CN1769268A - 一种天然及人工合成的异硫氰酸酯类化合物jc－5411在制备转录因子sp1的抑制剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明阐明了异硫氰酸盐类化合物(ISOTHIOCYANATES)，即JC－5411类化合物，无论是天然的还是人工合成的异硫氰酸盐类，通过抑制基因转录因子SP1的表达而具有调节细胞中雄激素受体基因表达，抑制前列腺细胞异常增殖之功能。在极低剂量下，即可抑制雄激素所诱导的大鼠良性前列腺肿大(BPH)，及前列腺癌细胞生长。进而本发明提供了一种行之有效的预防和治疗前列腺肿大和前列腺癌的全新方法。该系列化合物还具有毒副作用低，化学生物学性质稳定，生产成本低廉等优点，具有广泛的适用性。

Description

一种天然及人工合成的异硫氰酸酯类化合物JC-5411 在制备转录因子SP1的抑制剂中的应用

技术领域

本发明属于医药应用领域，涉及JC-5411系列化合物，以异硫氰酸盐为母核结构，包括天然的和人工合成的异硫氰酸盐。本发明运用最新的分子生物学技术首次证明JC-5411系列化合物，具有调节细胞中雄激素受体基因表达，抑制前列腺细胞异常增殖之功能，在极低剂量下，即可抑制雄激素所诱导的大鼠良性前列腺肿大(BPH)，及前列腺癌细胞生长。进而本发明提供了一种行之有效的预防和治疗前列腺肿大和前列腺癌的全新方法。该系列化合物还具有毒副作用低，化学生物学性质稳定，生产成本低廉等优点，具有广泛的适用性。

背景技术

前列腺增生症，亦称良性前列腺肿大(BPH)，和前列腺癌是一种与年龄相关的男性疾病。半个世纪以来，随着人类平均寿命的延长，这两种前列腺疾病发病率急剧增加。据不完全统计，在西方国家50岁以上男性中，良性前列腺增生肿大发病率高达80％。在我国前列腺肿大发病率亦高达50％。

前列腺癌，是西方国家发病最高的恶性肿瘤，约占男性总人口的10％。在我国，传统上认为前列腺癌发病率较低，因而多年来该病的研究，预防和治疗均未受到应有的重视。然而，随着人们经济生活的改善，生活习惯的变化及寿命的延长，近年来的研究表明，前列腺癌发病率增加惊人。因而若再不及时采取有力措施，加强科研力度，扭转预防上空白，治疗上依靠进口药物的状况，势必对日益老年化的中国社会带来严重的经济上的负面影响。

前列腺增生的主要危害是尿路梗阻。增生的腺体向尿道内突出，使前列腺段尿道弯曲、延长、变窄，膀胱底部抬高，尿道阻力增加，从而引起排尿困难，甚至尿潴留。由于尿液排出受阻，膀胱逼尿肌必须过度收缩才能完成排尿，使膀胱逼尿肌代偿肥厚；随着梗阻的进一步发展，膀胱逼尿肌即使过度收缩也不能将尿液完全排空，出现残余尿，膀胱壁肌束增厚突出形成小梁，小梁之间形成憩室，极易出现泌尿系感染和膀胱结石；长期排尿困难导致腹压增高，可引起腹股沟疝、脱肛或内痔等。如果不积极治疗，可出现膀胱输尿管反流，导致肾积水，压迫肾实质使肾功能减退，甚至肾功能衰竭。并且，若得不到合理治疗，良性前列腺增生肿大亦有演变成前列腺癌的危险。

研究表明，影响前列腺增生症和前列腺癌发病的因素很多，例如饮食习惯。国内有学者根据长期以来我国城市居民鱼、肉、蛋消耗量明显多于乡村居于的现实，调查了不同年龄组城乡居民前列腺增生症的发病情况的差异。研究结果表明，各年龄组前列腺体积都是城市比农村大。因为城市居民的上述高蛋白，脂肪食物消耗量明显多于乡村居民，进而认为高蛋白，高脂肪饮食与前列腺增生症和前列腺癌发病有关。但这类研究严重的缺陷是忽略了一个重要因素：即农村居民的蔬菜慑取量大大超过城市居民。

Kristal and Lampe⁽¹⁾流行病调查研究已表明，大量摄用芸苔类素菜可明显降低前列腺癌的发病率。十字花科蔬菜，包括芸苔类，如椰菜(绿菜花)，卷心菜，芽甘菜，白菜花等都能预防前列腺癌，并且这种预防作用没用种族差异^(2，3)。

另一重要因素是性激素。研究表明，前列腺增生症及前列腺癌的发病与因老龄而导致的性激素及其受体功能异常密切相关。例如，在对26例清宫太监随访中发现，这些太监虽平均年龄达72岁，但他们一般已在10---26岁时行阴茎、睾丸、阴囊切除术，因没有功能性睾丸，前列腺均呈高度萎缩状态。这一观察说明性激素对前列腺细胞的幸存和生长必不可少。

在前列腺组织中，睾丸酮(TESTOSTERONE，T)，在5α-还原酶的作用下生成更具有雄激素生物活性的二氢睾丸酮(DIHYDROTESTOSTERONE，DHT)。而DHT在前列腺生长，发育，和分化过程中都具有重要的作用。研究已证明在前列腺基质细胞中，前列腺肿大患者的5α-还原酶的活性是正常人的7倍⁽⁴⁾，进而细胞中DHT的含量由此而增加。一般认为增加的DHT将促进前列腺细胞增殖。

另一方面，雄激素及其受体(AR)在前列腺癌的发病，治疗中扮演重要角色。更应指出的是，早期的前列腺癌都属于激素依赖型，对抗激素治疗敏感。然而经过数月治疗后，大多数病人则由激素依赖型转为激素非依赖型。而激素非依赖型前列腺癌，对激素治疗或化疗都不敏感，是前列腺癌患者死亡的主要原因。

在绝大多数情况下，前列腺癌(PC)的恶变转型(从激素依赖型转变为激素非依赖型)都与雄激素受体(AR)的高度表达和活化密切相关⁽⁵⁾。其主要分子机理包括：1)雄激素受体(AR)基因扩增或基因突变以使得雄激素受体(AR)对低水平的雄激素或非雄激素配基高度敏感^(6-10)；2)雄激素受体(AR)与生长因子信息传导通路相互作用^(11-19)；3)雄激素受体(AR)过度的与转录辅助因子相互作用^(20-22)。采用定量DNA多聚酶链反应(Q-PCR)方法测定表明，激素非依赖型前列腺癌中的雄激素受体(AR)水平比激素依赖型或良性前列腺肿大细胞组织平均高6倍之多(7)。临床上有三分之一的激素非依赖型前列腺癌(PC)出现AR基因扩增^(8，23)。采用基因芯片技术，CHEN等人发现AR是唯一的在所有的激素非依赖的PC中都有所增加的基因⁽²⁴⁾。很显然，高度表达的雄激素受体(AR)基因使得其下游基因功能异常⁽⁶⁾，这些雄激素受体(AR)下游基因在激素治疗中促进PC细胞增殖和生存起了重要作用⁽²⁵⁾。为了研究PC细胞转型机理，我们成功建立了激素非依赖型细胞系，并证明了在这些激素非依赖细胞中AR高度表达，其主要以磷酸化的形式存在于细胞核中，具有生物学活性^(26-28)。

于是，对于激素非依赖性PC，不管是由于其AR基因扩增，突变，或是高度异常活跃，着眼于抑制AR表达的疗法将比现有的治疗方法更能有效地克服激素非依赖性而导致的耐药，进而取得更好的疗效。

雄激素受体(AR)基因属于不含有传统调节序列TATA和CCAAT的基因家族。相反地，3个SP1的调节序列出现在雄激素受体(AR)启动子的转录起始部位及5‘端非表达区(5’-UTR)^(29-33)。

SP1是最早被发现和克隆的转录因子⁽³³⁾。其含有3个具有基因转录调节功能区(34，35)。虽然许多基因的转录受SP1调控，但我们初步实验表明SP1对AR启动子的作用特别。

如图2所示，多个调节位点存在于整个雄激素受体(AR)启动子和5’UTR区域，包括NF-E1，OCT，CTF/NF-1，SP1，AG重覆序列，CCAAT(但不位于转录起始区)以及2个类似于E-盒调节序列⁽³⁶⁾。其中位于-278到+304区域的SP1和E-盒已被证明能调节AR转录^(37，38)。位于转录起始点附近的5‘UTR序列(+21到304)亦已被证明能增加AR表达效益⁽³⁸⁾，并与调节序列(-278到-74)相互作用促进AR的转录。我们发现了2个彼此相连的SP1位点位于5’-UTR的+429～+442处，并证明了该SP1序列同样能促进AR转录。于是SP1转录因子抑制剂将能有效地抑制AR转录和表达，进而达到预防和治疗激素依赖型和激素非依赖型前列腺癌。

在治疗上，前列腺增生症以手术治疗为主，药物治疗为辅。对于手术治疗，事实证明，一个世纪以来，手术作为治疗前列腺增生症的方法，虽然效果较好，死亡率不高，但仍给病人带来不同程度的损害。据美国医师对那些经尿道前列腺电切术(TURP)后前列腺增生症患者的长期随访，发现20％～25％的患者远期效果不甚理想，手术仍有尿路症状。随访10年以上者，约15％～20％的患者需再次手术，术后继发尿失禁者占2％～4％，阳痿占5％～10％，逆向射精达70％～75％。而药物治疗在西方国家一般采用5α-还原酶抑制剂如PROSCAR(美国麦克)和α1-肾上能受体拮抗剂。这二种治疗方法在一定程度上能缓解疾病症状(39)。在我国，前列腺增生症的治疗主要是中草药，如花粉素等，其疗效不确定。前列腺癌的治疗药物则主要依赖进口。

为了填补在该领域的研究空白，申请人无锡杰西医药科技有限公司在大量研究基础上，发现异硫氰酸盐(JC-5411系列化合物)，无论是天然的，还是人工合成的，均能抑制SP1转录因子，进而抑制异常的雄激素受体的转录和表达。我们的研究还表明，这类化合物具很强并等同抑制激素依赖和激素非依赖前列腺癌细胞生长的能力。动物实验亦已证明，JC-5411能有效地阻断雄激素诱导的前列腺肿大。与现有的治疗前列腺肿大和前列腺癌的药物相比，JC-5411系列化合物具有如下优点：

1、JC-5411系列化合物是新型的SP1抑制剂。与传统的SP1抑制剂如Mithramycin不同，JC-5411抑制SP1自身的表达，而不是干扰SP1转录因子与SP1靶DNA结合，进而JC-5411不具有传统SP1抑制剂所具有的毒性。

2、JC-5411在分子作用机理上是全新的治疗和预防前列腺肿大和前列腺癌的药物--即通过抑制异常的雄激素受体的转录和表达，因此不但具有高度的选择性，而且对治疗和预防前列腺肿大和早期激素依赖前列腺癌及晚期激素非依赖的前列腺癌有等同的效果。

3、与现有的治疗良性前列腺增生的药物相比，JC-5411不具有传统药物的副作用，特别是女性化及性功能减退等。

4、JC-5411系列化合物对非增殖正常细胞无任何作用，具有高度的选择性，进而毒副作用低。

5、JC-5411系列化合物具有较好的理化性质，适宜制成各种药物剂型，生产成本低廉。

发明内容

本发明的目的在于寻求一种天然及人工合成的异硫氰酸酯类化合物JC-5411在制备转录因子SP1的抑制剂中的应用，以JC-5411为代表，通过阻断SP1转录因子活性而抑制AR的转录与表达，进而抑制异常的前列腺增生及前列腺癌细胞的生长，可预防和治疗良性前列腺增生和前列腺癌。

本发明通过基因转染及蛋白印迹等分子生物学技术，在世界范围内首次证明了JC-5411系列化合抑制基因转录因子SP1的表达，使功能性SP1蛋白水平下降。

本发明通过基因转染和蛋白印迹方法在世界范围内首次证明了JC-5411对转录因子SP1的抑制而使维护前列腺细胞生存和增殖的雄激素受体水平下降。

本发明通过动物实验，在世界范围内首次证明了雄激素能促进良性前列腺细胞增生。这种增生能有效地被JC-5411阻断。

本发明通过MTT法证明了JC-5411不仅对激素依赖型和激素非依赖型前列腺癌细胞都具有很好抑制作用，而且对临床上束手无策的激素非依赖型前列腺癌亦具有与激素依赖型前列腺癌相同的抑制作用。

该项发明提供的药物产品用于治疗和预防良性前列腺肿大和前列腺癌。作为药用，这些产品含有有效剂量的JC-5411和其它制药工业所采用的一切适宜添加剂，以及各种适宜的给药途经。娴熟的药物生产工艺包括使用无毒的制药工业所接受的药物前体为原料，采用多种方法从天然材料中提取或人工合成JC-5411。娴熟的药物生产工艺还包括使用制药工业所接受的溶剂作为JC-5411的溶媒，例如水，矿物油，食用油，二甲基亚砜等。

在使用时，可以是单药治疗，亦可以是联合治疗。联合治疗可以是与其它西药联用，亦可以与中草药联用，或是与手术，放疗，免疫治疗，激素治疗，基因治疗等联用。联合治疗可以是同时治疗，亦可以是不同先后次序治疗。

JC-5411系列化合物作为药用，可以采用任何给药途经，任何给药方式。即可以口服，注射，吸入，透皮吸收，植入，腔边，黏膜，以及静脉滴注等。

JC-5411系列化合物作为药用，可以制成片剂，丸剂，胶囊剂，膏剂，霜剂，贴剂，粉剂，针剂，喷雾剂，植入剂，栓剂，滴剂等多种剂型。

JC-5411可制成口服给药，局部用药，吸入给药，肛门给药等剂型。使用无毒的制药工业所接受的材料作为载体，附加剂，赋型剂。再次指出的是给药方式可以是联合用药。可服给药剂型包括：片剂，胶囊，酊剂，锭剂，口服糖浆或其它一切适用剂型。

JC-5411可制成系统给药剂型，包括：皮下注射，皮内注射，肌肉注射，静脉注射，脊椎注射，鞘内注射，或其它任何注射给药和滴注。除此之外，JC-5411制剂除含有有效剂量的JC-5411外，尚含有其它药学上一切可用的无毒物质。包括一种或多种载体，稀释剂，附加剂，以及如果需要的话，其它药用成份。

JC-5411可制成任何形式的口服剂型，包括：片剂，锭剂，软硬胶囊，可服水剂，酊剂，口服混悬液，粉剂，乳化剂等。口服剂型可含有一种或多种甜味剂，矫味剂，颜色剂及防腐剂，以保证色彩完美和便于服用。

用于JC-5411片剂的赋型剂可以是惰性的稀释剂，如碳酸钙，碳酸钠，乳酸钙，磷酸钙，磷酸钠；制颗粒剂：玉米淀粉，藻朊酸；粘合剂：淀粉，明胶或是阿拉伯胶；滑润剂：硬脂酸，硬脂酸镁或滑石粉。采用一切已知技术，制成包衣或无衣片剂。包衣剂型包括肠溶衣和缓释剂型。用于缓释剂型的材料可以是甘油单脂或甘油二脂盐。

JC-5411胶囊可以是硬胶囊，亦可以是软胶囊。用于硬胶囊的辅料可以是碳酸钙，磷酸钙或高岭土。用于软胶囊的辅料如水，油类包括花生油，橄榄油或液态石蜡。

JC-5411口服水型混悬液可将有效剂量的JC-5411与合适的稀释剂配制而成。其稀释混悬剂可以是羟甲基纤维素钠或甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，藻酸钠盐，聚乙烯吡咯烷酮，西黄耆胶，阿拉伯胶。分散剂或湿润剂包括：天然磷脂，如卵磷脂，或烯烃氧化物与脂肪酸的缩合物，如17烷基乙烯氧化烷醇，或是乙烯与脂肪酸部分酯化缩合物，或是己糖醇如聚氧乙烯山梨醇单油酸盐，或是氧化乙烯和脂肪酸部分脂肪缩合产物，以及乙醇酐，如聚乙烯山梨醇甲酯酸盐。

JC-5411口服水型混悬液也可能含有一种或多种防腐剂，如乙基对或邻羟基苯安息香盐；含一种或多种甜味剂，如蔗糖或糖精。

JC-5411油型混悬液可将有效剂量的JC-5411混悬于植物油中，如大豆油，花生油，橄榄油，芝麻油，可可油。或是矿物油，如液态石蜡。该制剂亦可含有稀释剂，如蜂蜡，蜡，或十六烷醇，上文所述的甜味剂，以及矫味剂和稳定剂，如抗氧化剂维生素C(抗坏血酸)。

采用如上所述的分散剂，湿润剂，混悬剂，防腐剂，矫味剂，甜味剂，以及着色剂，JC-5411亦可制成水包油型制剂。JC-5411制成水包油型乳化剂。其油相可以是如上所述的植物油，如大豆油，橄榄油，花生油等。亦可以是液态石蜡，矿物油，或是二类的混合物。乳化剂可以是天然的乳化剂，如金合欢胶，或是西黄耆胶，天然磷脂如大豆磷脂，卵磷脂，脂肪酸，己糖醇或酐的脂或半脂化物，如山梨醇单脂。亦可是人造化工材料，如氧化乙烯半脂缩合物，聚乙烯山梨醇单脂盐。JC-5411的水包油型乳化制剂亦可含有甜味剂和矫味剂等。

JC-5411的糖浆剂和酊剂可采用甜味剂，如丙三醇，丙二醇，山梨醇或蔗糖。该制剂亦可含有湿润剂，防腐剂，矫味剂，颜色添加剂。

JC-5411的注射剂可采用无菌注射液或是油状混悬液。其可运用药剂学上一切适用的分散剂，湿润剂或混悬剂。该制剂可以是无菌透明液，使用药剂学上一切适用的稀释剂，如1，3-丁二醇，水，林格氏溶液或生理盐水。此外，无菌油脂类亦可作为溶剂或混悬剂，这可以是合成的甘油单脂或二脂，脂肪酸，如油酸等。

JC-5411亦可制成栓剂，如肛门栓剂等。栓剂可由一定量的JC-5411与相应的无刺激赋型剂组合而成。赋型剂在常温下为固体，但在肛门体温下液化而释放药物。适用的赋型剂包括可可脂和聚乙烯二醇类。

JC-5411的系统给药剂型，根据所用载体浓度，可以是混悬型，亦可是溶解型。为了使用便利或减轻病人痛苦，可添加防腐剂，缓冲剂和局部麻醉剂。

JC-5411亦可作为兽医用药。为便于动物服用，含有JC-5411的制剂可加入动物饲料中或饮水中。亦可制成方便的剂型作为动物的食品或饮品。

对于人，在治疗上述疾病时，JC-5411的剂量范围初步定为每公斤体重0.01mg至15mg，或按人均体重60公斤计大约每天0.6mg至900mg。根据给药方式，JC-5411可制成单一剂量剂型或多剂量剂型。剂量单位初步定为含有效成份1mg至500mg。

每日给药次数依病种而定。多数情况下，每日不多于四次。应指出的是，给药剂量可能取决于多种因素，如年龄，体重，健康状况，性别，饮食，以及给药时间，途径，病情，和药物的联合使用等。于是，最终给药方案应由医生根据具体情况而决定。

该专利所提及的优先化合物，有理想的药理学性质，其包括但不仅仅限于如下方面：优越的口服生物利用度，低毒性，低血浆蛋白结合率和理想的体内外半衰期。这类化合物能通过血脑屏障，这对治疗中枢神经系统疾病是其优点。

附图说明

图1，JC-5411及其活性代谢物PEITC-NAC的化学结构。

图2，雄激素受体(AR)基因启动子及AR-荧光素酶转染基因pLARS-1，AR-Sp1-3-0，pMAR-Sp1-3-0结构示意图。

图3，JC-5411对Sp1转录因子活性的影响。将对数生长期LNCAPAD细胞，以Sp1转录因子特异的荧光素酶转染基因转染，并于转染后24小时加入如图所示浓度的光辉霉素(阳性抑制剂对照)，Trichstain A(TSA，阳性促进剂对照，A)或JC-5411(B)。继续温孵24小时后，洗涤细胞，将其溶解后测定荧光素酶活性。由图中可以看出，JC-5411显著地抑制Sp1转录因子活性，有很好的剂量-效应关系。

图4，JC-5411抑制Sp1转录因子与其靶基因AR启动子DNA的结合。将对数生长期的LNCAP细胞，以不同浓度的JC-5411或光辉霉素(Mithramycin)(阳性对照)处理24小时后，提取细胞核蛋白。按文中所述方测定SP1-DNA复合物。实验表明，JC-5411与阳性对照药物光辉霉素相似，抑制SP1-DNA复合物的形成，并有很好的剂量-效应关系。

图5，JC-5411对SP1蛋白表达的影响。将对数生长期的LNCAP AD细胞以不同浓度的JC-5411处理24小时后，提取细胞总蛋白，以文中所述蛋白印迹方法测定SP1蛋白水平，并以β-Actin为内标，以确保实验的可靠性。由图中可以看出，JC-5411在浓度5μM时，明显地抑制SP1的表达。

图6，JC-5411对雄激素受体(AR)转录的影响。将对数生长期的LNCAPAD细胞以AR-荧光素酶转染基因pAR-Luc(pLARS-1，图1)，或SP1特异的AR-荧光素酶转染基因pARSp1-3-Luc(pAR-Sp1-3-0，图1)转染。24小时后，将转染细胞以不同浓度的JC-5411处理24小时，再按文中所述方法测定转染基因酶活性。如图所示，JC-5411显著地抑制雄激素受体的转录，呈良好的剂量-效应关系。

图7，JC-5411对内源性雄激素受体(AR)及其下游基因前列腺表面抗原(PSA)表达的影响。将对数生长期的LNCAPAD细胞，以不同浓度的JC-5411处理24小时，提取细胞总蛋白，再以文中所述的蛋白印迹法测定AR和PSA。如图所示，在10μM的JC-5411作用下，雄激素受体及其下游基因前列腺表面抗原的水平显著下降。

图8，紫杉醇(paclitaxel)和JC-5411对激素依赖型(LNCAP AD)及激素非依赖型(LNCAP AI)前列腺癌细胞生长抑制作用及其比较。取对数生长期的LNCAP AD和LNCAP AI细胞，以系列稀释的紫杉醇(A)或JC-5411(B)处理7天，以文中所述的MTT法测定细胞生长率。由图中曲线可以看出，激素依赖型和激素非依赖性对JC-5411有相同的敏感性，而对紫杉醇的敏感性，这二种细胞有很大的差异。

图9，JC-5411对雄激素诱导的良性前列腺增生的阻断作用。以文中所述方法建立动物模型并以JC-5411治疗。在JC-5411停药后24小时，将动物处死，称重，并取出前列腺组织，称量前列腺组织的重量。如上图所示，非治疗正常组和JC-5411治疗组相比较，动物的前列腺重量完全相同，而病理模型组和非治疗正常组相比较，病理模型组动物前列腺平均重量显著增加。雄激素诱导的这种良性前列腺增生能完全被JC-5411所阻断。

图10，雄激素对雄激素受体(AR)及细胞周期因子Cyclin D1和Cyclin E的诱导表达及JC-5411的抑制作用。动物模型及治疗见图9。在JC-5411停药后24小时，将动物处死，从前列腺组织中提取蛋白，以实施例一中所述的蛋白印迹方法测定雄激素受体及其它与细胞生长相关的蛋白含量变化。该图显示，动物给予雄激素后，前列腺组织中雄激素受体表达明显增加，同时，与细胞增殖相关的细胞周期因子的Cyclin D1和Cyclin E表达亦明显增加。动物经JC-5411治疗后，异常增加的AR，Cyclin D1和Cyclin E都回到正常水平。

具体实施方式

实施例1，JC-5411的合成：

仪噐与试剂

¹H-NMR谱用BruckerAV-300型核磁共振仪测定，內标TMS，溶剂为CDCl₃；MS用Nicolet FTMS-2000型质谱仪测定；元素分析用Elementar Vario EL III仪器测定。

薄板层析(TLC)采用硅胶GF254(青岛海洋化工厂生产)自制；试剂均为市售化学纯或分析纯产品，未经处理直接使用。

JC-5411(苯乙基硫代异氰酸酯，Phenethyl Isothiocyanate)的制备及检验

在50mL圆底烧瓶中加入15mLCH₂Cl₂和硫代光气3mL(40mmol)，搅拌，冷却至0℃，用恒压滴液漏斗缓慢滴加等当量的三乙胺(4.04g，40mmol)与苯乙胺(4.85g，40mmol)组成的混合液(滴加过程放热，温度不宜超过15℃)。滴毕后，在室温下反应5～6小时，用TLC检测苯乙胺消失后，加入10mL水淬灭反应。再加5mLCH₂Cl₂，分液漏斗分出有机相，无水硫酸钠干燥有机相后，过滤，浓缩有机相至干。残留液用石油醚(沸程60～90℃)作洗脱液，经硅胶柱洗脱纯化，浓缩后，经真空精馏得无色油状液体4.9g，产物纯度＞99.0％，产率75％。

通过¹H-NMR(Brucker AV-300型核磁共振仪)，MS(Nicolet FTMS-2000型质谱仪)，元素分析(Elementar Vario EL III仪器)进行结构确证，结果如下：

¹H-NMR δ：7.26～7.24(m，3H，Ph-H)，7.12(d，J＝8.5Hz，2H，Ph-H)，3.94(t，J＝7.0Hz，2H，CH₂)，2.81(t，J＝7.0Hz，2H，CH₂)；ESI-MS：164.1[M+H]⁺，C₉H₉NS(163.24)；Anal.Calcd for C₉H₉NS：C66.22，H 5.56，N8.58；Found：C 66.30，H 5.42，N 8.34；分子量为163.24。

JC-5411产物的具体分子式为：

实施例2，JC-5411抑制转录因子SP1的活性：

材料及方法：

试剂：取上述合成的JC-5411产物以DMSO配成溶液。Sp1-luc和mtSp1-luc是由启动子含有3个重复的SP1调节序列的荧光素酶基因及相应的突变基因构成，用于测定SP1转录因子的活性⁽⁴⁰⁾。Effectene转染试剂及荧光素酶测定试剂盒分别购于Qiagen(Valencia，CA)和Promega(Madison，WI)。蛋白印迹ELC试剂盒购于Amersham Biosciences(Buckingamshire，England)。蛋白电泳用聚丙酰胺凝胶试剂，SDS，电泳缓冲液，蛋白电转移缓冲液，购于美国Bio-Rad生命科学公司。实验用其它化学试剂，除特别说明外，均购于美国Sigma化学试剂公司。

细胞培养：人前列腺癌细胞LNCAP AD，购于American Type CultureCollection(最好能提供ATCC编号)。LNCAP A工根据GAO等人方法而建成⁽²⁶⁾。AD和AI细胞置于37℃，5％ CO₂温箱中，分别以含10％正常胎牛血清及活性碳吸呼过的胎牛血清和青霉素和链霉素的RPMI1640培养基培养。

基因转染：将对数期生长的AD或AI细胞接种于直径60毫米的平皿中，细胞密度为每毫升10⁵。在5％CO₂和37℃培养24小时后，细胞以每平皿1μgSP1-荧光素酶基因(Sp1-luc)，相应的突变基因(mtSp1-luc)进行转染，以Effectene(Qiagen，Valencia，CA)为转染试剂。转染后24小时，细胞以不同浓度的JC-5411处理24小时。收集细胞，洗涤后加入细胞溶解试剂，以Promega荧光素酶活性测定系统测定荧光素酶活性。

电迁移分析(EMSA)：EMSA是根据现有技术所述方法进行^(41，42)。简言之，将对数生长期的AD细胞以不同浓度的JC-5411处理24小时，按文献方法提取核蛋白。将5μg的核蛋白与³²P-标记的Sp1核苷序列或相应的突变核苷序列探针在室温下反应30分钟，其反应液中含有1g的dIdC，以提高反应的特异性。将反应产物以8％非变性的用聚丙酰胺凝胶进行电泳。聚丙酰胺凝胶干燥后，以X-光胶片检测蛋白-核酸反应信号。

蛋白印迹法检测SP1蛋白：取对数生长期的人前列腺癌细胞LNCAP以不同浓度的JC-5411处理24小时。收集细胞，洗涤，以文献方法⁽²⁷⁾提取蛋白，定量。取50μg的蛋白进行SDS-聚丙酰胺凝胶电泳。电泳后，将蛋白电转移到硝酸纤维膜上，以特异的SP1抗体进行检测，并以β-Actin抗体作为内标。

结果：为研究JC-5411对SP1转录因子的抑制作用，我们测定了JC-5411对SP1特异的荧光素酶转染基因影响。并以SP1特异激活剂TSA和SP1特异抑制剂作为对照，以确保测定系统的可靠性^(27，40)。如图3所示，Sp1-luc转染的AD细胞经JC-5411处理24小时后，转染基因的荧光素酶活性显著下降，其作用与阳性对照药物光辉霉素相似，并且呈现很好的剂量-效应关系。相反TSA则显著地促进荧光素酶活性。而以mSp1-luc转染的细胞则无活性。因此该实验说明JC-5411是SP1转录因子抑制剂。

为阐明JC-5411抑制SP1转录因子的作用机理，我们以电迁移法研究了JC-5411对SP1-DNA结合作用的影响。作为转录因子，SP1蛋白必须与其调节的靶基因启动子的SP1结合位点结合后才能激活该基因的转录。EMSA法则是研究这一作用的常用方法。从图4可见，细胞经JC-5411处理后，核蛋白(含有SP1转录因子)与SP1特异的寡聚核甘酸序列的结合呈药物浓度相关的关系下降。这一结果不仅再次证明JC-5411是SP1转录因子抑制剂，而且也说明JC-5411对SP1下游基因的抑制(如上述实验中的人造SP1特异的荧光素酶转染基因)是通过降低SP1转录因子与其靶基因启动子的结合而作用的。

为进一步阐明JC-5411对SP1的作用，我们以蛋白印迹法测定了JC-5411对SP1蛋白表达的影响。如图5所示，AD细胞经不同浓度的JC-5411处理24小时后，细胞SP1蛋白水平明显下降。在5.0或10M的JC-5411作用下，SP1蛋白量分别下降了50％和70％。该实验结果说明JC-5411对SP1的抑制是通过抑制SP1蛋白的表达而实现的。这与传统的SP1抑制剂如光辉霉素不同，后者是通过干扰SP1蛋白与其靶基因启动子的结合而发挥SP1抑制作用的⁽⁴³⁾。

实施例3，JC-5411对雄激素受体转录与表达的抑制

材料与方法

试剂：JC-5411，同实施例2。AR转染基因见参考文献⁽⁵⁾。SP1特异的雄激素受体(AR)-荧光素酶转染基因(pAR-Sp1-3-O，见图1)，是通过在荧光素酶基础基因pGL3(无启动子)中插入3个重复序列的SP1序列(位于AR启动子+429～+442)或相应的突变序列，其序列经DNA序列分析以确保准确无误。Effectene转染试剂及荧光素酶测定试剂盒分别购于Qiagen(Valencia，CA)和Promega(Madison，WI)。AR，PSA及β-actin购于Santa Cruz Biotechnology，Inc.(Santa Cruz，CA)。蛋白印迹ELC试剂盒购于Amersham Biosciences(Buckingamshire，England)。蛋白电泳用聚丙酰胺凝胶试剂，SDS，电泳缓冲液，蛋白电转移缓冲液，购于美国Bio-Rad生命科学公司。实验用其它化学试剂，除特别说明外，均购于美国Sigma化学试剂公司。

细胞培养：同实施例2。

基因转染：将对数期生长的AD或AI细胞接种于直径60毫米的平皿中，细胞密度为每毫升10⁵。在5％CO₂和37℃培养24小时后，细胞以每平皿1μgAR-SP1-荧光素酶基因(pAR-Sp1-3-O)，相应的突变基因(pmAR-Sp1-3-O)进行转染，以Effectene(Qiagen，Valencia，CA)为转染试剂。转染后24小时，细胞以不同浓度的JC-5411处理24小时。收集细胞，洗涤后加入细胞溶解试剂，以Promega荧光素酶活性测定系统测定荧光素酶活性。

蛋白印迹法检测SP1蛋白：将对数生长期的人前列腺癌细胞LNCAP以不同浓度的JC-5411处理24小时。收集细胞，洗涤，以文献方法⁽²⁷⁾提取蛋白，定量。取50μg的蛋白进行SDS-聚丙酰胺凝胶电泳。电泳后，将蛋白电转到硝酸纤维膜上，以特异的AR或PSA抗体进行检测，并以β-Actin抗体作为内标。

结果：由于SP1转录因子是操纵雄激素基因转录的主要转录因子，我们推测JC-5411对SP1的抑制将会影响AR的转录和表达。为证实这一推测，我们测定了JC-5411对AR转染基因pAR-luc(pLARS-1)及SP 1特异的雄激素受体(AR)-荧光素酶转染基因(pAR-Sp1-3-O，见图1)表达的影响。如图6所示，pAR-luc转染的LNCAP细胞经JC-5411处理24小时后，转染基因pAR-luc的荧光素酶活性明显下降。并且JC-5411对该转染基因的抑制作用具有很好的剂量效应关系。JC-5411对pAR-luc抑制作用的IC50大约为10μM。

为了证明JC-5411对AR基因转录表达的抑制是通过抑制SP1转录因子而实现的，我们测定了JC-5411对仅仅含有特异SP1调节序列的AR转染基因pAR-Sp1-3-O的作用。正如所料，JC-5411对pAR-Sp1-3-O有十分相似的抑制作用(图6B)。这一实验充分证明了JC-5411通过抑制SP1转录因子而阻断AR的转录和表达。

由于上述实验只证明了JC-5411对外源性AR转染基因的抑制作用，但该化合物对于内源性AR基因是否有相同抑制作用还须实验证明。为此我们以蛋白印迹法测定了JC-5411对LNCAP细胞内源性AR蛋白水平的影响。如图7所示，细胞经JC-5411作用24小时后AR蛋白水平明显下降。在JC-5411浓度为10μM时对AR表达作用的抑制最为明显。在相同浓度下，JC-5411亦明显抑制AR的下游基因-前列腺表面抗原(PSA)的表达。这一结果进一步说明了JC-5411亦阻断对内源性AR表达。

实施例4，JC-5411对激素依赖和激素非依赖前列腺癌细胞的抑制作用材料及方法：

试剂：JC-5411，同实施例2。实验用其它化学试剂，除特别说明外，均购于美国Sigma化学试剂公司。

细胞培养：人前列腺癌细胞LNCAP，同实施例2。

MTT：MTT和SRB实验方法如文献所述⁽⁴⁴⁾，简述如下：取对数生长期的癌细胞，接种于96孔板中，细胞密度为每孔2500细胞/200μl。24小时后加入等系列稀释的JC-5411或紫杉醇。细胞在药物作用下，继续培养7天。每孔取出100μl的培养液后，加入50μl MTT[溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide]溶液继续培养4小时。以200μl盐酸异丙醇溶液溶解紫黑色的甲潜沉淀物，于540nm波长处测定光吸收值。求得各组试验数据的平均值，以实验组对对照组计算得细胞生成抑制率。以Sigma Plot绘图软件绘得细胞生长率-药物浓度半对数曲线，并求得药物的半数有效浓度(IC₅₀)。

结果：由于过分活跃的雄激素-雄激素受体系统是促进前列腺细胞和前列腺癌细胞增殖的重要因素，JC-5411阻断雄激素受体的表达则有可能抑制前列腺细胞的增殖，并且由于AR对激素非依赖的前列腺癌细胞同样或甚至更为重要，阻断AR的转录和表达，则有可能同样能抑制激素非依赖的前列腺癌细胞生长。由此我们采用MTT方法，研究JC-5411对前列腺癌细胞的生长抑制作用，并比较激素依赖型(LNCAP AD)和激素非依赖型(LNCAP AI)细胞对JC-5411的敏感性。如图8A所示，JC-5411具有较强的抗前列癌细胞的活性，而且重要的是AD和AI细胞具有相同的敏感性，IC50都为0.6μM。在同等实验条件下，与临床上广泛使用的化疗药物紫杉醇相比，虽然紫杉醇抗前列腺癌作用很强，但激素非依赖的前列腺癌细胞AI显示出较强的耐药性。与激素依赖的前列腺癌细胞AD相比，后者的药物半数有效浓度是前者的60倍(IC50AD细胞为0.01nM，而AI细胞则为0.6nM，图8B)，这一结果与我们以前的观察相符^(27，45)。应指出的是，紫杉醇抗前列腺癌作用虽然较JC-5411强，但紫杉纯在有效药物浓度下即已产生较强的毒副作用，如紫杉醇在血浆药物浓度0.05M时即产生严重的骨髓抑制。而JC-5411源自天然食物，毒性低。临床实践已证明紫杉醇除了毒性的副作用以外，亦不能延长晚期前列腺癌患者的生命。

实施例5，JC-5411对雄激素诱导的良性前列腺增生的抑制

材料及方法：

试剂：JC-5411，同实施例2。实验用其它化学试剂包括环丙孕酮酯醋酸盐，睾丸酮丙酸脂(testosterone propionate)，除特别说明外，均购于美国Sigma化学试剂公司。

动物：成年无病源健康雄性Wistar大鼠，体重为500克左右，购于上海斯莱克实验动物有限公司。每笼二只，供应常规食物和饮用水，昼夜交替灯光，室温维持在25±2℃。

病理模型及药物治疗：将17只雄性Wistar大鼠随机分为3组。第一组5只，为非治疗正常组；第二组7只，为非治疗病理模型组；第三组5只，为JC-5411治疗组。第二，三组动物口服(灌胃)给予醋酸环丙孕酮酯(2％CMC溶液)，剂量为50mg/kg，每周5天，连续3周。然后，这二组动物皮下注射睾丸酮丙酸脂(50mg/ml玉米油溶液)，剂量为100mg/kg，每3日注射一次，共注射5次。第三组(治疗组)除给予上述雄激素外，在第一天给予睾丸酮丙酸脂至睾丸酮丙酸脂停药二周后，这段时间内，口服给予JC-5411，剂量为12μmol/只，隔日给药，每周给药三次。

在JC-5411停药24小时后，将动物处死，称重，并取出前例腺组织，称量前例腺组织重量。从前例腺组织中提取蛋白，以实施例2中所述的蛋白印迹方法测定雄激素受体及其它与细胞生长相关的蛋白含量变化。

结果：就总体体重而言，第一组，即正常对照组(非病理模型组)动物体重平均为416克，第二组，即病理模型组(非JC-5411治疗组)动物平均体重为440克，第三组(JC-5411治疗组)动物平均体重为420克。可见与第一组相比第二组动物体重有明显增加，说明雄激素能促进动物体重增加。而第三组动物体重与第一组基本相同，说明JC-5411的治疗能有效地阻断因雄激素诱导而增加的体重。

图9是上述四组动物间平均前列腺重量的比较。第一组正常对照组平均动物前列腺重量为1.34克(n＝5)，第二组病理模型组为1.74克(n＝7)，第三组JC-5411治疗组为1.35克(n＝5)。T-检验表明，病理模型组与对照组相比，T＝0.05，有显著差异；病理模型组与JC-5411治疗组相比，T＝0.05，也有显著差异；但对照组与治疗组相比，T＝0.92，无差异。病理检验表明无癌变产生。由此可见，雄激素能有效地诱发良性前列腺增生，同时这种雄激素诱导的良性前列腺增生可以有效地为JC-5411所阻断。

蛋白印迹实验表明，病理模型组平均雄激素受体水平与正常对照组相比明显上升。这与我们体外细胞实验相吻合，JC-5411的治疗明显地阻断雄激素诱导的雄激素受体增加(图10)。实验还表明，在雄激素的作用下，与细胞周期相关的细胞因子Cyclin D1和Cyclin E的表达亦明显上升，其结果是促进细胞增殖。雄激素的这一作用亦被JC-5411所阻断(图10)。

讨论：良性前列腺增生和前列腺癌是严重影响并威胁老年男性生活质量和生命的二种重要疾病，并且现有的治疗方法都存在各种各样的问题。于是寻找新的有效的，副作用小的治疗方法，十分重要。本发明我们采用多种分子生物学方法首次证明了JC5411通过抑制基因转录因子SP1的蛋白表达而抑制其转录因子活性，进而抑制雄激素受体的转录和表达，阻断雄激素所诱导的异常前列腺细胞或前列腺癌细胞的增生，达到预防和治疗良性前列腺肿大和各个阶段的前列腺癌，包括晚期的激素非依赖的前列腺癌。

对于良性前列腺肿大的药物治疗在西方国家一是采用5α-还原酶抑制剂如PROSCAR(美国麦克)和α1-肾上能受体拮抗剂。这二种治疗方法虽在一定程度上能缓解疾病症状⁽³⁹⁾，但副作用较大，特别是引起女性化和性功能障碍，常常使患者望而生畏。而中医中药治疗效果不很确定。而本发明所提供的JC5411化合物仅仅抑制因雄激素过量或活性异常而诱发的前列腺细胞增生(图9)，进而无女性化和性功能障碍等副作用。

对于前列腺癌的治疗，由于雄激素受体表达或其活性异常是前列腺癌治疗失败的主要原因，以雄激素受体为靶标的治疗前列腺癌的策略近年来已受到极高的关注，如AR抗体，AR-antisense寡核甘酸，AR-siRNA等^(46-50)，但尚未有正在实用可行的能供临床治疗使用方法。JC5411通过阻断异常的雄激素受体转录和表达，不仅可以预防前列腺癌的发生，而且可预防其由于雄激素受体异常而进一步恶变。再者本发明亦已证实JC5411对激素依赖型和激素非依赖型前列腺癌有等同的疗效(图X)。于是本发明首次在世界范围内提供了一种抑制雄激素受体转录表达而治疗前列腺癌的实用可行的方法。

就SP1抑制剂而言，JC5411直接抑制SP1本身的表达，使SP1总体蛋白水平下降(图5)，这一点亦不同于传统的SP1抑制剂Mithramycin。Mithramycin抑制SP1对其下游基因的抑制是通过干扰SP1蛋白与其DNA相结合⁽⁴³⁾。于是JC5411不具有Mithramycin的严重毒副作用，如心脏毒性，骨髓抑制等。就基因结构而言，雄激素受体和大多数基因不同，其启动子不具有一般转录因子调节的DNA序列，如TATA和CCAAT等，取而代之的是转录因子SP1调节序列，所以SP1的细胞总体蛋白水平对雄激素受体的转录和表达至关重要。于是本发明首次证明JC5411通过抑制SP1表达而特异地抑制雄激素受体。

            关于说明书附图中的中英文对照表

图2： Promoter region：                   启动子区；

      5’-untranslated region：           5‘-非转译区；

      transcription initiation：          转录起始点；

      repeats：                           重复序列；

      luciferase：                        荧光素酶；

      pLARS-1，pAR-Sp1-3-O，pMAR-Sp1-3-O：无相应中文。

图3： Effects；作用

      Relative luciferase activity：      相对荧光素酶活性；

      Mithramycin：                       光辉霉素

      Trichstatin A：                     无相应中文

图4： Sp1 binding complex：               SP1结合复合物

      Probe only：                        探针对照；

      Mithramycin：                       光辉霉素

图5： β-actin：                          β肌动原

图6： Effect：                            作用

      Activity：                          活性

      Unit/mg protein：                   单位/每毫克蛋白

图7： β-actin：                          β肌动原

图8： Paclitaxel：                        紫杉醇；

      Concentration：                     浓度；

      Growth Inhibition：                 生长抑制

图9： Prostate weight：                   前列腺重量；

      Normal：                            正常(对照)；

      Treatment：                         处理(治疗)

图10：Cyproterone testosterone：          丙孕酮酯醋酸盐，睾丸酮丙酸脂(？)

      Cyclin：                            无相应中文

      β-actin：                          β肌动原

Claims (10)

1、一种天然及人工合成的异硫氰酸酯类化合物JC-5411在制备转录因子SP1的抑制剂中的应用，其可抑制SP1在细胞中的含量，该异硫氰酸酯类化合物的化学结构特征为：

2、如权利要求1所述的化合物JC-4511在制备转录因子SP1的抑制剂中的应用，其特征在于通过抑制转录因子SP1进而使雄激素受体转录和表达受到抑制，进而抑制了雄激素介导的良性前列腺细胞增生及前列腺癌细胞生长。

3、权利要求1中所述化合物JC-5411在制备用于治疗和预防良性前列腺增生和前列腺癌的药物中的应用。

4、如权利要求3所述的化合物的应用，其中所述前列腺癌包括激素依赖型和激素非依赖型前列腺癌。

5、如权利要求3中所述化合物JC-5411在制备用于治疗和预防良性前列腺增生和前列腺癌的药物中的应用，其中所述化合物可采用制药工业中一切适用的制备方法进行生产：由人工合成，或由天然材料中提取而获得。

6、如权利要求3中所述化合物的应用，其中所述化合物可制成制药工业中一切适用剂型。

7、如权利要求6所述化合物的应用，其中所述的一切适用剂型包括：片剂，胶囊，小针注射剂，大针注射剂，静脉注射剂，肌肉注射剂，皮下注射剂，栓剂，软膏剂。

8、如权利要求3中所述化合物的应用，其中所述化合物可采用各种途径给药：口服给药，静脉注射，肌肉注射，皮下注射，腔内给药，舌下给药，肛门给药，外敷。

9、如权利要求3中所述化合物的应用，其中所述化合物可以单药治疗，也可以联合用药。

10、如权利要求9所述的化合物的应用，其中所述联合用药包括：与放射治疗联合使用，与中草药联合使用，与外科手术联合使用，与生物条件剂联合使用，与基因治疗联合使用。

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