CN1777620A

CN1777620A - 一种重组人ω干扰素及其表达方法与应用

Info

Publication number: CN1777620A
Application number: CN200480011049.1A
Authority: CN
Inventors: 陈薇; 齐连权; 付玲; 于长明; 来大志
Original assignee: Taiji Group Co ltd; Institute of Microbiology and Epidemiology of AMMS
Current assignee: Taiji Group Co ltd; Institute of Microbiology and Epidemiology of AMMS
Priority date: 2003-04-25
Filing date: 2004-04-19
Publication date: 2006-05-24
Also published as: CN1539971A

Abstract

本发明公开了一种重组人ω干扰素及其表达方法与应用。该重组人ω干扰素，是具有序列表中SEQ ID №：2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将SEQID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №：2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID №：2衍生的蛋白质。实验证明本发明的重组人ω干扰素在人群使用是安全的，在SARS流行期间能有效辅助预防SARS病毒感染。本发明的重组人ω干扰素表达方法具有产量高，表达及纯化简单易行，费用低廉，便于扩大生产等特点，具有广阔的市场前景。

Description

一种重组人 "干扰素及其表达方法与应用技术领域

本发明涉及基因工程领域中一种重组人 ω干扰素及其表达方法与应用，特别涉及一种重组人 ω干扰素、该干扰素的表达方法及其在制备预防和 /或治疗由冠状病毒引起的疾病的药物中的应用。

背景技术

人 ω干扰素发现于 1985年，是同 α干扰素功能相近但抗原性不同的一类干扰素分子 ( Hauptmann R, Swetly P. A novel class of human type I interferons [J] . Nucleic Acids Res, 1985， 13 (13)： 4739-4749. )_D 利用标准抗病毒试验，已经测定出人 ω干扰素的比活性为 2. 7- 4 X 108U/mg。通过仙台病毒诱导，已经成功地利用人外周血白细胞产生并纯化出了人 ω干扰素

(Adolf G R, Maurer-Fogy I， Kalsner I et al. Purification and characterization of natural human interferon omega 1. Two alternative fcleavage sites for the signal peptidase [J] . J Biol Chem, 1990， 265 (16)： 9290-9295. )。另外，利用不同的外源蛋白表达系统，分别在大肠杆菌、昆虫细胞和 CH0细胞中表达了重组的人 ω干扰素。这些使得对该蛋白的深入研究成为可能。在几种人肿瘤的小鼠模型中，包括卵巢癌、黑色素瘤和皮肤癌等，证实了人 ω干扰素具有体内的抗肿瘤功能（Horton H M, Hernandez P, Parker S E， et al. Antitumor effects of interferon— omega : in vivo therapy of human tumor xenografts in nude mice [J] . Cancer Res, 1999， 59 (16)： 4064-4068. )。利用人的肝癌细胞系， Hagelstein J等 (Hagelstein J, Kist A, Streramel W, et al. Antiviral potential of interferon- omega on hepatitis B virus replication in human hepatoma cells[J]. Arzneimittelforschung, 1998， 48(3) :343- 347. )比较了各种干扰素对乙肝病毒复制的抑制作用，结果发现，人 ω干扰素具有同 α干扰素、 Υ干扰素以及肿瘤坏死因子 α相似的抑制病毒复制作用。在体外对 HIV病毒的抑制实验中，发现人 ω干扰素有比 α干扰素更强的抑制病毒蛋白合成的作用。由于 ω干扰素具有较强的抗病毒复制，抗细胞增殖和免疫调节等作用，该细胞因子在多种肿瘤、病毒性疾病的治疗以及对 α干扰素耐药的患者的应用具有广阔的应用前景。毕赤酵母表达系统（Pichia pastoris )是近几年建立的一种真核表达系统 (Cereghino J L, Cregg J M. Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastorisij . FEMS Microbiol Rev, 2000， 24 (1) : 45-66. ), 是用于表达外源蛋白的最成功的表达系统之一。由于它既具有原核表达系统，如常用的大肠杆菌表达系统的繁殖迅速，费用低廉及操作方便的特点，又具有真核表达系统能对表达的蛋白质进行正确加工、折叠及适度糖基化的优点，同时还具有重组蛋白易于纯化的优点。因此正越来越广泛地用于蛋白质的大量表达。目前已有' 200多种蛋白在该表达系统中得以表达 (Cregg JM, Cereghino JL, Shi JY, et al. Recombinant protein expression in Pichia pastoris [J] . Mol Biotechnol, 2000, 16 (1) : 23-52. )。

毕赤酵母表达系统包括胞内表达和分泌表达两种方式，其中分泌表达由于其表达量高，糖基化完全，二硫键和高级结构形成正确，尤其是后续分离纯化简单方便而备受青睐。

毕赤酵母是一种甲醇营养型酵母菌，其生长迅速，培养条件简单，可以高密度连续培养；其遗传操作与酿酒酵母相似，技术已相当成熟；表达载体中普遍使用的醇氧化酶基因的启动子（pAOXl )为诱导型启动子，受葡萄糖抑制，甲醇诱导后才开始转录、翻译，非常适合于外源基因的表达。

PPIC9K是 Invitrogen公司推出的多拷贝分泌型表达载体。大小为 9. 3 kb。该载体含有大肠杆菌复制起点 Col El和氨苄青霉素及卡那霉素两个抗性基因，其中卡那霉素抗性基因还可以使毕赤酵母对 G418产生抗性，可用于多拷贝插入的筛选。 PPIC9K利用 α 因子的分泌信号将目的基因分泌至胞外。由于毕赤酵母本身仅分泌约占总量 5%的蛋白至胞外，因此对分泌表达的蛋白进行分离纯化极为方便。但是利用分泌型表达载体 PPIC9K表达的外源蛋白会出现不正确的 N端，这些多出的氨基酸残基会影响和改变所表达的蛋白的结构和功能 (Goda S， Takano K, Yamagata Υ， et al. Effect of extra N-terminal residues on the stability and folding of human lysozyme expressed in Pichia pastoris [J] . Protein Eng, 2000, 13 (4) : 299-307. ) 。本发明的发明 Λ扮翻 ¾« pPIC9K进行了勾，繊了新的 ¾¾ΜερΜΕΧ9Κ。并于 2002 年 5月 20日申请了中国发明^ lj，申 if^为 02117906. 9，名称为 "对外源因謝亍分泌纖髓贝酵 «ί«体"。严重急性呼吸系统综合征（SARS )，其病原体为一种最近出现的新病毒，它为冠状病毒的一个变种，与已知的冠状病毒基因序列的同源性约为 60%，但在抗原性上二者没有交叉。所以虽然正常人群的冠状病毒的抗体阳性率在 50% 以上，但对此种病毒却没有保护作用，导致人群的普遍易感。此病毒引发严重的呼吸系统疾病，病死率目前达到 4%，严重危害人类的健康，寻找对 SARS 病毒有效的防治药物成为医学界的当务之急。

发明公开

本发明的目的是提供一种重组人 ω干扰素及其编码基因。

本发明所提供的重组人 ω干扰素来源于人属人 Homo sapiens) ，名称为 rHuIFN- ω , 是具有序列表中 SEQ ID Ns : 2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将 SEQ ID No _: 2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与 SEQ ID No _: 2的氨基酸残基序列相同活性的由 SEQ ID Na_: 2衍生的蛋白质。

序列表中的序列 2是由 174个氨基酸残基组成的蛋白质。

重组人 ω干扰素的编码基因，名 rHuIFN- ω , 它是下列核苷酸序列之一：

1 )序列表中的 SEQ ID Na: 1 ;

2 )编码序列表中 SEQ ID No _: 2蛋白质序列的多核苷酸；

3 )与序列表中 SEQ ID Na : 1限定的 DNA序列具有 90 %以上同源性，且编码相同功能蛋白质的 DNA序列。

序列表中序列 1的 DNA序列由 525个碱基组成，该基因的读码框为自 5' 端第 1到第 525位碱基。

含有本发明基因的表达载体及细胞系均属于本发明的保护范围，利用现有分子生物学的方法可以得到不同的重组表达载体和工程菌，如重组表达载体 ρΜΕΧ9Κ ω (图谱如图 1所示）和含有本发明基因的毕赤酵母菌 GS115。

本发明的第二个目的是提供一种表达重组人 ω干扰素的方法。

本发明所提供的表达重组人 "干扰素的方法，是将含有上述重组人 ω干扰素编码基因的重组表达载体导入表达宿主，表达得到重组人 ω干扰素。

其中，所述宿主可为酵母菌、大肠杆菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞、枯草杆菌、乳酸杆菌等，优选为酵母菌，尤其优选为毕赤酵母菌，最优选为毕赤酵母菌 GS115。

在毕赤酵母培养上清液中，目的蛋白的含量在诱导后 48- 60h达到最高，占培养上清液中总蛋白的 20%- 30%。在经过四步层析纯化后，目的蛋白的纯度可到 95%以上，回收率在 30%以上。

本方法中，用于插入上述重组人 ω干扰素编码基因的表达载体可为在上述宿主中表达的载体，如可在大肠杆菌中表达的 pET、 pQE，可在毕赤酵母菌中表达的 pMEX9K、 pPIC9K, 其中优选为 pMEX9K。含有上述重组人 ω干扰素的编码基因的重组表达载体可按照常规方法构建。

本发明的第三个目的是提供一种预防和 /或治疗由冠状病毒引起的疾病的药物。

本发明所提供的预防和 /或治疗由冠状病毒引起的疾病的药物，它的活性成分是重组人 ω干扰素。

其中，所述冠状病毒优选为 SARS病毒。所述重组人 ω干扰素优选为被糖基化的，如在毕赤酵母表达系统中表达得到的糖基化的重组人 ω干扰素。所述毕赤酵母表达系统优选为分泌表达系统，如表达载体 pMEX9K、 pPIC9K。

需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等，必要时还可以加入香味剂、甜味剂等。 '

本发明的药物可通过注射或粘膜给药，可以制成注射剂、喷雾剂或滴鼻剂等多种药物形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备

上述药物的用量一般为 1000IU— 4000IU重组人 ω干扰素 /kg体重 /天。附图说明

图 1为重组人 ω干扰素表达载体的构建过程示意图

图 2为毕赤酵母转化子表达产物的 SDS- PAGE图谱

图 3为经糖苷酶 PNGase F消化后的重组人 ω干扰素的 SDS- PAGE图谱图 4为本发明的重组人 ω干狁素和 IFN- β对 SARS病毒攻击 VER0-E6细胞的保护作用照片

图 5为喷雾给药照片图 6为麻醉攻毒照片

图 7a为攻毒后第 6天药物组的肺部病变情况照片

图 7b为攻毒后第 6天安慰剂组的肺部病变情况照片

图 8a为攻毒后第 16天药物组的肺部病变情况照片

图 8b为攻毒后第 16天安慰剂组的肺部病变情况照片，图 9a为攻毒后第 16天药物组的脾组织病变情况照片

图 9b为攻毒后第 16天安慰剂组的脾组织病变情况照片

图 10a为安慰剂组攻毒后第 16天的肺部病理学组织 50 X观察照片图 10b为药物组攻毒后第 16天的肺部病理学组织 50 X观察照片图 11a为安慰剂组攻毒后第 16天的脾部病理学组织 25 X观察照片图 l ib为药物组攻毒后第 16天的脾部病理学组织 25 X观察照片图 12为安慰剂组细胞培养上清中的典型 SARS冠状病毒颗粒的电镜照片图 13-14为安慰剂组攻毒后第 6天的肺泡上皮细胞的电镜照片

图 15为安慰剂组攻毒后第 6天的脾淋巴细胞的电镜照片

实施发明的最佳方式

材料

菌株 '

大肠杆菌 DH5 α，毕赤酵母 Pichia pastoris购自华美公司。

酶，载体，引物和主要试剂

限制性内切酶、 T₄DNA连接酶、质粒抽提和回收试剂盒和 pGEMT载体均购自 Promega公司。引物由上海生工公司合成。 FICOLL, TRIZOL, 琼脂糖购自华美公司。 YNB为 Difico公司产品。低分子量标准蛋白为 Amersham Pharmacia 公司产品。糖苷酶 PNGase F购自 New England Biolabs公司。 MEM培养基和新生牛血清购自 Hyclone公司。

培养基

大肠杆菌培养基 LB培养基： 1 %蛋白胨， 1 %氯化钠， 0. 5 %酵母提取粉; LBAK培养基： LB培养基中分别加入氨苄青霉素和卡那霉素至终浓度为 100 g/mL。

酵母培养基 YPD培养基： 1 %酵母提取粉， 1 %蛋白胨， 2 %葡萄糖。 BMGY培养基： 1 %酵母提取粉， 1 %蛋白胨， 1. 34 YNB, 1 %甘油， 100ramol/L pH6.0的磷酸盐缓冲液， 4X10—⁵%生物素。 BMMY培养基： 1%酵母提取粉， 1 %蛋白胨， 1.34%YNB， 1%甲醇， 100mmol/L pH6.0的磷酸盐缓冲液， 4X10

—⁵%生物素。

细胞培养基：采用 MEM培养基，添加 3%-10%的新生牛血清。

实施例 1、重组人 ω干扰素的表达

1、 HuIFN-ω基因滅

采用 FIC0LL试剂，从人血中分离白细胞，用 TRIZ0L提取总 RNA，釆用常规 RT-PCR方法扩增人 ω干扰素基因，其中 PCR扩增的引物序列为

5' CGGAATTCATGCTGGGCTGTGATCTG3 ' ， 5' GCGTCGACTCAAGATGAGCCCAGG3 ' 。将得到的扩增产物连接入 pGEMT载体，得到重组质粒 pGEMTc 质粒。测序结果表明重组人 ω干扰素基因具有如序列表中序列 1所示的 cDNA序列，其编码如序列表 2所示的氨基酸残基序列。

利用具有序列表中序列 3 (扩增人 ω干扰素的 5' 端引物，引入 Xho I 切点，序列 3中自 5' 端的第 15-17位的 CTG密码子为编码人 ω干扰素的第一个密码子）和序列 4 (扩增人 ω干扰素的 3' 端引物，引入 Eco R I切点，）所示核苷酸序列的引物，用 PCR的方法从携带人 ω干扰素基因的质粒 pGEMTc 上扩增出该基因。分别用 Xho I和 EcoR\酶切载体 pMEX9K (齐连权，陈薇，于长明等.两个新型多拷贝毕赤酵母表达载体的构建 [J].军事医学科学院院刊， 2002， 26 (4) :264-266. ) 和 PCR产物，并回收酶切产物，连接得到重组质粒 pMEX9K ω，将该重组质粒通过 TSS法转化大肠杆菌 DH5 。从转化子中提取质粒，对提取得到的质粒进行测序，并用 ¾oI和^ oRI进行酶切，该酶切鉴定和测序结果表明，重组载体 ρΜΕΧ9Κω构建成功。重组载体的构建过程如图 1所示。图 1中， Kan+为卡那霉素抗性基因； rIFNW为重组人 ω干扰素基因； SS为 α-因子信号肽。 '

上述有关质粒 DNA的提取、酶切、回收、连接和转化等均按参考文献

(Sarabrook J, Fritsch EF， Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual [M] . New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, 16-56) 操作。

2、重组人 ω干扰素的高效表达

重组质粒 ρΜΕΧ9Κω DNA经 5¾Π酶切，分离纯化回收，用电转化法转化毕赤酵母 GS115。转化后的 GS115经 MD (MD培养基： 1. 34%YNB， 2 %葡萄糖， 4X 10— ⁵%生物素）平板筛选得到 hi s⁺重组克隆，将每个克隆同时点种于 MD、匪平板（匪培养基： 1. 34%YNB， 0. 5%甲醇， 4X 10^_5%生物素）， 30°C培养 2- 3d，确定每一个菌株的 Mut表型。将筛选出的三个表达量较高的重组克隆分别接种于 5ml BMGY中， 30 °C 300r/min培养至 0D₆。。为 2. 0-6. 0; 室温 6， 000r/min离心 4min。收集的菌体用 BMMY悬浮并稀释至 0D₆。。为 1. 0后， 30°C 300r/min诱导。每 12h补加甲醇至 0..5%。诱导 48h后收集培养上清， SDS- PAGE 检测蛋白表达并测定其生物活性。活性测定结果表明，三个阳性克隆上清活性分别为 3. 2 X 10⁶， 1. 6 X 10 n 3. 0 X 10⁶U/mL; SDS- PAGE检测蛋白表达的结果如图 2所示，在 22， 000处的蛋白条带为目的蛋白，该蛋白分子量大于理论分子量，推测可能为糖基化所致（在目的蛋白的氨基酸序列中，有一个潜在的糖基化位点 Asn80-Met81-Thr82)。图 2中，泳道 a. b. c为诱导后转化子的表达上清；泳 if d为诱导前转化子的表达上清；泳道 e为目的蛋白；泳道 m 为低分子量标准蛋白。

3、目的蛋白的分离纯化

将步骤 2中诱导后 48h的菌液， 10， 000r/min离心 10 min后，取上清用 0. 45Mm滤膜过滤，上样于乙酸钠预平衡的大颗粒阳离子层析柱（SP Sepharose XL, Amersham Biosciences) ，用 0. 5M氯化钠洗脱目的蛋白峰；目的蛋白峰上样于疏水层析柱（Phenyl HighSub, Amersham Biosciences ), 洗脱峰上样于小颗粒离子交换柱（Source 30S, Amersham Biosciences ) ， 500mol/L氯化钠洗脱目的蛋白峰；目的蛋白峰上样于 Superdex 75凝胶过滤柱，并用 20mmol/L PBS， 150mol/L氯化钠， pH7. 2洗脱目的蛋白峰。结果如图 3中的泳道 a所示，目的蛋白得到了很好的分离，经薄层扫描发现，目的蛋白纯度大于 95 %。

4、目的蛋白的去糖基化

利用糖苷酶 PNGase F对经上述纯化的目的蛋白进行消化，结果如图 3所示，表明重组人 ω干扰素的分子量约为 20， 300道尔顿，说明目的蛋白分子量大于理论分子量为糖基化所致。图 3中，泳道 a为经步骤 3纯化后的目的蛋白；泳道 b为经 PNGase F糖苷酶消化后得到的重组人 ω干扰素；泳道 _c 为 PNGase F糖苷酶；泳道 m为蛋白分子量标准。经过 PNGase F消化后的目的蛋白经 MALDI- T0F测定其相对分子质量与理论值基本一致（基质辅助激光解吸飞行时间 (MALDI-T0F)质谱技术测定目的蛋白在 PNGase F消化前后的分子量分别是 22， 166. 10和 20， 340. 71 ) 。

实施例 2、重组人 ω干扰素的鉴定

1、重组人 ω干扰素的 Ν端氨基酸序列分析

利用 ΡΕ公司的 491蛋白序列分析仪，采用自动 Edman降解法，测定了重组人 ω干扰素的氨基端的 15个氨基酸残基，其顺序为： LGCDLPQNHGLLSRN。说明重组人 ω千扰素具有同天然蛋白一致的氨基端氨基酸序列。

2、重组人 ω干扰素的活性测定

按照文献（中国生物制品标准化委员会编.中国生物制品规程 Μ .北京: 化学工业出版社， 2000， 373- 375. )进行。活性测定结果表明，经过实施例 1 ,步骤 3中的三步层析纯化后，目的蛋白的回收率在 35 %以上，最终目的蛋白的比活性达到了 2. 2 X 10⁸U/mL，同文献 (Horton H M, Hernandez P, Parker S E, et al. Antitumor effects of interferon— omega: in vivo therapy of human tumor xenografts in nude mice [J] . Cancer Res, 1999， 59 (16)： 4064-4068. )报道结果相似。

实施例 3、本发明的重组人 ω千扰素对 SARS冠状病毒攻击的保护作用病毒来源： SARS冠状病毒 BJ01 [J] (秦鄂德，祝庆余，于曼等， SARS相关病毒 (BJ01株)的全序列及其比较分析。科学通报， 2003, 48 ( 11 )： 1127 - 1134) ，以 1 : 20稀释使用。

细胞： VER0-E6细胞

本实施例所用的重组人 ω干扰素是实施例 1中的毕赤酵母 GS115表达得到的重组人 ω干扰素糖蛋白。

1、本发明的重组人 ω干扰素与 IFN- β对 SARS病毒攻击 VER0细胞的保护作用比较

IFN- β来源于国外上市的 CH0细胞重组产品 Rebif。为了明确 IFN- β和本发明的重组人 ω干扰素（rHuIFN- ω )抑制 SARS病毒细胞内复制能力的差别，应用细胞病变抑制 (CPE)方法对此进行了比较。 VER0-E6细胞以 25万 /ml 浓度接种 96孔培养板， 5 %C0₂、 37°C培养 4- 6hr，加入相同浓度的本发明的重组人 ω干扰素或 IFN- β培养 20h后，除 HI- H6孔外，每孔加入 100 μ 1病毒液，培养至病毒对照完全病变，结晶紫染色，结果如图 4所示，表明本发明的重组人 ω干扰素与 IFN- β具有相似的抗 SARS病毒活性。图 ½中， A1-G1 和 Α2- G2中每孔加入 10000IU/ml本发明的重组人 ω干扰素； A3-G3和 A4-G4 加入的本发明重组人 ω干扰素的浓度依次为 A3和 Α4为 10000IU/ml ； B3和 B4为 5000IU/ml ； C3和 C 为 2500IU/ml ； D3和 D4为 1250IU/ml ； E3和 E4为 625IU/ml ； F3和 F4为 312IU/ml ； G3和 G4为 156IU/ml ； A5-G5和 A6-G6加入的本发明重组人 ω干扰素的浓度依次为 Α5和 Α6为 10000IU/ml ； B5和 B6为 2000IU/ml ； C5和 C6为 400IU/ml ； D5和 D6为 80IU/ml ； E5 和 E6为 16IU/ml ； F5和 F6为 3. 2IU/ml ； G5和 G6为 0. 64IU/ml ； A7-G7 和 A8- G8每孔加入 10000IU/ml的 IFN-β； A9-G9和 A10- G10加入 IFN- β，其浓度依次为 Α9和 A10为 10000IU/ml ； B9和 B10为 5000IU/ml ； · C9和 C10 为 2500IU/ml； D9和 D10为 1250IU/ml； E9和 E10为 625IU/ml； F9和 F10 为 312IU/ml ； G9和 G10为 156IU/ml ； An- G11和 A12-G12加入 IFN- β，其浓度依次为 All和 A12为 10000IU/ml； B11禾口 B12为 2000IU/ml； C11禾口 C12 为 400IU/ml ； D11和 D12为 80IU/ml ； E11和 E12为 16IU/ml ； F11和 F12 为 3. 2IU/ml ； G11和 G12为 0. 64IU/ml ； H7- H12为病毒对照组; H1-H6 为细胞对照组。

2、本发明的重组人 IFN- ω喷雾剂对 SARS病毒攻击食蟹猴的保护作用为探讨本发明的重组人 ω干扰素喷雾剂防治 SARS的效果，进行了 SARS 一灵长类动物模型的探索和 SARS病毒攻击保护性实验。具体方法如下：将军事医学科学院动物中心提供的 10只食蟹猴（macaque) (3- 5年齢），随机分为安慰剂组和药物组，安慰剂组 4只，药物组 6只。于攻毒前 2天，药物组动物进行重组人 ω干扰素喷雾剂喷鼻（图 5) ，剂量与人用相同，即 200万 IU/8ml，左右鼻孔各 0. lml，每天一次，然后进行麻醉攻毒（图 6) ，攻毒后仍每天喷鼻一次；安慰剂组同步给予同等剂量的喷雾剂稀释液。攻毒株为 BJ01, 攻毒剂量为 lml ( 10⁷TCID₅o/ral ) 。于攻毒后第 6天和第 16天，解剖动物。

( 1 ) 大体解剖结果

安慰剂组：攻毒后第 6天，剖解见肺呈暗粉红色，肺表面不平，多个肺小叶肺尖部见有米粒大或大片出血斑（图 7b)；攻毒后第 16天，肺尖部出血更为明显，出血范围更广，肺呈暗红色，肺表面凹凸不平，可见发生气肿的肺泡突出于肺表面（图 8b ) ；脾肿大明显，呈暗黑褐色，边缘钝圆，脾表面见有白色的增生脾小体结节（图 9b) ；其它脏器无明显变化。

药物组：攻毒后第 6天（图 7a) 和第 16天（图 8a) ，肺呈暗粉红色，未见有出血斑；脾轻度肿大，表面可见少量白色脾小体增生结节（图 9a) 。

(2 ) 病理组织学观察

肺：攻毒后第 ₆天，安慰剂组食蟹猴肺间质及肺泡间隔内毛细血管中度扩张充血，呈间质性肺炎；攻毒后第 16天，肺炎更为明显，肺间质毛细血管高度扩张充血，有大量淋巴细胞和巨噬细胞浸润。肺泡间隔增宽，压挤肺泡腔变窄。重度炎症部位以重度渗出性炎症为特征，表现为肺泡和小支气管上皮细胞坏死、脱落，肺泡腔中有大量淋巴细胞、肺泡巨噬细胞、中性白细胞浸润和大量红细胞，偶见混杂纤维蛋白的蛋白性渗出液，整个肺组织结构破坏，相邻的肺泡代偿性肺气肿，多个肺泡腔破裂，融合成一个大腔（图 10a) 。攻毒后第 6天，药物组食蟹猴肺间质毛细血管轻度扩张充血，肺炎症状轻微; 第 16天，肺间质毛细血管及肺泡壁毛细血管充血，有少量淋巴细胞及巨噬细胞浸润（图 10b) 。

淋巴结：攻毒后第 6天，安慰剂组食蟹猴淋巴结淋巴细胞轻度增生，淋巴滤泡数目增多；攻毒后第 16天，淋巴结淋巴细胞增生更为明显，淋巴细胞致密，淋巴滤泡数目增多。药物组食蟹猴淋巴结淋巴细胞亦增生，但同期相比不及攻毒组明显。

脾：安慰剂组食蟹猴在攻毒后第 6天红髓血窦淤血，脾小体淋巴细胞轻度增生；攻毒后第 16天脾小体淋巴细胞增生更为明显，脾小体数目增多，脾小体生发中心淋巴细胞核分裂像明显，淋巴细胞排列紧密（图 11a) 。药物组动物脾淋巴细胞轻度增生（图 lib ) 。

肝：攻毒后药物组食蟹猴肝小叶结构完整，小叶内可见肝细胞颗粒变性和水泡变性，少数肝细胞脂肪变性；而安慰剂组食蟹猴肝细胞颗粒变性，汇管区中央静脉淤血，偶见血栓形成，肝汇管区中央静脉内亦可见有透明膜形成，汇管区少量淋巴细胞浸润，肝 Kupffer细胞轻度增生。

心肌：安慰剂组食蟹猴心外膜下心肌纤维间毛细血管充血，心肌纤维局灶性颗粒变性，尤以心外膜和心内膜下更为明显；药物组心肌纤维轻度颗粒变性。

肾：安慰剂组食蟹猴肾近曲小管和远曲小管上皮细胞颗粒变性或坏死，上皮细胞脱落；药物组食蟹猴肾小管上皮细胞颗粒变性。

其它脏器：未见明显变化。

( 3 ) 负染

在攻毒后第 6天和第 16天的安慰剂组食蟹猴肺组织匀浆中，分离出 SARS 冠状病毒。细胞培养上清中见有典型冠状病毒颗粒，病毒粒子直径 120nm左右，外周有典型冠状纤突（图 12， bar=100皿）。

(4) 超微结构观察

攻毒后第 6天，安慰剂组食蟹猴肺泡上皮和脾淋巴细胞胞浆内内质网扩张，冠状病毒粒子从内质上出芽，细胞胞浆中见有大量冠状病毒粒子，病毒颗粒直径 80- 120nm，病毒粒子中心电子密度低（图 13- 15， bar=100皿）。线粒体肿胀，核染色质凝聚。图 15中，右下角局部放大，示典型冠状病毒粒子。药物组食蟹猴肺上皮细胞和脾淋巴细胞偶见线粒体肿胀，胞浆空泡增多，未见典型冠状病毒颗粒。

本实施例中，安慰剂组食蟹猴接种 BJ01株冠状病毒，第 6天和第 16天，剖解见多个肺小叶肺尖部有米粒大或大片出血斑。病理组织学观察，食蟹猴均发生了间质性肺炎。重度炎症部位以重度渗出性炎症为特征，表现为肺泡和小支气管上皮细胞坏死、脱落，肺泡腔中有大量淋巴细胞、肺泡巨噬细胞、中性白细胞浸润和大量红细胞，偶见混杂纤维蛋白的蛋白性渗出液。在肺泡上皮细胞和脾淋巴细胞胞浆中观察到大量冠状病毒粒子，直径 80- 120nm。从肺脏分离出典型冠状病毒。这与人 SARS病人病理变化一致，表明食蟹猴可以作为研究 SARS的病理动物模型。

药物组食蟹猴同样接种大剂量 BJ01株冠状病毒，由于应用了本发明的重组人 ω干扰素喷雾剂，药物组动物与安慰剂组相比，肺部病理损伤程度轻，在肺泡上皮细胞未观察到冠状病毒粒子，也未能从脏分离出冠状病毒。表明本发明的重组人 ω干扰素能有效抑制 SARS病毒在体内的增殖，减轻对机体的损伤。

工业应用

本发明的重组人 ω干扰素有一个潜在的糖基化位点 A_Sn80-Met81- Thr82，经毕赤酵母表达的重组人 ω干扰素是被糖基化的蛋白，具有良好的热稳定性，常温下有效期达 6个月以上，非常方便医护人员在特定环境下随身携带和使用。另外，重组人 IFN-ω喷雾剂与其它生物免疫制剂相比，具有安全有效、无刺激、成本较低等特点，适合大规模普通人群应用。重组人 IFN-ω作喷雾剂的鼻腔给药方式，充分利用了鼻粘膜上丰富的微细绒毛和多孔的毛细血管，使干扰素通过鼻粘膜得到良好的吸收，激活鼻腔粘膜及临近组织上的受体系统而达到抗病毒作用。 VER0细胞实验表明本发明的重组人 ω干扰素与 IFN- β 具有相似的抗 SARS病毒活性；动物实验表明本发明的重组人 ω干扰素能有效抑制 SARS病毒在食蟹猴体内的增殖，减轻对机体的损伤。在 SARS流行期间，在中国北京、宁夏、河北、重庆、四川和天津六个省市自治区进行了重组人 ω干扰素预防 SARS病毒感染的临床研究，其中研究对象共 14061人，其中 8395 人为 rHuIFN- ω药物组，包括： SARS治疗定点医院的医务人员（高危人群） 4314人、 SARS疫区的城区居民 2181人、从疫区返乡的民工 1900人，结果表明重组人 ω干扰素在人群使用是安全的，并且能有效预防 SARS病毒感染。

本发明的重组人 ω干扰素表达方法具有产量高，表达及纯化简单易行，费用低廉，便于扩大生产等特点，具有广阔的市场前景。

Claims

权利要求书

1、一种重组人 ω干扰素，是具有序列表中 _SEQ ID No _: 2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将 SEQ ID No _: 2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与 SEQ ID No _: 2的氨基酸残基序列相同活性的由 SEQ ID No _: 2衍生的蛋白质。
2、根据权利要求 1所述的蛋白质，其特征在于：所述重组人 ω干扰素是具有序列表中 SEQ ID No : 2氨基酸残基序列的蛋白质。
3、重组人 ω干扰素的编码基因，是下列核苷酸序列之一- 1 )序列表中的 SEQ ID No : 1；

2)编码序列表中 SEQ ID o : 2蛋白质序列的多核苷酸；

3 )与序列表中 SE ID NO _: 1限定的 DNA序列具有 90%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的 DNA序列。
4、根据权利要求 3所述的编码基因，其特征在于：所述重组人 ω干扰素的编码基因是序列表中 SEQ ID Nfl: 1的多核苷酸。
5、含有权利要求 3或 4所述编码基因的重组表达载体。
6、根据权利要求 5所述的重组表达载体，其特征在于：所述载体为 ρΜΕΧ9Κ ω。
7、含有权利要求 3或 4所述编码基因的细胞系。
8、根据权利要求 7所述的细胞系，其特征在于：所述细胞系为含有所述重组人 ω干扰素编码基因的毕赤酵母菌 GS115。
9、一种表达重组人 ω干扰素的方法，是将含有上述重组人 ω干扰素编码基因的重组表达载体导入表达宿主，表达得到重组人 ω干扰素；所述重组人 ω干扰素的编码基因，是下列核苷酸序列之一： 1 )序列表中的 SEQ ID Na: 1； 2)编码序列表中 SEQ ID Na: 2蛋白质序列的多核苷酸； 3 )与序列表中 SEQ ID Nfi: 1限定的 DNA序列具有 90%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的 DNA 序列。
10、根据权利要求 9所述的方法，其特征在于：所述宿主为酵母菌、大肠杆菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞、枯草杆菌、乳酸杆菌。
11、根据权利要求 10所述的方法，其特征在于：所述宿主为毕赤酵母菌。 12、根据权利要求 11所述的方法，其特征在于：所述毕赤酵母菌为毕赤酵母菌 GS115。
13、根据权利要求 9或 10所述的方法，其特征在于：用于插入所述重组人 ω千扰素编码基因的表达载体为 pET、 pQE、 pMEX9K或 pPIC9K。
14、根据权利要求 13所述的方法，其特征在于：所述表达载体为 pMEX9K。

15、根据权利要求 9所述的方法，其特征在于：所述表达得到的重组人 ω干扰素通过以下方法纯化：过大颗粒阳离子层析柱，用 0. 5Μ氯化钠洗脱目的蛋白峰；目的蛋白峰上样于疏水层析柱，洗脱峰上样于小颗粒离子交换柱， 500mol/L氯化钠洗脱目的蛋白峰；目的蛋白峰上样于凝胶过滤柱，得到纯化的蛋白。
16、一种预防和 /或治疗由冠状病毒引起的疾病的药物，它的活性成分是重组人 ω干扰素。 '
17、根据权利要求 16所述的药物，其特征在于：所述冠状病毒为 SARS 病毒。
18、根据权利要求 16或 17所述的药物，其特征在于：所述重组人 ω干扰素是被糖基化的。
19、根据权利要求 18所述的药物，其特征在于：所述重组人 ω干扰素为在毕赤酵母表达系统中表达得到的糖基化的重组人 ω干扰素。
20、根据权利要求 19所述的药物，其特征在于：所述毕赤酵母表达系统为分泌表达系统。
21、根据权利要求 20所述的药物，其特征在于：所述分泌表达系统为表达载体 ρΜΕΧ9Κ或 pPIC9K。 '
22、根据权利要求 16或 17所述的药物，其特征在于：所述药物通过注射或粘膜给药。

23、根据权利要求 .22所述的药物，其特征在于：所述药物为注射剂、喷雾剂或滴鼻剂形式。
24、权利要求 1或 2所述重组人 ω干扰素在制备预防和 /或治疗由冠状病毒引起的疾病的药物中的应用。
25、根据权利要求 24所述的应用，其特征在于：所述冠状病毒为 SARS 病毒。 26、根据权利要求 24或 25所述的应用，其特征在于：所述重组人 ω干扰素是被糖基化的。
27、根据权利要求 26所述的应用，其特征在于：所述重组人 ω干扰素为在毕赤酵母表达系统中表达得到的糖基化的重组人 ω干扰素。
28、根据权利要求 27所述的应用，其特征在于：所述毕赤酵母表达系统为分泌表达系统。
29、根据权利要求 28所述的应用，特征在于：所述分泌表达系统为表达载体 ρΜΕΧ9Κ或 pPIC9K。
30、根据权利要求 24或 25所述的应用，其特征在于：所述药物通过注射或粘膜给药。
31、根据权利要求 30所述的应用，其特征在于：所述药物为注射剂、喷雾剂或滴鼻剂形式。