CN1758914A - 用吲哚啉酮化合物治疗过度骨质溶解 - Google Patents
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Abstract
如本文所述的式I和式II的化合物通过抑制M－CSF介导的破骨细胞形成而用于治疗过度骨质溶解。该化合物还用于抑制CSF1R的磷酸化和治疗表达CSF1R的癌。
Description
发明背景
骨是一种动态组织，经历恒定的重建过程以保持骨骼强度和健康。这种重建过程需要两个阶段：骨质溶解阶段和骨生成阶段。在骨质溶解中，破骨细胞侵袭骨并通过释放溶解胶原和矿物质的酸和酶的混合物来腐蚀它。此过程在骨上形成小腔。在骨生成中，破骨细胞将新的胶原和矿物质沉积到腔内。当骨质溶解和骨生成处于平衡时，骨质量不发生净变化。每年，骨重建过程替换大约20％的健康个体全部骨骼中的骨。
在某些病症中，骨质溶解比骨生成更活跃，导致骨的净损失。这些过度的骨质溶解可能发生在局部骨骼区域或者更广泛地遍及骨骼。尽管如此，骨损失具有严重的健康后果，包括骨折、高钙血、神经压迫综合征、变形和疼痛。
局部过度骨质溶解的一个特别严重的原因是癌转移到骨癌细胞通常分泌因子，例如巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)，从而促进破骨细胞形成和活性。当这些癌本身在骨中形成时，它们促进广泛的溶骨损害。这些与肿瘤相关的骨质溶解与许多种类的恶性肿瘤，包括血液恶性肿瘤(例如骨髓瘤和淋巴瘤)和实体瘤(例如乳房、前列腺、肺、肾和甲状腺瘤)一致。实际上，70％的死于乳腺癌的患者患有骨转移瘤，且骨是乳腺癌最常见的第一远端复发部位。患有骨转移瘤的癌症患者可能存活数年，这突出了对降低骨转移瘤影响的治疗的需要。
当过度骨质溶解在整个骨骼的广泛区域存在时，它发生常规描述的骨质疏松症。骨质疏松的常见类型包括与年龄有关的骨质疏松、绝经后骨质疏松、糖皮质激素诱导的骨质疏松、与糖尿病有关的骨质疏松和废止骨质疏松。骨质疏松给全世界带来难题。仅在美国有几百万的个体受此疾病和其伴随的疼痛、变形和衰弱性骨折的折磨。
破骨细胞，介导过度骨质溶解，其在多种细胞因子和生长因子调控下起作用(1，2)。它们是来源于单核细胞前体的多核细胞(3，4)。单核细胞前体分化成破骨细胞是一个复杂的过程，同时需要M-CSF和RANKL(NF-wB配体的受体激活剂)(3，4)。这些因子和破骨细胞分化的所有其它细胞与体液需要存在于骨骼转移瘤的微环境中(17)。
巨噬细胞，与破骨细胞有关，是宿主细胞对癌症反应的一个主要组分，可以导致肿瘤生长。具体而言，巨噬细胞和肿瘤细胞分泌M-CSF，一种用于由单核细胞前体形成破骨细胞的关键细胞因子(18-22)。巨噬细胞和单核细胞与某些肿瘤细胞还表达M-CSF受体(23-28)。
抑制破骨细胞形成和功能是一种治疗过度骨质溶解的理想方法。但是，目前可获得的确有此作用的物质的应用有限，并经常导致显著的副作用。
降钙素，一种由甲状腺对血清钙升高作出反应而分泌的肽激素，是一种已表征的破骨细胞形成和功能抑制剂(5)。然而，与降钙素长期接触，由于下调破骨细胞表面上的降钙素受体MRNA和降钙素受体而导致其对破骨细胞的抑制效果损失(6)。此外，由于降钙素是一种蛋白质，它不能口服，因为它在起作用前被消化。注射降钙素虽然它不影响体内其它器官或系统，但它可能导致变应性反应和不适的副作用，包括脸和手发红、尿频、恶心和皮疹。
与降钙素相似，TGF-β和echistatin，一种蛇毒液，在体外阻断骨质溶解(7)。但是，TGF-β和echistatin缺乏特异性，且echistatin阻断血小板粘附，从而可能导致危及生命的出血。
与破骨细胞上表达的抗原结合的单克隆抗体也可以阻断骨质溶解(8-10)。但是，这些抗体可能导致患者的免疫反应。
二膦酸盐也抑制破骨细胞活性(11)，并存在关于它们的应用的大量数据。尽管二膦酸盐是有益的，但它们从胃肠道吸收不良，并经常导致胃肠道不适。而且，二膦酸盐在骨中保持数年，如果它摄入太多并持续太长时间则它可能引起阻断正常骨修复机制的可能。
免疫细胞产物，例如干扰素-γ(IFN-γ)，干扰素-α(IFN-α)、制瘤素M和紫杉醇、苏拉明和一氧化氮也抑制破骨细胞活性(12-14)。但是，所有这些试剂具有限制它们应用的明显的副作用。干扰素可以诱导类似流感的疾病，紫杉醇和苏拉明通常具有严重的胃肠道毒性和/或生血副作用，而一氧化氮可以诱导血管舒张和低血压。
雌二醇是另一种已知的骨质溶解抑制剂(15)，它诱导破骨细胞的凋亡或编程性细胞死亡。类似地，视黄酸抑制骨质溶解(16)。不幸的是，这些化合物也导致使它们可接受程度降低的系统作用。例如，长期雌激素治疗造成乳腺癌、子宫癌和卵巢癌的风险增大。此外，雌二醇治疗可能导致阴道出血、乳房触痛、情绪障碍和胆囊疾病。选择性雌激素受体调节剂(SERMS)在某些组织中模拟雌激素而在其它组织中模拟抗雌激素。它们具有导致较少不期望的副作用的优点，但仍在某些患者中引起热潮红和深度血管血栓形成
因此，一直需要对过度溶骨疾病进行有效和实际的治疗。基于这种持续的需要，本发明者研制出一种通过施用有效量的式I或II的化合物来治疗过度溶骨疾病的方法，如以下所述。
发明概述
本发明的一个实施方案涉及一种通过给需要治疗的患者施用有效量的式I的化合物或其盐来治疗过度骨质溶解的方法：
其中
R独立地为H、OH、烷基、芳基、环烷基、杂芳基、烷氧基、杂环和氨基；
各个R1独立地选自烷基、卤素、芳基、烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基、环烷基、杂芳基、杂环、羟基、-C(O)-R8、-NR9R10、-NR9C(O)-R12和-C(O)NR9R10；
各个R2独立地选自烷基、芳基、杂芳基、-C(O)-R8和SO2R″，其中R″为烷基、芳基、杂芳基、NR9N10或烷氧基；
各个R5独立地选自氢、烷基、芳基、卤代烷基、环烷基、杂芳基、杂环、羟基、-C(O)-R8和(CHR)rR11；
X为O或S；
p为0-3；
q为0-2；
r为0-3；
R8选自-OH、烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、环烷基和杂环；
R9和R10独立地选自H、烷基、芳基、氨基烷基、杂芳基、环烷基和杂环，或者R9和R10可以与氮一起形成环，其中环原子选自C、N、O和S；
R11选自-OH、氨基、一取代的氨基、二取代的氨基、烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、环烷基和杂环；
R12选自烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、环烷基和杂环；
Z为OH、O-烷基或-NR3R4，其中R3和R4独立地选自氢、烷基、芳基、杂芳基、环烷基和杂环，或者R3和R4可以与N一起形成环，其中环原子选自CH2、N、O和S或
其中Y独立地为CH2、O、N或S，
Q为C或N；
n独立地为0-4；和
m为0-3。
在一个优选的实施方案中，给患者施用的化合物是式II的化合物：
其中的变量如前面定义。
在本发明的另一个实施方案中，在给需要的患者施用的式I或II中，R1为卤素(例如F和Cl)，而Z为-NR3R4，其中R3和R4独立地选自烷基和氢。
在另一个实施方案中，式I或II的Z为-NR3R4，其中R3和R4形成吗啉环。
在另一个实施方案中，式I或II的Z为：
其中各个Y为CH2，各个n为2，m为0，而R3和R4形成吗啉环。
在任何前述的实施方案中，优选R2为甲基，而q为2，其中甲基结合在式I或II的3位和5位。
在本发明的一个特定的实施方案中，给药的化合物选自
其中X为F、Cl、I或Br。在一个优选的实施方案中，X为F。
在本发明的另一个特定的实施方案中，式I的化合物选自：
化合物1 化合物2
化合物3 化合物8
化合物6 化合物7
化合物4 化合物9
和
化合物5
在本发明的某些实施方案中，患有过度骨质溶解的患者有骨质疏松症、已转移至骨的癌症、分泌M-CSF的癌症，和/或是绝经后的。
本发明的另一个实施方案涉及一种通过给患者施用抑制量的上述的式I或式II的化合物来治疗表达CSF1R，M-CSF受体的癌症。在一个实施方案中，在施用式I或式II的化合物之前确定该癌症表达CSF1R。
本发明的另一个实施方案涉及一种通过给患者施用抑制量的如上述的式I或式II的化合物来抑制CSF1R的磷酸化的方法。
附图的简要说明
图1显示Western印迹法，表明本发明的化合物1抑制M-CSF受体的磷酸化。
图2a显示的图形表明本发明的化合物1在体外以剂量依赖的方式抑制破骨细胞形成。
图2b显示的图形表明本发明的化合物1抑制早期破骨细胞形成，而不是晚期破骨细胞形成。
图3通过生物发光描述本发明的化合物1在体内抑制乳腺癌转移(breast cancer metastases)的生长。
图4是表示在用化合物1处理时，通过吡啶诺林水平测定的患有转移至骨的乳腺癌的小鼠表现出较少的骨质溶解的图。
发明详述
本发明者已完成令人惊奇的发现，即具有上述的式I和式II的结构的化合物抑制M-CSF受体，CSF1R的磷酸化。进一步地，本发明者已发现化合物在体内抑制破骨细胞形成，并显著减少与肿瘤转移至骨有关的骨质溶解。
因此，式I和式II的化合物用于治疗患有过度骨质溶解的患者。在此范围内，“骨质溶解”指由分泌酸和/或酶的细胞导致的骨分解。破骨细胞是这种细胞的主要实例，但本发明也包括抑制由其它细胞类型，包括肿瘤细胞和破骨细胞前体介导的骨质溶解。“过度的骨质溶解”指溶骨和骨生成活性之间的不平衡，它导致局部或系统性骨的净损失。
本发明的一个实施方案涉及治疗过度骨质溶解的方法，所述方法包括需要治疗的患者施用有效量的式I的化合物或其盐：
其中
R独立地为H、OH、烷基、芳基、环烷基、杂芳基、烷氧基、杂环和氨基；
各个R1独立地选自烷基、卤素、芳基、烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基、环烷基、杂芳基、杂环、羟基、-C(O)-R8、-NR9R10、-NR9C(O)-R12和-C(O)NR9R10；
各个R2独立地选自烷基、芳基、杂芳基、-C(O)-R8和SO2R″，其中R″为烷基、芳基、杂芳基、NR9N10或烷氧基；
各个R5独立地选自氢、烷基、芳基、卤代烷基、环烷基、杂芳基、杂环、羟基、-C(O)-R8和(CHR)rR11；
X为O或S；
p为0-3；
q为0-2；
r为0-3；
R8选自-OH、烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、环烷基和杂环；
R9和R10独立地选自H、烷基、芳基、氨基烷基、杂芳基、环烷基和杂环，或者R9和R10可以与氮一起形成环，其中环原子选自C、N、O和S；
R11选自-OH、氨基、一取代的氨基、二取代的氨基、烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、环烷基和杂环；
R12选自烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、环烷基和杂环；
Z为OH、O-烷基或-NR3R4，其中R3和R4独立地选自氢、烷基、芳基、杂芳基、环烷基和杂环，或者R3和R4可以与N一起形成环，其中环原子选自CH2、N、O和S或
其中Y独立地为CH2、O、N或S，
Q为C或N；
n独立地为0-4；和
m为0-3。
在一个优选的实施方案中，给患者施用化合物为式II的化合物：
其中的变量如前面定义。
在本发明的另一个实施方案中，在给需要的患者施用的式I或II中，R1为卤素(例如F和Cl)，而Z为-NR3R4，其中R3和R4独立地为H或烷基。
在另一个实施方案中，式I或II的Z为-NR3R4，其中R3和R4形成吗啉环。
在另一个实施方案中，式I或II的Z为：
其中各个Y为CH2，各个n为2，m为0，而R3和R4形成吗啉环。
在本发明的一个特定的实施方案中，给药的化合物选自
其中X为F、Cl、I或Br。在一个优选的实施方案中，X为F。
在本发明的另一个实施方案中，所述治疗方法包括给患有过度骨质溶解的患者施用有效量的选自以下的化合物：
5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸(2-二乙基氨基-乙基)-酰胺(化合物1)；
5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸(2-吡咯烷-1-基-乙基)-酰胺(化合物2)；
5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸(2-吗啉-4-基-乙基)-酰胺(化合物3)；
(S)-5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸(2-羟基-3-吗啉-4-基-丙基)-酰胺(化合物4)；
(R)-5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸(2-羟基-3-吗啉-4-基-丙基)-酰胺(化合物5)；
5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸(2-羟基-3-吗啉-4-基-丙基)-酰胺(化合物6)；
5-(5-氯-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸(2-羟基-3-吗啉-4-基-丙基)-酰胺(化合物7)；
5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸(2-乙基氨基-乙基)-酰胺(化合物8)；和
和3-[3，5-二甲基-4-(4-吗啉-4-基-哌啶-1-羰基)-1H-吡咯-2-亚甲基]-5-氟-1，3-二氢-吲哚-2-酮(化合物9)。
为清楚地描述用于本发明方法的式I和II的化合物，提供以下的定义。
“烷基”指饱和脂肪族烃基，包括1-20个碳原子的直链和支链基团(不管本文在何时指定数值范围，例如“1-20”，它意指该基团，在这种情况下为烷基，可以包含1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子等，并至多包含20个碳原子)。包含1-4个碳原子的烷基称为低级烷基。如果该低级烷基缺少取代基，则它们称为未取代的低级烷基。
更优选地，烷基是具有1-10个碳原子的中等大小的烷基，例如甲基、乙基、丙基、2-丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基等。最优选，低级烷基具有1-4个碳原子，例如甲基、乙基、丙基、2-丙基、正丁基、异丁基或叔丁基等。烷基可以是取代的或未被取代的。当被取代时，取代基优选为一个或多个，更优选1-3个，进一步更优选1或2个独立地选自以下的取代基：卤素；羟基；未取代的低级烷氧基；任选被一个或多个，优选1、2或3个彼此独立地为卤素、羟基、未取代的低级烷基或未取代的低级烷氧基的基团取代的芳基；任选被二个或多个基团，优选1、2或3个彼此独立地为卤素、羟基、未取代的低级烷基或未取代的低级烷氧基的基团取代的芳氧基；环上具有1-3个氮原子的6元杂芳基，该环上的碳任选被一个或多个基团，优选1、2或3个彼此独立地为卤素、羟基、未取代的低级烷基或未取代的低级烷氧基的基团取代；具有1-3个选自氮、氧和硫的杂原子的5元杂芳基，该基团中的碳和氮原子任选被一个或多个基团，优选1、2或3个独立地选自卤素、羟基、未取代的低级烷基或未取代的低级烷氧基的基团取代；具有1-3个选自氮、氧和硫的杂原子的5或6元杂环基，该基团中的碳和氮(如果存在的话)原子任选被一个或多个基团，优选1、2或3个独立地选自卤素、羟基、未取代的低级烷基或未取代的低级烷氧基的基团取代；巯基；(未取代的低级烷基)硫代；任选被一个或多个基团，优选1、2或3个彼此独立地选自卤素、羟基、未取代的低级烷基或烷氧基的基团取代的芳硫基；氰基；酰基、硫代酰基；O-氨基甲酰基；N-氨基甲酰基；O-硫代氨基甲酰基；N-硫代氨基甲酰基；C-酰氨基；N-酰氨基；硝基；N-亚磺酰氨基；S-亚磺酰氨基；RS(O)-；RS(O)2-；-C(O)OR；RC(O)O-；和-NR13R14，其中R13和R14独立地选自氢、未取代的低级烷基、三卤代甲基；环烷基；任选被一个或多个基团，优选1、2或3个彼此独立地为卤素、羟基、未取代的低级烷基或未取代的低级烷氧基的基团取代的杂环和芳基。
优选烷基被1或2个独立地选自以下的取代基取代：羟基；具有1-3个选自氮、氧和硫的杂原子的5-或6-元杂环基，该基团中的碳和氮(如果存在的话)原子任选被一个或多个基团，优选1、2或3个彼此独立地选自卤素、羟基，未取代的低级烷基或未取代的低级烷氧基的基团取代；具有1-3个选自氮、氧和硫的杂原子取代的5元杂芳基，该基团中的碳和氮原子任选被一个或多个基团，优选1、2或3个彼此独立地选自卤素、羟基，未取代的低级烷基或未取代的低级烷氧基的基团取代；环上具有1-3个氮原子的6元杂芳基，环上的碳任选被一个或多个基团，优选1、2或3个彼此独立地选自卤素、羟基、未取代的低级烷基或未取代的低级烷氧基的基团取代；或者-NR13R14，其中R13和R14独立地选自氢和烷基。甚至更优选该烷基被1或2个彼此独立地为以下的取代基取代：羟基、二甲基氨基、乙基氨基、二乙基氨基、二丙基氨基、吡咯烷基、哌啶子基、吗啉代基、哌嗪子基、4-低级烷基哌嗪子基、苯基、咪唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、噁唑基、三嗪基等。
“环烷基”指3-8元全碳单环；全碳5元/6元或6元/6元稠合双环或多环稠环(“稠合”环系统意指系统中的各环彼此共享相邻的碳原子对)基团，其中一个或多个环可以包含一个或多个双键，但没有环具有完全共轭的π电子系统。
环烷基的非限制性实例为环丙烷、环丁烷、环戊烷、环戊烯、环己烷、环己二烯、金刚烷、环庚烷、环庚三烯等。环烷基可以被取代或未被取代。当被取代时，取代基优选为一个或多个，更优选1个或2个独立地选自以下的取代基：未取代的低级烷基；三卤代烷基；卤素；羟基；未取代的低级烷氧基；任选被一个或多个，优选1或2个彼此独立地为卤素、羟基、未取代的低级烷基或未取代的低级烷氧基的基团取代的芳基；任选被一个或多个，优选1或2个彼此独立地为卤素、羟基、未取代的低级烷基或未取代的低级烷氧基的基团取代的芳氧基；在环上具有1-3个氮原子的6元杂芳基，该环上的碳任选被一个或多个，优选1或2个彼此独立地为卤素、羟基、未取代的低级烷基或未取代的低级烷氧基的基团取代；具有1-3个选自氮、氧和硫的杂原子的5元杂芳基，该基团的碳和氮原子任选被一个或多个，优选1或2个彼此独立地为卤素、羟基、未取代的低级烷基或未取代的低级烷氧基的基团取代；具有1-3个选自氮、氧和硫的杂原子的5或6元杂环基团，该基团上的碳和氮(如果存在的话)原子任选被一个或多个，优选1或2个彼此独立地为卤素、羟基、未取代的低级烷基或未取代的低级烷氧基的基团取代；巯基；(未取代的低级烷基)硫代；任选被一个或多个，优选1或2个彼此独立地为卤素、羟基、未取代的低级烷基或未取代的低级烷氧基的基团取代的芳硫基；氰基；酰基；硫代酰基；O-氨基甲酰基；N-氨基甲酰基；O-硫代氨基甲酰基；N-硫代氨基甲酰基；C-酰氨基；N-酰氨基；硝基；N-亚磺酰氨基；S-亚磺酰氨基；RS(O)-；RS(O)2-；-C(O)OR；RC(O)O-和-NR13R14，如以上定义。
“链烯基”指低级烷基，如本文定义，它由至少两个碳原子和至少一个碳-碳双键组成。代表性实例包括但不限于乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基，1-、2-或3-丁烯基等。
“炔基”指低级烷基，如本文定义，它由至少两个碳原子和至少一个碳-碳叁键组成。代表性实例包括但不限于乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-、2-或3-丁炔基等。
“芳基”指具有完全共轭的π-电子系统的1-12个碳原子的全碳单环或稠环多环(即共享相邻碳原子对的环)基团。芳基的非限制性实例为苯基、萘基和蒽基。芳基可以被取代或未被取代。当被取代时，取代基优选为一个或多个，更优选1、2或3个，进一步更优选1或2个独立地选自以下的基团：未取代的低级烷基、三卤代烷基、卤素、羟基、未取代的低级烷氧基、巯基、(未取代的低级烷基)硫代、氰基、酰基、硫代酰基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基，C-酰氨基、N-酰氨基、硝基、N-亚磺酰氨基、S-亚磺酰氨基、RS(O)-、RS(O)2-、-C(O)OR、RC(O)O-和-NR13R14，其中R13和R14如以上定义。
优选芳基任选被1或2个独立地选自以下的取代基取代：卤素、未取代的低级烷基、三卤代烷基、羟基、巯基、氰基、N-酰氨基、一或二烷基氨基、羧基或N-亚磺酰氨基。
“杂芳基”指包含1、2或3个选自N、O或S的环杂原子，剩余环原子为C，并具有完全共轭的π-电子系统的单环或稠环(即共享相邻原子对的环)基团。未取代的杂芳基的非限制性实例为吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、噁唑、噻唑、吡唑、吡啶、嘧啶、喹啉、异喹啉、嘌呤和咔唑。杂芳基可以被取代或未被取代。当被取代时，取代基优选为一个或多个，更优选1、2或3个，进一步更优选1或2个，独立地选自未取代的低级烷基、三卤代烷基、卤素、羟基、未取代的低级烷氧基、巯基、(未取代的低级烷基)硫代、氰基、酰基、硫代酰基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、硝基、N-亚磺酰氨基、S-亚磺酰氨基、RS(O)-、RS(O)2-、-C(O)OR、RC(O)O-和-NR13R14，其中R13和R14如以上定义。优选杂芳基任选被1或2个独立地选自以下的取代基取代：卤素、未取代的低级烷基、三卤代烷基、羟基、巯基、氰基、N-酰氨基、一或二烷基氨基、羧基或N-亚磺酰氨基。
“杂环”指在环上具有5-9个环原子的一环或稠环基团，其中一个或二个环原子选自N、O或S(O)n(其中n为0-2的整数)，剩余环原子为C。该环还可以具有一个或多个双键。但是，该环没有完全共轭的π-电子系统。未取代的杂环基的非限制性实例为吡咯烷基、哌啶子基、哌嗪基、吗啉代基、硫代吗啉代基、高哌嗪基等。杂环可以被取代或未被取代。当被取代时，取代基优选为一个或多个，更优选1、2或3个，进一步更优选1或2个，独立地选自未取代的低级烷基、三卤代烷基、卤素、羟基、未取代的低级烷氧基、巯基、(未取代的低级烷基)硫代、氰基、酰基、硫代酰基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、硝基、N-亚磺酰氨基、S-亚磺酰氨基、RS(O)-、RS(O)2-、-C(O)OR、RC(O)O-和-NR13R14，其中R13和R14如以上定义。优选杂环基团任选被1或2个独立地选自以下的取代基取代：卤素、未取代的低级烷基、三卤代烷基、羟基、巯基、氰基、N-酰氨基、一或二烷基氨基、羧基或N-亚磺酰氨基。
优选杂环基团任选被1或2个独立地选自以下的取代基取代：卤素、未取代的低级烷基、三卤代烷基、羟基、巯基、氰基、N-酰氨基、一或二烷基氨基、羧基或N-亚磺酰氨基。
“羟基”指-OH基团。
“烷氧基”指-O-(未取代的烷基)和-O-(未取代的环烷基)基团。代表性实例包括但不限于、例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、环丙氧基、环丁氧基、环戊氧基、环己氧基等。
“芳氧基”指-O-芳基和-O-杂芳基，如本文定义。
代表性实例包括但不限于苯氧基、吡啶氧基、呋喃氧基、噻吩氧基、嘧啶氧基、吡嗪氧基等，和它们的衍生物。
“巯基”指-SH基团。
“烷硫基”指-S-(未取代的烷基)和-S-(未取代的环烷基)基团。代表性实例包括但不限于，例如甲硫基、乙硫基、丙硫基、丁硫基、环丙硫基、环丁硫基、环戊硫基、环己硫基等。
“芳硫基”指-S-芳基和-S-杂芳基，如本文定义。代表性实例包括但不限于苯硫基、吡啶硫基、呋喃硫基、噻吩硫基、嘧啶硫基等、和它们的衍生的。
“酰基”指-C(O)-R″基团，其中R″选自氢；未取代的低级烷基；三卤代甲基；未取代的环烷基；任选被一个或多个，优选1、2或3个选自未取代的低级烷基、三卤代甲基、未取代的低级烷氧基、卤素和-NR13R14基团的取代基取代的芳基；任选被一个或多个，优选1、2或3个选自未取代的低级烷基、三卤代烷基、未取代的低级烷氧基、卤素和-NR13R14基团的取代基取代的杂芳基(通过环碳结合)；以及任选被一个或多个，优选1、2或3个选自未取代的低级烷基、三卤代烷基、未取代的低级烷氧基、卤素和-NR13R14基团的取代基取代的杂环(通过环碳结合)。代表性酰基包括但不限于乙酰基、三氟乙酰基、苯甲酰基等。
“醛”指R″为氢的酰基。
“硫代酰基”指-C(S)-R″基团，其中R″如本文定义。
“酯”指-C(O)O-R″基团，其中R″如本文定义，除了R″不能为氢。
“乙酰基”指-C(O)CH3基团。
“卤素”基团指氟、氯、溴或碘，优选氟或氯。
“三卤代甲基”指-CX3基团，其中X为如本文定义的卤素基团。
“亚甲二氧基”基团指-OCH2O-基团，其中二个氧原子结合在相邻的碳原子上。
“亚乙二氧基”基团指-OCH2CH2O-，其中二个氧原子结合在相邻的碳原子上。
“S-亚磺酰氨基”指-S(O)2NR13R14基团，其中R13和R14如本文定义。
“N-亚磺酰氨基”指-NR13S(O)2R基团，其中R13和R如本文定义。
“O-氨基甲酰基”基团指-OC(O)NR13R14基团，其中R13和R14如本文定义。
“N-氨基甲酰基”指ROC(O)NR14-基团，其中R和R14如本文定义。
“O-硫代氨基甲酰基”指-OC(S)NR13R14基团，其中R13和R14如本文定义。
“N-硫代氨基甲酰基”指ROC(S)NR14-基团，其中R和R14如本文定义。
“氨基”指-NR3R14基团，其中R13和R14均为氢。
“C-酰氨基”指-C(O)NR13R14基团，其中R13和R14如本文定义。
“N-酰氨基”指RC(O)NR14-基团，其中R和R14如本文定义。
“硝基”指-NO2基团。
“卤代烷基”意指被一个或多个相同或不同的卤原子取代的未取代的烷基，优选如本文定义的未取代的低级烷基，例如-CH2Cl、-CF3、-CH2CF3、-CH2CCl3等。
“芳烷基”意指被以上定义的芳基取代的未取代的烷基，优选如以上定义的未取代的低级烷基，例如-CH2苯基、-(CH2)2苯基、-(CH2)3苯基、CH3CH(CH3)CH2苯基等以及它们的衍生物。
“杂芳烷基”基团意指被杂芳基取代的未取代的烷基，优选如以上定义的未取代的低级烷基，例如-CH2吡啶基、-(CH2)2嘧啶基、-(CH2)3咪唑基等，以及它们的衍生物。
“一烷基氨基”意指基团-NHR′，其中R′为如以上定义的未取代的烷基或未取代的环烷基，例如甲基氨基、(1-甲基乙基)氨基、环己基氨基等。
“二烷基氨基”意指基团-NR′R′，其中各个R′独立地为如以上定义的未取代的烷基或未取代的环烷基基团，例如二甲基氨基、二乙基氨基、(1-甲基乙基)-乙基氨基、环己基甲基氨基、环戊基甲基氨基等。
“氰基烷基”意指未取代的烷基，优选如以上定义的未取代的低级烷基，所述基团被1或2个氰基取代。
“任选的”或“任选地”意指随后所述的事件或状况可能但不需要存在，且该表述包括该事件或状况存在的情况和不存在的情况。例如，“任选被烷基取代的杂环基”意指烷基可能但不需要存在，且该表述包括杂环基被烷基取代和杂环基不被烷基取代的情况。
“药物组合物”指一种或多种本文所述的化合物或其生理学/药学接受的盐或前体和其它化学组分，例如生理学/药学上可接受载体和赋形剂的混合物。药物组合物的目的是方便给生物体施用化合物。
式I或式II的化合物的前药在本发明的范围之内。此外，式I或式II的化合物本身可以用作前药。
“前药”指在体内转化成母体药物的试剂。前药通常是有用的，因为在某些情况下它们可能比母体药物更容易给药。例如，它们通过口服是可生物利用的，而母体药物则不是。相对于母体药物而言前药还可以改善药物组合物的溶解度。前药的非限制性实例是作为酯(“前药”)给药的本发明的化合物，以促进传递通过细胞膜，其中水溶性对移动性有害，但一旦处在水溶性是有益的细胞中则代谢水解成羧酸，活性实体。
前药的另一个实例可以是短多肽，例如但不限于2-10个氨基酸多肽，通过末端氨基结合到本发明化合物的羧基上，其中该多肽在体内水解或代谢以释放活性分子。
此外，考虑式I或式II的化合物在生物体如人体内可以通过酶代谢生成能调节蛋白激酶活性的代谢产物。这些代谢产物在本发明的范围之内。
本文所用的“生理学/药学上可接受载体”指不对生物体造成显著刺激并且不取消给药化合物的生物活性和性能的载体或稀释剂。
“药物学可接受赋形剂”指加到药物组合物以进一步促进化合物给药的惰性物质。赋形剂的非限制性实例包括碳酸钙、磷酸钙、多种糖和淀粉类型、纤维素衍生物、明胶、植物油或聚乙二醇。
本文所用的术语“药学上可接受盐”指保持母体化合物的生物有效性和性能的盐。这些盐包括：
(i)通过母体化合物的游离碱与以下酸反应得到的酸加成盐：无机酸如盐酸、氢溴酸、硝酸、磷酸、硫酸和高氯酸等、或者有机酸如乙酸、草酸、(D)或(L)苹果酸、马来酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸等，优选盐酸或(L)-苹果酸，例如5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸(2-二乙基氨基乙基)酰胺的L-苹果酸盐；或者
(ii)当母体化合物中存在的酸性质子被金属离子，例如碱金属离子、碱土离子或铝离子取代时形成的盐；或者与有机碱如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨丁三醇、N-甲基葡糖胺等形成的配位体。
“方法”指用于实现既定任务的方式、手段、技术和过程，包括但不限于化学、药学、生物学、生物化学和药学技术的从业者已知的或者容易由已知的方式、手段、技术和过程形成的方式、手段、技术和过程。
“体内”指在活生物体，例如但不限于小鼠、大鼠或兔中完成的过程。
“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”指缓解、改善、取消或减轻病症和/或它的任何伴随症状的方法。
“患者”指包含至少一个细胞的任何活的实体。活生物体例如可以简单地为单一真核细胞或者复杂地为哺乳动物，包括人类。
“治疗有效量”指一定程度上防止、缓解、改善或减轻治疗病症的迹象或症状的给药化合物的数量。
“CSF1R”指巨噬细胞集落刺激因子受体，包括可以称为CSF-1受体、M-CSF受体和/或c-fins基因产物。还包括巨噬细胞集落刺激因子受体的任何组分部分或组分。
可以根据本发明治疗的溶骨症包括已知为骨质疏松的系统症状。骨质疏松可以归因于(1)妇女的绝经，(2)男人或妇女的衰老，(3)导致不能达到峰值骨质量的儿童和青春期次最佳骨生长，和/或(4)继其它症状、饮食疾病、药物和/或药物治疗之后发生的骨损失。可以治疗的另一种系统症状是佩吉特氏病，它包括过度溶骨组分。
根据本发明可以治疗的其它溶骨病是更为局部化的。一个特定的实例是转移瘤诱导的骨质溶解。在此症状中，骨癌或骨转移瘤诱导导致疾病、骨虚弱和骨折的局部骨质溶解。这些局部骨质溶解还允许通过在骨内制造更大的空间并从骨基质中释放生长因子而更大地生长。
目前已知导致肿瘤诱导的骨质溶解的癌症包括血液恶性肿瘤(例如骨髓瘤和淋巴瘤)和实体瘤(例如乳房、前列腺、肺、肾和甲状腺瘤)，本发明考虑治疗所有这些病症。
如上述，本发明者已发现式I和式II的化合物抑制M-CSF受体的磷酸化。因此，本发明包括通过给患者施用式I或式II的化合物来抑制M-CSF受体磷酸化的方法。
此外，本发明包括治疗表达CSF1R的癌症的方法。这些癌症的实例包括但不限于乳腺癌和女性生殖道癌症如卵巢癌和子宫内膜癌。其它癌症包括骨髓增生异常综合征(MDS)、急性骨髓白血病(AML)和急性前髓细胞白血病(APML)。因此，式I或式II的化合物可以施用于患有M-CSF受体阳性癌症的患者。
在给癌症患者施用式I或式II的化合物之前，可以确定癌症是否表达CSF1R。这种试验可以直接检测CSF1R蛋白(例如免疫试验，例如ELISA、RIPA、IHC染色)，或者可以间接地完成(例如通过杂交方法如ISH来检测基因转录)。
这些方法在本领域中是已知的，并已由Kacinski等人(23，26-27)，Tang等人(34)和Toy等人(28)成功地用于CSF1R。癌症表达CSF1R的事实表明式I或式II的化合物的治疗是有用的。
给药和药物组合物
要求专利保护的方法涉及给人患者施用式I或式II的化合物或其药学上可接受盐。作为可替代的选择，式I或式II的化合物可以在药物组合物中给药，其中将前面的物质与适宜的载体或赋形剂混合。用于药物制备和给药的技术可见于″Remington′s PharmacologicalSciences，″Mack Publishing Co.，Easton，PA.，最新版。
本文所用的“给药”或“施用”指将式I或式II的化合物或其药学上可接受盐或者包含本发明的式I或式II的化合物或其药学上可接受盐递送至生物体以治疗过度骨质溶解或癌症。
适宜的给药途径可以包括但不限于口、直肠、透粘膜或肠给药或肌内、皮下、髓内、鞘内、直接心室内、静脉内、玻璃体内、腹膜内、鼻内或眼内注射。优选的给药途径是口服和肠胃外给药。
而且，可以在靶向药物递送系统中，例如在用肿瘤特定抗体包被的脂质体中施用。脂质体将靶向作用于肿瘤或破骨细胞祖代并被其选择性吸收。
本发明的药物组合物可以由本技术中已知的方法，例如常规的混合、溶解、粒化、制糖衣丸、磨细、乳化、装入胶囊、封装或冻干方法来制备。
本发明所用的药物组合物可以常规的方式，使用一种或多种生理学可接受载体，包括促进将活性化合物加工成可药用的制剂的赋形剂和助剂来制备。适宜的制剂取决于选择的给药途径。
关于注射，可以将本发明的化合物制成水溶液，优选在生理学相容缓冲液如Hanks溶液、Ringer溶液或生理盐水缓冲液中制备。关于透粘膜给药，在制剂中使用适于渗透障碍的渗透剂。这些渗透剂在本技术中是公知的。
关于口服，可以通过将活性化合物与本技术中已知的药学上可接受载体组合。这些载体使本发明的化合物能够制成片剂、丸剂、锭剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆、悬浮液等，供患者口摄入。口用肠胃外制剂可以用固体赋形剂，如果需要的话在加入其它适宜的助剂之后任选研磨所得的混合物加工颗粒混合物来制备，以得到片剂或糖衣丸核心。具体而言，有用赋形剂为填充剂，例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨醇，纤维素制剂如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉和马铃薯淀粉，以及其它物质如明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要的话，可以加入崩解剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸。还可以用盐如海藻酸钠。
为糖衣丸核心提供适宜的包衣。为此目的，可以使用可以任选包含阿拉伯胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、聚羧乙烯(carbopol)凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶液和适宜的有机溶剂或溶剂混合物的浓糖溶液。可以将染料或色素加到片剂或糖衣丸包衣，以鉴定或表征不同活性化合物剂量的组合。
可以口用的药物组合物包括由凝胶制备的推入嵌合胶囊、由凝胶和增塑剂如甘油或山梨醇制备的密封胶囊。推入嵌合胶囊可以包含与填充剂如乳糖、粘合剂如淀粉和/或润滑剂如滑石或硬脂酸镁以及任选的稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，可以将活性化合物溶解或悬浮在适宜的液体，例如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇中。还可以在这些制剂中加入稳定剂。
还可以使用的药物组合物包括硬明胶胶囊。作为一个非限制性实例，在胶囊口服药口制剂中的化合物1可以为50和200mg剂量浓度。这两种剂量浓度由相同的颗粒，通过填充到不同尺寸的硬凝胶胶囊中来制备，3号用于50mg胶囊，0号用于200mg胶囊。
可以将胶囊装入褐色玻璃或塑料瓶中以对活性化合物进行光保护。含有活性化合物胶囊制剂的容器必须在受控的室温(15-30℃)下储存。
为进行吸入给药，使用加压包装或喷雾器和适宜的抛射剂将根据本发明使用的化合物方便地以气溶胶喷雾剂的形式递送，所述抛射剂例如但不限于二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳。在加压气溶胶的情况下，可以通过提供用于递送计量的阀来控制剂量单元。例如用于吸入器或吹入器的明胶的胶囊或药筒可以制成包含化合物的粉末混合物和适宜的粉末基质如乳糖或淀粉。
还可以将化合物制备用于肠胃外给药，例如通过大丸药注射或连续输注。用于注射的制剂可以单元剂型，例如安瓿或多剂量容器形式存在，并含有加入的防腐剂。该组合物可以是诸如在油或水性赋形剂中的悬浮液、溶液或乳液的形式，并可以包含制剂材料如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。
用于肠胃外给药的药物组合物包括水溶形式的水溶液，例如但不限于活性化合物的盐。此外，活性化合物的悬浮液可以在亲脂性赋形剂中制备。适宜的亲脂性赋形剂包括脂肪油，例如芝麻油、合成脂肪酸酯如油酸乙酯和甘油三酸酯或者诸如脂质体的材料。水性注射液可以包含增加悬浮液粘性的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨醇或右旋糖酐。任选地，悬浮液还可以包含适宜的稳定剂和/或增加化合物溶解度的试剂，以允许制备高浓度溶液。
作为可替代的选择，活性成分可以是用于在使用前与适宜的赋形剂，例如无菌、不含热原的水组成的粉末形式。
该化合物还可以例如使用常规的栓剂基质如可可油或其它甘油酯制成直肠组合物，例如栓剂或保留灌肠剂。
除了前述的制剂之外，该化合物还可以制成贮存制剂。这种长效制剂可以通过植入(例如皮下或肌内)或肌内注射给药。
本发明的化合物可以与适宜的聚合或疏水材料(例如含药理学可接受油的乳液)、离子交换树脂一起制备用于这种给药途径，或者制成微溶的衍生物，例如但不限于微溶盐。
用于本发明疏水化合物的药物载体的非限制性实例为包含苄醇、非极性表面活性剂、水可溶混有机聚合物和水相如VPD共溶剂系统的共溶剂系统。VPD是一种3％w/v苄醇、8％w/v非极性表面活性剂聚山梨醇酯80和65％w/v聚乙二醇300的溶液，在无水乙醇中组成体积。VPD共溶剂系统(VPD∶D5W)由在水中的用5％右旋糖1∶1稀释的VPD的溶液组成。这种共溶剂系统良好地溶解疏水化合物，其本身在系统给药时产生低毒性。天然地，这种共溶剂系统的比例可以在不破坏它的溶解度和毒性特征的情况下发生相当的变化。而且，共溶剂组分的密度可以如此改变：例如可以使用其它低毒性非极性表面活性剂代替聚山梨醇酯80，聚乙二醇部分大小可以变化，其它生物相容性聚合物可以代替聚乙二醇，例如聚乙烯吡咯烷酮，而其它糖或多糖可以代替右旋糖。
作为可替代的选择，可以使用用于疏水药物组合物的其它递送系统。脂质体和乳液是已知用于疏水药物的递送赋形剂或载体的实例。此外，某些有机溶剂如二甲亚砜也可以使用，虽然其经常存在较大毒性的成本。
此外，可以使用持续释放系统递送化合物，例如含有治疗剂的固体疏水聚合物的半渗透基质。许多持续释放材料已形成，并被本领域技术人员公知。持续释放胶囊可以依赖它们的化学性质释放化合物，持续数周至超过100天。根据治疗剂的化学性质和生物稳定性，可以使用其它用于蛋白稳定的策略。
本文所药物组合物还可以包含适宜的固体或凝胶相载体或赋形剂。这些载体或赋形剂的实例包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖、淀粉、纤维素衍生物、明胶和聚合物如聚乙二醇。
用于本发明的制剂的实例在表1-3中(以下)，它见于2002年10月10日提交的美国专利申请10/237,966，现为一项临时申请，本文将其全文引入以供参考。
表1
| 5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸(2-二乙基氨基-乙基)-酰胺硬明胶胶囊的组成 | ||||
| 成分名称 | 颗粒中的浓度 | 50mg胶囊中的用 | 75mg胶囊中的 | 200mg胶囊中的用 |
| (％w/w) | 量(mg) | 用量(mg) | 量(mg) | |
| API | 65.0 | 50.0 | 75.0 | 200.0 |
| 甘露糖醇 | 23.5 | 18.1 | 27.2 | 72.4 |
| 交联羧甲纤维素钠e | 6.0 | 4.6 | 6.9 | 18.4 |
| 聚维酮(K-25) | 5.0 | 3.8 | 5.7 | 15.2 |
| 硬脂酸镁 | 0.5 | 0.38 | 0.57 | 1.52 |
| 胶囊 | - | 尺寸1 | 尺寸3 | 尺寸0 |
表2
| 5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸(2-二乙基氨基-乙基)-酰胺L-苹果酸酯硬明胶胶囊的组成 | ||
| 成分名称/等级 | 颗粒中的浓度(％w/w) | 50mg胶囊中的用量(mg) |
| API | 75.0 | 66.800c |
| 甘露糖醇 | 13.5 | 12.024 |
| 交联羧甲纤维素钠e | 6.0 | 5.344 |
| 聚维酮(K-25) | 5.0 | 4.453 |
| 硬脂酸镁 | 0.5 | 1.445 |
| 胶囊 | - | 尺寸3 |
表3
| 5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸(2-二乙基氨基-乙基)-酰胺L-苹果酸酯硬明胶胶囊的组成 | ||||
| 成分名称/等级 | 颗粒中的浓度(％w/w) | 25mg胶囊中的用量(mg) | 50mg胶囊中的用量(mg) | 100mg胶囊中的用量(mg) |
| APIa | 40.0 | 33.400d | 66.800c | 200.06 |
| 甘露糖醇 | 47.5 | 39.663 | 79.326 | 158.652 |
| 交联羧甲纤维素钠e | 6.0 | 5.010 | 10.020 | 20.04 |
| 聚维酮(K-25) | 5.0 | 4.175 | 8.350 | 16.700 |
| 硬脂酸镁 | 1.5 | 1.252 | 2.504 | 5.008 |
| 胶囊 | - | 尺寸3 | 尺寸1 | 尺寸0 |
a调整该批所需的药物用量至对于胶囊具有100％的标记浓度。适宜地调节甘露糖醇用量以对于每种浓度而言保持相同的填充重量。
b数量等于100mg游离碱。
c数量等于50mg游离碱。
d数量等于25mg游离碱。
e半数颗粒内半数颗粒外
可以提供许多式I和式II的化合物作为生理学可接受盐，其中该化合物可以形成带负电或正电的种类。化合物形成带正电部分的盐的实例包括但不限于季铵，盐，例如盐酸盐、硫酸盐、碳酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、琥珀酸盐，其中季铵基团的氮原子是所选择的与适宜的酸反应的本发明化合物的氮。本发明化合物形成带负电部分的盐包括但不限于通过化合物中的羧酸与适宜的碱(例如氢氧化钠(NaOH)、氢氧化钾(KOH)、氢氧化钙(Ca(OH)2)等)反应形成的钠、钾、钙和镁盐。
适用于本发明的药物组合物包括其中含有用于实现预期目的的足够数量，即治疗有效量的活性成分的组合物。
治疗有效量的确定在本领域技术人员的能力范围内，特别是在根据本文提供的详细内容的情况下。
关于任何用于本发明方法的化合物，可以由细胞培养试验来估计治疗有效数量或剂量。然后，可以形成用于动物模型的剂量以获得循环浓度范围，包括在细胞培养物中测定的IC50(即实现对CSF1R的磷酸化的半数最大抑制作用的受试化合物的浓度)。然后可以将这些信息更精确地用于确定人的有用剂量。
本文所述化合物的毒性和治疗效力可以通过细胞培养物或实验动物中进行标准药学方法，例如通过测定IC50和LD50来测定，其中LD50为关于主题化合物的实现半数抑制致命的受试化合物的浓度。
从这些细胞培养试验和动物研究中获得的数据可以用于制定用于人的剂量范围。剂量可以依赖于所用的剂型和所用的给药途径而变。确切的制剂、给药途径和剂量可以由个体内科医师根据患者的症状来选择(例如参见Fingl等人，1975，in″The Pharmacological Basis ofTherapeutics″，Ch.1 p.l)。
可以单独调整剂量和时间间隔以提供足以保持激酶调节效果的活性种类的血浆水平。这些血浆水平称为最小有效浓度(MECs)。MEC将随各化合物而变，但可以由体外数据来估计，例如实现50-90％激酶所需的浓度可以用本文所述的试验来确定。
实现MEC所需的剂量将取决于各自的给药特征和途径。HPLC试验或生物试验可以用于测定血浆浓度。
剂量时间间隔还可以用MEC值来确定。应该使用在10-90％的时间，优选30-90％的时间，最优选50-90％的时间保持血浆水平大于MEC的方案来施用化合物。
目前，式I或式II的化合物的治疗有效量可以大约为25mg/m2-1500mg/m2/天；优选大约3mg/m2/天。甚至更优选50mg/qm qd至400mg/qd。
在局部给药或选择性摄入的情况下，药物的有效局部浓度可与血浆浓度有关，并可以使用本技术中已知的其它方法来确定正确的剂量和时间间隔。
给药的组合物的数量当然取决于治疗的受试者、病痛的严重程度、给药方式、处方医师的判断等。
期待本发明的方法可以与其它治疗联合使用，包括用于癌症的化学治疗、放射治疗和外科手术治疗。
关于本文所述的联合治疗和药物组合物，本发明的化合物和其它试剂的有效量可以由本领域技术人员根据本文所述的化合物的有效量和已知或已描述的其它试剂的有效量来确定。用于这些治疗和组合物的给药制剂和途径可以基于本文关于包含本发明的化合物作为单一活性试剂的组合物和治疗所述的信息以及关于与其联合的化学治疗和其它试剂所提供的信息。
具体而言，考虑可以将所述的化合物与二膦酸盐或激素治疗(例如芳香酶抑制剂)组合以防止乳腺癌中的骨分解。还考虑可以将化合物与全反式视黄酸(ATRA)组合用于治疗AML和其它癌症。
一般合成方法
可以使用以下一般方法来制备本发明的化合物：
将适宜取代的2-羟吲哚(1当量)，适宜取代的醛(1.2当量)和碱(0.1当量)在溶剂(1-2ml/mmol 2-羟吲哚)中混合，然后将混合物加热大约2至大约12小时。冷却后，将形成的沉淀过滤，用冷乙醇或醚洗涤，并真空干燥得到固体产物。如果没有沉淀形成，则将反应混合物浓缩，并将残余物与二氯甲烷/醚一起研磨，通过过滤收集所得的固体，然后干燥。可任选进一步通过色谱法纯化产物。
碱可以是有机或无机碱。如果使用有机碱，优选它是氮碱。有机氮碱的实例包括但不限于二异丙基胺、三甲基胺、三乙基胺、苯胺、吡啶、1，8-二氮杂双环[5.4.1]十一-7-烯、吡咯烷和哌啶。
无机碱的实例例如但不限于氨水、碱金属或碱土金属氢氧化物、磷酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐、硫酸氢盐和酰胺。碱金属包括锂、钠和上，而碱土包括钙、镁和钡。
在本发明目前优选的实施方案中，当溶剂为质子溶剂，例如水或醇时，碱为碱金属或碱土无机碱，优选碱金属或碱土氢氧化物。
本领域技术人员根据已知的一般有机合成原理和本文的公开清楚地知道哪一种碱对所考虑的反应来说是最合适的。
完成反应的溶剂可以是质子或质子惰性溶剂，优选它是质子溶剂。“质子溶剂”是氢原子共价连接到使氢原子具有相当酸性，从而能够通过氢键被溶质“共享”的氧或氮原子上的溶剂。质子溶剂的实例包括但不限于水和醇。
“质子惰性溶剂”可以是极性或非极性的，但在任何情况下它不含酸性氢，因而不能与溶质形成氢键。非极性质子惰性溶剂的非限制性实例为戊烷、己烷、苯、甲苯、二氯甲烷和四氯化碳。极性质子惰性溶剂的实例为氯仿、四氢呋喃、二甲亚砜和二甲基甲酰胺。
在本发明目前优选的实施方案中，溶剂为质子溶剂，优选水或醇，例如乙醇。
所述反应在大于室温的温度下完成。温度一般为大约30℃至大约150℃，优选大约80℃至大约100℃，最优选大约75℃至大约85℃，它在约是乙醇的沸点。“大约”意指温度范围优选所示温度的10摄氏度范围内，更优选在所示温度的5摄氏度范围内，最优选在所示温度的2摄氏度范围内。因此，例如大约“75℃”意指75±10℃，优选75℃+5℃，最优选75℃±2℃。
2-羟吲哚和醛，可以容易地使用化学领域中已知的技术合成。本领域技术人员可以认识到用于形成本发明化合物的其它合成方法是可获得的，以下通过举例的形式提供而不是限制。
本发明的化合物根据以下方法制备，或者如在以下文献中所述制备：美国专利申请09/783,264和WO 01/60814、WO 00/08202、2001年8月15日提交的美国临时申请60/312,353、2002年8月13日提交的目前的美国专利申请10/281,985、2002年9月18日提交的美国临时申请60/411,732、2001年10月提交的美国临时申请60/328,226、2002年10月10日提交的现在的美国专利申请10/268,082和2002年2月15日提交的美国专利申请10/076,140，所有这些文献被全文引用以供参考。此外，本文引用2003年2月24日提交的美国临时申请60/448,874和60/448,922的内容以供参考。
合成方法
方法A：吡咯的甲酰化反应
-10℃下将POCl3(1.1当量)滴加到二甲基甲酰胺(3当量)，然后加入溶于二甲基甲酰胺的适宜的吡咯。搅拌2小时后，用H2O稀释反应混合物，并用10N KOH碱化至pH 11。用H2O洗涤过滤收集的沉淀形式，并在真空烘箱中干燥得到期望的醛。
方法B：吡咯甲酸酯的皂化
将在EtOH中的吡咯甲酸酯和KOH(2-4当量)的混合物回流直至通过薄层色谱法(TLC)表明反应完全。用1N HCl将冷却的反应混合物酸化pH 3。用H2O洗涤过滤收集的沉淀形式，并在真空烘箱中干燥得到期望的吡咯甲酸。
方法C：酰胺化
向溶于二甲基甲酰胺(0.3M)的吡咯甲酸的搅拌溶液中加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基-丙基)碳化二亚胺(1.2当量)、1-羟基苯并三唑(1.2当量)和三乙基胺(2当量)。加入适宜的胺(1当量)，并将混合物搅拌至TLC表明反应完全。然后将乙酸乙酯加到反应混合物，并用饱和NaHCO3和盐水(使用外盐)洗涤溶液，用无水MgSO4干燥，并浓缩得到期望酰胺。
方法D：醛和含有羧酸取代基的羟吲哚的缩合
将在乙醇(0.4M)中的羟吲哚(1当量)、1当量的醛和1-3当量的哌啶(或吡咯烷)的混合物于90-100℃下搅拌，直至TLC表明反应完全。然后将混合物浓缩，并用2NHCl酸化剩余物。用H2O和EtOH洗涤形成的沉淀，然后在真空烘箱中干燥得到产物。
方法E：醛和不含羧酸取代基的羟吲哚的缩合
将在乙醇(0.4M)中的羟吲哚(1当量)、1当量的醛和1-3当量的哌啶(或吡咯烷)的混合物于90-100℃下搅拌，直至TLC表明反应完全。将混合物冷却至室温，并用真空过滤法收集形成的固体，用乙醇洗涤，并干燥得到产物。如果沉淀在冷却反应混合物时没有形成，则将混合物浓缩并用柱色谱法纯化。
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提供以下实施例以例示本发明。但是，应该理解本发明不限于这些实施例中所述的特定条件或细节。在整个说明书中，对公众可获得的文献的任何和所有的参考被具体地引入本专利申请以供参考。
合成实施例
实施例1-(3Z)-3-{[3，5-二甲基-4-(吗啉-4-基)哌啶-1-基羰基]-1H-吡咯-2-基亚甲基}-5-氟-1，3-二氢-2H-吲哚-2-酮(化合物9)的合成
步骤1
60分钟内向在50℃下加热的4-氨基-1-苄基哌啶(Aldrich，1.53mL，7.5mmol)、K2CO3(2.28g，16.5mmol)和DMF(15mL)的搅拌的混合物中滴加双(2-溴乙基)醚(Aldrich，tech.90％，0.962mL，7.65mmol)。80℃下搅拌6小时后，TLC(90∶10∶1氯仿/MeOH/浓NH4OH水溶液)表明形成新的斑点。继续加热，此时通过在2小时内吹入氮气流来蒸发溶剂。粗品物质较纯，但经历较短的硅胶柱(1％-6％梯度的9∶1MeOH/NH4OH水溶液，在氯仿中)。蒸发纯馏分得到～1.7g的二胺4-(吗啉-4-基)-1-苄基哌啶，为一种蜡状固体。
1HNMR(400MHz，d6-DMSO)δ7.31(m，4H)，7.26(m 1H)，3.72(t，J＝4.7Hz，4H)，3.49(s，2H)，2.94(br d，J＝5.9Hz，2H)，2.54(t，J＝4.7Hz，4H)，2.19(tt，Y＝11.5，3.9Hz，1H)，1.96(td，J＝11.7，2.2Hz，2H)，1.78(br d，J＝12.5Hz，2H)，1.55(m，2H)。
步骤2
在氮气氛下，通过用使用氮气球冲洗(～20秒)进入容器并通过油鼓泡器流出而将Pd(OH)2(20％担载在碳上(＜50％湿)，390mg，25wt％)、甲醇(50mL)和≤1.7M HCl(3eq，～10.6mL——当观察ppt时包括后来加入的水)的搅拌的混合物与1atm.氢气氛交换。20分钟后，在氢气氛下将反应混合物加热至50℃，并在30分钟内滴加在甲醇(8mL)中的4-(吗啉-4-基)-1-苄基哌啶(1.56g，6.0mmol)。10小时后，TLC表明所有的原料胺消耗至更大极性的点(水合三酮活性)。然后用C盐过滤反应混合物，并蒸发得到4-(吗啉-4-基)哌啶二氢氯化物，为一种米色固体。用过量的碱性树脂(＞16g，Bio-Rad Laboratories，AG1-X8，20-50目，氢氧化物形式，甲醇洗涤二次)和盐酸胺的甲醇混合物对此物质进行游离碱化。在用树脂漩涡处理30分钟后，倾倒甲醇溶液，并蒸发得到932mg 4-(吗啉-4-基)哌啶游离碱，为一种蜡状结晶固体。
1HNMR(400MHz，d6-DMSO)δ3.53(br s，4H)，3.30(v br s，1H(+H2O))，2.92(br d，J＝11.7Hz，1H)，2.41(s，4H)，2.35(-obscdt，J＝11.7Hz，2H)，2.12(br t，1H)，1.65(br d，J＝11.7Hz，2H)，1.18(brq，J＝10.9Hz，2H)；LCMS-APCIm/z 171[M+1]+。
步骤3
将如在PCT公开01/60814中所述制备的(3Z)-3-(3，5-二甲基-4-羧基-1H-吡咯-2-基亚甲基)-5-氟-1，3-二氢-2H-吲哚-2-酮(120mg，0.40mmol)和BOP(221mg，0.50mmol)悬浮在DMF(5mL)中，在室温下进行良好地搅拌，并加入三乙基胺(134μL，0.96mmol)。10-15分钟后，向均一的反应混合物一次性加入4-(吗啉-4-基)哌啶(85mg，0.50mmol)。将反应混合物搅拌48小时(可能更早地完成)，然后转移至含有氯仿-异丙醇(5/1)和5％ LiCl水溶液的漏斗中。分离浑浊的橙色有机相，用附加的5％LiCl水溶液(2X)、1M NaOH水溶液(3X)、标准NaCl水溶液(1X)洗涤，然后干燥(Na2SO4)，并蒸发得到粗产物(96.3％纯；通过1HNMR表明为痕量HMPA)。然后通过极短硅胶柱(3cm)(5-15％梯度的MeOH，在DCM中)将粗产物进一步纯化，其中除去痕量的较快移动的3E-异构体。蒸发纯馏分，并用饱和EtOAc溶液结晶过夜，用Et2O(～3倍)稀释，并在0℃下冷却。倾倒母液以在完全真空后得到目标化合物，为橙色结晶(153mg 85％)。
1HNMR(400MHz，d6-DMSO)δ13.60(s，1H)，10.87(s，1H)，7.72(dd，J＝9.4，2.7Hz，1H)，7.68(s，1H)，6.91(td，J＝9.3，2.6Hz，1H)，6.82(dd，J＝8.6，4.7Hz，1H)，3.54(app br t，J＝4.3Hz，4H)，3.31(2x s，3H+3H)，2.43(br s，4H)，2.36(m，1H)，2.25(br m，6H)，1.79(br s，2H)，1.22(br s，2H)；LCMS 453[M+1]+。
如以上实施例1所述进行，但用(3Z)-3-(3，5-二甲基-4-羧基-1H-吡咯-2-基亚甲基)-5-氟-1，3-二氢-2H-吲哚-2-酮代替(3Z)-3-(3，5-二甲基-4-羧基-1H-吡咯-2-基亚甲基)-1，3-二氢-2H-吲哚-2-酮得到(3Z)-3-{[3，5-二甲基-4-(吗啉-4-基)哌啶-1-基羰基]-1H-吡咯-2-基亚甲基}-，3-二氢-2H-吲哚-2-酮。1HNMR(400MHz，d6-DMSO)δ13.55(s，1H)，10.87(s，1H)，7.74(d，J＝7.6Hz，1H)，7.59(s，1H)，7.11(t，J＝7.6Hz，1H)，6.97(t，J＝7.6Hz，1H)，6.86(d，J＝7.4Hz，1H)，3.54(app br t，J＝4.3Hz，4H)，3.31(2x 5，3H+3H)，2.43(br 5，4H)，2.35(m，1H)，2.28(br m，6H)，1.79(hr 5，2H)，1.22(br，2H)；LCMS m/z 435[M+1]+
如以上实施例1所述进行，但用(3Z)-3-(3，5-二甲基-4-羧基-1H-吡咯-2-基亚甲基)-5-氟-1，3-二氢-2H-吲哚-2-酮代替(3Z)-3-(3，5-二甲基-4-羧基-1H-吡咯-2-基亚甲基)-5-氯-1，3-二氢-2H-吲哚-2-酮得到(3Z)-3-{[3，5-二甲基-4-(吗啉-4-基)哌啶-1-基羰基]-1H-吡咯-2-基亚甲基}-5-氯-1，3-二氢-2H-吲哚-2-酮。
1HNMR(400MHz，d6-DMSO)δ13.56(s，1H)，10.97(s，1H)，7.95(d，J＝2.0Hz，1H)，7.74(s，1H)，7.11(dd，J＝8.2，2.0Hz，1H)，6.85(d，J＝8.2Hz，1H)，3.54(app br t，J＝～4Hz，4H)，3.31(2x 5，3H+3H)，2.43(br S，4H)，2.37(m，1H)，2.25(br m，6H)，1.79(br s，2H)，1.23(br s，2H)；LCMS m/z 470[M+1]+。
如以上实施例1所述进行，但用可商购得到的4-(1-吡咯烷基)-哌啶代替4-(吗啉-4-基)-哌啶得到(3Z)-3-{[3，5-二甲基-4-[4-(吡咯烷-1-基)哌啶-1-基羰基]-1H-吡咯-2-基)亚甲基]-5-氟-1，3-二氢-2H-吲哚-2-酮。
1HNMR(400MHz，d6-DMSO)δE/Z异构体混合物；LCMS m/z 437[M+1]+。
可以根据2001年10月10日提交的美国临时申请60/328,226和2002年10月10日提交的美国专利申请10/268,082合成以上的实施例，所述文献在此被引用以供参考。
实施例2-(3Z)-3-{[3，5-二甲基-4-(吗啉-4-基)氮杂环丁烷-1-基羰基]-1H-吡咯-2-基亚甲基}-5-氟-1，3-二氢-2H-吲哚-2-酮的合成
步骤1
将根据Tetrahedron Letters 40(1999)3761-64所述的已知方法由2，3-二溴丙基氢溴化胺(58.8mmol)制备的1-氮杂双环[1.1.0]丁烷的溶液于0℃下缓慢地加到在无水非变性乙醇(250ml)中的吗啉(15.7ml；180mmol)和硫酸(3.3g的96％溶液)溶液中。将反应混合物地冰浴上搅拌30分钟，然后在室温下搅拌8小时。
加入氢氧化钙(5.5g)和100ml水，并将所得的浆搅拌1小时，然后过滤通过C盐滤垫。将滤液浓缩，并在减压(20mm Hg)下蒸发以除去水和过量的吗啉。在高度真空下使用Kugelrohr容器将蒸馏残留物再蒸馏以得到纯4-(氮杂环丁烷-3-基)吗啉，产率33％(2.759g)，为一种无色油状液体。
13C-NMR(CDCl3，100MHz)：66.71(2C)，59.37(1C)，51.46(2C)，49.95(2C)1H(CDCl3，400MHz)：3.727(t，J＝4.4Hz，4H)，3.619(t，J＝8Hz，2H)，3.566(t，J＝8Hz，2H)，3.227(m，J＝7Hz，1H)，2.895(br s，1H)，2.329(br s，4H)
步骤2
将(3Z)-3-({3，5-二甲基-4-羧基}1-H-吡咯-2-基)亚甲基)-5-氟-1，3-二氢-2H-吲哚-2-酮的1-(8-氮杂苯并三唑基)-酯(0.5mmol，210mg)[通过以下方法制备：在DMF(5ml)中的Hunig碱(3.0mmol，0.525ml)存在下用HATU试剂(570mg，1.5mmol)活化(3Z)-3-(3，3-二甲基-4-羧基-1-H-吡咯-2-基亚甲基)-5-氟-1，3-二氢-2H-吲哚-2-酮(480mg；1.6mmol)，用氯仿(5ml)沉淀分离出纯形式，并在高度真空下干燥，产率92％(579mg)]悬浮在无水DMA(1.0ml)中。一次性加入在DMA(1.0ml)中的4-(氮杂环丁烷-3-基)-吗啉(142.5mg，1mmo l)的溶液，并在室温下将所得的溶液搅拌20分钟。室温下用油泵蒸发反应混合物，用6ml甲醇和二乙基胺的混合物(20∶1；v/v)稀释稠的剩余物，用机械方法接种，并在冰箱(+3℃)内放置8小时。将沉淀过滤(用冰冷的甲醇作简短洗涤)，并在真空下干燥得到目标产物。71.5％产率(152mg橙色固体)
LC/MS：+APCI：M+1＝425；-APCI：M-1＝423
19F-NMR(d-DMSO，376.5MHz)：-122.94(m，1F)
1H(d-DMSO，400MHz)：13.651(s，1H)，10.907(s，1H)，7.754(dd，J＝9.4Hz，J＝2.4Hz，1H)，7.700(s，1H)，6.935(dt，J＝8.2Hz，J＝2.4Hz，1H)，6.841(dd，J＝8.6Hz，J＝3.9Hz；1H)，3.963(br s，2H)，3.793(br s，2H)，3.581(br t，J＝4.3Hz，4H)，3.133(m，1H)，2.367(s，3H)，2.340(s，3H)，2.295(br s，4H)
如以上实施例2所述进行，但用(3Z)-3-(3，5-二甲基-4-羧基-1H-吡咯-2-基亚甲基)-5-氯-1，3-二氢-2H-吲哚-2-酮代替(3Z)-3-(3，5-二甲基-4-羧基-1H-吡咯-2-基亚甲基)-5-氟-1，3-二氢-2H-吲哚-2-酮得到(3Z)-3-{[3，5-二甲基-4-(吗啉-4-基)氮杂环丁烷-1-基羰基]-1H-吡咯-2-基亚甲基}-5-氯-1，3-二氢-2H-吲哚-2-酮，为一种橙色固体。
LC/MS：+APCI：M+1＝441；-APCI：M-1＝440，441
1H(d-DMSO，400MHz)：13.607(s，1H)，11.006(s，1H)，7.976(d，J＝2.0Hz，1H)，7.756(s，1H)，7.136(dd，J＝8.2Hz，J＝2.0Hz，1H)，6.869(d，J＝8.2Hz，1H)，3.964(br s，2H)，3.793(br s，2H)，3.582(br t，J＝4.3Hz，4H)，3.134(m，1H)，2.369(s，3H)，2.347(s，3H)，2.296(br s，4H)
如以上实施例2所述进行，但用4-(氮杂环丁烷-3-基)-顺式-3，5-二甲基吗啉(使用类似于制备4-(氮杂环丁烷-3-基)-吗啉的方法，但用顺式-3，5-二甲基吗啉(20.7g；180mmol)代替吗啉来制备)代替4-(氮杂环丁烷-3-基)吗啉得到(3Z)-3-{[3，5-二甲基-4-(2，5-二甲基吗啉-4-基)氮杂环丁烷-1-基羰基]-1H-吡咯-2-基亚甲基}-5-氟-1，3-二氢-2H-吲哚-2-酮，为一种橙色固体。
LC/MS：+APCI：M+1＝453；-APCI：M-1＝451
19F-NMR(d-DMSO，376.5MHz)：-122.94(m，1F)
1H(d-DMSO，400MHz)：13.651(s，1H)，10.907(s；1H)，7.758(dd，J＝9.4Hz，J＝2.3Hz；1H)，7.700(s，1H)，6.935(dt，J＝8.6Hz，J＝2.7Hz，1H)，6.842(dd，J＝8.2Hz，J＝4.3Hz，1H)，3.961(br s，2H)，3.790(br s，2H)，3.546(br m，2H)，3.092(m，1H)，2.690(br s；2H)，2.364(s，3H)，2.338(s，3H)，1.492(br m，2H)，1.038(br s，6H)
如以上实施例2所述进行，但用(3Z)-3-(3，5-二甲基-4-羧基-1H-吡咯-2-基亚甲基)-5-氯-1，3-二氢-2H-吲哚-2-酮代替(3Z)-3-(3，5-二甲基-4-羧基-1H-吡咯-2-基亚甲基)-5-氟-1，3-二氢-2H-吲哚-2-酮，并用4-(氮杂环丁烷-3-基)-顺式-3，5-二甲基吗啉代替4-(氮杂环丁烷-3-基)吗啉得到(3Z)-3-{[3，5-二甲基-4-(3，5-二甲基吗啉-4-基)氮杂环丁烷-1-基羰基]-1H-吡咯-2-基亚甲基}-5-氯-1，3-二氢-2H-吲哚-2-酮，为一种橙色固体。
LC/MS：+APCI：M+1＝469，470；-APCI：M-1＝468，469
1H(d-DMSO，400MHz)：13.606(s，1H)，11.008(s，1H)，7.979(d，J＝2.0Hz，1H)，7.758(s，1H)，7.138(dd，J＝8.2Hz，J＝2.0Hz，1H)，6.870(d，J＝8.2Hz，1H)，3.964(br s，2H)，3.790(br s，2H)，3.547(br m，2H)，3.095(m，1H)，2.691(br s，2H)，2.366(s，3H)，2.345(s，3H)，1.494(br m，2H)，1.039(br s，6H)
如以上实施例1所述进行，但用如以下所述制备的2-(R)-吡咯烷-1-基甲基吡咯烷代替4-(吗啉-4-基)-哌啶得到(3Z)-3-{[3，5-二甲基-2R-(吡咯烷-1-基甲基)吡咯烷-1-基羰基]-1H-吡咯-2-基亚甲基}-5-氟-1，3-二氢-2H-吲哚-2-酮。
2(R)-吡咯烷-1-基甲基吡咯烷的合成
步骤1
向在DMF(20ml)中的(+)-苄氧羰基-D-脯氨酸(1.5g，6.0mmol)、EDC(2.3g，12.0mmol)和HOBt(80Omg，12.9mmol)的溶液加入三乙基胺(1.5ml)和吡咯烷(1.0ml，12.0mmol)中。室温下搅拌18小时。加入饱和NaHCO3，用CH2Cl2萃取(三次)。分离有机层，并用Na2SO4干燥。除去溶剂，用硅胶色谱法(EtOAc)纯化剩余物得到1-(R)-[N-(苄氧基羰基)-吡咯基]吡咯烷，为一种白色固体(94％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3，所有旋转异构体)δ1.57-1.66(m，1H)，1.71-2.02(m，5H)，2.04-2.19(m，2H)，3.26-3.43(m，3H)，3.44-3.78(m，3H)，4.41(dd，J＝4.5，7.6Hz，0.5H)，4.52(dd，J＝3.7，7.6Hz，0.5H)，4.99(d，J＝12.1Hz，0.5H)，5.05(d，J＝12.5Hz，0.5H)，5.13(d，J＝12.1Hz，0.5H)，5.20(d，J＝12.5Hz，0.5H)，7.27-7.38(m，5H)。
步骤2
将在甲醇(15ml)中的1-(R)-[N-(苄氧基羰基)脯氨酰]吡咯烷(2.7g，8.9mmol)和5％ Pd-C催化剂(270mg)的混合物在氢气氛下搅拌20小时。用C盐过滤反应混合物，并除去溶剂得到2(R)-脯氨酰吡咯烷，为一种粘性油(80％)，将其不经进一步纯化用于下一步骤。
1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ1.52-1.78(m，SH)，1.82-1.89(m，2H)，1.97-2.04(m，1H)，2.63-2.71(m，1H)，2.97-3.02(m，1H)，3.22-3.35(m，3H)，3.48-3.54(m，1H)，3.72(dd，J＝6.1，8.0Hz，1H)。
步骤3
将2-(R)-脯氨酰吡咯烷(1.2g，7.1mmol)溶于THF(10ml)。将反应混合物冷却至0℃，并在0℃下滴入在THF(10ml，10mmol)中的1M BH3。将反应混合物回流16小时，3M HCl(4.7ml)。加入2M NaOH溶液直至达到pH 10。用在CH2Cl2中的5％ MeOH萃取产物(三次)。用Na2SO4干燥有机层，并除去溶剂得到标题化合物，为一种浅黄色液体(73％)，将其不经进一步纯化直接用于下一步。
1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ1.22-1.30(m，1H)，1.55-1.69(m，6H)，1.71-1.79(m，1H)，2.26-2.30(m，1H)，2.33-2.38(m，1H)，2.40-2.45(m，4H)，2.65-2.71(m，1H)，2.78-2.84(m，1H)，3.02-3.09(m，1H)。
如以上实施例1所述进行，但用2-(S)-吡咯烷-1-基甲基吡咯烷(如上述制备，但用苄氧羰基-L-脯氨酸代替(+)苄氧羰基-D-脯氨酸)代替4-(吗啉-4-基)-哌啶，得到(3Z)-3-{[3，5-二甲基-2S-(吡咯烷-1-基甲基)吡咯烷-1-基羰基]-1H-吡咯-2-基亚甲基}-5-氟-1，3-二氢-2H-吲哚-2-酮。
实施例3-5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基-甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸的合成
步骤1
用冰浴搅拌来冷却二甲基甲酰胺(25mL，3eq.)。向其中加入POCl3(1.1eq.，10.8mL)。30分钟后，将在DMF(2M，40mL)中的3，5-二甲基-4-乙酯吡咯(17.7g，105.8mmol)的溶液加到反应物，并持续搅拌。2小时后，用水(250mL)稀释反应物，并用1N NaOH水溶液碱化至pH＝11。通过过滤除去白色固体，用水冲洗，然后用己烷冲洗，并干燥得到5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸乙酯(19.75g，95％)，为一种褐色固体。
1H NMR(360MHz，DMSO-d6)δ12.11(br s，1H，NH)，9.59(s，1H，CHO)，4.17(q，J＝6.7Hz，2H，OCH2CH3)，2.44(s，3H，CH3)，2.40(s，3H，CH3)，1.26(d，J＝6.7Hz，3H，OCH2CH3)。
步骤2
将5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸乙酯(2g，10mmol)加到溶于甲醇(3mL)和水(10mL)的氢氧化钾(3g，53mmol)的溶液。将混合的回流3小时，冷却至室温，并用6N盐酸酸化至pH 3。通过过滤收集固体，用水洗涤，并在真空烘箱中干燥过夜得到5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸(1.6g，93％)。
1H NMR(300MHz，DMS0-d6)δ12.09(s，br，2H，NH & COOH)，9.59(s，1H，CHO)，2.44(s，3H，CH3)，2.40(s，3H，CH3)。
步骤3
将5-氟代靛红(fluoroisatin)(8.2g，49.7mmol)溶于50mL水合肼，并回流1小时。然后将反应混合物倾入冰水。随后将沉淀过滤，用水洗涤，并在真空烘箱中干燥得到5-氟-2-羟吲哚(7.5g)。
步骤4
将在乙醇(3mL)中的5-氟羟吲哚(100mg，0.66mmol)、5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸(133mg，0.79mmol)和10滴哌啶的反应混合物在60℃下搅拌过夜并过滤。用1M盐酸盐水溶液、水洗涤固体，并干燥得到5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸(201mg，定量)，为一种黄色固体。MS m/z(相对密度，％)299([M-1]+，100)。
实施例4-5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-亚基-甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸(3-二乙基氨基-2-羟基-丙基)-酰胺的合成
步骤1
30℃下向2-氯甲基环氧乙烷(95g，1.03mole)加入水(3.08g，0.17mole)和二乙基胺(106.2mL，1.03mole)的混合物。然后将反应混合物于28-35℃下搅拌6小时，并冷却至20-25℃，得到1-氯-3-二乙基氨基-丙-2-醇。
步骤2
向在78mL水中的氢氧化钠(47.9g，1.2mole)的溶液加入1-氯-3-二乙基氨基-丙-2-醇。将所得物于20-25℃下搅拌1小时，用178mL水稀释，并用醚萃取二次。用固体氢氧化钾干燥合并的醚溶液，并蒸发得到135g粗产物，用分步蒸馏法纯化得到纯的缩水甘油基二乙基胺(98g，76％)，为一种油。
步骤3
10分钟内向冰冷的25％(w/w)的氢氧化铵的溶液(25mL，159mmole)滴加缩水甘油基二乙基胺(3.2g，24.8mmol)。将反应混合物于0-5℃下搅拌1小时，然后在室温下搅拌14小时。将所得的反应混合物蒸发，并蒸馏(84-90℃，在500-600mT下)得到1-氨基-3-二乙基氨基-丙-2-醇(3.3g，92％)。MS m/z 147([M+1]+)。
步骤4
向在1.0mL DMF中的5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸(100mg，0.43mmo1)、EDC(122.7mg，0.64mmol)和HOBt(86.5mg，0.64mmol)的溶液加入1-氨基-3-二乙基氨基-丙-2-醇(93.2mg，0.64mmol)。将所得的反应溶液于室温下搅拌过夜，并蒸发。将剩余物悬浮在10mL水中，并过滤。用饱和碳酸氢钠和水洗涤固体，并在高度真空烘箱中干燥过夜得到粗产物，使用柱色谱法，用含有三乙基胺的6％甲醇-二氯甲烷(2滴/100mL 6％甲醇-二氯甲烷)洗脱得到5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸(3-二乙基氨基-2-羟基-丙基)-酰胺(62mg，34％)，为一种黄色固体。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ13.70(s，1H，NH-1′)，10.90(s，1H，NH-1)，7.76(dd，J＝2.38，9.33Hz，1H，H-4)，7.72(s，1H，乙烯基-H)，7.60(m，br.，1H，CONHCH2CH(OH)-CH2N(C2H5)2-4′)，6.93(dt，J＝2.38，8.99Hz，1H，H-5)，6.85(dd，J＝4.55，8.99Hz，1H，H-6)，3.83(m，br，1H，OH)，3.33(m，4H)，2.67(m，br，5H)，2.46(s，3H，CH3)，2.44(s，3H，CH3)，1.04(m，br，6H，CH3x2).MS m/z(相对密度，％)427([M+1]+；100)。
实施例5-5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基-甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸(2-羟基-3-吗啉-4-基-丙基)-酰胺(R)、(S)和(R/S)(化合物4、5和6)的合成
步骤1
在乙醇(50mL)中的吗啉(2.6mL，30mmol)和表氯醇(2.35ml，30mmol)的混合物于70℃下搅拌过夜。除去溶剂后，用二氯甲烷(50mL)稀释剩余物。通过真空过滤收集沉淀的干净固体，得到1-氯-3-吗啉-4-基-丙-2-醇(2.0g，37％)。
1H NMR(DMSO-d6)δ3.49(t，J＝4。8Hz，2H)，3.60(t，J＝4.6Hz，2H)，3.75(m，4H，2xCH2)，4.20(dd，J＝5.2，12Hz，2H)，4.54(m，2H)，4.62(m，1H，CH)，6.64(d，J＝6.4Hz，1H，OH).MS(m/z)180.2(M+1)。
步骤2
室温下用在甲醇(25wt％，20mL)中的NH3的溶液处理1-氯-3-吗啉-4-基-丙-2-醇(2.0g，11mmol)。使氮冒泡通过反应混合物以除去氨。蒸发溶剂以得到1-氨基-3-吗啉-4-基-丙-2-醇的盐酸盐(2.0g，91％)。1H NMR(DMSO-d6)δ2.30(d，J＝6.0Hz，2H)，2.36(m，4H，NCH2)，2.65(dd，J＝8.4，12.8Hz，1H)，2.91(dd，J＝3.6，12.8Hz，1H)，3.52(m，4H，OCH2)，3.87(m，1H，CH)，5.32(s，1H，OH)，8.02(brs.，3H，NH3 +).MS(m/z)161.1(M+1)。
步骤3
将5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸(120mg，0.4mmol)与1-氨基-3-吗啉-4-基-丙-2-醇(74mg，0.48mmol)缩合以沉淀5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸(2-羟基-3-吗啉-4-基-丙基)-酰胺(65mg，36％)。将母液蒸发至干，并用快速色谱法纯化剩余物以得到另外的2N(70mg，39％)。1H NMR(DMSO-d6)δ2.28(m，1H)，2.32(m，1H)，2.40(m，4H)，2.40，2.42(2xs，6H，2xCH3)，3.15(s，1H)，3.31(m，1H)，3.55(m，4H)，3.78(m，1H)，4.73(brs，1H，OH)，6.82(dd，J＝4.5，8.4Hz，1H)，6.90(td，2J＝2.8，3J＝10.0Hz，1H)，7.53(m，1H)，7.70(s，1H)，7.74(dd，I＝2.0，9.6Hz，1H)(芳香和乙烯基)，10.87(s，1H，CONH)，13.66(s，1H，NH).LC-MS(m/z)441.4(M-1)。
2-羟基-7-氧杂-4-氮阳离子螺[3，5]壬烷氯化物的合成
向配备热电偶、氮进气口和250ml加液漏斗的1L三颈圆底烧瓶中装入吗啉(91.5g，91.5ml，1.05mole，1.0eq.)和100ml乙醇。将溶液快速搅拌，同时在大约30分钟内从添加漏斗中加入表氯醇(100g，84.5ml，1.08mole，1.03eq.)。监测温度，并在罐温达到27℃时用冰浴冷却反应物。将澄清的溶液搅拌18小时。用GC分析反应物(用5滴反应混合物稀释至1ml乙醇，并注射至采用以下运行参数的15m DB-5毛细管GC柱，注射器250℃，检测器250℃，烘箱内温度28℃，加热至250℃，速率10℃/分)。反应完成时剩余少于3％吗啉。反应物在50℃和全室真空下旋转蒸发时浓缩，直至没有蒸馏物可以浓缩。将所得的油在室温下储存24-48小时，或者直至观察到明显的结晶物质(种晶将加速该过程)。用250ml丙酮稀释浆并过滤。在60℃的真空烘箱中干燥固体18-24小时。如此得到84g结晶产物。可以将母液浓缩，并以增加的回收率重复结晶过程。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ6.55(d，1H)，4.64(m，1H)，4.53(m，2H)，4.18(m，2H)，3.74(m，4H)，3.60(m，2H)，3.48(m，2H).13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ70.9，61.39，61.04，60.25，58.54，57.80。
1-氨基-3-(4-吗啉基)-2-丙醇(外消旋)的合成
向配备磁搅拌棒的3L一颈圆底烧瓶装入2-羟基-7-氧杂-4-氮阳离子螺[3.5]壬烷氯化物(150g，835mmole)，然后装入在甲醇(2120ml)中的23wt.％无水氨水。塞住烧瓶，并将所得的澄清溶液于20-23℃下搅拌18小时。在以下条件下进行GC表明无剩余原料。移出塞子，并使氨从溶液中冒泡出来，持续30分钟。然后将烧瓶转移至旋转蒸发烧瓶并用45℃浴和全室真空浓缩成一种白色固体。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ3.57(dd，2H)，3.3-3.5(m，6H)，2.59(m，2H)，2.2-2.4(m，6H)；13C NMR(100MHz DMSO-d6)δ70.8，67.1，60.1，53.8，48.1。
根据以上实施例3所述的方法，但用如下述制备的2-(S)-1-氨基-3-吗啉-4-基-丙-2-醇代替2-(RS)-1-氨基-3-吗啉-4-基-丙-2-醇，得到目标化合物5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸(2-(S)-羟基-3-吗啉-4-基-丙基)-酰胺。
1-氨基-3-(4-吗啉基)-2-丙醇(非外消旋)的合成
向配备机械搅拌、热电偶和添加漏斗的1L三颈圆底烧瓶装入吗啉(91.5g，91.5ml，1.05mole，1.0eq.)和45ml叔丁醇。将溶液快速搅拌，同时通过添加漏斗在大约30分钟内加入R-表氯醇(100g，84.5ml，1.08mole.1.03eq.)。监测温度，并当罐温达27℃时用冰水浴冷却反应物。将澄清的溶液搅拌18小时。用GC分析反应(用5滴反应混合物稀释成1ml乙醇，并注射至采用以下运行参数的15m DB-5毛细管GC柱，注射器250℃，检测器250℃，烘箱内温度28℃，加热至250℃，速率10℃/分)。反应完成时剩余少于3％吗啉。将溶液冷却至10℃，滴加20wt％的在THF(576g)中的叔丁醇钾溶液，保持温度小于15℃。将所得的白色浆于10-15℃下搅拌2小时，并用上述条件进行GC检查。没有观察到氯乙醇。用50℃浴和全室真空将混合物旋转蒸发浓缩。用水(500ml)和二氯甲烷稀释所得的混合物。分离相，并用二氯甲烷(500ml)洗涤水相。用硫酸钠干燥合并的有机层，并浓缩至一种澄清、无色的油。如此得到145g，97％产率的环氧化物。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ3.3(dd，4H)，3.1(m，1H)，2.6(dd，1H)，2.5(dd，1H)，2.4(m，4H)，2.2(dd，2H)；13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ65.4，60.1，53.1，48.9，43.4。
将以上粗环氧化物装入带磁搅拌棒的3L一颈圆底烧瓶。加入在甲醇(24％w/w 2.5L)中的无水氨，塞住烧瓶，并在室温下将混合物搅拌24小时。在上述条件下进行GC表明无剩余原料。移出塞子，并使氨从溶液中冒泡出来，持续30分钟。然后将烧瓶转入旋转蒸发烧瓶，并用45℃浴和全室真空浓缩得到一种澄清无色油。如此得到124g产物。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ3.57(dd，2H)，3.3-3.5(m，6H)，2.59(m，2H)，2.2-2.4(m，6H)；13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ70.8，67.1，60.1，53.8，48.1。
1-氨基-3-(4-吗啉基)-2-(S)-丙醇的合成
向配备机械搅拌、热电偶和添加漏斗的1L三颈圆底烧瓶装入吗啉(91.5g，91.5ml，1.05mole，1.0eq.)和200ml甲醇。将溶液快速搅拌，同时通过添加漏斗在大约30分钟内加入R-表氯醇(100g，84.5ml，1.08mole.1.03eq.)。监测温度，并当罐温达27℃时用冰水浴冷却反应物。将澄清的溶液搅拌18小时。用GC分析反应(用5滴反应混合物稀释成1ml乙醇，并注射至采用以下运行参数的15m DB-5毛细管GC柱，注射器250℃，检测器250℃，烘箱内温度28℃，加热至25O℃，速率10℃/分)。反应完成时剩余少于3％吗啉。将溶液冷却至10℃，滴加25wt％的在甲醇(233g，1.08mole，247ml)中的甲醇钠溶液，保持温度低于15℃。将所得的白色浆于10-15℃下搅拌2小时，并用上述条件进行GC检查。没有观察到氯乙醇。用50℃浴和全室真空将混合物旋转蒸发浓缩。用水(500ml)和二氯甲烷稀释所得的混合物。分离相，并用二氯甲烷(500ml)洗涤水相。用硫酸钠干燥合并的有机层，并浓缩至一种澄清、无色的油。如此得到145g，97％产率的1，2-环氧-3-吗啉-4-基丙烷。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ3.3(dd，4H)，3.1(m，1H)，2.6(dd，1H)，2.5(dd，1H)，2.4(m，4H)，2.2(dd，2H)；13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ65.4，60.1，53.1，48.9，43.4。
将以上粗1，2-环氧-3-吗啉-4-基丙烷装入带磁搅拌棒的3L一颈圆底烧瓶。加入在甲醇(24％w/w 2.5L)中的无水氨，塞住烧瓶，并在室温下将混合物搅拌24小时。在上述条件下进行GC表明无剩余原料。移出塞子，并使氨从溶液中冒泡出来，持续30分钟。然后将烧瓶转入旋转蒸发烧瓶，并用45℃浴和全室真空浓缩得到一种澄清无色油。如此得到124g 1-氨基-3-(4-吗啉基)-2-(S)-丙醇。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ3.57(dd，2H)，3.3-3.5(m，6H)，2.59(m，2H)，2.2-2.4(m，6H)；13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ70.8，67.1，60.1，53.8，48.1。
将咪唑酰胺(7.0g，32.3mmol)、胺(15.0g，64.6mmol)、5-氟羟吲哚(4.93g，32.6mmol)、三乙基胺(9.79g，96.9mmol)和THF(88ml)混合，并加热至60℃，将黄色浆冷却至rt(室温)，并过滤。用80ml THF洗涤滤饼，并在50℃和室内真空下干燥过夜。得到一种褐色固体(23.2g)。将固体在350ml水中于rt下成浆5小时并过滤。用100ml水洗涤滤饼并在50℃和室内真空下干燥过夜。得到8.31g，化学产率56％。
向配备温度计、冷凝器、磁搅拌器和氮进气口的0.25L烧瓶装入4.92g 5-氟羟吲哚、7.0g咪唑酰胺、15.5g(R)-1-氨基-3-(4-吗啉基)-2-丙醇、9.78g三乙基胺和88ml四氢呋喃。将混合物于60℃下加热16.5小时。将反应物冷却至室温并过滤。将所得的固体在乙腈中以11ml/g连接成浆三次(3)，真空干燥得到3.6g(25.25％)。[HPLC，Hypersil BDS，C-18，5μ，(6∶4)，乙腈∶0.1M氯化铵，PHA-571437＝4.05分]。H1NMR(DMSO)：δ10.86(1H，bs)；7.75(1H，d)；7.70(1H，s)；7.50(1H，m)；6.88(2H，m)；4.72(1H，bs)；3.78(1H，bs)；3.56(4H，m)；3.32(6H，m)；3.15(1H，m)；2.43(8H，bm)。
实施例6-合成2，4-二甲基-5-[2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-1H-吡咯-3-甲酸(2-羟基-3-吗啉-4-基-丙基)-酰胺
将5-(2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸(113mg，0.4mmol)与1-氨基-3-吗啉-4-基-丙-2-醇(74mg，0.48mmol)缩合以沉淀2，4-二甲基-5-[2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-1H-吡咯-3-甲酸(2-羟基-3-吗啉-4-基-丙基)-酰胺(77mg，45.3％)。
1H NMR(DMSO-d6)δ2.27(m，1H)，2.32(m，1H)，2.40(m，4H)，2.40，2.42(2xs，6H，2xCH3)，3.15(s，1H)，3.32(m，1H)，3.55(m，4H)，3.77(m，1H)，4.74(d，J＝4.8Hz，1H，OH)，6.86(d，J＝7.6Hz，1H)，6.96(t，J＝7.2Hz，1H)，7.10(t，J＝7.6Hz，1H)，7.49(t，J＝5.6Hz，1H)，7.61(s，1H)，7.77(d，J＝8.0Hz，1H)(芳香和乙烯基)，10.88(s，1H，CONH)，13.62(s，1H，NH).LC-MS(m/z)425.4(M+1)。
实施例7-5-[5-氯-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基-甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸(2-羟基-3-吗啉-4-基-丙基)-酰胺(化合物7)的合成
将5-(5-氯-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸(126.6mg，0.4mmol)与1-氨基-3-吗啉-4-基-丙-2-醇(74mg，0.48mmol)缩合以沉淀5-[5-氯-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸(2-羟基-3-吗啉-4-基-丙基)-酰胺(107mg，58％)。
1H NMR(DMSO-d6)δ2.29(m，1H)，2.33(m，1H)，2.39(m，4H)，2.40，2.42(2xs，6H，2xCH3)，3.15(s，1H)，3.37(m，1H)，3.55(m，4H)，3.77(m，1H)，4.74(d，J＝4.8Hz，1H，OH)，6.85(d，J＝8.4Hz，1H)，7.11(dd，J＝2.0，8.0Hz，1H)，7.53(t，J＝5.6Hz，1H)，7.75(s，1H)，7.97(d，J＝2.0Hz，1H)(芳香和乙烯基)，10.99(s，1H，CONH)，13.62(s，1H，NH).LC-MS(m/z)457.4(M-1)。
实施例8-5-[5-溴-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基-甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸(2-羟基-3-吗啉-4-基-丙基)-酰胺的合成
将5-(5-溴-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸(72.2mg，0.2mmol)与1-氨基-3-吗啉-4-基-丙-2-醇(38mg，0.24mmol)缩合以沉淀5-[5-溴-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸(2-羟基-3-吗啉-4-基-丙基)-酰胺(55mg，55％)。1H NMR(DMSO-d6)δ2.27(m，1H)，2.32(m，1H)，2.39(m，4H)，2.41，2.42(2xs，6H，2xCH3)，3.13(s，1H)，3.35(m，1H)，3.55(m，4H)，3.77(m，1H)，4.74(d，J＝4.4Hz，1H，OH)，6.80(d，J＝8.4Hz，1H)，7.24(dd，J＝2.0，8.0Hz，1H)，7.51(t，J＝5.6Hz，1H)，7.76(s，1H)，8.09(d，J＝2.0Hz，1H)(芳香和乙烯基)，10.99(s，1H，CONH)，13.62(s，1H，NH).LC-MS(m/z)503.4(M-1)。
实施例9-2，4-二甲基-5-[2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基-甲基]-1H-吡咯-3-甲酸(2-羟基-3-[1，2，3]三唑-1-基-丙基)-酰胺的合成
步骤1
将在乙醇(50mL)中的3-[1，2，3]三唑(2.0g，29mmol)、表氯醇(3.4ml，43.5mmol)和N，N-二异丙基-乙基胺(2.6mL，15mmol)的混合物于室温下搅拌过夜。搅拌溶剂后，用快速色谱法(CH2Cl2/CH3OH＝100/1-100/2-100/4)纯化剩余物得到1-氯-3-(1，2，3)-三唑-2-基丙-2-醇(2.1g，45％)。1H NMR(CDCl3)δ3.52(m，2H，OH和CH2)，3.60(dd，J＝5.2，11.2Hz，1H)，4.36(m，1H，CH)，4.68(m，2H)，7.67(s，2H).MS(m/z)162.1(H+1)和1-氯-3-(1，2，3)三唑-1-基丙-2-醇(2.3g，49％).1H NMR(CDCl3)δ3.56(s，1H)，3.57(s，1H)，4.35(m，1H)，4.53(dd，J＝7.2，14Hz，1H)，4.67(dd，J＝3.8，14Hz，1H)，7.67(s，1H)，7.71(s，1H).MS(m/z)162.1(M+1)。
步骤2
60℃下在密封的加压容器中，用在甲醇(25wt％，20mL)中的NH3溶液将1-氯-3(1，2，3)三唑-1-基丙-2-醇(2.3g，13mmol)处理过夜。在冷却至室温之后，使氮冒泡进入反应混合物以除去氨。蒸发溶剂以得到1-氨基-3-(1，2，3)三唑-1-基丙-2-醇的盐酸盐(2.57g，100％)。
1H NMR(DMSO-d6)δ2.68(dd，J＝8.8，12.8Hz，1H)，2.97(dd，J＝3.6，12.8Hz，1H)，4.15(m，1H)，4.44(dd，J＝6.4，14Hz，1H)，4.57(dd，J＝4.6，14Hz，1H)，5.95(d，J＝5.2Hz，1H，OH)，7.77(s，1H)，8.01(brs.，3H，NH3+)，8.12(s，1H).MS(m/z)143.1(M+1)。
步骤3
将5-(2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸(113mg，0.4mmol)与1-氨基-3(1，2，3)三唑-1-基-丙-2-醇(85mg，0.48mmol)缩合以沉淀2，4-二甲基-5-[2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-1H-吡咯-3-甲酸(2-羟基-3-[1，2，3]三唑-1-基-丙基)-酰胺(70mg，41％)。
1H NMR(DMSO-d6)δ2.45，2.48(2xs，6H，2xCH3)，3.35(m，2H)，4.02(m，1H)，4.32(dd，J＝7.6，14Hz，1H)，4.53(dd，J＝3.4，14Hz，1H)，5.43(d，J＝5.6Hz，1H，OH)，6.91(d，J＝7.6Hz，1H)，7.01(t，J＝7.6Hz，1H)，7.15(t，J＝8.0Hz，1H)，7.66(s，1H)，7.12(t，J＝5.6Hz，1H)，7.74(s，1H)，7.77(d，J＝7.6Hz，1H)，8.11(s，1H)，10.93(s，1H，CONH)，13.68(s，1H，NH).LC-MS(m/z)405.4(M-1)。
实施例10-5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基-甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸(2-羟基-3-[1，2，3]三唑-1-基-丙基)-酰胺的合成
将5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸(120mg，0.4mmol)与1-氨基-3(1，2，3)三唑-1-基-丙-2-醇(85mg，0.48mmol)缩合以沉淀5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸(2-羟基-3-[1，2，3]三唑-1-基-丙基)-酰胺(100mg，62％)。
1H NMR(DMSO-d6)δ2.42，2.44(2xs，6H，2xCH3)，3.27(m，2H)，3.98(m，1H)，4.27(dd，J＝7.6，14Hz，1H)，4.50(dd，J＝3.4，13.6Hz，1H)，5.38(d，J＝5.6Hz，1H，OH)，6.82(dd，J＝4.4，8.4Hz，1H)，6.91(td，2J＝2.4，3J＝9.0Hz，1H)，7.70(m，3H)，7.75(dd，J＝2.4，9.2Hz，1H)，8.11(s.1H)，10.93(s，1H，CONH)，13.73(s，1H，NH).LC-MS(m/z)423.4(M-1)。
实施例11-5-[5-氯-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基-甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸(2-羟基-3-[1，2，3]三唑-1-基-丙基)-酰胺的合成
将5-(5-氯-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸(126.6mg，0.4mmol)与1-氨基-3(1，2，3)三唑-1-基-丙-2-醇(85mg，0.48mmol)缩合以沉淀5-[5-氯-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸(2-羟基-3-[1，2，3]三唑-1-基-丙基)-酰胺(48mg，27％)。
1H NMR(DMSO-d6)δ2.42，2.44(2xs，6H，2xCH3)，3.27(m，2H)，3.99(m，1H)，4.28(dd，J＝7.8，14Hz，1H)，4.51(dd，J＝3.2，14Hz，1H)，5.39(d，J＝6.0Hz，1H，OH)，6.85(d，J＝8.4Hz，1H)，7.12(dd，J＝2.0，8.2Hz，1H)，7.70(m，2H)，7.74(s，1H)，7.97(d，J＝2.0Hz，1H)，8.07(s，1H)，10.99(s，1H，CONH)，13.65(s，1H，NH).LC-MS(m/z)439.4(M-1)。
实施例12-5-[5-溴-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基-甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸(2-羟基-3-[1，2，3]三唑-1-基-丙基)-酰胺的合成
将5-(5-溴-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸(144.4mg，0.4mmol)与1-氨基-3(1，2，3)三唑-1-基-丙-2-醇(85mg，0.48mmol)缩合以沉淀5-[5-溴-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸(2-羟基-3-[1，2，3]三唑-1-基-丙基)-酰胺(130mg，67％)。
1H NMR(DMSO-d6)δ2.41，2.44(2xs，6H，2xCH3)，3.27(m，2H)，3.99(m，1H)，4.28(dd，J＝7.6，14Hz，1H)，4.50(dd，J＝3.6，14Hz，1H)，5.40(d，J＝5.6Hz，1H，OH)，6.81(d，J＝8.4Hz，1H)，7.24(dd，J＝2.0，8.0Hz，1H)，7.70(m，2H)，7.77(s，1H)，8.07(s.1H)，8.10(d，J＝1.6Hz，1H)，11.0(s，1H，CONH)，13.64(s，1H，NH).LC-MS(m/z)485.4(M-1)。
实施例13-5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸(2-二乙基氨基-乙基)酰胺(化合物1)的合成
将5-氟-1，3-二氢吲哚-2-酮(0.54g，3.8mmol)与5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸(2-二乙基氨基乙基)酰胺缩合以得到0.83g(55％)标题化合物，为一种黄绿色固体。
可替代选择地合成5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸(2-二乙基氨基-乙基)酰胺
将水合肼(55％，3000mL)和5-氟-靛红(300g)加热至100℃。20分钟内分部分(100g)加入额外的5-氟-靛红(500g)并进行搅拌。将混合物加热至110℃，并搅拌4小时。将混合物冷却至室温，并通过真空过滤收集固体，以得到粗(2-氨基-5-氟-苯基)-乙酸酰肼(748g)。将该酰肼悬浮在水(700mL)中，并用12N盐酸调节混合物的pH至＜pH3。将该混合物于室温下搅拌12小时。通过真空过滤收集固体，并用水洗涤两次。将产物真空干燥以得到5-氟-1，3-二氢-吲哚-2-酮(600g，73％产率)，为一种褐色粉末。1H-NMR(二甲亚砜-d6)δ3.46(s，2H，CH2)，6.75，6.95，7.05(3xm，3H，芳香)，10.35(s，1H，NH).MS m/z152[M+1]。
将3，5-二甲基-1H-吡咯-2，4-二甲酸2-叔丁酯4-乙酯(2600g)和乙醇(7800mL)剧烈搅拌，同时缓慢加入10N盐酸(3650mL)。温度从25℃升至35℃，并开始产生气体。将混合物加热至54℃，并进一步搅拌加热1小时，此时温度为67℃。将混合物冷却至5℃，并缓慢地搅拌加入32L冰和水。用真空过滤法收集固体，并用水洗涤三次。将固体风干至恒重得到2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸乙酯(1418g，87％产率)，为一种粉色固体。1H-NMR(二甲亚砜-d6)δ2.10，2.35(2xs，2x3H，2xCH3)，4.13(q，2H，CH2)，6.37(s，1H，CH)，10.85(s，1H，NH).MS m/z 167[M+1]。
在冰浴中将二甲基甲酰胺(322g)和二氯甲烷(3700mL)冷却至4℃，并搅拌加入氯化氧磷(684g)。15分钟内以等分试样缓慢加入固体2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸乙酯(670g)。最大温度达到18℃。将混合物加热回流1小时，在冰浴中冷却至10℃，快速加入冰水并剧烈搅拌。将温度升到15℃。加入10N盐酸(1.6L)并剧烈搅拌。将温度升至22℃。使混合物静置30分钟，并进行分层。温度达到最大值40℃。用10N氢氧化钾(3.8L)以允许温度在加入期间达到并保持55℃的速率将水层调节至pH 12-13。加入完成后将混合物冷却至10℃，并搅拌1小时。用真空过滤法收集固体，并用水洗涤4次，以得到5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸乙酯(778g，100％产率)，为一种黄色固体。1H-NMR(DMSO-d6)δ1.25(t，3H，CH3)，2.44，2.48(2xs，2x3H，2xCH3)，4.16(q，2H，CH2)，9.59(s，1H，CHO)，12.15(br s，1H，NH).MS m/z 195[M+1]。
将5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸乙酯(806g)、氢氧化钾(548g)、水(2400mL)和甲醇(300mL)搅拌回流2小时，然后冷却至8℃。用二氯甲烷将混合物萃取二次。用1000mL 10N盐酸将水层调节至pH 4，保持温度低于15℃。加入水以有利于搅拌。通过真空过滤收集固体，用水洗涤三次，并在真空和50℃下干燥得到5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸(645g，93.5％产率)，为一种黄色固体。1H-NMR(DMSO-d6)δ2.40，2.43(2xs，2x3H，2xCH3)，9.57(s，1H，CHO)，12.07(br s，2H，NH+COOH).MS m/z 168[M+1]。
将5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸(1204g)和6020mL二甲基甲酰胺于室温下搅拌，并加入1-(3-二甲基-氨基丙基-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(2071g)、羟基苯并三唑(1460g)、三乙基胺(2016mL)和二乙基乙二胺(1215mL)。将混合物在室温下搅拌20小时。用3000mL水、2000mL盐水和3000mL饱和碳酸氢钠溶液稀释混合物，并用10N氢氧化钠调节pH至大于10。每次用5000mL在二氯甲烷中的10％甲醇萃取混合物二次，并合并萃取物，用无水硫酸镁干燥，并旋转蒸发至干。用1950mL甲苯稀释混合物，并再次旋转蒸发至干。将剩余物与3∶1己烷∶乙醚(4000mL)一起研磨。用真空过滤法收集固体，用400mL乙酸乙酯洗涤两次，并在真空和34℃下干燥21小时以得到5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸(2-二乙基氨基-乙基)-酰胺(819g，43％产率)，为一种浅褐色固体。1H-NMR(二甲亚砜-d6)δ0.96(t，6H，2xCH3)，2.31，2.38(2xs，2xCH3)，2.51(m，6H 3xCH2)，3.28(m，2H，CH2)，7.34(m，1H，酰胺NH)，9.56(s，1H，CHO)，11.86(s，1H，吡咯NH).MS m/z 266[M+1]。
将5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸(2-二乙基氨基乙基)-酰胺(809g)、5-氟-1，3-二氢-吲哚-2-酮(438g)、乙醇(8000mL)和吡咯烷(13mL)在78℃下加热3小时。将混合物冷却至室温，通过真空过滤法收集固体，并用乙醇洗涤。将固体与乙醇(5900mL)在72℃下一起搅拌30分钟。将混合物冷却至室温。通过真空过滤法收集固体，用乙醇洗涤，并在真空和54℃下干燥130小时以得到5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸(2-二乙基氨基-乙基)-酰胺(1013g，88％产率)，为一种橙色固体。
1H-NMR(二甲亚砜-d6)δ0.98(t，6H，2xCH3)，2.43，2.44(2xs，6H，2xCH3)，2.50(m，6H，3xCH2)，3.28(q，2H，CH2)，6.84，6.92，7.42，7.71，7.50(5xm，5H，芳香，乙烯基，CONH)，10.88(s，1H，CONH)，13.68(s，1H，吡咯NH).MS m/z 397[M-1]。
5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸(2-二乙基氨基-乙基)酰胺的马来酸盐可以根据2002年8月13日提交的美国专利申请10/281,985的内容来制备，该专利要求2001年8月15日提交的美国专利临时申请60/312,353的优先权，所述专利在此被引用以供参考。
在2001年2月14日提交的，标题为″PYRROLE SUBSTITUTED2-INDOLINONE--PROTEIN KINASE INHIBITORS″的申请09/783,264中描述了5-(5-溴-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸、5-(5-氯-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸、5-(2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸的合成，所述文献的内容在此被全文引用。
实施例14-5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸(2-吡咯烷-1-基-乙基)-酰胺(化合物2)的合成
将5-氟-1，3-二氢-吲哚啉-2-酮与5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸(2-吡咯烷-1-基-乙基)-酰胺缩合得到标题化合物。
MS+ve APCI 397[M+1]。
实施例15-5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸(2-乙基氨基-乙基)-酰胺(化合物8)的合成
将5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸(2-乙基氨基-乙基)-酰胺(99g)、乙醇(400ml)、5-氟-2-羟吲哚(32g)和吡咯烷(1.5g)回流搅拌3小时。将混合物冷却至室温，并通过真空过滤法收集固体。将固体在乙醇中于60℃下搅拌，冷却至室温，并用真空过滤法收集。将产物在真空下干燥得到5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸(2-乙基氨基-乙基)-酰胺(75g，95％产率)。1H-NMR(二甲亚砜-d6)δ1.03(t，3H，CH3)，2.42，2.44(2xs，6H，2xCH3)，2.56(q，2H，CH2)，2.70，3.30(2xt，4H，2xCH2)，6.85，6.92，7.58，7.72，7.76(5xm，5H，芳香，乙烯基，和CONH)，10.90(br s，1H，CONH)，13.65(br s，1H，吡咯NH)。
MS m/z 369[M-1]。
实施例16-5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸(2-吗啉-4-基-乙基)-酰胺(化合物3)的合成
将5-氟-1，3-二氢-吲哚-2-酮与5-甲酰基-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸(2-吗啉-1-基-乙基)-酰胺缩合得到标题化合物。
生物学实施例
实施例17-5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸(2-二乙基氨基-乙基)-酰胺(化合物1)抑制CSF4R的磷酸化
使3T3-huCSF1R细胞饥饿过夜(RPMI 1640/0.1％ FBS)，然后悬浮在含有0.1％FBS±化合物1的新鲜的RPMI 1640中，每种条件下在6孔平板中使用2000万个细胞。将细胞与化合物1一起在37℃下处理2小时，然后用100ng/ml的人M-CSF(R & D Systems，Minneapolis，MN)刺激10分钟。刺激后立即溶解细胞，并在4℃下将溶解产物旋转20分钟。
将上清液移至新的微夏普列斯超速离心管。对于每个样品，使500μg的总蛋白与兔多克隆抗体发生免疫沉淀反应成为与珠偶合的人CSF1R(Santa Cruz Biotechnology，CA)。然后进行p-CSF1R Western印迹法，使用以1∶1000稀释的抗-二氧磷基-CSF1R(Tyr723)抗体(CellSignaling Technology，Beverly，MA)。肌动蛋白的抗体用作总蛋白对照，因CSF1R的抗体不能良好地认别p-CSFIR。
图1所示的结果表明，化合物1以剂量依赖的方式抑制CSF1R磷酸化。阳性对照泳道表明缺乏抑制，M-CSF刺激CSF1R磷酸化。但是，随着化合物1的剂量增加，CSF1R磷酸化降低。用NIH3T3细胞表达时化合物1对CSF1R抑制作用的IC50的50-100nM。
实施例18-5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸(2-二乙基氨基-乙基)-酰胺(化合物1)在体外抑制鼠破骨细胞形成
从雌性Balb/c小鼠上分离骨髓细胞，并在培养基中单独或加入10ng/ml鼠M-CSF和100ng/ml鼠RANK配体(RANKL)从第0天开始培养以诱导破骨细胞形成。向含有细胞因子的培养物中加入不同浓度的化合物1，浓度为1nM-10μM。在第7天通过比色定量酒石酸盐抗酸磷酸酶活性(TRAP)并对＞3个核的TRAP阳性细胞进行计数来评价破骨细胞形成。如图2a所示，10-100nM浓度的化合物1抑制破骨细胞的形成。
进行类似的研究，在第0天加入细胞因子，但改变化合物1的加入时间(D0、D2或D4)。在第6天进行TRAP染色和定性。此研究表明作用机理是抑制M-CSF作用(早期形成)，而不是RANKL作用(后期形成)。图2b总结数据，表明在100nM和10nM的浓度下，前体细胞与化合物1接触越晚，化合物表现出的抑制作用越小。
实施例19-5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸(2-二乙基氨基-乙基)-酰胺(化合物1)在体内抑制癌生长
使用MDA-MB-435-HAL-1uc乳腺癌异种移植物模型以确认乳腺癌骨转移生长有明显的抑制。通过生物发光法，用Xenogen IVISTM系统成像来监测活的肿瘤细胞的存在。用化合物1处理小鼠表明活的肿瘤明显减少。
细胞系
获得人乳腺癌细胞系435/HAL(Pharmacia Corp.，St，Louis，MO)。用体内筛选法分离细胞系以鉴定表现出原发性肿瘤生长速率增加和体内肺转移增加的MDA-MB-435人乳腺癌细胞系的衍生物(30)。然后用荧光素酶稳定转染435/HAL细胞(荧火虫Photinus pyralis的光发射酶)。用1∶4比率的pGL3-对照(Promega，Madison，WI)和pTK-Hygro(Clontech，Palo Alto，CA)，使用Lipofectamine2000(Invitrogen，Carlsbad，CA)转染细胞。将细胞保持在Hygromycin(200μg/ml)(Invitrogen)中，并通过环克隆来分离有抵抗力的群体。筛选抵抗Hygro的菌落以用于使用Promega brite-glo试剂进行荧光素酶表达，归一化为RLU/μg蛋白。选择具有最高荧光素酶活性的亚克隆，我们称之为′435/HAL-luc.′
将这些细胞在补充10％牛胎血清、2mM谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠(Life Technologies Inc.，Gaithersburg，MD)的RPMI 1640中培养，并常规地保持在37℃和5％二氧化碳下的加湿室内。在指数生长期间从培养烧瓶中收集细胞，用无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤一次，计数，并再悬浮在PBS中，至移植前达适宜的浓度。
小鼠
获得雌性无胸腺nu/nu小鼠(Charles River Laboratories，Wilmington，MA)。在不含病原体的条件下在微隔离笼中笼养小鼠，并随意获取无菌啮齿动物固型食物和水。在AAALAC，国际公认的动物园中根据关于实验动物的护理和使用的实验动物研究指导协会(National Institutes of Health，Bethesda，MD)来进行异种移植动物研究。当小鼠大约为8周龄时通过左心室移植细胞以评价骨生长，在10-11周龄时将肿瘤块移植至#2哺乳动物脂肪垫以评价常位生长。
在小鼠中使用IVIS
TM
成像系统进行乳腺癌检测
用150mg/kg荧光素(Xenogen Corp.，Alameda，CA)腹膜内注射小鼠，然后在5分钟后用氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉。再过5分钟后，用在Xenogen IVISTM成像系统(Xenogen Corp.)中的强化电偶装置(ICCD)照相机将小鼠成像以评价小鼠体内癌的生物发光。简言之，将小鼠置于温控的成像室的床上，并捕捉小鼠腹侧的灰度等级全体图，然后进行代表在表达荧光素酶的癌细胞的裂解萤光素上检测到的光子的空间分布的生物发光图的覆盖。在第46天对小鼠的背侧进行最后照像以监测脊髓内肿瘤的生长。通过计算各个光子发射部位周围所画的区域的像素来对生物发光信号进行定量，使用专门版本的IGOR Pro version4.0软件(WaveMetrics，Inc.，Lake Oswego，OR)，该软件称为LivingImage version 2.11(Xenogen Corporation，Alameda，CA)。测定在含有完全癌损伤的感兴趣的区域内所有检测的光子总数。为评价肿瘤生长抑制作用，使用Student′s t检验来评价处理组和对照组之间的光发射读数(p＜0.05被认为是显著的)。
实施例20-5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-亚基甲基)-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸(2-二乙基氨基-乙基)-酰胺(化合物1)在体内抑制由乳腺癌转移诱导的骨质溶解
实验性骨转移模型中的化合物1处理
在第0天将3×106 435/HAL-luc细胞接种至无胸腺小鼠的左心室。20天后，用IVISTM成像系统将小鼠成像，并根据癌的生物发光的度量即光发射，将其置于16只小鼠的两个配对的组。第二天，用管饲法给在骨内带有确定的435/HAL-luc肿瘤的小鼠施用80或40mg/kg化合物1或CMC赋形剂，每天一次，直至研究结束(21天)。小鼠大约每周成像一次。在移植后41天时，对照组的小鼠恶化，并表现出触发研究结束的后肢瘫痪症状。从用化合物1或它的赋形剂处理的小鼠中收集股骨、下颌骨和脊骨，并固定在Streck′s Tissue Fixative中，然后进行骨密度扫描和组织学分析。还收集血清以测定循环中的胶原分解产物吡啶诺林(pyridinoline)(PYD)。
化合物1抑制435/HAL-luc骨转移的生长
此实验证明化合物1可以显著抑制乳腺癌在骨内转移的生长。在治疗期间，获得腹侧生长发光全体图以分析长骨和下颌骨中的肿瘤生长。化合物1大大降低两种剂量下的来自小鼠骨的光子数发射(图3)。来自胸腔区的光子发射可能是在心内注射时沉积在心包或胸腔内的肿瘤细胞导致的。在结束前，还给腹部和背照相以分析脊骨转移。分别分析在不同部位捕获肿瘤生长的感兴趣的区域(ROI)。关于来自长骨(股骨和胫骨)和下颌骨的光子发射随时间变化的组合数据如图3所示。骨中的肿瘤生长受化合物1显著抑制(第41天：89％抑制，p＝0.001)。
血清PYD ELISA：亲本乳腺癌细胞系MDA-MB-435非常良好地表征为具有溶骨活性(32)。测定胶原分解产物吡啶诺林(PYD)的血清水平是一种确定的溶骨活性试验，该活性与大鼠模型中的骨转移瘤体积明显有关(29，31，33)。收集血清样品，等分试样处理，并在-80℃下冷冻至分析。使用竞争性酶免疫试验试剂盒，根据制造商的方案(Serum PYD，Quidel 8019，San Diego，CA)来测定血清PYD。重复测定样品。来自12只赋形剂处理和14只化合物1处理的小鼠的结果表明与赋形剂处理的小鼠相比，接受化合物1处理小鼠的血清PYD水平明显降低30％(p＝0.047)。赋形剂处理小鼠的平均值为1.8+/-0.21ng/ml，而用80mg/kg化合物1处理的小鼠的平均值为1.3+/-0.16ng/ml。
图4表示用于此实验的数据点的分布。
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本领域技术人员显然知道可以在不背离本发明的构思和范围的情况下对本发明的方法和组合物作多种修改和改变。本发明意在覆盖这些修改和改变，条件是它们处在所附的权利要求及其等同的范围内。
参考资料
本文引用上面引述的各篇以下的参考资料的内容以供参考。
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Claims (15)
1.一种治疗患者的过度骨质溶解的方法，所述方法包括给所述患者施用有效量的式I的化合物或其盐：
其中
R独立地为H、OH、烷基、芳基、环烷基、杂芳基、烷氧基、杂环和氨基；
各个R1独立地选自烷基、卤素、芳基、烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基、环烷基、杂芳基、杂环、羟基、-C(O)-R8、-NR9R10、-NR9C(O)-R12和-C(O)NR9R10；
各个R2独立地选自烷基、芳基、杂芳基、-C(O)-R8和SO2R″，其中R″为烷基、芳基、杂芳基、NR9N10或烷氧基；
各个R5独立地选自氢、烷基、芳基、卤代烷基、环烷基、杂芳基、杂环、羟基、-C(O)-R8和(CHR)rR11；
X为O或S；
p为0-3；
q为0-2；
r为0-3；
R8选自-OH、烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、环烷基和杂环；
R9和R10独立地选自H、烷基、芳基、氨基烷基、杂芳基、环烷基和杂环，或者R9和R10可以与氮一起形成环，其中环原子选自C、N、O和S；
R11选自-OH、氨基、一取代的氨基、二取代的氨基、烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、环烷基和杂环；
R12选自烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、环烷基和杂环；
Z为OH、O-烷基或-NR3R4，其中R3和R4独立地选自氢、烷基、芳基、杂芳基、环烷基和杂环，或者R3和R4可以与N一起形成环，其中环原子选自CH2、N、O和S或
其中Y独立地为CH2、O、N或S，
Q为C或N；
n独立地为0-4；和
m为0-3。
2.权利要求1的方法，其中R1为卤素，而p为1。
3.权利要求2的方法，其中Z为-NR3R4，其中R3和R4形成吗啉环。
4.权利要求1的方法，其中Z为：
其中各个Y为CH2，各个n为2，m为0，而R3和R4形成吗啉环。
5.权利要求1-3之任一项的方法，其中R2为甲基，而q为2，其中甲基结合在3位和5位。
6.权利要求1的方法，其中施用的化合物为式II的化合物：
7.权利要求6的方法，其中R5为H。
8.权利要求6的方法，其中R2为甲基，q为2，其中甲基结合在3位和5位。
9.权利要求6的方法，其中患者患有已经转移到骨的癌症。
10.权利要求6的方法，其中患者患有分泌M-CSF的癌症。
11.权利要求6的方法，其中患者患有骨质疏松症。
12.权利要求6的方法，其中患者为绝经后的。
13.权利要求1的方法，其中施用的化合物选自
14.权利要求1的方法，其中式I的化合物选自：
化合物6 化合物7
化合物4 化合物9
和
化合物5
15.一种抑制需要抑制的患者的CSF1R磷酸化的方法，所述方法包括给所述患者施用抑制量的式I的化合物：
其中
R独立地为H、OH、烷基、芳基、环烷基、杂芳基、烷氧基、杂环和氨基；
各个R1独立地选自烷基、卤素、芳基、烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基、环烷基、杂芳基、杂环、羟基、-C(O)-R8、-NR9R10、-NR9C(O)-R12和-C(O)NR9R10；
各个R2独立地选自烷基、芳基、杂芳基、-C(O)-R8和SO2R″，其中R″为烷基、芳基、杂芳基、NR9N10或烷氧基；
各个R5独立地选自氢、烷基、芳基、卤代烷基、环烷基、杂芳基、杂环、羟基、-C(O)-R8和(CHR)rR11；
X为O或S；
p为0-3；
q为0-2；
r为0-3；
R8选自-OH、烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、环烷基和杂环；
R9和R10独立地选自H、烷基、芳基、氨基烷基、杂芳基、环烷基和杂环，或者R9和R10可以与氮一起形成环，其中环原子选自C、N、O和S；
R11选自-OH、氨基、一取代的氨基、二取代的氨基、烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、环烷基和杂环；
R12选自烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、环烷基和杂环；
Z为OH、O-烷基或-NR3R4，其中R3和R4独立地选自氢、烷基、芳基、杂芳基、环烷基和杂环，或者R3和R4可以与N一起形成环，所述环原子选自CH2、N、O和S，或形成
其中Y独立地为CH2、O、N或S，
Q为C或N，
n独立地为0-4；和
m为0-3。
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