤。

5.根据权利要求1、2所述的应用，其特征在于所述的肿瘤包括实体肿瘤、血液系统肿瘤。

6.一种治疗肿瘤多药耐药的中药组合物，其特征在于，至少含有五味子。

7.一种治疗肿瘤多药耐药的中药提取物，其特征在于，至少含有五味子提取物。

8.一种药物组合物，其特征在于：含有有效剂量的五味子提取物，以及药效学上可接受的载体。

9.一种药物组合物，其特征在于：至少由五味子提取物和抗肿瘤药物组成。

10.根据权利要求9组合物，抗肿瘤药物是为P-gp底物的抗肿瘤药物。

11.根据权利要求10组合物，P-gp底物的抗肿瘤药物选自蒽环类、长春碱类、紫杉烷类、鬼臼类、米托蒽醌、放线菌素D、丝裂霉素C。

12.根据权利要求11组合物，P-gp底物的抗肿瘤药物选自长春新碱、阿霉素、紫杉醇。

13.根据权利要求8-12的任一药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物可以是片剂、胶囊、丸剂、注射剂、缓释制剂、控释制剂及各种微粒给药系统。

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