CN1795271A - 使生产游霉素的Streptomyces菌株产率提高的自诱导化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了如结构式(Ⅰ)所示的化合物。此外，本发明提供了生产如结构式(Ⅰ)所示的化合物的方法。本发明还提供了一种通过Streptomyces菌株生产游霉素的方法，所述方法包括将包含自诱导物的组合物加入到发酵培养基中。本发明还提供了如结构式(Ⅰ)所示的化合物在通过发酵Streptomyces菌株来制造产物的过程中的用途。本发明最后公开了一种Streptomyces菌株，其在生产游霉素的方面有缺陷，但能生产如结构式(Ⅰ)所示的化合物，其中，R1和R2都是氢；以及另一种Streptomyces菌株，其在生产R1和R2都是氢的如结构式(Ⅰ)所示的化合物的方面有缺陷，但能在所述化合物存在的情况下生产游霉素。

Description

使生产游霉素的Streptomyces菌株产率提高的自诱导化合物
技术领域
本发明涉及对化合物(例如次级代谢产物、蛋白质或多肽)的发酵生产。更具体地，本发明涉及能提高生产游霉素的Streptomyces菌株产率的化合物。
背景技术
放线菌(Actinomycetes)是一族有丝细菌，其能产生很多不同的次级代谢产物，其中包括多烯大环内酯类。多烯大环内酯类是抗真菌化合物，其可由超过一百种不同的放线菌合成。从生物合成的观点来看，这些化合物是广泛分布的多聚乙酰(polyketide)类化合物的亚族。公知的多烯大环内酯类的例子是两性霉素B、游霉素(也被称为匹马霉素)和制霉菌素。
为获得这些化合物，通常在液体培养基(深层培养物)中培养细菌，使产物排出到液体中，从中对其进行分离。产物的形成可以发生于生物最初的快速生长期间和/或培养物保持缓慢生长或无生长状态的第二阶段。在此过程中，单位时间形成的产物的量(产率)通常是很多因子的函数：生物的内在代谢活性；培养物中占据主导的生理条件(例如，pH、温度、培养基组分)；以及在用于该过程的设备中存在的生物的量。通常，对发酵方法进行的优化中，主要着力于获得最高的可能产率。对此问题的一种解决方法是获得尽可能高的细菌浓度。但是，属于放线菌家族的细菌的一种独特的特征使其难于达到该目标。生长于深层培养物中的放线菌具有丝状形态，这通常导致培养液体高度粘滞。对获得高产率的问题的另一种解决方法可以是开发新策略，以提高放线菌的产率。这可能意味着在更高的生产速率下进行同样的方法，和/或将可能获得更高浓度的产物。该方法的这两种改变都将导致更高的产率。因此，人们需要新的策略，以提高包含放线菌的发酵方法的产率。
发明内容
本发明提供了一种如结构式(I)所述的化合物或其盐：
其中：
-每个R1都是：氢，任选被取代的烷基，被取代的甲硅烷基或-C(O)(R3)，其中R3是氢，任选被取代的烷基，或任选被取代的芳基；
以及
-每个R2都是：氢，任选被取代的烷基，被取代的甲硅烷基或-C(O)(R3)，其中R3是氢，任选被取代的烷基，任选被取代的芳基或OR4，其中R4是任选被取代的烷基、或任选被取代的芳基。
每个R3和R4优选是甲基、乙基、正丙基或异丙基。
此外，本发明还提供了生产如结构式(II)所示的化合物的方法：
Figure A20048001417200062
其中包括，发酵能生产所述如结构式(II)所示化合物的Streptomyces菌株。该方法还可包括将如结构式(II)所示的化合物从所获得的混合物中分离出来。然后可对分离出的如结构式(II)所示的化合物进行纯化。
此外，本发明还提供了生产如结构式(I)所示的化合物的方法，其中R1和R2不都是氢，所述方法包括用如结构式(II)所述的化合物与乙酰化试剂反应。
本发明提供了通过Streptomyces菌株生产游霉素的发酵方法，所述方法包括将包含自诱导物(auto inducer)的组合物加入到发酵培养基中去。
本发明还提供了通过Streptomyces菌株生产游霉素的发酵方法，所述方法包括提高发酵培养基中自诱导物的浓度，这是通过提高所述Streptomyces菌株对所述自诱导物的天然生产来实现的。
本发明此外还提供了如结构式(I)所示的化合物在通过发酵Streptomyces菌株来制造产物的过程中的用途。
本发明还提供了一种Streptomyces菌株，其在生产游霉素的方面有缺陷，但能生产如结构式(II)所示的化合物。本发明此外还提供了一种Streptomyces菌株，其在生产如结构式(II)所示的化合物的方面有缺陷，但能在所述如结构式(II)所示的化合物存在的情况下生产游霉素。
发明详述
本文中通篇使用的术语和缩写的定义如下所示。
术语“A因子”指2-(6’-甲基庚酰)-3R-羟甲基-4-丁内酯，其是来自Streptomyces griseus的游霉素诱导因子。
术语“FMOC”指9-芴基甲氧羰基(9-fluorenylmethyloxycarbonyl)。
术语“IP因子”指2，3-二氨基-2，3-二(羟甲基)-1，4-丁二醇。
术语“npi”指游霉素生物合成受损的非生产突变体。
术语“MEA”指麦芽提取物培养基。
术语“NBG”指蛋白胨-牛肉提取物培养基。
术语“NTG”指利用N-甲基-N’-亚硝基胍的诱变。
术语“TSB”指胰蛋白胨大豆肉汤提取物。
术语“YED”指酵母提取物-葡萄糖培养基。
术语“YEME”指酵母提取物-麦芽提取物培养基。
游霉素是糖基化多烯的原型分子，其对于抗真菌疗法很重要。游霉素还显示出抗病毒活性，其能激活免疫反应，并协同其它抗真菌药物或抗肿瘤药物发挥作用。游霉素可通过Streptomyces菌株来生产，例如Streptomyces natalensis和Streptomyces gilvosporeus，游霉素广泛应用于食品工业，以预防奶酪和其它未灭菌食品(即咸肉)受到霉菌污染。
我们惊奇地发现、分离并鉴定了一组新的化合物，当将其加入到生产游霉素的生物中后，它们能使游霉素的产率增加20-65％。此类化合物中的一种，2，3-二氨基-2，3-二(羟甲基)-1，4-丁二醇(下文中称为IP因子)是对称的，并且具有完全新颖的化学结构。
被称为自诱导物的可扩散的低分子量化学物质可对放线菌的次级代谢和细胞分化加以控制。存在有不同种类的自诱导物因子，其属于至少五个化学物质类别。这些类别如下所述：
1)丁内酯类，其包括Streptomyces griseus的A因子，Streptomycesvirginiae的virginia丁内酯因子和从Streptomyces coelicolor、Streptomycesviridochromogenes、Streptomyces bikiniensis、Streptomyces cyaneofuscatus、Vibrio fischeri和其它放线菌分离出的类似的化合物。这些化合物的结构在Horinouchi et al.(Mol.Microbiol.12，859-864，1994)中有所描述；
2)革兰氏阴性细菌的高丝氨酸内酯；
3)生产利福霉素的Amycalotopsis(Nocardia)mediterranei的类核苷酸B因子(3’-(1-丁基磷酸)腺苷)；
4)呋喃酰(furanosyl)硼酸二酯，它是革兰氏阴性细菌的群体感应(quorum sensing)诱导物；以及
5)革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的经修饰肽信息素。
令人吃惊地，本文公开的化合物与上面这些类别的自诱导物并没有结构上的联系。
在本发明的第一个方面，描述了如结构式(I)所述的化合物或其盐：
其中：
-每个R1都是：氢，任选被取代的烷基，被取代的甲硅烷基或-C(O)(R3)，其中R3是氢，任选被取代的烷基，或任选被取代的芳基；
并且
-每个R2都是：氢，任选被取代的烷基，被取代的甲硅烷基或-C(O)(R3)，其中R3是氢，任选被取代的烷基，任选被取代的芳基或OR4，其中R4是任选被取代的烷基、或任选被取代的芳基。优选地，所述盐是来自无机酸，例如二氧化碳、磷酸、氢溴酸、氢氯酸、硝酸、高氯酸、硫酸等或来自有机酸，例如乙酸、蚁酸、草酸等的盐。
每个R3和R4优选是甲基、乙基、正丙基或异丙基。
任选被取代的烷基是C1-20的直链烷基，优选为C1-12，更优选为C1-8，最优选为C1-5，其链上的一个或多个位置可被或可不被其它基团所取代，其它基团可以是烷基、芳基、氨基、羟基和/或硫基。类似地，任选被取代的芳基是其环上的一个或多个位置可被或可不被其它基团所取代的芳香基团，例如苯、嘧啶、噻唑等，其它基团可以是烷基、芳基、氨基、羟基和/或硫基。甲硅烷基通常被简单烃链所取代，例如甲基、乙基、异丙基、叔丁基或苯基等芳基。
在一种实施方式中，R1和R2都是氢，该化合物被称为IP因子。
在另一种实施方式中，R1是-C(O)(R3)，其中R3是氢、任选被取代的烷基或任选被取代的芳基，且R2是氢。在这种实施方式中，R3优选是甲基、乙基、正丙基、异丙基。上述IP因子的乙酰化衍生物可用于NMR结构阐明的研究，还可作为中间产物用于生产IP因子的合成方法中。所述的化合物是酯，可通过IP因子与一系列本领域技术人员已知的乙酰化试剂(例如，March“Advanced Organic Chemistry”，John Wiley & Sons，Inc，1985)反应来获得。在某些情况下，上述反应需要进行氨基的保护-去保护。所述乙酰化试剂可以是羧酸，其可能需要催化剂(例如强有机酸)的存在；酸性卤化物，例如乙酰氯；或酸酐，例如乙酸酐。优选的所述化合物是如结构式(I)所示的，其其中R1是-C(O)(CH3)，R2是氢(四乙酰基IP因子，IPa)或如结构式(I)所示的，且其中R1是-C(O)(CH2CH3)，R2是氢。
在又一种实施方式中，R1是氢，R2是-C(O)(R3)，其中R3是氢，任选被取代的烷基，任选被取代的芳基或OR4，其中R4是任选被取代的烷基、或任选被取代的芳基或其盐。每个R3和R4优选是甲基、乙基、正丙基或异丙基。IP因子的此类衍生物可被用作为生产IP因子的合成方法中的中间产物。所述的化合物是酰胺，可通过IP因子与一系列本领域技术人员已知的乙酰化试剂(例如，March“Advanced Organic Chemistry”，John Wiley& Sons，Inc，1985)反应来获得。在某些情况下，上述反应需要进行氨基的保护-去保护。所述乙酰化试剂可以是羧酸，其可能需要催化剂(例如强有机酸)的存在；酸性卤化物，例如乙酰氯或氯甲酸9-芴基甲基酯；或酸酐，例如乙酸酐。优选的所述化合物是如结构式(I)所示的，其中R1是氢，R2是9-芴基甲氧羰基(di-FMOC-IP因子)。
本发明的第二个方面是生产如结构式(I)所示的化合物或其盐的方法，其中R1是氢，R2是氢。该方法包括对生产游霉素的生物进行发酵，例如Streptomyces natalensis或Streptomyces gilvosporeus。所述的R1是氢且R2是氢的如结构式(I)所示的化合物可以例如通过用水不混溶溶剂或部分水混溶溶剂来萃取得到。优选地，所述Streptomyces natalensis菌株是Streptomyces natalensis ATCC 27448或能产生IP因子的npi突变体(见实施例)。优选地，所述Streptomyces gilvosporeus菌株是Streptomycesgilvosporeus ATCC 13326。优选地，所述溶剂是乙酸乙酯。然而，其它溶剂，例如1-丁醇，叔丁醇、乙酸丁酯、氯仿、二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、二异丙醚、二乙醚、乙酸异丙酯、乙酸甲酯、甲基异丁基酮、甲基叔丁基酮、乙酸丙酯、甲苯、二甲苯等也可使用。选择最方便的溶剂对于本领域的技术人员来说不存在任何问题。萃取过程可重复若干次，例如2至10次，或在连续逆流萃取设备中进行，这取决于溶剂的性质。所述R1是氢，R2是氢的如结构式(I)所示的化合物的产量通常从1nM至100mM，优选从10nM至10mM，更优选从100nM至1mM。
在一种实施方式中，在萃取之前，用本领域可获得的任何浓缩方法对培养物进行浓缩，例如蒸发、冻干或膜技术。
在另一种实施方式中，通过加入酸将pH调至1至5之间，优选在2至4之间，更优选在2.5至3.5之间，来使可选地经过浓缩的培养物澄清。优选地，所述的酸是氢氯酸。但是，本领域的技术人员知道，其它的矿物酸(例如硫酸和硝酸)以及有机酸(例如乙酸和蚁酸)也可使用。所述澄清过程可在温度为0至50℃之间进行，优选在1至30℃之间，更优选在2至25℃之间，进一步更优选在3至20℃之间，最优选在4至10℃之间。
在另一种实施方式中，从经过澄清的发酵液体中除去固体。任何可用的固液分离技术(例如过滤和离心)都可用于此目的。在萃取之前，经过澄清的液体的pH被调至5至9之间，优选在6至8之间，更优选在6.5至7.5之间。所述pH变化可通过本领域技术人员已知的任何碱来完成。其例子包括氢氧化铵、氢氧化钾、碳酸钠、氢氧化钠或其它无机或有机碱。
在另一种实施方式中，用已知的纯化技术对有机相中存在的IP因子进行进一步的纯化，所述技术例如碳处理、尺寸排除色谱、HPLC色谱、疏水相互作用色谱或两种或多种所述纯化技术的组合。优选地，在纯化之前，用上文所述的浓缩技术对含有IP因子的有机相进行浓缩。
在另一种实施方式中，可通过使用有机合成和/或生物有机合成技术的全合成方式来获得IP因子。一种方法是将两个氨基引入2，3-二(羟甲基)-1，4-丁-2-烯二醇，例如通过卤化进行，接着与叠氮化物反应，接着还原叠氮化物的部分。另一种方法是直接向2，3-二(羟甲基)-1，4-丁-2-烯二醇加入叠氮化卤，然后用叠氮化物置换出剩余卤化物，然后是还原。所述2，3-二(羟甲基)-1，4-丁-2-烯二醇可通过对容易获得的2，3-二甲基-2-丁烯进行烯丙位羟基化来获得，或通过任选地受保护的二羟基丙酮与任选地受保护的2-溴-1，3-丙二醇的膦盐发生反应来获得。
其它的合成方法同样也是可以适用的，本领域的技术人员能够基于基础化学知识设计出最可行的方法。一种特别的替代方法是对容易获得的二羟基丙酮进行还原，得到2，3-二(羟甲基)-2，3-二羟基-1，4-丁二醇，再用公知技术将后一种化合物的叔羟基再转化为氨基，例如将所述叔羟基转化为磺酸酯，接着用叠氮化物(例如金属叠氮化物)进行取代然后再进行还原。任选地，在这些过程期间，伯氨基被保护，之后去保护，使用的保护基团如Greene et al.(“Protective Groups in Organic Synthesis”，John Wiley &Sons，Inc，1991)所述。
本发明的第三个方面是一种经过改善的用于生产游霉素的发酵方法，所述方法包括将包含自诱导物的组合物加入到发酵培养基中。此类自诱导物可以是任何丁内酯类的自诱导物(例如，Streptomyces griseus的A因子，Streptomyces virginiae的virginia丁内酯因子和从Streptomycescoelicolor、Streptomyces viridochromogenes、Streptomyces bikiniensis、Streptomyces cyaneofuscatus、Vibrio fischeri和其它放线菌分离出的类似的化合物)或IP因子或其盐。所述发酵方法可以是任何基于使用Streptomyces菌株的生产方法。所述Streptomyces菌株可以是任何生产游霉素的菌株，例如Streptomyces natalensis或Streptomyces gilvosporeus。优选地，所述生产游霉素的菌株是Streptomyces natalensis ATCC 27448或Streptomyces gilvosporeus ATCC 13326，但是其它菌株同样适用。所述Streptomyces菌株还可以是生产两性霉素B的菌株，例如Streptomycesnodosus，或生产制霉菌素的菌株，例如Streptomyces noursei。或者，所述Streptomyces菌株还可以是适于生产游霉素或游霉素衍生物的重组菌株，如Martín et al.(国际专利申请WO 00/77222)所述。此类衍生物例如具有代替游霉素分子C4和C5碳原子之间的环氧化物功能的双键，和/或具有代替游霉素分子C12碳原子处的羧基的醛、醇或甲基，如Martín et al.(国际专利申请WO 00/77222)所述。
本领域的技术人员公知可用于发酵Streptomyeces菌株的各种培养基；所述培养基全部适用于本方面的方法。特别适用的培养基是复合培养基，例如TSB、MEA、NBG、YED和YEME。
自诱导物可以原样添加。但是，本发明还包括将能产生自诱导物的第二种生物加入。
在一种优选的实施方式中，IP因子或其盐加入的量可以是使得IP因子的总浓度为5至2000nM之间的量，优选为使其总浓度为20至1000nM之间，更优选为50至400nM之间。IP因子或其盐可在发酵过程中的很多阶段被加入，例如在发酵中一批或多批加入，在开始发酵之前加入，或在某预定的生产水平达到之后加入，可与加入到发酵过程中的一种或多种组分混合等。IP因子或其盐可作为固体物质加入和/或可溶于溶剂中。发酵过程完成之后，可用本领域技术人员已知的任何一种方法来分离得到的游霉素。
本发明的第四个方面是用于生产游霉素的改进方法，所述方法包括：通过提高发酵培养基中生物对自诱导物的天然生产来提高自诱导物的浓度。
本发明的第五个方面是IP因子在通过Streptomyces菌株发酵来制造产物的过程中的用途。优选的菌株、培养基和IP因子的浓度以及添加的方式与本发明的第三和第四个方面相同。优选地，通过发酵方法生产出的化合物是游霉素，色素或胞外酶，例如胆固醇氧化酶。
在一种优选的实施方式中，IP因子被用于与Streptomyces菌株中存在的IP因子结合蛋白相结合。所述IP因子结合蛋白是所谓的“遏止子类型的调控子”，IP因子不存在时，其能遏止所需产物(例如游霉素)的产生。一旦存在有IP因子，例如按照上文所述加入，IP因子结合蛋白的遏止功能就被阻止，游霉素产量就会提高。
本发明的第六方面是一组游霉素生产有缺陷的突变体(npi突变体)。所述突变体可以通过对Streptomyces natalensis菌株使用诱变技术来获得。至少使用一轮诱变。Npi突变体不能抑制真菌测试菌株的生长，它们由此被探测到和分离出。所述测试菌株可以是其生长可被游霉素抑制的任何真菌菌株。优选地，所述测试菌株是Candida utilis菌株，更优选地，所述菌株是Candida utilis CECT 1061(也见实施例1)。
在一种实施方式中，所述诱变技术是NTG，且所述Streptomycesnatalensis菌株是Streptomyces natalensis ATCC 27448。
在另一种实施方式中，npi突变体在游霉素的生产的方面有缺陷，但在IP因子的生物合成的方面没有缺陷。所述npi突变体能在IP因子生物合成方面有缺陷的突变体中使游霉素生产得以重建。优选地，所述npi突变体属于实施例中提到的A、B、C、F或J组。更优选地，所述npi突变体是npi16、npi30、npi71、npi79、npi83、npi85、npi88、npi116、npi140、npi148、npi169、npi178、npi218、npi226、npi235、npi238、npi249、npi275、npi276、npi380或npi384。
在另一种实施方式中，npi突变体在IP因子生物合成方面也是有缺陷的，它们将不能生产游霉素，除非有外源IP因子加入。这种实施方式中的npi突变体对测定其它菌株中IP因子的产率特别有用，这是通过以下方式来实现的：在互补试验中培养两种菌株，观察所述IP因子生物合成有缺陷的npi突变体中是否存在游霉素生产。用上文所述的测试菌株可探测到游霉素生产。所述测试菌株可以是其生长会受游霉素抑制的任何菌株。优选地，所述测试菌株是Candida utilis菌株，更优选地，所述菌株是Candidautilis CECT 1061。优选地，所述npi突变体是npi287。
附图说明
图1是经FMOC衍生的纯IP因子(上面一幅)、A因子(90％纯度，中间一幅)和与IP因子混合的A因子(90％纯度)(底下一幅)的HPLC分析。X轴上的值是分钟。IP因子FMOC在11.8min洗脱出。注意Streptomyces griseus A因子制剂不含痕量IP因子。
图2展示了Streptomyces natalensis npi287响应于IP因子的增加的浓度(100至500nM)的游霉素产量。剂量应答型的特征从0、110、166、220、333、446和500nM IP因子的测量点处获得。Y轴：Candida utilis中游霉素诱导的抑制区域直径，单位cm(见实施例5)；x轴：IP因子的浓度，单位nM。
图3显示了通过向复合TBS培养基中野生型Streptomyces natalensisATCC 27448的培养物中加入外源IP因子(300nM)来激活对游霉素的生产。图3A：细胞干重(■)；y轴：以mg/ml表示的干重浓度；x轴：以小时表示的时间。图3B：(▲)没有加入IP因子的对照；(□)加入了IP因子；y轴：游霉素浓度，单位μg/ml；x轴：以小时表示的时间。
图4显示了通过向复合NBG培养基中野生型Streptomyces natalensisATCC 27448的培养物中加入外源IP因子(300nM)来激活对游霉素的生产。图4A：细胞干重(■)；y轴：以mg/ml表示的干重浓度；x轴：以小时表示的时间。图4B：(▲)没有加入IP因子的对照；(□)加入了IP因子；y轴：游霉素浓度，单位μg/ml；x轴：以小时表示的时间。
图5显示了通过向复合YEME培养基中野生型Streptomyces natalensisATCC 27448的培养物中加入外源IP因子(300nM)来激活对游霉素的生产。图5A：细胞干重(■)；y轴：以mg/ml表示的干重浓度；x轴：以小时表示的时间。图5B：(▲)没有加入IP因子的对照；(□)加入了IP因子；y轴：游霉素浓度，单位μg/ml；x轴：以小时表示的时间。
图6显示了在Streptomyces最低限度培养基中，Streptomyces natalensisATCC 27448(野生型)的培养物中IP因子和游霉素形成的时间段。图6A：(■)干重；y轴：以mg/ml表示的干重浓度；x轴：以小时表示的时间。图6B：(□)IP因子；(▲)游霉素；y轴：左边以μg/ml表示的游霉素浓度和右边以ng/ml表示的IP因子浓度；x轴：以小时表示的时间。
图7显示了在Lechevalier定义的培养基中，Streptomyces natalensisATCC 27448(野生型)的培养物中IP因子和游霉素形成的时间段。图7A：(■)干重；y轴：以mg/ml表示的干重浓度；x轴：以小时表示的时间。图7B：(□)IP因子；(▲)游霉素；y轴：左边以μg/ml表示的游霉素浓度和右边以ng/ml表示的IP因子浓度；x轴：以小时表示的时间。
图8显示了在复合TSB培养基中，Streptomyces natalensis ATCC27448(野生型)的培养物中IP因子和游霉素形成的时间段。图8A：(■)干重；y轴：以mg/ml表示的干重浓度；x轴：以小时表示的时间。图8B：(□)IP因子；(▲)游霉素；y轴：左边以μg/ml表示的游霉素浓度和右边以ng/ml表示的IP因子浓度；x轴：以小时表示的时间。
图9与图8相同，除了用NBG培养基代替了TSB培养基。
图10与图8相同，除了用YEME培养基代替了TSB培养基。
图11与图8相同，除了用YED培养基代替了TSB培养基。
图12是HPLC分析，分别展示了如下情况：没有IP因子复合NBG培养基在接种时(上面一幅)；补充有0.2μg/mlIP因子的NBG培养基(中间一幅)和用Streptomyces natalensis ATCC接种后48小时的NBG培养物(底下一幅)。IP因子-FMOC峰被遮住了。最上面一幅中，斜箭头表示IP因子-FMOC的预期位置。类似的结果在TSB、YEME和YED培养基中也获得了。
实施例
在下面给出的实施例中，用到了下述菌株：野生型Streptomycesnatalensis ATCC 27448被用作亲本菌株以分离出不同的npi突变体。Streptomyces natalensis培养物被保持于固体TBO孢子形成培养基(sporulation medium，每升含有20g番茄酱，25g燕麦和25g琼脂)中，如Aparicio et al.(Chem.Biol.7，895-905，2000)所述。Candida utilis CECT1061(也称Pichia jadinii)在对游霉素的抗真菌活性生物试验中被用作测试菌株。Streptomyces griseus IFO 13350(之前被描述为Streptomycesbikiniensis IFO 13350)的培养物被用于在YMPG培养基中生产A因子(Horinouchi et al.，J.antibiot.38，636-641，1985)。Streptomyces griseusHHl(A因子阴性菌株)被用于量化A因子诱导活性。
               实施例1  非生产克隆的诱变和分离
将Streptomyces natalensis ATCC 27448的孢子(大约106孢子/ml)悬浮于pH9.0的0.05M Tris-马来酸盐缓冲液中，用N-甲基-N’-亚硝基胍(1mg/ml)在30℃进行20分钟的诱变。在上述条件下，20分钟后死亡率为大约50％。
经过突变的孢子被清洗、稀释，涂布到YED培养基上，在28℃进行培养。当菌落开始生长(24小时后)，将含有单个菌落的琼脂小块(直径7mm)从平板上切下来，在高aw(湿度)条件下再培养24小时，在Candidautilis菌苔上检测每个克隆的游霉素生产情况。不产生抑制区域的突变体，即其中围绕琼脂小块的可见的抑制环小于1mm的突变体被选择出来。在SPG培养基的液体培养物中证实了选出的突变体的游霉素生产缺陷(Gil etal.，J.Gen.Microciol.131，1279-1287，1985)。通过互补试验来对在液体培养基培养物中不能复原(revert)的突变体进行进一步的分析。
上述NTG诱变之后的第一轮筛选中，分离出了总共384个游霉素生物合成受损的非生产(npi)突变体(npi1至npi384)。它们中的一些会复原或不稳定。数轮筛选之后(见实施例3)，选出35个稳定的npi突变体(表1)，在固体YED培养基上进行配对互补试验以进行检测。使用共合成方法(co-synthesis)来进行Streptomyces natalensis的npi突变体的互补(见实施例3)。当作为琼脂小块培养物在Candida utilis菌苔上分别检测时，两个npi(非生产)突变体A和B不能产生游霉素，但它们中的一个(A，复原者)在与“捐赠者”菌株-B紧邻培养时，能重新获得游霉素生产能力。
基于互补试验的结果，将突变体分为11类(表1中的A至K)，七个突变体的一类(npi12、npi54、npi64、npi86、npi98、npi6和npi137)(表1中的组H)不能与其它任何类别的突变体互补，反之亦然。
A、B、C、F和J类的非生产突变体全部都能与npi287(组G，表1)互补。上述互补试验的结果显示，A、B、C、F和J类的npi突变体能产生与npi287的游霉素生产互补的诱导物质，这些突变体在随后的生物合成途径中被阻止。突变体npi287对消耗的野生型Streptomyces natalensisATCC27448培养液有着清楚的应答关系，因此其被用作IP因子存在情况的的测试(复原者)菌株。突变体类D、E、K和I无法与需要G类的诱导物互补，因此其也可能含有与IP因子生物合成相关的突变。
  类   互补类
  A   npi380   B，C，D，E，G，J，K
  B   npi16，npi235   A，C，E，G
  C   npi275   A，B，D，G，I，J
  D   npi31   A，C
  E   nNpi38   A，B
  F   npi30，npi71，npi83，npi85，npi116，npi140，npi148，npi178，npi226，npi238，npi249，npi276   G
  G   npi287   A，B，C，F，J
  H   npi6，npi12，npi54，npi64，npi86，npi98，npi137   无
  I   npi22，npi255   C
  J   npi79，npi88，npi169，npi218，npi384   A，C，G
  K   npi39，npi271   A
表1Streptomyces natalensis npi(非生产突变体)的互补组
     实施例2  培养基和对液体培养物中游霉素产量的定量
四种不同的复合培养基被用于对IP因子浓度及其与游霉素生产的关系进行定量。它们包括：补充有葡萄糖(5g/l)的NBG培养基(OXOID)；YEME培养基(酵母提取物3g/l；蛋白胨5g/l；麦芽提取物3g/l和葡萄糖10g/l)；TSB培养基(DIFCO)和YED培养基(酵母提取物10g/l；葡萄糖10g/l)。此外，还有两种被定义的培养基用于对诱导物的生产进行定量：Streptomyces MM(Kieser et al.in″Practical Streptomyces Genetics″，JohnInnes Foundation，Norwich，UK，2000)和Lechevalier定义的培养基(Martinand McDaniel，Eur.J.Appl.Microbiol.3，135-144，1976)。
通常通过在319nm处进行分光光度测定来对液体培养物中游霉素的产量进行定量。用5ml甲醇对0.5ml的一份培养物进行萃取，用蒸馏水对其进行稀释；按照以前描述过的(Aparicio et al.(Chem.Biol.7，895-905，2000))，用纯的游霉素样品(Sigma Chem.Co)作为标准，对游霉素浓度进行定量。
                     实施例3  互补试验
用标准的共合成方法，在固体YED培养基中，在31个稳定的非生产突变体的对之间进行互补试验。每对npi突变体都作为菌苔培养物来被培养。从每个培养区域中取出琼脂小块，用Candida utilis作为敏感生物来对游霉素的生产进行生物检测。当两个非生产突变体相互紧邻放置时，游霉素的生产可清楚地探测出阳性互补，而单独检测时，来自两个非生产突变体中的每一个的琼脂小块都不显示抑制区域。
    实施例4  对IP因子的萃取以及对其进行HPLC纯化至同质
在Braun Biostat C发酵罐中YED培养基中生长了24小时的Streptomycesnatalensis野生型菌株的培养液(15升)在真空蒸发器中被浓缩了10倍。通过在冷室中用6M HCl于pH3.0来使蛋白质沉淀，对经浓缩的培养液进行澄清。用浓的NaOH将经澄清的培养液pH调至7.0，进行萃取。然而出人意料地，在酸性、中性或弱碱性(pH7.5)pH值下用乙酸乙酯萃取之后，相当大比例的IP因子留在水相中。与丁内酯相反，在用氯仿重复萃取诱导物的过程中，发现有相当大部分的IP因子(大约80％)一直留在水相中，这暗示这是相当亲水的分子。用乙酸乙酯重复进行萃取，可以萃取到足够进行良好纯化的的IP因子。然后收集有机相，在真空下浓缩至干，得到的产物溶于100ml 10％甲醇(v/v)，上样至预先用相同的溶剂(10％甲醇，v/v)平衡过的活性碳柱(30×3cm)。通过用50％甲醇(v/v)、100％甲醇、甲醇中10％乙酸乙酯(v/v)、甲醇中50％乙酸乙酯(v/v)和纯的乙酸乙酯(100％)进行分步洗脱(流速2ml/min)，将保留化合物(包括IP因子)区分开来。对IP因子的生物检测显示，其在第二部分被洗脱出来(100％甲醇)。然后对含有IP因子的部分进行浓缩，上样至Sephadex G10柱(2000×1cm)，用蒸馏水洗脱(流速0.8ml/min)。尺寸排除色谱产生了40ml的活性部分。
从Sephadex G10柱洗脱之后，用配备有Polartiy C18柱(3.9×150mm；颗粒大小，5mm)和PDA996探测器的Waters 600单元通过反向HPLC色谱法，对具有生物活性的部分进行纯化。用由乙腈-水的线性梯度(从时间为0时的1∶99v/v至15分钟时的70∶30v/v)构成的移动相混合物，在保留时间为2.5min时，洗脱出IP因子。按Sim和Perry(Glycoconjugate J.14，661-668，1997)所述，用FMOC(氯甲酸9-芴基甲基酯)对IP因子进行衍生化。
从Streptomyces griseus IFO 13350的培养物中纯化出作为对照的A因子。如同预计的，用该方案很好地纯化得到了A因子，其在100％甲醇部分中洗脱出来。
              实施例5  测定IP因子的生物学活性
当补充有Streptomyces natalensis野生型培养物或来自Streptomyces griseus的 A因子时，突变体npi287恢复了游霉素生产
鉴于最初的研究表明，在与不同的Streptomyces natalensis突变菌株的共合成实验中，突变体npi287恢复了游霉素生产，因此对其与消耗的亲本菌株Streptomyces natalensis ATCC 27448的培养液的互补情况进行试验。结果显示，补充在YED、NB或YEME培养基中培养了24小时的Streptomycesnatalensis野生型菌株培养液后，突变体npi287恢复了完全的游霉素生产水平，这暗示IP因子通过野生型菌株分泌。在生物试验中显示，IP因子对Streptomyces natalensis npi287有强诱导能力，而其乙酰化衍生物则无诱导效果。Streptomyces griseus的A因子对Streptomyces natalensis npi287也具有一定的诱导活性。
经纯化的IP因子与A因子不同
Streptomyces griseus 35570的A因子被纯化出来，这是通过依据其对测试菌株Streptomyces griseus HH1的生物活性来进行的，HH1是缺乏游霉素生产的突变体，因为它在A因子生物合成方面存在缺陷。如上所示，含有经过纯化的Streptomyces griseus A因子的部分在Streptomyces natalensisnpi287突变体中诱发游霉素生产，如生产游霉素的亲本菌株Streptomycesgriseus 38870的粗培养液一样。上述结果显示，npi287菌株的游霉素生产与A因子相关。
有趣的是，反面的试验是阴性的。无论是野生型Streptomycesnatalensis培养液还是HPLC纯化的IP因子都无法为Streptomyces griseusHH1突变体重建链霉素生产，进一步地表明，IP因子与A因子不同，其是对Streptomyces natalensis特异的。
纯的IP因子无法激活野生型Streptomyces natalensis或npi287突变体的孢子形成，这与公知的A因子对Streptomyces griseus HH1孢子形成的激活不同。
上述结果，连同IP因子对FMOC衍生化的敏感性，清楚地支持了两种化合物本质上不同的观点。
为对Streptomyces griseus菌株是否可能生产痕量的IP因子进行研究，对含有纯IP和A因子的部分进行了比较HPLC分析。结果(图1)显示，用FMOC衍生化的活性IP因子在11.0min时洗脱出来(图1，上面和底下的图)，而FMOC衍生化之后的A因子色谱图上则没有观察到峰的出现(图1，中间一幅)。IP因子和FMOC反应的能力暗示了在其结构中有氨基存在，而A因子在同样条件下没有反应则证实了A因子结构中不存在此类基团。
剂量应答：IP因子在低浓度下发挥作用
IP因子的生物活性是通过其对固体SPG培养基上Streptomyces natalensisnpi287突变菌株游霉素生产的诱导能力来测定的。Streptomyces natalensisnpi287在30℃生长2天之后，培养液的样品(100ml)或来自IP因子纯化过程的不同部分被加入到琼脂层的孔(直径7mm)中。平板被Candida utilis的培养物覆盖，在28℃培养24小时。npi287菌株经过游霉素诱导之后，游霉素抑制区域直径的增加，与样品中IP因子的量成比例。
纯IP因子的可获得性使得可以通过对npi287菌株的标准诱导试验来对其诱导效果进行定量(图2)。npi287菌株清楚地应答于100nM浓度的IP因子，抗生素的产生显示了直至350nM处的线性应答。350nM浓度的IP因子使游霉素抑制区域增加了两倍(达到了50毫米以上)，在浓度超过400nM时试验达到饱和。对游霉素生产的诱导能被探测到所需要的IP因子极限水平为大约50nM。上述结果与“群体感应”类型的分子典型的协同效应相符。
野生型菌株Streptomyces natalensis ATCC 27448对游霉素的生产被外源IP因 子激活
在群体感应系统中，自诱导物信号是由培养物中的一些细胞分泌的，而诱导物是由其它细胞引入的，以触发分化或其它生物化学转变。
如图3、4和5所示，NBG、TSB和YEME培养基中亲本菌株Streptomyces natalensis ATCC 27448的游霉素生产可通过在这三种培养基中加入300nM IP因子来激活。鉴于野生型能合成内源IP因子，外源诱导物的激活效应显示，野生型的游霉素生物合成是有限制的。此外，结果显示，IP因子被Streptomyces natalensis利用，或者至少其触发了信号级联过程，导致了游霉素的过量生产。
实施例6在定义的和复合培养基中Streptomyces natalensis培养物中IP因子
                        生产的动力学
IP因子的合成时间与对游霉素生物合成起始的触发相关。此外，形成的IP因子的水平对总的游霉素积累来说可能是有限制作用的。为分析IP因子生物合成的时间段，在已知能支持游霉素高产量生产的四种复合培养基TSB、MEA、NBG、YED和YEME，以及两种定义的培养基中培养Streptomyces natalensis ATCC 27448，两种定义的培养基即：用于Streptomyces的MM(Kieser et al.in″Practical Streptomyces Genetics″，JohnInnes Foundation，Norwich，UK，2000)和Lechevalier(Martin and McDaniel，Eur.J.Appl.Microbiol.3，135-144，1976)。
这两种定义的培养基支持低产量的游霉素生产(图6和7)。在Streptomyces MM和Lechevalier MM中，IP因子的合成都与生长平行进行，在快速生长阶段(等同于单细胞细菌的指数生长阶段)的终点观察到峰(20至40ng/ml)。在这两种定义的培养基中，游霉素的生物合成与培养物的生长平行，但存在有大约12小时的延迟。上述结果显示，IP因子的形成与生长阶段相关，其领先于游霉素的产生。
我们发现，所有的复合培养基都能支持远远更高水平的游霉素生产(图8至11)，其范围从TSB培养基中的550mg/ml(图8B)至YEME培养基中的850mg/ml(图10B)。在这四种复合培养基中，IP因子的形成远早于与生长阶段一致的游霉素，其能达到的水平为：从YEME培养基中的50ng/ml至TSB培养基中的80ng/ml之间，这明显高于(大约两至三倍于)定义的培养基中IP因子的水平。YED培养基应被特别关注，其中IP因子积累至450ng/ml的水平。在该培养基中游霉素的产量也很高(500mg/ml)，但与观察到的IP因子的大幅增长无法匹配。上述结果显示，生物合成步骤，而非IP因子水平，限制了在该培养基中高于IP因子饱和水平的游霉素的生产。
为验证IP因子是在对Streptomyces natalensis的培养期间产生的，而不是存在于用于上述实验的复合培养基中的，在接种之前和用Streptomycesnatalensis接种培养48小时之后，用HPLC对所有的培养基进行检测(结果在图12中)。接种之前复合培养基中没有IP因子存在，而该培养基中培养48小时之后明显就有了IP因子的积累。为验证IP因子的不存在，NBG培养基预先放入了纯的IP因子，如图9的中间一幅所示，补充有IP因子的培养基的HPLC洗脱曲线验证了该分子在初始培养基中的缺乏。
               实施例7  NMR谱和质谱分析
用1D NMR方法(1H-NMR和13C-NMR)和2D位移关联(shift-correlated)NMR技术(HMQC-HSQC和HMBC)的组合来进行完全的1H和13C信号指认，从而通过NMR谱分析来实现IP因子的结构阐释。用BrukerWM 500光谱仪[500MHz(1H NMR)和125MHz(13C NMR)]，于室温下，D2O中，记录NMR谱。化学位移以δ标度被给出，其相对于溶剂和作为内部信号的二恶烷。2D实验的脉冲程序取自Bruker软件库，参数如下所述：500/125MHz梯度选择的HMQC谱，弛豫延迟D1＝1.5s；进化延迟(evolution delay)D2＝3.33ms；长程偶合的进化延迟(HMBC)D6＝60ms。用CF3COOH 0.1％作为电离源，在HP 1100-MSD上记录ES+质谱。
对IP因子的1H NMR谱的分析仅显示了δ3.71处的一个单峰信号，而其13C NMR谱含有两个信号，其被指认为一个亚甲基(CH2，δ58.76ppm)和一个δ60.87ppm的季碳原子。这通过DEPT实验得到了证实。用HMQC谱来进行对亚甲基碳原子的指认，该HMQC谱显示出通过1JH.C与亚甲基质子关联的δ3.71ppm处的关联峰。在HMBC谱中，在亚甲基质子和δ60.87ppm的季碳原子之间获得了一个通过3JC.H的关键关联峰。
组 pH＝5.20 pH＝8.05
 1H  13C  1H  13C
  CH2   3.71(s)   58.76   3.66(s)   59.44
  C   60.87   59.93
表2IP因子的1H NMR和13C NMR数据(D2O中，化学位移以δppm表示)
亚甲基化学位移(δH和δC)的低场本质暗示存在有氧化基团(-CH2OH)。这通过与IP因子的乙酰化衍生物(IPa)的NMR谱的比较得到了证实。乙酰化衍生物的1H NMR谱(在CDCl3中记录)显示了δ1.25和4.43ppm处的两个单峰，其分别对应于甲基(CH3COO-)和亚甲基(CH3COOCH2-)；13CNMR谱显示了δ20.70ppm(CH3)、δ58.10ppm(C)、δ62.71ppm(CH2)和δ170.60ppm(CO)处的四个单峰。
季碳原子的前场位移和pH变化造成的化学位移的变动(表2)，暗示了胺基的存在。质谱证实了这一点。IP因子在正电发射(ES+)的m/z91[M+2H]+/2处给出了一个离子，表明了双电荷种类。在所有可获得的数据的基础上，IP因子被推定为2，3-二氨基-2，3-二(羟甲基)-1，4-丁二醇。

Claims (22)

1.一种如结构式(I)所示的化合物或其盐：
其中：
-每个R1都是：氢，任选被取代的烷基，被取代的甲硅烷基或-C(O)(R3)，其中R3是氢，任选被取代的烷基，或任选被取代的芳基；
并且
-每个R2都是：氢，任选被取代的烷基，被取代的甲硅烷基或-C(O)(R3)，其中R3是氢，任选被取代的烷基，任选被取代的芳基或OR4，其中R4是任选被取代的烷基、或任选被取代的芳基。
2.如权利要求1所述的化合物，其中R1是-C(O)(R3)，其中R3是甲基、乙基、正丙基或异丙基。
3.如权利要求1或2所述的化合物，其中R2是-C(O)(R3)，其中R3是甲基、乙基、正丙基或异丙基。
4.如权利要求1或2所述的化合物，其中R2是-C(O)(OR4)，其中R4是甲基、乙基、正丙基或异丙基。
5.如权利要求1所述的化合物，其中R1是氢，且R2是氢。
6.一种制备如权利要求5所述的化合物的方法，所述方法包括对能生产所述化合物的Streptomyces菌株进行发酵。
7.如权利要求6所述的方法，进一步地包括将所述化合物从获得的混合物中分离出来和/或对分离出的化合物进行纯化。
8.如权利要求6或7所述的方法，其中，所述Streptomyces菌株是Streptomyces natalensis或Streptomyces natalensis的突变体，所述突变体对游霉素的生物合成受损，但其对所述化合物的生物合成并未受损。
9.通过Streptomyces菌株生产游霉素的发酵方法，所述方法包括将包含自诱导物的组合物加入到发酵培养基中。
10.通过Streptomyces菌株生产游霉素的发酵方法，所述方法包括：通过提高所述Streptomyces菌株对自诱导物的天然生产来提高发酵培养基中自诱导物的浓度。
11.如权利要求9或10所述的方法，其中所述的自诱导物是丁内酯自诱导物。
12.如权利要求9或10所述的方法，其中所述的自诱导物是如结构式(II)所示的化合物：
13.如权利要求11所述的方法，其中所述自诱导物是2-(6’-甲基庚酰)-3R-羟甲基-4-丁内酯。
14.如权利要求1至5中任意一项所述的化合物在通过对Streptomyces菌株进行发酵来制备产物的过程中的用途。
15.如权利要求14所述的用途，其中所述的化合物与所述Streptomyces菌株中存在的IP因子结合蛋白相结合。
16.如权利要求14或15所述的用途，其中所述Streptomyces菌株是Streptomyces natalensis。
17.如权利要求14至16中任意一项所述的用途，其中所述产物是次级代谢产物、色素、蛋白质或肽。
18.如权利要求17所述的用途，其中所述产物是游霉素。
19.如权利要求14至18中任意一项所述的用途，其中，所述化合物被加入到发酵培养基中，所述Streptomyces菌株对所述化合物的生产被提高，和/或生产所述化合物的第二种菌株被加入到发酵培养基中。
20.如权利要求14至19中任意一项所述的用途，其中发酵培养基中所述化合物的总浓度在50至400nM之间。
21.一种Streptomyces菌株，其在游霉素生产方面有缺陷，并且，其能生产如权利要求5所述的化合物。
22.一种Streptomyces菌株，其在生产如权利要求5所述的化合物的方面有缺陷，但是其能在所述化合物存在的情况下生产游霉素。
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