CN1796382A - 一类新的大环内酯化合物,其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了下面分子式(I)的化合物Wortmannilactone A、B及其同分异构体C、D如分子式(II)所示，其制备方法和含有它们的药物组合物，所述化合物及含有它们的药物组合物可用于治疗和/或预防糖尿病并发症及治疗癌症。其中，R₁＝OH时，为化合物Wortmannilactone A，R₁＝OCH₃时，为化合物Wortmannilactone B，其中，R₂＝OH时，为化合物Wortmannilactone C，R₂＝OCH₃时，为化合物Wortmannilactone D。

Description

一类新的大环内酯化合物，其制备方法和用途

技术领域

本发明公开了一类新化合物，其制备方法和其用途，更具体地说，本发明公开了分子式(I)化合物Wortmannilactone A、B及其同分异构体：化合物Wortmannilactone C、D(见分子式(II))，含有它的药物组合物，利用微生物发酵制备上述化合物的方法及其中使用的微生物，和上述化合物或含有它们的药物组合物在制备用于治疗和/或预防糖尿病并发症的药物及抗肿瘤药物中的用途。

其中R₁＝OH时，为化合物Wortmannilactone A，

    R₁＝OCH₃时，为化合物Wortmannilactone B。

其中，R₂＝OH时，为化合物Wortmannilactone C，

      R₂＝OCH₃时，为化合物WortmannilactoneD。

背景技术

糖尿病是由胰岛素分泌和/或胰岛素作用的绝对或相对减弱而引起的综合症，主要表现为高血糖。糖尿病分为胰岛素依赖型糖尿病(I DM)和胰岛素非依赖型糖尿病(II DM)，II DM晚期可出现并发症，其中微血管并发症包括眼病、肾病和外周和自主神经病，大血管并发症包括动脉粥样硬化冠心病和外周动脉病。糖尿病，特别是其并发症，给患者及其亲属带来了巨大的痛苦。

自从胰岛素用于治疗糖尿病以来，酮酸中毒、感染不再威胁糖尿病患者的生命安全。但长期的糖尿病并发症仍然是糖尿病患者头痛的严重问题。通过对糖尿病患者聚醇代谢通路异常的研究发现，细胞组织中山梨醇的蓄积是组织结构、功能改变的重要原因，而聚醇代谢通路中的关键酶是醛糖还原酶(aldose reductase，AR)。醛糖还原酶以还原型辅酶II(NADPH)为辅酶，它催化己糖的还原反应，可以将葡萄糖和半乳糖转化为相应的还原产物山梨醇和半乳糖醇。然后，山梨醇再在山梨醇脱氢酶(sorbitoldehydrogenase)的作用下氧化成果糖。山梨醇脱氢酶则是聚醇代谢通路中的第二个酶，它可以氧化多种糖醇，但却不能氧化半乳糖醇。因此，在体内易导致半乳糖醇的积聚，从而引起半乳糖血症的发生(张礼萍等人，醛糖还原酶抑制剂研究，国外医药抗生素分册，1997，18(1)：5-10)。值得注意的是，葡萄糖和半乳糖均不是AR的最适底物，当血糖浓度维持在正常的生理水平时，AR并不被激活。在高血糖的生理状况(如糖尿病发生时)，催化葡萄糖转化为6-磷酸葡萄糖的己糖激酶被饱和，此时AR则被激活，促使体内的葡萄糖转化成山梨醇。然而，山梨醇脱氢酶的活力并未呈比例地相应增加，山梨醇又由于自身极性因素不易通过细胞膜，所以在胞内造成了山梨醇的聚积。大量的动物和临床试验都已证实，醛糖还原酶抑制剂(ARI)能有效地改善糖尿病患者的聚醇代谢紊乱，从而预防和延缓糖尿病并发症如白内障、神经病变、肾脏病变等的发生和发展(杨哲，醛糖还原酶抑制剂和糖尿病并发症，国外医学药学分册，1999，26(4)：217-222)。

Varma等人研究了多种黄酮类化合物的醛糖还原酶抑制活性。结果表明它们不同程度具有活性。但至今还没有一个化合物投放市场(Var SD，etal，Flavonoids as inhibitors of lens aldose reductase，ScienceNY，1975，188：1215-1216)。

尽管已有预防糖尿病并发症的药物，但仍不能满足市场的需要。市场仍需要预防糖尿病并发症的替代药物，特别是天然来源的替代药物。

因此，本发明的一个目的是提供一种分子式(I)的化合物Wortmannilactone A、B及其同分异构体：化合物Wortmannilactone C、D(见分子式(II))，含有它的药物组合物及将它们用作醛糖还原酶抑制剂用于治疗和/或预防糖尿病并发症和制备抗肿瘤药物的用途。

本发明另一目的是提供一种制备上述化合物的方法及在该方法中使用的微生物。

本发明另一目的是提供一种治疗和/或预防糖尿病并发症的药物组合物。

本发明另一目的是提供一种抗肿瘤的药物组合物。

发明概述

本发明发明人对醛糖还原酶抑制剂进行了大量研究，结果惊人地发现某些微生物的代谢产物具有醛糖还原酶抑制剂活性，通过进一步药理实验，发现了其还具有抗肿瘤作用，因此完成本发明。

一方面，本发明提供了一种如分子式(I)的化合物Wortmannilactone A、B及其同分异构体：化合物Wortmannilactone C、D(见分子式(II))，及其可药用盐、溶剂化物、立体异构体或前药：

                       (I)

其中R₁＝OH时，为化合物Wortmannilactone A，

    R₁＝OCH₃时，为化合物Wortmannilactone B。

其中，R₂＝OH时，为化合物Wortmannilactone C，

      R₂＝OCH₃时，为化合物WortmannilactoneD。

另一方面，本发明提供了一种利用微生物发酵制备上述化合物的方法，该方法包括将选定的真菌在培养基上发酵，然后对所得发酵液进行分离和纯化。

另一方面，本发明提供了一种微生物F-01-195，它可用于上述发酵方法制备上述化合物，它的保藏编号为CGMCC 1224。

另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包括上述化合物或其可药用盐作为活性成分和可药用载体。

另一方面，本发明涉及上述化合物或组合物用于制备治疗和/或预防糖尿病并发症的药物的用途。

另一方面，本发明涉及上述化合物或组合物用于制备抗肿瘤药物中的用途。

附图说明：

图1为产生菌F-01-195的菌落形态照片；

图2为产生菌F-01-195的电子显微镜照片；

图3为Wortmannilactone A紫外吸收光谱图；

图4为Wortmannilactone A红外光谱图；

图5为Wortmannilactone A质谱图；

图6为Wortmannilactone A¹H NMR图谱；

图7为Wortmannilactone A¹³C NMR图谱；

图8为Wortmannilactone B¹H NMR图谱；

图9为Wortmannilactone B¹³C NMR图谱；

图10为Wortmannilactone C¹H NMR图谱；

图11为Wortmannilactone C¹³C NMR图谱；

图12为Wortmannilactone D¹H NMR图谱；

图13为WortmannilactoneD¹³C NMR图谱。

发明的详细描述

如上所述，本发明涉及分子式(I)化合物WortmannilactoneA、B及其同分异构体：化合物Wortmannilactone C、D(见分子式(II))，其可药用盐、溶剂化物、立体异构体或前药：

其中R₁＝OH时，为化合物Wortmannilactone A，

    R₁＝OCH₃时，为化合物Wortmannilactone B。

其中，R₂＝OH时，为化合物Wortmannilactone C，

      R₂＝OCH₃时，为化合物Wortmannilactone D。

上述化合物可做为醛糖还原酶抑制剂用于治疗和/或预防糖尿病并发症，另外，还可以用于治疗肿瘤。

具有上述用途的化合物不仅是化合物本身，适当时也可以是其药学上可接受的盐(酸或碱加成盐)或立体异构体(包括光学异构体，例如对映体和外消旋体)。

上述药学可接受的加成盐包括化合物能够形成的治疗活性的非毒性酸和碱加成盐形式。碱性的化合物通过用适当的酸处理碱的形式可转化成它们的药学可接受的酸加成盐。酸的例子包括无机酸，诸如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、磷酸；有机酸，诸如乙酸、丙酸、羟乙酸、乳酸、丙酮酸、乙醇酸、马来酸、丙二酸、草酸、苯磺酸、甲苯磺酸、甲磺酸、三氟乙酸、富马酸、琥珀酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、水杨酸、对氨基水杨酸、扑酸、苯甲酸、抗坏血酸等。碱加成盐形式的例子是钠、钾、钙盐，以及与药学可接受的胺形成的盐，所述的胺是诸如氨、烷基胺、苯胺和氨基酸，诸如精氨酸和赖氨酸。

上述化合物和盐可以形成溶剂化物，例如水合物、醇合物等。上述醛糖还原酶抑制剂还可以是前药或可在体内代谢变化后释放出所述活性成分的形式。选择和制备适当的前药衍生物是本领域技术人员公知技术。

下文中为简便起见，本发明限定的任何化合物、其可药用盐、其溶剂化物及其立体异构体都简称为本发明的化合物。

本发明另一方面提供了制备上述化合物的方法，该方法包括：

1.提供能够通过发酵产生上述化合物的微生物，它们为云南真菌，优选，邬氏黄丝曲霉(Talaromyces wortmannii)CGMCC No.1224。该菌种F-01-195已于2004年9月27日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，保藏编号为CGMCC No.1224。

菌株来源：产生菌株F-01-195是从我国云南省的土壤样品中分离得到。

菌株鉴定：该菌种在查氏琼脂(CA)上，25℃，7天：菌落直径11-13mm，稍厚或较薄，表面平坦或有轻微沟槽，边缘于培养基内，不规则；质地绒状至轻微絮状；分生孢子结构稀疏，子囊果结构较少，无渗出液和可溶性色素。

在查氏酵母膏琼脂(CYA)上，25℃，7天：菌落直径10-15mm，表面有沟槽，浅或深，绒状至絮状，菌丝体在菌落边缘为白色，向菌落中心逐渐变为淡黄色、玉米黄色；子囊果生长层经常不存在；分生孢子结构稀疏至中等，有明显的渗出液；无可溶性色素；背面黄棕色。在5℃，7天：菌落直径3-5mm；菌丝白色或淡黄色；背面黄棕色。在37℃不萌发。

在麦芽浸膏琼脂(MEA)上，25℃，7天：菌落直径15-20mm，平坦，致密，绒状至轻微絮状；边缘菌丝体淡黄色，中心区域玉米黄色，围绕着密集的子囊果生长层。分生孢子结构稀疏至中等，颜色同CYA；有淡黄色渗出液；无可溶性色素；背面黄棕色至深黄棕色。

子囊果生长在疏松交织的黄色菌丝中，10-15天成熟，直径100-200um；子囊果单独产生；子囊孢子淡黄色，3.5-5.0×3.0-3.2μm，表面有刺。分生孢子梗发生于表面或气生菌丝，梗茎72-166×1.8-3.4μm，壁光滑至粗糙，帚状枝二轮生；梗基4-6个，8-12×1.6-3.0μm；瓶梗细长，壁光滑至粗糙，每轮2-4个，8-10×1.5-2.4μm，瓶梗颈长；分生孢子椭圆形，2.2-2.4×1.2-1.5μm，壁有小刺，分生孢子链较长。

根据以上培养特征可以确定该菌种F-01-195为邬氏黄丝曲霉Talaromyces wortmannii。

2.选择性地在种子培养基上培养微生物，

3.提供一种发酵培养基，该培养基为本领域常用培养基，优选加入黄豆粉的大米，

4.将微生物在发酵培养基中进行发酵，

5.选择性地对所得发酵液进行分离和纯化。

本发明的一个实施方案中，优选在pH约为7的条件下发酵。本发明另一实施方案中，分离包括用溶剂提取菌体再除去溶剂，纯化包括硅胶柱层析和选择性的HPLC单组分制备。

本发明方法不受上述顺序的限制，并且所述培养基成分可以在本领域技术人员可预见的范围内改变。

本发明另一方面提供了一种药物组合物，其含有作为活性成分的上述化合物和可药用载体。药物组合物的制备方法为本领域常用方法。

本文所述的化合物或其药学上可接受的加成盐或水合物可以利用各种给药途径或方式释放至患者。适合的给药途径包括但不限于吸入、透皮、口服、直肠、经粘膜、肠内和肠胃外给药，肠胃外给药包括肌内、皮下和静脉内注射。

本文所用的术语“给药”可涵盖所有直接与间接释放化合物到其预期作用部位的手段。

本文所述的化合物或其药学上可接受的盐和/或水合物可以单独给药，与其他本发明化合物联合给药，和/或以与其他已知治疗剂联合的形式给药。

本发明的活性化合物可以本身形式给药的，或者以药物组合物形式给药，其中活性化合物是与一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂混合的。按照本发明使用的药物组合物通常是按常规方式配制的，使用一种或多种生理学上可接受的载体，包含赋形剂和助剂，它们有利于将活性化合物加工成可以在药学上使用的制剂。适当的制剂取决于所选择的给药途径。

关于口服给药，化合物可以是容易这样配制的，将活性化合物与本领域熟知的药学上可接受的载体结合。这类载体使本发明化合物能够配制成片剂、丸剂、锭剂、胶囊剂、液体、凝胶、糖浆剂、浆液、悬液等，用于被所要治疗的患者口服。口用药物制剂可以这样得到，与固体赋形剂混合，可选地研磨所得混合物，加工颗粒的混合物，如果需要的话加入适合的助剂，得到片剂或锭剂芯。适合的赋形剂确切地是填充剂，例如糖，包括乳糖、蔗糖或甘露糖醇；纤维素制备物，例如玉米淀粉、小麦淀粉、稻米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要的话，可以加入崩解剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或藻酸或其盐，例如藻酸钠。

可以口服的药物制剂包括推入配合的胶囊剂，由明胶制成，以及软的密封胶囊剂，由明胶和一种增塑剂制成，例如甘油。推入配合的胶囊剂可以含有活性成分与下列成分的混合物：填充剂，例如乳糖；粘合剂，例如淀粉；和/或润滑剂，例如滑石粉或硬脂酸镁或微粉硅胶；和可选的稳定剂。在软胶囊剂中，活性化合物可以是溶解或悬浮在适合的液体中的，例如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。另外，可以加入稳定剂。所有口服给药制剂都应当是适合于这类给药的剂量。

关于颊给药，组合物可以采取片剂或糖锭剂的形式，按常规方式配制。

关于通过吸入给药，按照本发明使用的化合物适宜以气雾剂的形式从加压包装或雾化器中释放出来，其中利用适合的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟代甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他适合的气体。在加压气雾剂的情况下，通过提供计量释放的阀门可以确定剂量单位。用在吸入器或吹入器内的明胶胶囊和药筒可以配制成含有化合物与适合的粉末基质的粉末混合物，例如乳糖或淀粉。

化合物可以配制用于肠胃外给药，通过注射，例如急推注射或连续输注。注射用制剂可以是单位剂型，例如在安瓿或多剂量容器内，其中加入防腐剂。组合物可以采取在油性或水性载体中的悬液、溶液或乳液的形式，并且可以含有配制用试剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或藻酸或其盐，例如藻酸钠。

肠胃外给药用药物制剂包括水溶性活性化合物的水溶液。酌情可以制备活性化合物的油性注射悬液。适合的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油，例如芝麻油，或合成的脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酯，或脂质体，水性注射悬液可以含有增加悬液粘性的物质，例如羧甲基纤维素钠葡聚糖。可选地，悬液还可以含有适合的稳定剂或增加化合物溶解度的试剂，以便制备高浓缩的溶液。

或者，活性成分可以是粉末形式，在使用前用适合的载体再生，例如无菌无热原的水。

化合物还可以配制成直肠组合物，例如栓剂或保留灌肠剂，例如含有常规的栓剂基质，例如可可脂或其他甘油酯。

除了前述制剂以外，化合物还可以配制成药库制剂。这类长效制剂可以通过植入或经皮释放(例如皮下或肌内)、肌内注射或透皮贴剂给药。因而，例如，化合物可以与适合的聚合或疏水性材料(例如在可接受的油中的乳液)或离子交换树脂一起配制，或者配制成微溶性衍生物，例如微溶性盐。

药物组合物还可以包含适合的固体或凝胶相载体或赋形剂。这类载体或赋形剂的实例包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖、淀粉、纤维素衍生物，明胶、和聚合物，例如聚乙二醇。

优选地，组合物是单位剂型，例如片剂或胶囊剂。

给药方式以及有效剂量的选择将尤其根据所治疗的疾病而异。给药方式和剂量的选择在本领域技术人员的能力范围内。

本发明化合物的单位剂型通常将含有0.1至99重量％活性物质，更通常为5至75重量％活性物质。举例来说，单位剂型可以含有1mg至1g化合物，更通常为10mg至500mg，例如在50mg与400mg之间，剂量通常为100mg至200mg。

每个剂量单位或每次口服给药优选地含有1至250mg(关于肠胃外给药，优选地含有0.1至25mg)结构(I)或(II)化合物或其药学上可接受的盐，

本发明的化合物将按照有效提供所需治疗效果的量给药。提供所需治疗效果所必要的浓度将尤其根据疾病的明确性质、患者的年龄、体重和疾病的严重性而异。

给药剂量优选地将对患者是无毒的，不过在某些情况下所治疗疾病的严重性可能迫使给以导致一些毒性迹象的量的化合物。

通常，本发明化合物的给药量将在0.01mg/kg至100mg/kg体重的范围内，更优选为0.1mg/kg至10mg/kg体重，特别是1mg/kg至5mg/kg体重。

药学上可接受的本发明化合物正常地将按照每日剂量方案对受治疗者给药。关于成年患者，这例如可以是结构(I)或(II)化合物或其药学上可接受的盐的口服剂量在1mg与500mg之间，优选在1mg与250mg之间，或者静脉内、皮下或肌内剂量在0.1mg与100mg之间，优选在0.1mg与25mg之间，按照游离化合物计算，化合物每天分1至4次给药。因而，关于体重70kg的普通人，本发明化合物的典型每日剂量将在70mg至700mg的范围内。这样一种剂量例如可以每日分二至四次给药。

不过，给药剂量的大小和给药的频率最终将由治疗该患者的医师来决定和判断。

本发明的化合物还可以选择性地与已知的治疗糖尿病的药物联合给药。在上述组合物中可以加入有效量的治疗糖尿病的药物。治疗糖尿病的药物是本领域技术人员已知的，优选α-淀粉酶抑制剂、木糖醇或壳聚糖。

当本发明化合物与已知治疗糖尿病的药物联合给药时，它们可以同时、分别或顺序给药。优选将它们制成试剂盒的形式。

本发明的化合物可用于治疗和/或预防糖尿病并发症，其中糖尿病并发症选自下面并发症所组成的组：糖尿病肾病，糖尿病眼病、糖尿病神经系统疾病、糖尿病心脏病、糖尿病动脉硬化和糖尿病微血管病，优选糖尿病肾病、糖尿病眼病、糖尿病神经系统疾病或糖尿病微血管病。

本发明的另一方面，本发明化合物与已知治疗糖尿病的药物联合给药时，它们可以同时、分别或顺序给药。本发明提供了本发明化合物及含本发明化合物的组合物用于制备治疗和/或预防糖尿病并发症的药物中的用途，其中所述并发症如上所述。

本发明另一方面，本发明提供了含有治疗糖尿病药物的本发明组合物用于制备治疗和/或预防糖尿病并发症的药物中的用途，其中所述的糖尿病并发症如上所述。

本发明另一方面，本发明提供了本发明化合物及含本发明化合物的组合物用于制备抗肿瘤的药物中的用途，其中所述抗肿瘤药物包括抗结肠癌、肺癌、卵巢癌等实体瘤的抗肿瘤药物和抗白血病等腹水瘤药物。本发明化合物可以与已知抗肿瘤的药物联合给药，当它已知抗肿瘤的药物联合给药时，与它们可以同时、分别或顺序给药。

下面实施例进一步详细说明本发明，但它们并非理解成对本发明范围的任何限制。

仪器与试剂为本领域技术人员常用的仪器与试剂

除非特别说明，本发明中所说的％均为重量百分比

红外光谱仪：Nicolet公司magna-IR 550型

紫外光谱仪：Pharmacia公司Ultrospec 2100 Pro型

核磁共振仪：Varian公司inova 500

高分辨质谱仪：Bruker Daltonics公司Apex II FT-ICRMS

旋光仪：Perkin-elmer 241 polarimeter

材料：

NADPH(北京欣经科生物技术公司)，新鲜猪眼球(石家庄肉联厂)，

巯基乙醇，PMSF(苯基甲基磺酰基氟化物)，(sigma公司)

下面的操作均在0～4℃进行。每批取猪的晶状体约90g，于三倍体积的冷的0.05mol/L NaPi缓冲液中(含0.5mmol/LPMSF和0.5mmol/L EtSH)匀浆，10000×g离心50分钟除去不溶物。上清中加入(NH₄)₂SO₄至40％的饱和度，轻度搅拌15分钟，离心除去沉淀，再加入(NH₄)₂SO₄至50％的饱和度，轻度搅拌15分钟，离心除去沉淀，加入(NH₄)₂SO₄至75％的饱和度，轻度搅拌15分钟离心收集沉淀，用冷的0.05mol/L的NaPi(含0.5mmol/LPMSF和0.5mmol/L EtSH)溶解，于0.05mol/L的NaPi溶液(含0.5mmol/LPMSF和0.5mmol/L EtSH)中透析过夜。透析后，将上述酶液加入甘油至40％的浓度，于-20℃保存备用。

实施例1菌种的培养

斜面培养基：

淀粉2％，葡萄糖1％，热榨黄豆饼粉0.2％，麦牙粉0.6％，酵母粉0.3％，NaCl 0.2％，MgSO₄.7H₂O 0.1％，CaCO₃0.2％pH7.0

发酵培养基：

大米培养基为每100g大米中加入豆粉2.5g。由真菌F-01-195斜面，接种于种子培养基，27℃，72hr培养后，接入内含量为100g大米培养基的750ml三角瓶中，PH约为7于固体培养基中培养14天。

实施例2.化合物Wortmannilactone A、B、C、D的分离及结构确认

F-01-195固体培养物2kg，用4000ml乙酸乙酯浸泡2小时，乙酸乙酯层经无水Na₂SO₄脱水后，浓缩抽干后，得到褐色物质40g。

取38g样品，用少量甲醇溶解后，使用硅胶柱(φ2.5×25cm)色谱进行进一步的分离纯化，层析柱的洗脱条件为100％的CHCl₃至100％MeOH的阶段洗脱，收集合并活性组分，CHCl₃∶MeOH为5∶1部分浓缩抽干后得褐色固体320mg，使用ODS反相柱(PHENOMENEX ODS Φ20×250mm)在制备型HPLC(购自Waters公司，pump：515，Detector：996，Injector：752i)上进行单组分的制备(流动相为40％CH₃CN，流速为6ml/min，检测波长为271nm)得到四个淡黄色物质WortmannilactoneA(61.2mg)、B(8.1mg)、C(11.2mg)、D(6.1mg)，保留时间分别为15.4，20.5，17.8和22.3分钟。

各化合物的理化分析数据如下：

Wortmannilactone A：淡黄色固体，分子量(FAB-MS)：418，高分辨质谱HSFAB-MS：测定值：441.2247(M+Na)，理论值：C₂₄H₃₄O₆Na441.2239，分子式：C₂₄H₃₄O₆[α]_D ²⁰-52°(c0.8CH₃OH)；UV：λ_max ^meOH 225(ε4.80)，261(ε4.91)，271(ε4.95)nm.IR(KBr)(cm^-1)：3519，1696。

¹³C-NMR(δ，ppm)165.9(2-C)，145.17(4-C)，140.86(6-C)，137.61(15-C)，136.67(8-C)，135.69(19-C)，132.05(17-C)，130.68(7-C)，130.48(18-C)，129.09(16-C)，127.84(5-C)，127.22(20-C)，120.17(3-C)，70.0(22-C)，68.03(14-C)，66.28(10-C)，64.77(12-C)，62.8(24-C)，47.57(11-C)，47.06(13-C)，43.33(9-C)，42.82(23-C)，37.24(21-C)，24.33(25-C)。

¹H-NMR(δ，ppm)7.01(1H，dd，J＝15，11Hz)(4-H)，6.38(1H，dd，J＝15，11Hz)(6-H)，6.23(1H，dd，J＝15，11Hz)(5-H)，6.12(1H，m)(7-H)，6.12(1H，m)(16-H)，6.10(1H，m)(18-H)，5.99(1H，dd，J＝15，11Hz)(17-H)，5.92(1H，dd，J＝15，11Hz)(19-H)，5.84(1H，m)(8-H)，5.73(1H，d，J＝15Hz)(3-H)，5.59(1H，dt，J＝15，7.5Hz)(20-H)，5.33(1H，dd，J＝15，7.5Hz)(15-H)，4.99(1H，m)(22-H)，4.59(1H，brs)(10-OH)，4.53(1H，brs)(14-OH)，4.47(1H，brs)(23-OH)，4.36(1H，brs)(12-OH)，4.12(1H，m)(14-H)，3.85(1H，m)(10-H)，3.60(1H，m)(24-H)，3.27(1H，m)(12-H)，2.19(1H，m)，2.42(1H，m)(21-H)，2.06(1H，m)，2.55(1H，m)(9-H)，1.56(1H，m)，1.68(1H，m)(23-H)，1.34(1H，m)，1.51(1H，m)(11-H)，1.18(1H，m)，1.58(1H，m)(13-H)，1.05(3H，d，J＝6Hz)(25-H)。

Wortmannilactone B 淡黄色固体；分子量(FAB-MS)：432，高分辨质谱HSFAB-MS：测定值：455.2420(M+Na)。理论值：455.2410，C₂₅H₃₆O₆Na。分子式：C₂₅H₃₆O₆。[α]_D ²⁰-35°(c0.52CH₃OH).UVλ_Max ^MeOH224.7(ε4.83)，60.9(ε4.92)，270.9(ε4.98)nm.IR(KBr)(cm^-1)：3520，1696。

¹H(500Hz，DMSO-d₆)data，5.71(1H，d，15)(H-2)，6.99(1H，dd，15，11)(H-3)，6.23(1H，m)(H-4)，6.25(1H，m)(H-5)，5.95(1H，dd，15，11)(H-6)，5.85(1H，m)(H-7)，2.1(1H，m)(H-8a)，2.55(1H，m)(H-8b)，3.89(1H，m)(H-9)，1.3(1H，m)(H-10a)，1.5(1H，m)(H-10b)，3.11(1H，m)(H-11)，1.1(1H，m)(H-12a)，1.56(1H，m)(H-12b)，3.71(1H，m)(H-13)，5.33(1H，dd，15，7.5)(H-14)，6.20(1H，m)(H-15)，6.24(1H，m)(H-16)，6.15(1H，m)(H-17)，5.85(1H，m)(H-18)，5.70(1H，m)(H-19)，2.25(1H，m)(H-20a)，2.45(1H，m)(H-20b)，5.01(1H，m)(H-21)，1.56(1H，m)(H-23a)，1.65(1H，m)(H-23b)，3.60(1H，m)(H-24)，1.09(3H，d，6)(H-25)，3.072(3H，s)(H-26)，4.36(1H，d，7)(9-OH)，4.55(1H，d，4.5)(11-OH)，4.53(1H，d，5)(23-OH).¹³C NMR(125Hz，DMSO-d₆)data，165.76(C-1)，120.03(C-2)，145.50(C-3)，127.52(C-4)，141.11(C-5)，131.19(C-6)，137.06(C-7)，43.42(C-8)，65.96(C-9)，48.02(C-10)，64.02(C-11)，44.66(C-12)，78.96(C-13)，133.34(C-14)，133.08(C-15)，131.73(C-16)，130.27(C-17)，135.46(C-18)，127.88(C-19)，36.62(C-20)，69.87(C-21)，42.1(C-23)，62.76(C-24)，24.41(C-25)，55.13(C-26)。

Wortmannilactone C 淡黄色固体；分子量(FAB-MS)：418，高分辨质谱HSFAB-MS：测定值：441.2249(M+Na)，理论值：C₂₄H₃₄O₆Na 441.2239，分子式：C₂₄H₃₄O₆[α]_D ²⁰-9.2°(c0.85CH₃OH)；UV：λ_max ^MeOH 224.7(ε4.78)，260.9(ε4.88)，270.9(ε4.91)nm.IR(KBr)(cm-1)3520，1711.¹H NMR(500Hz，DMSO-d₆)5.62(1H，d，15)(H-2)，7.06(1H，dd，15，11)(H-3)，6.13(1H，dd，15，11)(H-4)，6.55(1H，dd，15，11)(H-5)，6.05(1H，m)(H-6)，5.88(1H，m)(H-7)，2.21(1H，m)(H-8a)，2.31(1H，m)(H-8b)，3.73(1H，m)(H-9)，1.21(1H，m)(H-10a)，1.54(1H，m)(H-10b)，3.48(1H，m)(H-11)，2.07(1H，m)(H-12a)，2.21(1H，m)(H-12b)，5.43(1H，m)(H-13)，5.92(1H，m)(H-14)，5.99(1H，m)(H-15)，5.99(1H，m)(H-16)，5.78(1H，15，11)(H-17)，5.47(1H，dd，m)(H-18)，3.84(1H，m)(H-19)，1.75(1H，m)(H-20a)，1.85(1H，m)(H-20b)，5.17(1H，m)(H-21)，1.54(2H，m)(H-23)，3.54(1H，m)(H-24)，1.03(3H，d，6)(H-25)，4.61(1H，d，5)(9-OH)，4.50(1H，d，4.5)(11-OH)，4.68(1H，d，5)(19-OH)，4.58(1H，d，5)(24-OH)，.¹³C NMR(125Hz，DMSO-d₆)data，166.00(C-1)，120.38(C-2)，144.75(C-3)，128.39(C-4)，140.63(C-5)，132.94(C-6)，135.53(C-7)，39.5(C-8)，66.58(C-9)，40.40(C-10)，67.32(C-11)，40.53(C-12)，130.23(C-13)，132.70(C-14)，132.33(C-15)，133.38(C-16)，129.92(C-17)，137.46(C-18)，70.91(C-19)，43.47(C-20)，69.66(C-21)，44.88(C-23)，62.71(C-24)，24.14(C-25)。

Wortmannilactone D 淡黄色固体；分子量(FAB-MS)：432，高分辨质谱HSFAB-MS：测定值：455.2418(M+Na)，理论值：C₂₄H₃₄O₆Na 455.2410，分子式：C₂₅H₃₆O₆。[α]_D ²⁰-3.2°(c0.35CH₃OH)；UV：λ_max ^MeOH224.7(ε4.79)，260.9(ε4.89)，270.9(ε4.93)nm.IR(KBr)(cm-1)：3519，1708。¹H(500Hz，DMSO-d₆)5.61(1H，d，15)(H-2)，7.04(1H，dd，15，11)(H-3)，6.12(1H，dd，15，11)(H-4)，6.55(1H，dd，15，11)(H-5)，6.05(1H，m)(H-6)，5.84(1H，m)(H-7)，2.21(1H，m)(H-8a)，2.32(1H，m)(H-8b)，3.72(1H，m)(H-9)，1.1(1H，m)(H-10a)，1.54(1H，m)(H-10b)，3.50(1H，m)(H-11)，2.08(1H，m)(H-12a)，2.19(1H，m)(H-12b)，5.45(1H，m)(H-13)，5.95(1H，m)(H-14)，5.95(1H，m)(H-15)，5.84(1H，m)(H-16)，5.83(1H，m)(H-17)，5.31(1H，dd，15，9)(H-18)，3.47(1H，m)(H-19)，1.85(1H，m)(H-20a)，1.95(1H，m)(H-20b)，5.17(1H，m)(H-21)，1.54(2H，m)(H-23)，3.56(1H，m)(H-24)，1.03(3H，d，6)(H-25)，3.06(3H，s)(H-26)，4.40(1H，d，5)(9-OH)，4.62(1H，d，4.5)(11-OH)，4.51(1H，d，5)(23-OH).¹³C NMR(125Hz，DMSO-d₆)data，166.00(C-1)，120.25(C-2)，144.94(C-3)，128.36(C-4)，140.63(C-5)，132.94(C-6)，135.53(C-7)，39.5(C-8)，66.47(C-9)，40.27(C-10)，67.18(C-11)，39.8(C-12)，130.95(C-13)，133.71(C-14)，132.19(C-15)，133.39(C-16)，129.69(C-17)，133.07(C-18)，80.84(C-19)，41.46(C-20)，69.86(C-21)，44.78(C-23)，62.78(C-24)，24.22(C-25)，55.51(C-26)。

结构解析：

Wortmannilactone A：

UV谱中224.7nm(ε4.80)，260.9nm(ε4.91)，270.9nm(ε4.95)为最大吸收值，提示出该化合物中有较强的共轭系统存在。IR谱中显示有酯羰基(1695.9cm^-1)。

13CNMR谱中显示该化合物中有24个碳，其中165.9ppm的碳显示为酯羰基的特征；120.1～145.7ppm的12个碳显示为双键次甲基的特征；62.8～70.0ppm的5个碳显示为连氧亚甲基的特征；37.2～47.6ppm的5个碳为脂肪亚甲基的特征；24.3ppm为甲基碳。1HNMR谱中，该化合物有34个氢存在，在5.53～7.01ppm的12个氢为双键次甲基上氢的信号，仔细辨别其偶合常数可以推定双键的偶合方式为反式偶合。

WortmannilactoneA的结构主要通过¹H-¹H COSY和HMBC可以推出各个碳氢的链接关系，从而确定该化合物的结构。根据δ_H5.73和羰基碳(C-1 atδ_c165.9)的在HMBC上的相关以及它的偶合常数J＝15Hz，可以把该氢归位于3位，H2～7及H14～19可以通过COSY谱和氢谱的偶合常数确定为相邻的非取代的三烯结构，HMBC谱也支持这一推断。同时该化合物的UV谱也支持这一推断。在δ_C68.03(C-13)连氧次甲基可以通过δ_H5.33(H-14)和δ_H4.12(H-13)以及δ_H4.12(H-13)和δ_H1.18(H-12a)的COSY相关确定和亚甲基δ_C47.06(C-12)和δ_C137.61(C-14)烯碳相连。而同时δ_H1.18(H-12a)，δ_H1.58(H-12b)和C-13(δ_C68.03)以及δ_H5.33(H-14)和δ_C68.03(C-13)在HMBC谱上的相关也支持该推断。H9～H12和H20～H25的相邻关系也可以同样通过COSY和HMBC关系确定。氢谱中在偏低场的4.99ppm(H-21)的氢和其相应的70.0ppm(C-21)的碳的化学位移表明该化合物形成了一个内酯结构，这种连接方式可以被C-1(δ_C165.9)的化学位移以及在HMBC谱中H-21和C-1的相关所证明。δ_H4.36，4.59，4.53，4.47的羟基氢可以通过δ_H4.36和δ_H3.85(H-9)，δ_H4.59和δ_H3.27(H-11)，δ_H4.53和δ_H4.12(H-13)以及δ_H4.47和δ_H3.60(H-24)的相关关系归位为9，11，13，24-OH。所以该化合物被确定为一个22元环的大环内酯化合物，被命名为Wortmannilactone A。

Wortmannilactone C和Wortmannilactone A有相同的分子式(m/z 441.2249，calcd for C₂₄H₃₄O₆Na[M+Na]⁺，HRFABMS)，根据¹³C，¹H NMR谱的信号可以确定该化合物同样为大环内酯类化合物。Wortmannilactone C的大致结构也是通过COSY和HMBC NMR谱推导出的，并发现和Wortmannilactone A有许多相似之处。但在δ_C70.91(C-19)连氧次甲基可以通过δ_H3.84(H-19)和5.47(H-18)，δ_H3.84(H-19)和δ_H1.75(H-20a)以及δ_H1.75(H-20a)和δ_H5.17(H-21)的COSY相关确定和亚甲基δ_C43.47(C-20)和δ_C137.46(H-18)烯碳相连。而同时δ_H1.85(H-20b)和δ_C70.91(C-19)以及5.78(H-17)和δ_C70.91(C-19)在HMBC谱上的相关也支持该推断。δ_H4.61，4.50，4.68，4.38的羟基氢可以通过4.36 to δ_H3.73(H-9)，δ_H4.50 to δ_H3.48(H-11)δ_Hδ_H4.38 to δ_H3.84(H-19)以及4.38to δ_H 3.54(H-24)的相关关系归位为9，11，19，24-OH。

¹³C，¹H NMR谱的信号显示Wortmannilactone B，D分别是Wortmannilactone A，C的甲酯衍生物。通过一维和二维NMR谱可以确定Wortmannilactone B为Wortmannilactone A-14甲酯，Wortmannilactone D为Wortmannilactone D-19甲酯。

从而确定化合物Wortmannilactones的结构如下：

其中R₁＝OH时，为化合物Wortmannilactone A，

    R₁＝OCH₃时，为化合物Wortmannilactone B。

其中，R₂＝OH时，为化合物Wortmannilactone C，

      R₂＝OCH₃时，为化合物WortmannilactoneD。

实施例3化合物Wortmannilactone A、B、C、D的活性测定(1)

测定方法及实验数据的处理与本申请人在2003年7月10日申请的申请号为：03146651.6发明名称为醛糖还原酶抑制剂，其制备方法和用途中公开的方法相同。

取化合物Wortmannilactone适量，用甲醇配制成20mg/ml溶液，并逐级稀释至10mg/ml、5ml/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml。分别取出50微升加入共1000微升的测活体系中，其终浓度分别为1mg/ml(2.39mmol/L)，0.5mg/ml(1.19mmol/L)，0.25mg/ml(0.60mmol/L)，0.125mg/ml(0.30mmol/L)，0.0625mg/ml(0.15mmol/L)，测定其对醛糖还原酶的抑制活性。

测活反应的样品管加入：60mmol/L NaPi缓冲液(pH6.2)和适量的酶液，50μl样品的甲醇溶液；对照孔加入：60mmol/L NaPi缓冲液(pH6.2)和适量的酶液，50μl甲醇；空白孔加入：60mmol/L NaPi缓冲液(pH6.2)，50μl甲醇。样品孔、对照孔和空白孔均在37℃保湿15分钟，各管加入334μl 1.2mol/LLi₂SO₄、83μl 36mmol/L DL-甘油醛和83μl 1.5mmol/L NADPH开始反应，用生化分析仪(RBT 815上海第三分析仪器厂)于340nm波长处测定37℃每分钟的光密度减少值(ΔOD/min)。

结果如表1：

                                表1

	A	B	C	D
					IC50(mmol/L)	0.407	0.424	0.385	0.410

本发明的实施例中为了简便起见，A、B、C、D分别代表化合物Wortmannilactone A、Wortmannilactone B、Wortmannilactone C、Wortmannilactone D。

实施例4化合物WortmannilactoneA、C的活性测定(2)

体内实验参照Dvornik等的方法并进行适当的改进。(Science182：1146-1148 1973)

雌性SD大鼠(120～140g)静脉注射链尿霉素70mg/kg，形成试验性糖尿病大鼠。在三周内，大鼠被连续使用对照食物以及含有本药物0.8％的食物(1.5g药物/kg每天)进行喂养，每组动物12只。处死大鼠，取出大鼠的晶状体。测定晶状体内葡萄糖，山梨醇和果糖的浓度。葡萄糖，果糖浓度的测定采用市售试剂盒(德国拜发公司产品)，山梨醇浓度的测定参照Bergmeyer等的方法。(Clin.Biochem.2，373(1969))。结果见表2，表中数据为减去正常小鼠相应值后的数据。

                           表2

分组	累积量(毫摩尔/克组织)
				葡萄糖(Mean±S.E)	山梨醇(Mean±S.E)	果糖(Mean±S.E)
	对照	11.3±1.0	2.12±0.18				4.68±0.38
A的测定值				11.8±1.6	1.34±0.21*	2.58±0.28*
	A的变化率		-36.8％				-44.8％
C的测定值				11.6±1.3	1.46±0.18	2.76±0.32
	C的变化率		-31.2％				-41.0％

P＜0.05

从大鼠的体内实验可以看出，上述化合物可以明显的降低糖尿病大鼠的山梨醇和果糖的积累，从而达到对糖尿病并发症的治疗效果，同时对组织内葡萄糖没有影响。

实施例5化合物Wortmannilactone A、B、C、D的活性测定(3)

我们按照目前通用的抗肿瘤活性测定方法进行了抗肿瘤活性的测定。采用的细胞系和实验用材料均能够很方便购得。RPMI1640和磺酰罗丹明B均购自Sigma公司。

取指数生长期细胞用完全培养基(RPMI1640)配成细胞数为2.5×10⁴/ml的悬液，接种于96孔培养板中，加入待试药物。于培养后72小时后使用磺酰罗丹明B(SRB)法测定药物对肿瘤细胞的杀伤作用。

磺酰罗丹明B(SRB)法的测定方法为用1％醋酸配成0.4％溶液。细胞在加药培养结束后用终浓度为10％三氯醋酸固定细胞，放置1小时。用去离子水洗5遍，甩干，空气干燥。每孔加入100ul SRB染料。结合的SRB用150μl 10mmol/L非缓冲Tris碱液(pH10.5)溶解。用酶标仪测定其在515nm处的吸光度。

实验结果见表3：

                 表3化合物的抗肿瘤活性IC₅₀(μmol/L)：

化合物	HCT-5	HCT-115	A549	MDA-MB-231	K562
						A	28.7	35.0	76.5	107.6	65.7
B	32.4	41.7	104.2	95.6	115.7
						C	56.3	52.4	118.5	120.4	130.5
D	46.3	44.7	115.7	111.1	122.6

由以上结果可以看出，本发明的化合物有较强的抗肿瘤活性。

实施例6化合物Wortmannilactone A、C的活性测定(4)

实验方法：将S180肿瘤细胞(购自武汉细胞所)腹腔注射昆明小鼠(KM小鼠)体内生长6-8天后，抽取小鼠的腹水，用生理盐水洗涤并稀释(10⁷/ml)后，接种到体重均一的KM小鼠腋下(0.2ml/只)，24小时后，将小鼠随机分为阴性对照组、阳性药对照组、受试物各剂量组，每组10只，各组小鼠平均体重相差＜1g，接种瘤株24小时后开始给药，连续给药7天.结束给药后5天处死小鼠剥离瘤块，并称重，计算抑瘤率.

抑瘤率＝(1-实验组小鼠平均瘤重/对照组小鼠平均瘤重)*100％

实验结果见表4

                                  表4

组别	剂量mg/d·Kg	开始体重(g)	去瘤后体重(g)	瘤重(g)	抑瘤率(％)
						生理盐水	0.5ml	23.1±1.4	36.6±3.4	2.0±0.6
溶剂	0.5ml	23.0±7.2	37.9±4.0	1.4±0.6	---
						环磷酰胺	0.8	23.0±1.9	32.9±2.4	0.3±0.1	78.6
A	1.8	23.5±1.9	30.1±4.7	0.46±0.4	67.1
						0.6	22.9±1.6	33.4±4.2	0.57±0.3	59.3
	C	1.8	23.9±2.1	29.8.1±3.7	0.48±0.5						65.8
0.6						23.1±1.6	34.2.4±4.5	0.60±0.2	57.2

P＜0.05

实验结论：

受试品在该实验条件下，对S180荷瘤小鼠具有较强的抑瘤作用。

Claims (10)

1.如下式(I)的化合物Wortmannilactone A、B及其可药用盐、溶剂化物、立体异构体或前药：

其中R₁＝OH时，为化合物Wortmannilactone A，

    R₁＝OCH₃时，为化合物Wortmannilactone B。

2.权利要求1所述的化合物的同分异构体及可药用盐、溶剂化物、立体异构体或前药，如下式(II)

其中，R₂＝OH时，为化合物Wortmannilactone C，

      R₂＝OCH₃时，为化合物WortmannilactoneD。

3.一种制备权利要求1或2所述的化合物的方法，其包括：培养产生式(I)或(II)的化合物的微生物，然后对所得发酵液进行分离和纯化。

4.权利要求3的方法，其中所述的微生物为邬氏黄丝曲霉(Talaromyceswortmannii)CGMCC No.1224。

5.一种药物组合物，其含有权利要求1或2的化合物作为活性成份和可药用载体。

6.权利要求1或2的化合物或权利要求5所述的药物组合物，制备用于醛糖还原酶抑制剂可预防和/或治疗的疾病的药物中的用途。

7.权利要求1或2的化合物或权利要求5所述的药物组合物，制备用于治疗和/或预防糖尿病并发症的药物中的用途。

8.权利要求7的用途，其中所述的糖尿病并发症选自由下面并发症组成的组：糖尿病肾病、糖尿病眼病、糖尿病神经系统疾病、糖尿病心脏病、糖尿病动脉硬化和糖尿病微血管病。

9.权利要求1或2的化合物或权利要求5所述的药物组合物，制备用于抗肿瘤药物中的用途。

10.权利要求9的用途，其中所述的肿瘤为以下之一：结肠癌、肺癌、乳腺癌、白血病。

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