CN1747749A - 具有mmp抑制活性的诊断造影剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及诊断成像领域。具体来说,本发明涉及其中已知涉及特定基质金属蛋白酶的疾病的诊断成像。本发明的一个实施方案是具有基质金属蛋白酶抑制剂活性的适于诊断成像的化合物。本发明还公开了包含本发明诊断造影剂的适于哺乳动物给药形式的药物组合物。本发明还公开了在本发明诊断造影剂的合成中的中间体,以及用于制备本发明药物组合物的药盒。本发明药物组合物可用于已知涉及特定基质金属蛋白酶的疾病的诊断。
Description
发明领域
本发明涉及体内诊断造影,特别是SPECT造影领域。具体来说,本发明涉及包含基质金属蛋白酶抑制剂的新造影剂,所述新造影剂可用于心血管疾病、炎性疾病和恶性疾病的体内诊断造影。
相关领域的描述
基质金属蛋白酶(MMP)是由至少20种锌依赖内肽酶组成的家族,这些内肽酶介导细胞外基质(ECM)的降解或重建[Massova等人,FASEB J(1998)
12 1075-95]。MMP家族的成员可一起降解血管的所有组分,因此在涉及ECM组分降解的生理和病理事件中起主要作用。因为MMP可干扰控制细胞行为的细胞-基质相互作用,所以它们的活性影响细胞分化、迁移、增殖和凋亡等多种不同过程[Nagase和WoessnerJ.Biol.Chem.(1999)
274 21491-4]。精细地调控生理状况中MMP活性的负调控并不总是起它们所应当行使的功能。据信,在几种病症中,MMP活性的不适当表达构成了病理机制的一部分。因此,在很多炎性、恶性和变性疾病中,MMP成为治疗抑制剂的靶目标[Whittaker等人,Chem.Rev.(1999)
99 2735-76]。
因此,据信MMP的合成抑制剂可用于治疗很多炎性、恶性和变性疾病。此外,已经有人提出MMP抑制剂可用于诊断这些疾病。WO01/60416公开了可用于诊断与细胞外基质降解有关的心血管病变例如动脉粥样硬化、心力衰竭和再狭窄的化合物。上述专利所公开的化合物包括MMP抑制剂,所述MMP抑制剂通过任选的连接基团与能够缀合诊断金属的螯合剂理解。其中描述了优选的MMP抑制剂、螯合剂和连接基团。Zheng等人的报道[Nuc.Med.Biol.29761-770(2002)]描述了用正电子成像(PET)示踪剂11C和16F标记的MMP抑制剂的合成。其中所描述的化合物据述可用于乳腺癌的非侵入性成像。
发明概述
本申请公开了已发现可特别用于诊断成像的具有MMP抑制活性的新的造影剂。本发明的另一个方面是可用于人体诊断成像的药物组合物。还公开了用于制备本发明药物组合物的药盒。此外,本发明包括本发明药物组合物在诊断造影中的应用。
本发明的造影剂可用于已知涉及特定基质金属蛋白酶的多种病症(炎性、恶性和变性疾病)的体内诊断成像。这些病症包括:
(a)动脉粥样硬化,其中各种MMP过度表达。已经在人动脉粥样硬化斑中检测到了最高水平的MMP-1、3、7、9、11、12、13和MT1-MMP[S.J.George,Exp.Opin.Invest.Drugs,9(5),993-1007(2000)以及其中的参考文献]。还已经报道了在人粥样斑中MMP-2的表达[Z.Li等人,Am.J.Pathol.,148,121-128(1996)]和MMP-8的表达[M.P.Herman等人,Circulation,104,1899-1904(2001)];
(b)CHF(Peterson,J.T.等人,用于治疗心力衰竭的基质金属蛋白酶的开发,Drug Dev.Res.(2002),55(1),29-44报道,MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-8、MMP-9、MMP-13和MMP-14在心力衰竭中上调);
(c)癌症[Vihinen等人,Int.J.Cancer 99,pu57-186(2002)总结了MMP参与癌症,尤其强调了MMP-2、MMP-3、MMP-7和MMP-9];
(d)关节炎[Jacson等人,Inflamm.Res.50(4),p183-186(2001)“在靶向明胶酶A激活的类风湿性关节炎中选择性基质金属蛋白酶抑制”,特别讨论了MMP-2];
(e)肌萎缩性侧索硬化[Lim等人,J.Neurochem,67,251-259(1996);其中涉及MMP-2和MMP-9];
(f)脑转移瘤,据报道其中涉及MMP-2、MMP-9和MMP-13[Spinale,Circul.Res.,90,520-530(2002)];
(g)脑血管疾病,据报道其中涉及MMP-2和MMP-9[Lukes等人,Mol.Neurobiol.,19,267-284(1999)];
(h)阿尔茨海默氏病,已经在患病组织中鉴定出来MMP-2和MMP-9[Backstrom等人,J.Neurochem.,58,983-992(1992)];
(i)神经炎性疾病,其中涉及MMP-2、MMP-3和MMP-9[Mun-Bryce等人,Brain.Res.,933,42-49(2002)];
(j)COPD(即慢性阻塞性肺病),据报道其中MMP-1、MMP-2、MMP-8和MMP-9上调[Segura-Valdez等人,Chest,117,684-694(2000)];
(k)眼睛病变[Kurpakus-Wheateret等人,Prog.Histo.Cytochem.,36(3),179-259(2001)];
(l)皮肤疾病[Herouy,Y.,Int.J.Mol.Med.,7(1),3-12(2001)]。
发明详述
本发明的第一个方面是诊断造影剂,所述造影剂包含用γ-发射放射性核素标记的式I所示基质金属蛋白酶抑制剂的诊断造影剂:
R1选自氢、羟基、C1-6烷基、C6-14芳基、C7-20芳基烷基,或者与R5及其所连接的碳一起形成C6-8环烷基环或C4-6杂环基环,或者与R4一起形成含有5-7个原子和1或2个选自N或O的杂原子的C4-6杂环基环;
R2和R3独立地为氢、羟基、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6氨基、C6-14芳基、C7-20芳基烷基或C7-20氨基甲酰基芳基;
R4是C6-14芳基、C4-6杂芳基、C7-20芳基烷基、C7-20氨基甲酰基芳基或芳基氨基甲酰基芳基;且
R5选自氢或C1-6烷基,
条件是:当R1是异丙基,R3是氢,且R4是3-吡啶基时,则R2不是甲氧基。
单独使用或者作为另一基团(例如羟基烷基、氨基烷基、羧基烷基或烷氧基烷基)的一部分使用的“烷基”在本文中定义为任何直链、支链或环状饱和或不饱和的CxH2x+1基团,其中除非另有说明,否则x是1-6的整数。
单独使用或者作为另一基团的一部分使用的“芳基”在本文中定义为衍生自单环或多环芳烃的任何C6-14分子片段或基团。在本发明中,合适的芳基是任选在任何位置被取代的苯基或萘基。
“芳基烷基”在本文中定义为由如上所定义的烷基和芳基构成的任何C7-20基团。
“杂芳基环”在本发明中定义为包含1或2个杂原子的C6-14环状基团。合适的杂原子包括N和O。
术语“卤素”是指选自氟、氯、溴和碘的基团。
“胺”在本发明中定义为含有氨基或取代的氨基的任何有机基团。
本文所用的词语“用γ-发射放射性核素标记的”是指式I的一个原子或取代基包含γ-发射放射性核素,所述γ-发射放射性核素作为人工富含水平的该结构内在的原子,或者作为已经通过适于偶联所述γ-发射放射性核素的官能团化学连接的另外的必需特征。
优选的本发明诊断造影剂包含用γ-发射放射性核素标记的式I化合物,其中:
R1选自C1-6烷基、C6-14芳基或C7-20芳基烷基,或者与R5及其所连接的碳一起形成C4-6杂环基环;
R2是氢、羟基、甲基、异丙基、甲氧基或卤素;
R3是氢;
R4是吡啶基或(Ar1)y-(R)z(NH)-苯基,其中Ar1是亚苯基,R是CH2或C=O,y=0或1,且z=0或1;且
R5是氢,
条件是:当R1是异丙基,且R4是3-吡啶基时,则R2不是甲氧基。
最优选的本发明诊断造影剂包含用γ-发射放射性核素标记的式I化合物,其中:
R1是甲基、异丁基、异丙基、苄基或羟基苄基;
R2是羟基、卤素或甲氧基;
R3是氢;
R4是吡啶基或(Ar1)y-(R)z(NH)-苯基,其中Ar1是1,4-亚苯基,R是CH2或C=O,y=0或1,且z=0或1;且
R5是氢,
条件是:当R1是异丙基,且R4是3-吡啶基时,则R2不是甲氧基。
当R5是氢时,本发明的基质金属蛋白酶抑制剂包括在携带R1基团的碳原子上的手性中心。该手性中心的对映体在本发明的范围内,优选的对映体是式Ia所示对映体:
尤其优选的本发明诊断造影剂包含式I化合物,其中所述γ-发射放射性核素替代或者化学连接一个或多个R1-R4取代基。最尤其优选的本发明诊断造影剂包含式I化合物,其中R2在磺酰胺的对位,且R3在磺酰胺的间位。
未用γ-发射体标记的式I化合物可根据MacPherson等人,J.Med.Chem.1997;2525-32中描述的方法容易地合成。
合适的本发明γ-发射放射性核素是γ-发射金属离子或γ-发射放射性卤素。在下文中,包括在优选和最优选的实施方案中对此进行更详细描述。
当本发明γ-发射放射性核素是金属离子时,其适当地选自99mTc、111In、113mIn、67Cu或67Ga。优选的γ-发射金属离子是99mTc、67Cu、67Ga和111In,其中99mTc是最优选的。金属离子适当地以金属络合物的形式存在于本发明的诊断造影剂中,这样诊断造影剂是式II所示的金属络合缀合物:
[{基质金属蛋白酶抑制剂}-(A)n]m-[金属络合物] (II)其中:-(A)n-是连接基团,n是0-50的整数,且m是1、2或3。
术语“金属络合物”是指金属离子与一个或多个配体的配位络合物。非常优选地,所述金属络合物是“抗转螯合的”,即金属络合物不易于在金属配位位点与其它潜在竞争性配体发生配体交换。潜在竞争性配体包括体外式I化合物与制剂中的其它赋形剂(例如制剂中使用的辐射防护剂或抗微生物防腐剂)或体内的内源性化合物(例如谷胱甘肽、转铁蛋白或血浆蛋白)。术语“连接基团”(A)n如下文关于式IIa所定义。
本发明的第二个方面是配体缀合物,可以将其进行放射标记以形成式II所示金属络合物缀合物。优选的本发明配体缀合物是式IIa所示的缀合物:
[{基质金属蛋白酶抑制剂}-(A)n]m-[配体] (IIa)
其中:-(A)n-是连接基团,其中每个A独立地为CR’2、CR’=CR’、C≡C、CH2CH2O、CR’2CO2、CO2CR’2、NR’CO、CONR’、NR’(C=O)NR’、NR’(C=S)NR’、SO2NR’、NR’SO2、CR’2OCR’2、CR’2SCR’2、CR’2NRCR’2、C4-8亚环杂烷基、C4-8亚环烷基、C5-12亚芳基或C3-12亚杂芳基;
R’独立地选自H、C1-4烷基、C2-4链烯基、C2-4炔基、C1-4烷氧基烷基或C1-4羟基烷基;
n是0-50的整数;且
m是1、2或3。
在式II和IIa中,m优选为1或2,最优选为1。
适于在本发明中形成抗转螯合的金属络合物缀合物的配体包括:螯合剂,其中排列2-6个,优选2-4个金属配位原子,以形成5或6元螯合剂环(通过具有碳原子的非配位骨架或连接金属配位原子的非配位杂原子);或单齿配体,其包含能够与金属离子强结合的配位原子,例如异腈、膦或diazenide。作为螯合剂一部分与金属良好结合的配位原子类型的实例是:胺、硫醇、酰胺、肟和膦。膦形成这样的强的金属络合物,甚至单齿或二齿膦形成合适的金属络合物。异腈和diazenide的线形几何学是这样的,它们自身不有助于掺入到螯合剂内,并因此常用作单齿配体。合适的异腈的实例包括简单的烷基异腈例如叔丁基异腈和醚取代的异腈例如MIBI(即1-异氰基-2-甲氧基-2-甲基丙烷)。合适的膦的实例包括Tetrofosmin和单齿膦例如三(3-甲氧基丙基)膦。合适的diazenide的实例包括HYNIC系列的配体,即肼取代的吡啶或烟酰胺类。
对于锝,适于形成抗转螯合的金属络合物的螯合剂的实例包括但不限于:
(i)式III所示的二胺二肟:
其中E1-E6分别独立地为R”基团;
每个R”为H或C1-10烷基、C3-10烷基芳基、C2-10烷氧基烷基、C1-10羟基烷基、C1-10氟烷基、C2-10羧基烷基或C1-10氨基烷基,或者两个或多R”基团与它们所连接的原子一起形成碳环、杂环、饱和或不饱和环,并且其中一个或多个R”基团与式I化合物缀合;且
Q是式-(J)f-所示桥连基团;
其中f是3、4或5,并且每个J独立地为-O-、-NR”-或-C(R”)r,条件是-(J)f-含有最多一个是-O-或-NR”-的J基团。
优选的Q基团如下:
Q=-(CH2)(CHR”)(CH2)-,即亚丙基胺肟或PnAO衍生物;
Q=-(CH2)2(CHR”)(CH2)2-,即亚戊基胺肟或PentAO衍生物;
Q=-(CH2)2NR”(CH2)2-。
E1-E6优选选自:C1-3烷基、C4-10烷基芳基、C2-3烷氧基烷基、C1-3羟基烷基、C1-2氟烷基、C1-3羧基烷基或C1-3氨基烷基。最优选地,每个E1-E6基团是CH3。
式I化合物优选在E1或E6上与R”基团或Q部分的R”基团缀合。最优秀地,式I化合物与Q部分的R”基团缀合。当式I化合物与Q部分的R”基团缀合时,R”基团优选在桥头位置。在这种情况下,Q优选为-(CH2)(CHR”)(CH2)-、-(CH2)2(CHR”)(CH2)2-或-(CH2)2NR”(CH2)2-,最优选为-(CH2)2(CHR”)(CH2)2-。
尤其优选的双官能二胺二肟螯合剂具有以下结构:
这样式I化合物经由桥头-CH2CH2NH2基团缀合。该双官能二胺二肟螯合剂在本文的其余部分成为螯合剂1或CA1。
(ii)N3S配体,该配体具有硫代三酰胺供体部分例如MAG3(巯基乙酰基三甘氨酸)和相关配体;或具有二酰胺吡啶硫醇部分例如PICA;
(iii)N2S2配体,该配体具有二胺二硫醇供体部分例如BAT或ECD(即乙基半胱氨酸酯二聚体)或酰胺胺二硫醇供体部分例如MAMA;
(iv)N4配体,该配体是开链或大环配体,具有四胺、酰胺三胺或二酰胺二胺供体部分例如cyclam、monoxocyclam或dioxocyclam。
(v)N2O2配体,该配体具有二胺二苯酚供体部分。
上述配体特别适于络合99mTc,并且Jurisson等人[Chem.Rev.(1999)
99 2205-2218]对此做了更详细描述。其它合适的配体描述在Sandoz WO91/01144中,该文献包括特别适于铟和钆,尤其是大环氨基羧酸酯和氨酸膦酸配体。形成钆的非离子(即中性)金属络合物的配体是已知的,并且描述在US 4885363中。当放射性金属离子是锝时,配体优选为是四齿配体的螯合剂。对于锝,优选的螯合剂是二胺二肟,或具有如上所述的N2S2或N3S供体部分的配体。对于锝,尤其优选的螯合剂是二胺二肟。
式II的连接基团-(A)n-的作用是将较大的金属络合物与式I化合物的活性位点隔开一定距离,这样该化合物与MMP酶的结合不受影响。这可通过合并柔性(例如简单的烷基链),这样较大基团自身能够远离活性位点和/或刚性,例如将金属络合物定向以远离活性位点的环烷基或芳基间隔基团来实现。
连接基团的性质还可以用于调节所得金属络合物缀合物的生物分布。因此,例如,在连接基团中引入醚基将有助于把血浆蛋白结合降至最小。包含多个连接的-CH2CH2O-基团(PEG连接基团)或1-10个氨基酸的肽链的连接基团还具有以下另外的性质:容许有利地改变特定化合物的临床性质,尤其是生物分布。这样的“生物改性剂”可促进造影剂从背底组织例如肌肉或肝脏和/或血液中清除,由此由于更少的背底干扰而给出更好分诊断成像。生物改性剂连接基团还可用于使得带来更有利的排泄途径,例如经由肾排泄而不是经由肝脏排泄。
非肽类连接基团例如亚烷基或亚芳基具有这样的优点,与缀合的式I化合物之间没有任何显著的氢键相互作用,这样连接基团不缠绕在式I化合物周围。优选的亚烷基间隔基团是-(CH2)q-,其中q是2-5。优选的亚芳基间隔基团是式IV所示基团:
其中a和b独立地为0、1或2。
当连接基团不包含PEG或肽链时,优选的连接基团-(A)n-具有包含2-10个原子、最优选2-5个原子、尤其优选2或3个原子的构成-(A)n-部分的连接原子主链。具有2个原子的最小连接基团主链带来的优点是,鳌合剂与式I化合物良好地分隔开,这样将任何相互作用降至最小。当连接基团是PEG连接基团时,-(A)n-中A基团的数目n可最高达50,优选15-30。当连接基团包含肽链时,其优选为1-10个氨基酸残基的肽链,氨基酸残基优选选自甘氨酸、赖氨酸、天冬氨酸或丝氨酸。
非常优选地,式I化合物以这样的方式与金属络合物结合,其中连接键在血液中不易于发生代谢,因为代谢将会导致金属络合物在化合物到达体内靶位点之前发生裂解。因此,式I化合物优选与本发明的金属络合物通过不易于代谢的键共价结合。
最有选的用γ-发射金属离子标记的本发明化合物是用与CA1配位的99mTc标记,在一个式I的R1-R4取代基上,CA1通过合适的化学官能团连接,具有任选的连接基团。优选的用99mTc标记的本发明化合物的实例如下(Tc在结构中代表99mTc):
化合物1 化合物2 化合物3
化合物16
化合物17
当γ-发射放射性核素是放射性卤素时,其优选为碘的同位素,并且诊断造影剂是通过将前体与碘的γ-发射同位素反应而有效地制得的。这样的前体在下文中更详细地描述,并且是本发明的第四个方面。优选的碘的γ-发射同位素是123I或131I。
碘的γ-发射同位素优选通过直接的共价键与芳环例如苯环连接,或通过乙烯基进行连接,因为已知与饱和脂族系统结合的碘原子易于在体内代谢并由此损失碘的γ-发射同位素。最优选地,碘的γ-发射同位素通过直接的共价键与式I的-NSO2-苯环连接。
尤其优选的用碘的γ-发射同位素标记的本发明诊断造影剂是式I化合物,其中:
(i)R1是异丙基,R2是4-OH,R3是3-123I,且R4是吡啶基(当R4是3-吡啶基时=化合物4);
(ii)R1是异丙基,R2是4-123I,R3是H,且R4是吡啶基(当R4是3-吡啶基时=化合物7);
(iii)R1是异丙基,R2是4-(4-[123I]碘苯甲酰胺),R3是H,且R4是吡啶基(当R4是3-吡啶基时=化合物20);
(iv)R1是4-羟基-3-[123I]碘苄基,R2是4-碘,R3是H,且R4是吡啶基(当R4是3-吡啶基时=化合物21);或
(v)R1是异丙基,R2是4-碘,R3是3-H,且R4是(Ar1)y-(R)z(NH)-(Ar2),其中Ar1是1,4-亚苯基,且Ar2是-[123I]碘苯基,R可以是CH2或C=O,y=0或1,且z=0或1;
并且其中当R4是吡啶基时,其优选为3-吡啶基。
放射性碘标记的MMP抑制剂的非放射性类似物表现出优良的抗MMP-2的抑制作用,对于化合物9,IC50值是2.5nM(表1),对于化合物8,是320nM(表1)。这些非放射性类似物还表现出抗MMP-9的抑制作用,对于化合物9,IC50值是4.6nM,对于化合物8,是153nM(表1)。因此,本发明化合物具有能够预示其体内MMP活性的成功成像的体外特征。所以,将使用这些新的放射示踪剂与SPECT联合使用,提供了用于在体内非侵入性地进行MMP活性成像的创新工具。在动物模型中的成像试验提供了本发明造影剂适于进行体内MMP活性成像的进一步证据。
在第三个方面,本发明提供了药物组合物,所述组合物包含适于对哺乳动物给药形式的如上所述的诊断造影剂以及生物相容载体。“生物相容载体”是流体,尤其是液体,造影剂可悬浮或溶解在其中,这样组合物是生理相容的,即组合物可以对哺乳动物体给药而不会带来毒性或不适当的不适。生物相容载体适当地为可注射的液态载体例如无菌、不含热原的注射用水;水溶液例如盐水(其可有利地被平衡,这样最终的用于注射的产品是等渗或非低渗的);一种或多种张力调节物质(例如具有生物相容反离子的血浆阳离子的盐)、糖(例如葡萄糖或蔗糖)、糖醇(例如山梨醇或甘露醇)、二醇(例如甘油)或其它非离子多元醇材料(例如聚乙二醇、丙二醇等)的水溶液。
本发明的第四个方面是可用于制备本发明放射性碘标记的诊断造影剂的前体,所述前体包含适于与碘的γ-发射同位素反应以生成所述诊断造影剂的基团。用于制备放射性碘标记的造影剂的合适的前体是这样的式I化合物,所述式I化合物包含非放射性卤素原子例如芳基碘或芳基溴(以容许放射性碘交换);活化的芳基环(例如苯酚基团);或有机金属前体化合物(例如三烷基锡或三烷基甲硅烷基);或有机前体例如三氮烯。Bolton[J.Lab.Comp.Radiopharm.2002 45 485-528]描述了用于引入碘的γ-发射同位素的方法。碘的γ-发射同位素可连接在其上的合适的芳基的实例如下:
其中存在合适的芳基的优选的本发明前体化合物的实例如下:
上述两种合适的芳基都包含使得能够容易地将碘取代到芳环上的取代基。或者,含有碘的γ-发射同位素的取代基可经由放射性卤素交换通过直接的碘化来合成,例如
在第五个方面,本发明提供了用于制备本发明药物组合物的药盒。当本发明药物组合物包含用γ-发射放射性金属标记的诊断造影剂时,所述药盒包含(i)包含与适于γ-发射放射性金属配位的配体缀合的式I化合物的配体缀合物,和(ii)生物相容还原剂。当本发明药物组合物包含用碘的γ-发射同位素标记的诊断造影剂时,所述药盒包含前体,所述前体是包含适于与碘的γ-发射同位素反应的基团的式I化合物,这样所述前体与通常是碘化物形式的碘的γ-发射同位素的反应生成所述诊断造影剂。
这样的药盒被设计成能得到适合于对人给药的无菌的放射性药物产品,如通过直接注射到血液中。对于99mTc来说,药盒优选被冷冻干燥,并被设计成能从99mTc放射性同位素发生器中重新用无菌的99mTc-高锝酸盐(TcO4 -)组成,以便在不进行进一步操作的情况下获得适合于对人给药的溶液。适当的药盒包括含有游离碱或酸式盐形式的配体或螯合剂缀合物的容器(例如隔膜密封的瓶),以及生物相容的还原剂例如连二亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、抗坏血酸、甲脒亚硫酸、亚锡离子、铁(II)或铜(I)。生物相容还原剂优选为亚锡盐例如氯化亚锡或酒石酸亚锡。或者,药盒可任选包含金属络合物,在加入放射性金属后,所述金属络合物发生金属转移作用(即金属交换)从而生成所需产物。
药盒可任选进一步包含另外的组分例如转螯合剂、辐射防护剂、抗微生物防腐剂、pH调节剂或填充剂。“转螯合剂”是与锝快速反应以形成弱络合物,然后被配体置换的化合物。这样,就由于与锝络合相竞争的高锝酸盐的快速还原而把形成还原水解锝(RHT)的危险降到最低程度。适当的这种转螯合剂是弱有机酸,即pKa为3-7的有机酸与生物相容阳离子的盐。合适的这样的弱有机酸是乙酸、柠檬酸、酒石酸、葡糖酸、葡庚糖酸、苯甲酸、苯酚或膦酸。因此,合适的盐是乙酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、葡糖酸盐、葡庚糖酸盐、苯甲酸盐、苯酚化物或膦酸盐。最优选的这样的盐是酒石酸盐、葡糖酸盐、葡庚糖酸盐、苯甲酸盐或膦酸盐,最优选膦酸盐,尤其最优选二膦酸盐。优选的这种转螯合剂是MDP,即亚甲基二膦酸与生物相容阳离子的盐。
术语“生物相容阳离子”意思是指与离子化的带负电荷的基团形成盐的带正电荷的反离子,其中所述带正电荷的反离子也是无毒的,因此适合于对哺乳动物体,特别是人体给药。适当的生物相容的阳离子的实例包括:碱金属钠或钾;碱土金属钙和镁;和铵离子。优选的生物相容阳离子是钠和钾,最优选钠。
术语“辐射防护剂”意思是指能通过捕获高度反应性的自由基,如由水的射解产生的含氧自由基而抑制降解反应,如氧化还原过程的化合物。本发明的辐射防护剂适当地选自:抗坏血酸、对氨基苯甲酸(即4-氨基苯甲酸)、龙胆酸(即2,5-二羟基苯甲酸)和这种酸与如上定义的生物相容阳离子的盐。
术语“抗微生物防腐剂”意思是指可抑制潜在有害的微生物如细菌、酵母或霉菌生长的试剂。根据剂量的大小,抗菌防腐剂也可以显示出某些杀菌性能。本发明抗菌防腐剂的主要作用是抑制重新组成后药物组合物,即放射性诊断产品本身中任何这种微生物的生长。但是,抗菌防腐剂也可任选用来抑制在重新组成之前本发明药盒的一个或多个组分中潜在有害的微生物的生长。适当的抗菌防腐剂包括:对羟苯甲酸酯,即对羟基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯或丁酯或其混合物;苯甲醇;苯酚;甲酚;溴化十六烷基三甲铵和硫柳汞。优选的抗菌防腐剂是对羟苯甲酸酯。
术语“pH调节剂”意思是指用于保证重新组成的药盒的pH值在对人或哺乳动物给药的可接受限值范围之内(大约为pH值4.0-10.5)的化合物或化合物的混合物。适当的这种pH值调节剂包括可药用的缓冲剂,如N-(羟甲基)甲基甘氨酸、磷酸盐或TRIS[即三(羟甲基)氨基甲烷],和可药用的碱如碳酸钠、碳酸氢钠或其混合物。当配体缀合物以酸式盐形式使用时,pH调节剂可任选在单独的瓶或容器中提供,这样使用者可以在多步操作的一部分来调节pH。
术语“填充剂”是指可药用的增量剂,其可以在生产和冻干期间有助于材料操作。合适的填充剂包括无机盐例如氯化钠和水溶液糖和糖醇例如蔗糖、麦芽糖、甘露醇或海藻糖。
本发明的第六个方面是本发明药物组合物在心血管疾病的诊断成像中的应用。本发明药物组合物可尤其用于动脉粥样硬化和CHF的诊断成像。使用本发明诊断造影剂能够诊断活性斑负荷,活性斑负荷使得能够对已知患有或被怀疑患有冠状动脉疾病的患者,即具有疼痛或疼痛史的患者,或鉴定为具有高度危险但是无症状的患者进行危险分级。此外,本发明诊断造影剂能够鉴定有症状患者中的易损斑,这使得能够鉴定急性心肌梗塞或中风的高度危险性,不论有无狭窄,以及能够在患者表现出胸痛时迅速进行危险分级。此外,易损斑的血管成形术是高度危险的,并且可在手术后导致动脉树栓塞。因此,对这种亚类型的斑进行成像可有助于减轻手术后并发症。
本发明的第七个方面是本发明药物组合物在炎性疾病的诊断成像,和特别是COPD的诊断成像中的应用。
附图简述
图1表明了用于制备前体化合物的合成途径,所述前体化合物可用于本发明诊断造影剂的放射合成,其中γ-发射放射性核素是碘的放射性同位素。通过该合成途径也制得了这些放射性碘标记的诊断造影剂的非放射性变型。图1中的“X”如关于式V和VI所定义。
图2-5表明了分别用于制备配体缀合物,化合物10、11、18和19的合成途径。
图6表明了通过化合物的放射性碘化来制备化合物4的放射合成。
图7表明了用于制备前体化合物15的两条合成途径。
图8表明了在取自ApoE(-/-)小鼠的左颈动脉样本上进行的免疫组织化学的结果。HE=苏木精和曙红。图8还表明了体内注射化合物6之后,在取自ApoE(-/-)小鼠的左颈动脉样本上进行的放射自显影法(标记的“Autorad”)的结果。
图9表明了在注射化合物4之后在ApoE(-/-)小鼠中产生的影像。
图10表明了在没有预先施用冷的化合物的情况下,在ApoE(-/-)小鼠中化合物4的摄取量,与在预先施用冷的化合物CGS27023之后,在ApoE(-/-)小鼠中化合物4的摄取量的比较。
图11表明了时间-活性曲线,这些曲线是由在试验A中没有预先给药与在试验B中进行预先给药后的小鼠4和5的摄取量,该曲线表明在预先给药的动物中表现出较低的摄取量。
附图12表明了在试验A中得自ApoE(-/-)小鼠的肝脏、肾、膀胱、脑和胸区域的分析的平均(±SEM)数据。
实施例
实施例1描述了用于制备非放射性现有技术化合物CGS 27023的合成途径。
实施例2描述了用于制备化合物9的合成途径,化合物9是化合物6和7的非放射性变型,化合物6和7都是本发明诊断造影剂。
实施例3描述了用于制备化合物14的合成途径,化合物14是用于如实施例14和15所述制备化合物6和7的前体。
实施例4描述了用于制备化合物13的合成途径,化合物13是用于如实施例12和13所述制备化合物4和5的前体。
实施例5描述了用于合成化合物8的合成途径,化合物8是化合物4和5的非放射性变型,化合物4和5都是本发明诊断造影剂。
实施例6描述了用于制备CA1的合成,CA1是用于在化合物1、2、3、16和17中配位99mTc的螯合剂,化合物1、2、3、16和17都是本发明的诊断造影剂。
实施例7描述了用于合成化合物10的合成途径,化合物10是可以用99mTc标记以生成化合物1的配体缀合物。
实施例8描述了用于制备化合物11的合成途径,化合物11是可以用99mTc标记以生成化合物2的配体缀合物。
实施例9描述了用于制备化合物18的合成途径,化合物18是可以用99mTc标记以生成化合物16的配体缀合物。
实施例10描述了用于制备化合物19的合成途径,化合物19是可以用99mTc标记以生成化合物17的配体缀合物。
实施例11描述了用99mTc标记化合物10、11、12、18和19的方法。
实施例12描述了通过用123I标记化合物13来制备化合物4的方法。实施例12描述了用于获得化合物5的与实施例12相同的方法,但是在实施例13中是用125I标记化合物13。
实施例14描述了使用前体化合物14来制备化合物6的放射合成。实施例15描述了用于制备化合物7的与实施例14相同的方法。化合物6和7都是本发明的诊断造影剂。
实施例16描述了化合物15的合成,其中化合物15是适于化合物6和7的放射合成的前体。
实施例17描述了由三丁基锡前体化合物15制备化合物7的放射合成。
实施例18描述了用于评价本发明化合物抑制MMP-2和MMP-9的能力的分析。表2中的结果表明,本发明诊断造影剂的非放射性变型(化合物8和9)具有与现有技术化合物相差不大的MMP抑制活性。这提供了这些化合物的放射性变型(化合物2-5)可以在其中涉及MMP的疾病中用作诊断造影剂的证据。
实施例19描述了用于在体内评价本发明化合物的特征的ApoE(-/-)小鼠模型。
实施例20描述了用于制备组织学和免疫组织化学所用的组织样本的方法。实施例21描述了用于制备放射自显影法所用样本的方法。如图8所示的这些试验的结果表明化合物5的摄取量与MMP-9的存在有关。
实施例22描述了如何在小鼠中进行体内成像试验。这些试验证实了在120分钟的时间内,在结扎区域化合物4的摄取量不断增加,这意味着化合物特异性地摄取到损伤部位内。还表明了化合物4没有象在已经用非放射性现有技术化合物CGS27023预先给药的ApoE-/-小鼠中那样良好地摄取,这意味着化合物4具有与CGS 27023类似的结合特性。通过分析所感兴趣的区域而进行的化合物4的生物分布试验表明,通过肾和肝脏排泄从血液中迅速清除,并且在相同期间内在胸腔和脑中没有可评估的信号(图12)。这样的清除特征适于诊断造影剂。
本文中的很多示例性化合物是式I化合物,并且方便起见,将其在下面的表1中定义:
表1:在说明书中描述的式I化合物
化合物 | R1 | R2 | R3 | R4 |
CGS27023(现有技术) | 异丙基 | 4-OMe | H | 3-吡啶基 |
1 | 异丙基 | 4-CO-CA1-99mTc | H | 3-吡啶基 |
2 | 异丙基 | 4-OMe | H | 苯甲酰基-CA1-99mTc |
3 | CH2CH2CO-CA1-99mTc | 4-碘 | H | 3-吡啶基 |
4 | 异丙基 | 4-OH | 3-[123I]-iodo | 3-吡啶基 |
5 | 异丙基 | 4-OH | 3-[125I]-iodo | 3-吡啶基 |
6 | 异丙基 | 4-[125I]碘 | H | 3-吡啶基 |
7 | 异丙基 | 4-[123I]-碘 | H | 3-吡啶基 |
8 | 异丙基 | 4-OH | 3-iodo | 3-吡啶基 |
9 | 异丙基 | 4-碘 | H | 3-吡啶基 |
10 | 异丙基 | 4-CO-CA1 | H | 3-吡啶基 |
11 | 异丙基 | 4-OMe | H | 苯甲酰基-CA1 |
12 | CH2CH2CO-CA1 | 4-碘 | H | 3-吡啶基 |
13 | 异丙基 | 4-OH | H | 3-吡啶基 |
14 | 异丙基 | 4-Br | H | 3-吡啶基 |
15 | 异丙基 | 4-三丁基锡 | H | 3-吡啶基 |
16 | 异丙基 | 4-OMe | H | 连接基团1-CA1-99mTc* |
17 | 异丙基 | 4-OMe | H | 连接基团2-CA1-99mTc* |
18 | 异丙基 | 4-OMe | H | 连接基团1-CA1 |
19 | 异丙基 | 4-OMe | H | 连接基团2-CA1 |
20 | 异丙基 | 4-(4-[123I]碘苯甲酰氨基) | H | 3-吡啶基 |
21 | 4-羟基-3-[123I]碘苄基 | 4-碘 | H | 3-吡啶基 |
*连接基团1=-Ph-C(=O)-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-NH-C(=O)-(CH2)3-C(=O)-
连接基团2=-Ph-C(=O)-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-O-CH2-C(=O)-
实施例1:制备CGS 27023(现有技术)
CGS 27023是通过MacPherson等人[J.Med.Chem.1997,40;2525-2532]描述的合成方法的改进形式合成的。
本合成首先是将市售的缬氨酸叔丁酯苯基磺酰氯反应,而MacPherson等人首先是将未保护的缬氨酸与苯基磺酰氯反应,然后将酸官能团作为叔丁酯保护起来。本发明合成的其余部分与MacPherson等人的报道相同。图1显示了所用的合成路线,其中对于CGS 27023,X=甲氧基。
产率94%
mp 156-158°
1H-NMR(300MHz,DMSO-D6):δ[ppm]:10.76(宽,s,1H,OH),8.52(m,2H,H芳基),8.18(d,3J=8.1Hz,1H,H芳基),7.69(dd,3J1=8.1Hz,3J2=5.6Hz,1H,H芳基),7.47(d,3J=8.9Hz,2H,H芳基),6.82(d,3J=8.9Hz,2H,HAryl),4.72(d,2J=16.7Hz,1H,CH2),4.52(d,2J=16.7Hz,1H,CH2),3.63(s,3H,OCH3),3.64(d,3J=10.4Hz,1H,N-CH),1.85-1.71(m,1H,CH(CH3)2),0.59(d,3J=6.5Hz,3H,CH(CH3)2),0.42(d,3J=6.5Hz,3H,CH(CH3)2).
13C-NMR(75.5MHz,DMSO-D6):δ[ppm]:166.22,163.01,144.91,142.01,141.14,138.78,131.48,129.59,126.52,114.72,63.35,56.12,45.04,28.09,19.50,19.29.
实施例2:制备化合物9
化合物9是按照与实施例1中描述的制备CGS 27023的相同方法制得的,在图1中,X=I。
粗产物的产率:56%,可将该粗产物从乙腈中重结晶,获得36%无色固体。
mp 169℃.
1H-NMR(400MHz,DMSO-D6):δ[ppm]:10.87(宽,s,1H,OH),8.80(m,2H,H芳基),8.45(d,3J=8.3Hz,1H,H芳基),7.96(dd,3J1=8.1Hz,3J2=6.0Hz,1H,H芳基),7.90(d,3J=8.6Hz,2H,H芳基),7.52(d,3J=8.6Hz,2H,H芳基),4.95(d,2J=16.9Hz,1H,CH2),4.74(d,2J=16.9Hz,1H,CH2),3.83(d,3J=10.6Hz,1H,N-CH),2.05-1.93(m,1H,CH(CH3)2),0.78(d,3J=6.5Hz,3H,CH(CH3)2),0.59(d,3J=6.5Hz,3H,CH(CH3)2).
13C-NMR(75.5MHz,DMSO-D6):δ[ppm]:166.95,145.67,143.58,142.69,140.27,139.47,139.18,129.96,127.45,102.99,64.51,46.16,29.11,20.51,20.24.
MALDI-TOF:490(M-HCl+H+).
元素分析,C17H21IClN3O4S的计算值:C 38.83,H 4.03,N 7.99。实测值:C 38.67,H 3.85,N 7.94。
实施例3:制备化合物14
化合物14是按照与实施例1中描述的制备CGS 27023的相同方法制得的,在图1中,X=Br。
产率:51%无色固体。
mp:169-170℃.
1H-NMR(300MHz,DMSO-D6):δ[ppm]:11.03(宽,s,1H,OH).8.80(m,2H,H芳基),8.42(d.3J=8.1Hz,1H,H芳基),7.93(dd,3J1=8.0Hz,3J2=5.9Hz,1H,H芳基),7.90(d,3J=8.6Hz,2H,H芳基),7.52(d,3J=8.6Hz,2H,H芳基),4.98(d,2J=16.6Hz,1H,CH2),4.77(d,2J=16.6Hz,1H,CH2),3.88(d,3J=10.5Hz,1H,N-CH),2.08-1.95(m,1H,CH(CH3)2),0.81(d,3J=6.5Hz,3H,CH(CH3)2),0.63(d,3J=6.5Hz,3H,CH(CH3)2).
13C-NMR(75.5MHz,DMSO-D6):δ[ppm]:165.91,145.13,142.02,141.17,138.91,138.47,132.67,129.39,127.51,126.66,63.54,45.18,28.12,19.51,19.23.
MALDI-TOF:466(M-HCl+Na+),464(M-HCl+Na+),444(M-HCl+H+),442(M-HCl+H+).
元素分析,C17H21BrClN3O4S的计算值:C 42.64,H 4.42,N 8.78。实测值:C 42.60,H 4.20,N 8.52。
实施例4:制备化合物13
化合物9的合成是按照与实施例1中描述的制备CGS 27023的相同方法进行的,在图1的式V中,X=BnO(N-(叔丁氧基)-2(R)-[[(4-苄氧基苯基)磺酰基](3-吡啶甲基)氨基]-3-甲基丁酰胺)。
将1.20g(2.28mmol)相当于附图1式V的化合物(其中X=BnO)溶解在30ml无水甲醇中,用111mg Pd/C(10%)处理,在氢气氛下搅拌66小时。过滤出结晶,用80ml甲醇洗涤。将溶剂蒸发,把固体残余物真空干燥。从氯仿中重结晶,获得了797mg(1.83mmol,80%)无色细小结晶产物附图1式V,其中X=OH(N-(叔丁氧基)-2-(R)-[[(4-羟基苯基)磺酰基](3-吡啶甲基)氨基]-3-甲基-丁酰胺)
mp 160-162℃.
1H-NMR(300MHz,DMSO-D6):δ[ppm]:10.74(s,1H,OH),8.64(s,1H,H芳基),8.54(m,1H,H芳基),7.83(d,3J=7.9Hz,1H,H芳基),7.63(d,3J=8.7Hz,2H,H芳基),7.37(dd,3J1=7.8Hz,3J2=4.8Hz,1H,H芳基),6.91(d,3J=8.7Hz,2H,H芳基),4.80(s,2H,CH2),4.09(d,3J=10.6Hz,1H,N-CH),2.09-1.97(m,1H,CH(CH3)2),1.22(s,9H,C(CH3)3),0.93(d,3J=6.3Hz,3H,CH(CH3)2),0.86(d,3J=6.3Hz,3H,CH(CH3)2).
13C-NMR(75.5MHz,DMSO-D6):δ[ppm]:168.14,161.56,150.30,148.49,136.64,133.85,130.87,129.43,123.18,115.78,81.04,63.07,45.52,28.56,26.60,19.59,19.20.
MALDI-TOF:474(M+K+),458(M+Na+),436(M+H+).
将600mg(1.38mmol)其中X=OH的附图1式V化合物溶解在含有80μl(1.38mmol)乙醇的30ml二氯乙烷中。将该溶液冷却至-10℃,向其中通入3小时的氯化氢。将该反应容器密封,让该混合物温热至室温。搅拌2天后,通过蒸发把溶剂降至1/3体积,用乙醚处理残余物。将所得悬浮液剧烈搅拌4小时。通过抽滤收集沉淀,真空干燥,获得了562mg(1.35mmol,98%)化合物13,为无色粉状固体。
1H-NMR(300MHz,DMSO-D6):δ[ppm]:11.13(s,1H,OH),10.83(s,1H,OH),8.96(s,2H,H芳基),8.59(d,3J=8.0Hz,1H,H芳基),8.11(dd,3J1=7.7Hz,3J2=5.9Hz,1H,H芳基),7.77(d,3J=8.6Hz,2H,H芳基),7.06(d,3J=8.6Hz,2H,H芳基),5.11(d,2J=16.8Hz,1H,CH2),4.90(d,2J=16.8Hz,1H,CH2),4.01(d,3J=10.6Hz,1H,N-CH),2.25-2.12(m,1H,CH(CH3)2),0.99(d,3J=6.4Hz,3H,CH(CH3)2),0.81(d,3J=6.4Hz,3H,CH(CH3)2).
13C-NMR(75.5MHz,DMSO-D6):δ[ppm]:166.32,162.04,144.85,142.09,141.17,138.99,129.72,129.59,126.45,115.93,63.30,44.98,28.08,19.49,19.33.
MALDI-TOF:402(M-HCl+Na)+.
实施例5:制备化合物8
化合物8的合成是按照与实施例1中描述的制备CGS 27023的相同方法进行的,在图1的式V中,X=OH(N-(叔丁氧基)-2(R)-[[(4-羟基苯基)磺酰基](3-吡啶甲基)氨基]-3-甲基-丁酰胺)。
将1.00g(2.30mmol)其中X=OH的附图1式V化合物溶解在40ml甲醇中,用1.22g(11.5mmol)碳酸钠处理。将该溶液在冰浴中冷却,用1小时滴加2.3ml 1M一氯化碘在甲醇中的溶液。在加入期间,该溶液的深红色几乎立即消失。让该混合物达到室温,搅拌过夜。然后将该悬浮液过滤,把滤液用4ml 10%硫代硫酸钠处理,用1N H2SO4调节至pH 7。用乙醚萃取后,将合并的萃取液用盐水洗涤,并干燥(Na2SO4)。将该乙醚溶液真空浓缩,获得了900mg N-(叔丁氧基)-2(R)-[[(4-羟基-3-碘苯基)磺酰基](3-吡啶甲基)-氨基]-3-甲基丁酰胺。该固体为浅粉红色固体,其不用进一步纯化直接用于下一步骤。
将900mg N-(叔丁氧基)-2(R)-[[(4-羟基-3-碘苯基)磺酰基](3-吡啶甲基)-氨基]-3-甲基丁酰胺粗产物溶解在含有93μl乙醇的二氯甲烷中。将该溶液冷却至-10℃,向其中通入1.5小时氯化氢。将该反应容器密封,让该混合物温热至室温。在室温搅拌19小时后,通过蒸发把溶剂减至约20ml,将残余物用约50ml乙醚处理。将所得悬浮液剧烈搅拌1-2小时。通过抽滤收集沉淀,真空干燥,获得了830mg无色浅黄色粉状固体。从2倍的甲醇/乙腈(1∶1)中进行重结晶,获得了150mg纯的化合物8。
产率:12%(两步的产率)。
mp:201-203℃.
1H-NMR(300MHz,DMSO-D6):δ[ppm]:11.70(宽,s,1H,OH),11.03(宽,s,1H,OH),8.86(s,1H,H芳基),8.84(s,1H,H芳基),8.45(d,3J=8.1Hz,1H,H芳基),7.98(dd,3J1=8.3Hz,3J2=5.7Hz,1H,H芳基),7.96(d,3J=2.3Hz,1H,H芳基),7:69(d,3J=8.6Hz,1H,H芳基),7.10(d,3J=8.6Hz,1H,H芳基),4.98(d,2J=16.5Hz,1H,CH2),4.82(d,2J=16.5Hz,1H,CH2),3.89(d,3J=10.6Hz,1H,N-CH),2.15-2.02(m,1H,CH(CH3)2),0.87(d,3J=6.6Hz,3H,CH(CH3)2),0.69(d,3J=6.6Hz,3H,CH(CH3)2).
13C-NMR(75.5MHz,DMSO-D6):δ[ppm]:166.25,161.32,144.95,142.22,141.36,138.72,138.12,131.33,129.15,126.44,115.16,84.87,63.33,45.03,28.05,19.50,19.31.
元素分析,C17H21IN3O5SCl的计算值:C 37.69,H 3.90,N 7.76;实测值:C 37.84,H 4.42,N 7.39。
实施例6:制备螯合剂1
6(a)3-(甲氧基羰基亚甲基)戊二酸二甲酯
将在甲苯(600ml)中的甲氧羰基亚甲基三苯基正膦(167g,0.5mol)用3-氧代戊二酸二甲酯(87g,0.5mol)处理,将该反应在120℃的油浴上于100℃在氮气氛下加热36小时。然后将该反应真空浓缩,把该油状残余物用40/60石油醚乙醚1∶1,600ml研制。沉淀出了三苯基膦氧化物,将上清液倾出/过滤出。将真空蒸发的残余物于高度真空Bpt下进行Kugelrohr蒸馏(烘箱温度180-200℃,0.2托),获得了89.08g 3-(甲氧基羰基亚甲基)戊二酸二甲酯,267mM,53%。
NMR 1H(CDCl3):δ3.31(2H,s,CH2),3.7(9H,s,3xOCH3),3.87(2H,s,CH2),5.79(1H,s,=CH,)ppm.
NMR 13C(CDCl3),δ36.56,CH3,48.7,2xCH3,52.09和52.5(2xCH2);122.3和146.16C=CH;165.9,170.0和170.53xCOO ppm.
6(b)3-(甲氧基羰基亚甲基)戊二酸二甲酯的氢化
将在甲醇(200ml)中的3-(甲氧基羰基亚甲基)戊二酸二甲酯(89g,267mmol)与(10%披钯炭:50%水)(9g)在氢气氛下(50psi)摇动(30小时)。将该溶液经由硅藻土过滤,真空浓缩,获得了3-(甲氧基羰基甲基)戊二酸二甲酯,为油状物(84.9g,94%)。
NMR1H(CDCl3),δ2.48(6H,d,J=8Hz,3xCH2),2.78(1H,六重峰,J=8Hz CH,)3.7(9H,s,3xCH3).
NMR 13C(CDCl3),δ28.6,CH;37.50,3xCH3;51.6,3xCH2;172.28,3xCOO
6(c)将三甲酯还原和酯交换以生成三乙酸酯
在氮气氛下,在2L三颈烧瓶内,用1小时将在四氢呋喃(400ml)中的氢化锂铝(20g,588mmol)小心地用在四氢呋喃(200ml)中的三(甲氧基羰基甲基甲烷(40g,212mmol)处理。发生了剧烈的放热反应,引起溶剂剧烈回流。将该反应在油浴上于90℃回流3天。通过小心地滴加乙酸(100ml)直至氢气释放停止来中止该反应。将该搅拌着的反应混合物小心地用乙酸酐溶液(500ml)处理,以引起轻微回流的速度进行处理。给烧瓶装配上蒸馏装置,搅拌,然后在90℃(油浴温度)加热以蒸馏出四氢呋喃。再加入一部分乙酸酐(300ml)将该反应返回回流配置,在油浴中于140℃搅拌和加热5小时。让该反应冷却并过滤。将氧化铝沉淀用乙酸乙酯洗涤,把合并的滤液在旋转蒸发仪上于50℃的水浴温度真空(5mmHg)浓缩,获得了油状物。将该油状物置于乙酸乙酯(500ml)中,用饱和碳酸钾水溶液洗涤。分离出乙酸乙酯溶液,用硫酸钠干燥,真空浓缩,获得了油状物。将该油状物在高度真空下进行Kugelrohr蒸馏,获得了三(2-乙酰氧基乙基)甲烷(45.313g,产率为95.9%,0.165mol)为油状物。在0.1mmHg的沸点为220℃。
NMR1H(CDCl3),δ1.66(7H,m,3xCH2,CH),2.08(1H,s,3xCH3);4.1(6H,t 3xCH2O).
NMR 13C(CDCl3),δ20.9,CH3;29.34,CH;32.17,CH2;62.15,CH2O;171,CO.
6(d)从三乙酸酯除去乙酸酯基团
将在甲醇(200ml)和880氨(100ml)中的三(2-乙酰氧基乙基)甲烷(45.3g,165mM)在油浴上于80℃加热2天。将该反应再用一部分880氨(50ml)处理,在油浴中于80℃加热24小时。再加入一部分880氨(50ml),将该反应在80℃加热24小时。然后将该反应真空浓缩以除去所有溶剂,获得了油状物。将该油状物置于880氨(150ml)中,在80℃加热24小时。然后将该反应真空浓缩以除去所有溶剂,获得了油状物。进行Kugelrohr蒸馏,获得了乙酰胺,bp 170-180℃0.2mm。将含有乙酰胺的该产物洗净,继续蒸馏。获得了三(2-羟基乙基)甲烷(22.53g,152mmol,92.1%),bp 220℃0.2mm。
NMR1H(CDCl3),δ1.45(6H,q,3xCH2),2.2(1H,五重峰,CH);3.7(6H,t 3xCH2OH);5.5(3H,brs,3xOH).
NMR 13C(CDCl3),δ22.13,CH;33.95,3xCH2;57.8,3xCH2OH.
6(e)将三醇转化成三(甲磺酸酯)
在氮气氛下,向三(2-羟基乙基)甲烷(10g,0.0676mol)在二氯甲烷(50ml)内的搅拌着的冰冷溶液中缓慢地滴加甲磺酰氯(40g,0.349mol)在二氯甲烷(50ml)中的溶液,加入速度使得温度不超过15℃。然后以加入速度使得温度不超过15℃的速度滴加溶解在二氯甲烷(50ml)中的吡啶(21.4g,0.27mol,4eq),为放热反应。将该反应在室温搅拌24小时,然后浴5N盐酸(80ml)处理,分离各层。将水层用二氯甲(50ml)萃取,合并有机萃取液,用硫酸钠干燥,过滤,真空浓缩,获得了含有过量的甲磺酰氯的三(2-(甲基磺酰氧基)乙基)甲烷。理论产量为25.8g。
NMR1H(CDCl3),δ4.3(6H,t,2xCH2),3.0(9H,s,3xCH3),2(1H,六重峰,CH,),1.85(6H,q,3xCH2).
6(f)制备1,1,1-三(2-叠氮基乙基)甲烷
在氮气氛下,用15分钟向三(2-(甲基磺酰氧基)-乙基)甲烷[得自步骤6(e),含有过量的甲磺酰氯](25.8g,67mmol,理论上的)在无水DMF(250ml)中的搅拌着的溶液分批加入叠氮化钠(30.7g,0.47mol。观察到放热,将该反应在冰浴上冷却。30分钟后,将该反应混合物在油浴上于50℃加热24小时。该反应混合物变为棕色。让该反应冷却,用稀的碳酸钾溶液(200ml)处理,用40/60石油醚/乙醚10∶1(3×150ml)萃取3次。将有机萃取液用水(2×150ml)洗涤,用硫酸钠干燥,过滤。将乙醇(200ml)加到该石油醚/乙醚溶液中以把三叠氮化物保持在溶液中,真空浓缩至体积小于200ml。加入乙醇(200ml),再次真空浓缩,以除去石油醚,至乙醇溶液小于200ml。
注意:不要除去所有溶剂,因为叠氮化物有可能爆炸,并且应当在所有时间保持稀溶液。
NMR1H(CDCl3),δ3.35(6H,t,3xCH2),1.8(1H,六重峰,CH,),1.6(6H,q,3xCH2).
6(g)制备1,1,1-三(2-氨基乙基)甲烷
将在乙醇(200ml)中的三(2-叠氮基乙基)甲烷(15.06g,0.0676mol),(假定在上一反应中是100%产率)用10%披钯炭(2g,50%水)处理,氢化2小时。每隔2小时就将该反应容器抽空一次以除去反应中释放出的氮气,用氢气填充。取样本进行NMR分析以确定三叠氮化物完全转化为三胺。
注意:未反应的叠氮化物有可能在蒸馏时爆炸。
将该反应经由硅藻土垫过滤以除去催化剂,真空浓缩,获得了三(2-氨基乙基)甲烷,为油状物。通过在0.4mm/Hg进行Kugelrohr蒸馏(bp.180-200℃),获得了无色油状物(8.1g,55.9mmol,从三醇开始的总产率为82.7%)。
NMR1H(CDCl3),2.72(6H,t,3xCH2N),1.41(H,七重峰,CH),1.39(6H,q,3xCH2).
NMR 13C(CDCl3),δ39.8(CH2NH2),38.2(CH2.),31.0(CH).
1,1,1-三(2-氨基乙基)甲烷可通过另一下述方法制得:
6(g)(i):使用对甲氧基苄基胺将三甲酯酰胺化
将(甲氧基羰基甲基)甲烷[2g,8.4mmol;在上面的步骤6(b)中制得的]溶解在对甲氧基苄基胺(25g,178.6mmol)中。安装上蒸馏装置,在氮气流下于120℃加热24小时。通过收集的甲醇的量来监测反应进程。将该反应混合物冷却至室温,加入30ml乙酸乙酯,然后将沉淀的三酰胺产物搅拌30分钟。通过过滤分离出该三酰胺,将氯饼用足量的乙酸乙酯洗涤几次以除去过量对甲氧基-苄基胺。干燥后,获得了4.6g,100%白色粉末。该高度不溶的产物不用进一步纯化或鉴定直接用于下一步骤。
6(g)(ii):制备1,1,1-三[2-(对甲氧基苄基氨基)乙基]甲烷
在冰水浴中冷却的1000ml三颈烧瓶内,将得自步骤2(a)的三酰胺(10g,17.89mmol)小心地加到250ml 1M硼烷溶液(3.5g,244.3mmol中。加入完全后,移去冰水浴,将该反应混合物缓慢地加热至60℃。将该反应混合物在60℃搅拌20小时。取出该反应混合物的样本(1ml),与0.5ml 5N HCl混合,静置30分钟。向该样本中加入0.5ml 50NaOH,然后加入2ml水,将该溶液搅拌直至所有白色沉淀溶解。将该溶液用乙醚(5ml)萃取,蒸发。将残余物以1mg/ml的浓度溶解在乙腈中,通过MS分析。如果在MS谱中发现一酰胺和二酰胺(M+H/z=520和534),则该反应未完全。为了反应完全,再加入100ml 1M硼烷的THF溶液,将该反应混合物在60℃再搅拌6小时,按照上一取样操作取出一份新的样本。按照需要再加入1M硼烷的THF溶液,直至完全转化为三胺。
将该反应混合物冷却至室温,缓慢地加入5N HCl[注意:发生剧烈的泡沫形成!]。加入HCl直至不再观察到有气体释放出来。将该混合物搅拌30分钟,然后蒸发。将残余物悬浮在NaOH溶液(20-40%;1∶2w/v)中,搅拌30分钟。然后将该混合物用水(3体积)稀释。将该混合物用乙醚(2×150ml)萃取[注意:不用使用卤代溶剂]。然后将合并的有机相用水(1×200ml)、盐水(150ml)洗涤,用硫酸镁干燥。蒸发后获得了:7.6g,84%,为油状物。
NMR 1H(CDCl3),δ:1.45,(6H,m,3xCH2;1.54,(1H,七重峰,CH);2.60(6H,t,3xCH2N);3.68(6H,s,ArCH2);3.78(9H,s,3xCH3O);6.94(6H,d,6xAr).7.20(6H,d,6xAr).
NMR13C(CDCl3),δ:32.17,CH;34.44,CH2;47.00,CH2;53.56,ArCH2;55.25,CH3O;113.78,Ar;129.29,Ar;132.61;Ar;158.60,Ar;
6(g)(iii)制备1,1,1-三(2-氨基乙基)甲烷
将1,1,1-三[2-(对甲氧基苄基氨基)乙基]甲烷(20.0g,0.036mol)溶解在甲醇(100ml)中,加入Pd(OH)2(5.0g)。将该混合物氢化(3巴,100℃,在高压釜中),搅拌5小时。分别在10和15小时之后分两批加入Pd(OH)2(2×5g)。将该反应混合物过滤,将滤液用甲醇洗涤。将合并有机相蒸发,把残余物真空蒸馏(1×10-2,110℃),获得了2.60克(50%)1,1,1-三(2-氨基乙基)甲烷,与通过前面所述方法获得的相同。
6(h)制备3-氯-3-甲基-2-亚硝基丁烷
将2-甲基丁-2-烯(147ml,1.4mol)与亚硝酸异戊酯(156ml,1.16mol)的混合物在cardice与甲醇的浴中冷却至-30□,用高架搅拌器剧烈搅拌,滴加浓盐酸(140ml,1.68mol),滴加速度使得温度保持在-20℃以下。这需要约1小时,由于这是剧烈的放热,所以必须注意防止过热。加入乙醇(100ml)以降低在加入结束时形成的浆液的粘度,将该反应在-20℃--10℃搅拌2小时以反应完全。通过真空过滤收集沉淀,用4×30ml冷(-20℃)乙醇和100ml冰冷的水洗涤,真空干燥,获得了3-氯-3-甲基-2-亚硝基丁烷,为白色固体。将乙醇滤液和洗涤液合并,用水(200ml)稀释,冷却,并在-10℃静置1小时,又获得了一批结晶出的3-氯-3-甲基-2-亚硝基丁烷。通过过滤收集该沉淀,用最小所需量的水洗涤,真空干燥,总共获得了3-氯-3-甲基-2-亚硝基丁烷(115g 0.85mol,73%)>98%纯度(NMR)。
NMR1H(CDCl3),异构体的混合物(异构体1,90%)1.5d,(2H,CH3),1.65d,(4H,2×CH3),5.85,q,和5.95,q,以及1H.(异构体2,10%),1.76s,(6H,2×CH3),2.07(3H,CH3)。
6(i)合成二[N-(1,1-二甲基-2-N-羟基亚胺丙基)2-氨基乙基]-(2-氨基乙基)甲烷(螯合剂1)
在室温,氮气氛下,于剧烈搅拌下向三(2-氨基乙基)甲烷(4.047g,27.9mmol)在无水乙醇(30ml)内的溶液中加入无水碳酸钾(7.7g,55.8mmol,2eq)。将3-氯-3-甲基-2-亚硝基丁烷(7.56g,55.8mol,2eq)溶解在无水乙醇(100ml)中,将75ml该溶液缓慢地滴加到该反应混合物内。通过二氧化硅TLC纯化该反应,用二氯甲烷、甲醇、浓(0.88sg)氨水;100/30/5展开,通过用茚三酮喷雾和加热来使TLC平板显色。观察到了一、二和三烷基化产物,其RF值以该顺序增加。使用RPR反相柱进行分析HPLC,用7.5-75%乙腈在3%氨水中的混合物进行梯度洗脱。将该反应真空浓缩以除去乙醇,悬浮在水(110ml)中。将该水浆液用乙醚(100ml)萃取以除去某些三烷基化化合物和亲脂性杂质,使得在水层中留下一烷基化产物和所需的二烷基化产物。将该水溶液用乙酸铵(2eq,4.3g,55.8mmol)缓冲以保证良好的色谱纯化。将该水溶液在4℃保藏过夜,然后通过自动制备HPLC纯化。
产率(2.2g,6.4mM,23%)。
质谱:阳离子10V锥形电压。实测值:344;计算的M+H=344。
NMR1H(CDCl3),δ1.24(6H,s,2xCH3),1.3(6H,s,2xCH3),1.25-1.75(7H,m,3xCH2,CH),(3H,s,2xCH2),2.58(4H,m,CH2N),2.88(2H,t CH2N2),5.0(6H,s,NH2,2xNH,2xOH).
NMR1H((CD3)2SO)δ1.14xCH;1.29,3xCH2;2.1(4H,t, 2xCH2);
NMR13C((CD3)2SO),δ9.0(4xCH3),25.8(2xCH3),31.0 2xCH2,34.6 CH2,56.8 2xCH2N;160.3,C=N.
HPLC条件:流速8ml/分钟,使用25mm PRP柱
A=3%氨溶液(sp.gr=0.88)/水。
B=乙腈
时间 %B
0 7.5
15 75.0
20 75.0
22 7.5
30 7.5
每次运转加3ml水溶液,在12.5-13.5分钟的时间窗口收集。
实施例7:制备化合物10
合成途径如图2所示。
7(a)4-(1-叔丁氧基羰基-2-甲基-丙基氨磺酰基)-苯甲酸甲酯(化合物1*)
在室温向2-氨基-3-甲基-丁酸叔丁酯(H-D-Val-OtBu.HCl)(500mg,2.38mmol)在乙腈(20ml)内的搅拌着的悬浮液中加入吡啶(767μl,9.52mmol)。迅速获得了澄清无色溶液。然后滴加4-氯磺酰基-苯甲酸甲酯(670mg,2.86mmol)在乙腈(6ml)中的溶液,该混合物变为浅黄色,在室温搅拌4小时。通过TLC(EtOAc/己烷,1∶1)监测该反应。将溶剂蒸发,加入乙酸乙酯(50ml)和饱和碳酸氢钠溶液(10ml)。将该混合物转移到分液漏斗内,剧烈摇晃。然后分离各相,将乙酸乙酯相用盐水洗涤(10ml),干燥(MgSO4),过滤并蒸发,获得了粗产物。通过快速色谱法纯化(乙酸乙酯/己烷,1∶1),获得了纯的产物,为白色固体。产量880mg(99.55%)。
7(b)4-[(1-叔丁氧基羰基-2-甲基-丙基)-吡啶-3-基甲基-氨磺酰基]-苯甲酸甲酯(化合物2*)
在室温向4-(1-叔丁氧基羰基-2-甲基-丙基氨磺酰基)-苯甲酸甲酯(化合物1*-884mg,2.38mmol)在二甲基甲酰胺(30ml)内的搅拌着的溶液中加入碳酸铯(10.86g,33.34mmol)。然后向该悬浮液中加入3-吡啶甲基氯盐酸盐(546mg,3.33mmol),将该反应混合物在室温搅拌24小时,这时TLC(EtOAc/己烷1∶1)监测表明反应完全。将该混合物蒸发至干,把残余物在乙酸乙酯(50ml)中搅拌。将乙酸乙酯相用水(1×50ml)萃取,干燥(MgSO4),过滤并蒸发,获得了粗产物,为棕色油状物。通过快速色谱法纯化该油状物,获得了纯的产物,为无色油状物。产量800mg(79.21%)。
7(c)4-[(1-羧基-2-甲基-丙基)-吡啶-3-基甲基-氨磺酰基]-苯甲酸甲酯(化合物3*)
将酯(化合物2*-321mg,0.75mmol)溶解在二氯甲烷(15ml)中,冷却至-10℃。向该溶液中通入10分钟的氯化氢气体。将该反应混合物密封,温热至室温,搅拌16小时。将溶剂蒸发,把残余物与二氯甲烷(2×10ml)共蒸发,获得了产物,为白色泡沫状物(278mg,产率为83.73%).
7(d)4-[(1-羟基氨基甲酰基-2-甲基-丙基)-吡啶-3-基甲基-氨磺酰基]-苯甲酸甲酯(化合物5*)
将酸(化合物3*-112mg,0.28mmol)、1-羟基苯并三唑(39mg,0.29mmol)、4-甲基吗啉(297μl,1.4mmol)和O-叔丁基二甲基甲硅烷基)羟基胺(124mg,0.84mmol)溶解在二氯甲烷(8ml)中。加入N-[(二甲基氨基)丙基]-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐(73mg,0.38mmol),将该反应混合物搅拌24小时。将该反应混合物用水(10ml)稀释,用二氯甲烷(2×10ml)萃取。将合并的二氯甲烷相干燥(Na2SO4),过滤。向滤液中加入几滴氯化氢在二氧杂环己烷中的溶液,直接获得了游离的异羟肟酸(108mg)。
7(e)4-[(1-羟基氨基甲酰基-2-甲基-丙基)-吡啶-3-基甲基-氨磺酰基]-苯甲酸(化合物6*)
将2N氢氧化钠(200l)加到酯(化合物5*-32mg,0.072mmol)在甲醇(1ml)内的溶液中,将该混合物在室温搅拌。30分钟后,将该混合物蒸发至干,把残余物溶解在水(2ml)中。使用2N HCl将该溶液酸化。通过制备HPLC纯化后,获得了纯的产物,为白色粉末(28mg,产率为95.01%)。
7(f)4-[(1-羟基氨基甲酰基-2-甲基-丙基)-吡啶-3-基甲基-氨磺酰基]-N-{5-(2-羟基亚氨基-1,1-二甲基-丙基氨基)-3-[2-(2-羟基亚氨基-1,1-二甲基-丙基氨基)-乙基]-戊基}-苯甲酰胺(化合物10)
将酸(化合物6*)-12.5mg,0.031mmol)、1-羟基苯并三唑(3.68mg,0.027mmol)、4-甲基吗啉(17.4μl,0.124mmol)和N-[(二甲基氨基)丙基]-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐(8.06mg,0.042mmol)溶解在二甲基甲酰胺(2ml)中。加入螯合剂1(13mg,0.037mmol),将该反应混合物搅拌24小时。将溶剂蒸发后,获得了粗产物,直接通过HPLC纯化(梯度00_30_60)。产物为浅棕色树胶状物(2mg,产率为9%)。
实施例8:制备化合物11
化合物11的合成如图3所示。
8(a)2-(4-甲氧基-苯磺酰基氨基)-3-甲基-丁酸叔丁酯
在室温向2-氨基-3-甲基-丁酸叔丁酯(H-D-Val-OtBu.HCl)(500mg,2.38mmol)在乙腈(20ml)内的搅拌着的悬浮液中加入吡啶(767μl,9.52mmol)。迅速获得了澄清无色溶液。然后滴加4-甲氧基苯磺酰氯(541mg,2.62mmol)在乙腈(10ml)中的溶液,该混合物变为浅黄色,在室温搅拌。TLC(EtOAc/己烷,1∶1)监测表明该反应在3小时后完成。将乙腈蒸发后,把残余物置于二氯甲烷(30ml)后,分别用10%碳酸氢钠溶液(30ml)和水(30ml)萃取一次。然后分离各相,将二氯甲烷相干燥(Na2SO4),过滤并蒸发,获得了粗产物。通过快速色谱法纯化(乙酸乙酯/己烷,1∶1),获得了纯的产物,为白色固体。产量801mg(93.90%)。
8(b)4-{[(1-叔丁氧基羰基-2-甲基-丙基)-(4-甲氧基-苯磺酰基)-氨基]-甲基}苯甲酸甲酯(化合物7*)
在室温向2-(4-甲氧基-苯磺酰基氨基)-3-甲基-丁酸叔丁酯(140mg,0.41mmol)在乙腈(5ml)内的搅拌着的溶液中加入碳酸铯(1.33g,4.10mmol)。然后将4-(溴甲基)苯甲酸甲酯(115mg,0.50mmol)加到该悬浮液中,将该反应混合物在70℃搅拌1小时,这时TLC(EtOAc/己烷1∶1)监测表明反应完全。冷却至室温后,将该混合物过滤以除去过量碳酸铯,蒸发至干。通过快速色谱法纯化残余物(EtOAc/己烷1∶1),获得了纯的产物,为浅黄色油状物。产量153mg(76%)。
8(c)4-{[(1-叔丁氧基羰基-2-甲基-丙基)-(4-甲氧基-苯磺酰基)-氨基]-甲基}-苯甲酸(化合物8*)
将二酯(化合物7*)(151mg,0.31mmol)溶解在四氢呋喃(2ml)中,在室温加入4N LiOH(250μl)。将该混合物在60℃加热5小时,HPLC监测表明水解完全。将该混合物冷却至室温,将溶剂蒸发。把残余物溶解在水中,用乙醚将该澄清溶液萃取一次。然后把水相冷却至5℃(冰/水),用1N HCl中和,然后用乙酸乙酯(3×5ml)萃取。将合并的乙酸乙酯相用水(5ml)和盐水(5ml)萃取,干燥(Na2SO4)过滤并蒸发,获得了产物,为白色泡沫状物。产量133mg(90%)。
8(d)2-[(4-{5-(2-羟基亚氨基-1,1-二甲基-丙基氨基)-3-[2-(2-羟基亚氨基-1,1-二甲基丙基氨基)-乙基]-戊基氨基甲酰基}-苄基)-(4-甲氧基-苯磺酰基)-氨基]-3-甲基-丁酸叔丁酯(化合物9*)
向在二甲基甲酰胺(4ml)内的酸(化合物8*)(61mg,0.13mmol)中加入N,N-二异丙基乙胺(46μl,0.26mmol)、N-[(二甲基氨基)-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶-1-基亚甲基]甲基甲烷六氟磷酸铵N-氧化物,HATU(49mg,0.15mmol)和C-Pn216(51mg,0.15mmol)。将该反应混合物在室温搅拌,1小时后,HPLC表明完全转化为新的产物。将该混合物蒸发至干,通过快速色谱法纯化(氯仿∶甲醇,8/2)纯化之后,分离出了纯的产物,为白色结晶。产量66mg。
8(e)2-[(4-{5-(2-羟基亚氨基-1,1-二甲基-丙基氨基)-3-[2-(2-羟基亚氨基-1,1-二甲基丙基氨基)-乙基]-戊基氨基甲酰基}-苄基)-(4-甲氧基-苯磺酰基)-氨基]-3-甲基-丁酸(化合物10*)
将二氯甲烷(4ml)加到叔丁酯(化合物9*)(64mg,0.08mmol)中,向在室温获得的该乳色溶液中通入氯化氢气体10分钟。将该混合物蒸发至干,将残余物与二氯甲烷(5×5ml)共蒸发,获得了产物,为灰白色固体。产量58mg(97%)。M+1=747。
8(f)4-{[(1-羟基氨基甲酰基-2-甲基-丙基)-(4-甲氧基-苯磺酰基)-氨基]甲基}-N-(5-(2-羟基亚氨基-1,1-二甲基-丙基氨基)-3-[2-(2-羟基亚氨基-1,1-二甲基-丙基氨基)-乙基]-戊基}-苯甲酰胺(化合物11)
将异羟肟酸通过叔丁基二甲基甲硅烷基保护的中间体(化合物11*)连接上去。因此,将酸(化合物10*)(57mg,0.76mmol)、4-甲基吗啉(34μl,0.30mmol)、[7-氮杂苯并三唑-1-基氧基三(吡咯烷子基)鏻六氟磷酸盐]PyAOP,40mg,0.076mmol)和O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)羟基胺(12mg,0.08mmol)在二甲基甲酰胺(4ml)中的混合物于室温搅拌,通过HPLC监测反应。3小时后停止反应,将溶剂蒸发。把残余物再溶解在二氯甲烷中,在室温向该混合物中通入氯化氢气体10分钟。将该混合物蒸发至干,将残余物与二氯甲烷(5×5ml)共蒸发。HPLC纯化之后获得了产物,为白色粉末,M+H,762。产量15mg。
实施例9:制备化合物18
9(a)2-[[4-(2-{2-[2-(2-叠氮基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙基氨基甲酰基)-苄基]-(4-甲氧基-苯磺酰基)-氨基]-3-甲基-丁酸叔丁酯(化合物12*)
向在二甲基甲酰胺(6ml)内的酸(化合物8*;140mg,0.30mmol)中加入N,N’-二异丙基乙胺(104.51μl,0.60mmol)、N-[(二甲基氨基)-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶-1-基亚甲基]甲基甲烷六氟磷酸铵N-氧化物,HATU(114mg,0.30mmol)和2-{2-[2-(2-叠氮基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙胺(65.50mg,0.30mmol)。将该反应混合物在室温搅拌,2小时后,HPLC表明完全转化为新的产物。将该混合物蒸发至干,通过快速色谱法纯化(乙酸乙酯)纯化之后,分离出了纯的产物,为无色油状物。产量142mg(70%)。
9(b)2-[[4-(2-{2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙基氨基甲酰基)-苄基]-(4-甲氧基-苯磺酰基)-氨基]-3-甲基-丁酸叔丁酯(化合物13*)
向叠氮化物(化合物12*;200mg;0.29mmol)在THF(5ml)内的搅拌着的冷却至0℃(冰/水)的溶液中加入三苯基膦(84,0.32mmol)。在该温度下搅拌5分钟后,移去冷却浴,继续在室温搅拌19小时。然后加入水(200μl),15分钟后,分析(HPLC)表明水解完全。将溶剂蒸发,通过快速色谱法纯化油状残余物,首先用CHCl3/甲醇(8∶2)洗脱,然后用CHCl3/甲醇/H2O洗脱,获得了化合物,为无色油状物。产率134mg(71%)。M+652
9(c)2-[{4-[2-[2-{2-[2-(4-羧基-丁酰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙基氨基甲酰基]-苄基]-(4-甲氧基-苯磺酰基)-氨基}-3-甲基-丁酸叔丁酯CA1(化合物14*)
将胺(化合物13*;73mg,0.11mmol)、N,N-二异丙基乙胺(39μl,0.22mmol)和活性酯4-{5-(2-羟基亚氨基-1,1-二甲基-丙基氨基)-3-[2-(2-羟基亚氨基-1,1-二甲基-丙基氨基)-乙基]-戊基氨基甲酰基}-硫代丁酸2,3,5,6-四氟-苯基酯(b;85mg,0.11mmol)在二甲基甲酰胺(5ml)中的溶液于室温搅拌2小时,这时HPLC表明该反应已经完全。将该混合物蒸发至干,通过快速色谱法纯化残余物(CHCl3/MeOH,8∶2),获得了产物,为树胶状物。产量54mg(45%)。
9(d)2-[{4-[2-(2-{2-[2-(4-羧基-丁酰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙基氨基甲酰基]-苄基}-(4-甲氧基-苯磺酰基)-氨基]-3-甲基-丁酸cPn216,(化合物15*)
将二氯甲烷(5ml)加到叔丁酯(化合物14*;50mg,0.046mmol)内,向在室温获得的该乳色溶液中通入氯化氢气体10分钟。将该混合物蒸发至干,将残余物与二氯甲烷(5×5ml)共蒸发,获得了产物,为白色固体。产量47mg(99%).M+1=1035。
9(e)4-[2-(2-{2-[2-(4-{[(1-羟基氨基甲酰基-2-甲基-丙基)-(4-甲氧基-苯磺酰基)-氨基]-甲基}-苯甲酰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙基氨基甲酰基]-丁酸cPn216(化合物18)
将异羟肟酸通过叔丁基二甲基甲硅烷基保护的中间体连接上去。因此,将酸(化合物15*;47mg,0.045mmol)、4-甲基吗啉(20μl,0.18mmol)、[7-氮杂苯并三唑-1-基氧基三(吡咯烷子基)鏻六氟磷酸盐]PyAOP(a;23.5mg,0.045mmol)和O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)羟基胺(10mg,0.07mmol)在二甲基甲酰胺(4ml)中的混合物于室温搅拌,通过HPLC监测反应。1小时后停止反应,将溶剂蒸发。把残余物再溶解在二氯甲烷中,在室温向该混合物中通入氯化氢气体10分钟。将该混合物蒸发至干,将残余物与二氯甲烷(5×5ml)共蒸发。HPLC纯化之后获得了产物,为白色粉末,M+H,1050,产量7mg(15%)。
实施例10:制备化合物
10(a)2-[{4-[2-(2-{2-[2-(2-羧基甲氧基-乙酰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙基氨基甲酰基]-苄基}-(4-甲氧基苯磺酰基)-氨基]-3-甲基丁酸叔丁酯(化合物17*)
将胺(化合物13*;60mg,0.092mmol)、N,N’-二异丙基乙胺(96μl,0.55mmol)和二甘醇酸酐(66mg,0.55mmol)在二甲基甲酰胺(6ml)中的混合物于室温搅拌3小时,这时HPLC表明该反应已经完全。将溶剂减压蒸发,把残余物溶解在含有0.1%TFA的乙腈中。在室温搅拌5分钟后,将该混合物蒸发至干,通过快速色谱法纯化粗产物,使用CHCl3/MeOH/H2O,65∶25∶4。获得了产物,为白色泡沫状物。产量70.50mg(99.80%)。
10(b)2-[{4-[2-(2-{2-[2-(2-羧基甲氧基-乙酰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙基氨基甲酰基]-苄基}-(4-甲氧基苯磺酰基)-氨基]-3-甲基丁酸叔丁酯-CA1缀合物(化合物18*)
向在二甲基甲酰胺(5ml)内的酸(化合物17*;70.50mg,0.092mmol)中加入N,N’-二异丙基乙胺(32μl,0.184mmol)、N-[(二甲基氨基)-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶-1-基亚甲基]甲基甲烷六氟磷酸铵N-氧化物,HATU(38mg,0.10mmol)和螯合剂1(CA1;34mg,0.10mmol)。将该反应混合物在室温搅拌,6小时后,HPLC表明基本上完全转化为新的产物。将该混合物蒸发至干,通过制备HPLC色谱法纯化(乙腈∶水∶0.1%三氟乙酸,10∶80∶60)之后,分离出了纯的产物,为白色晶体。产量21mg(21%)。
10(c)2-[{4-[2-(2-{2-[2-(2-羧基甲氧基-乙酰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙基氨基甲酰基]-苄基}-(4-甲氧基苯磺酰基)-氨基]-3-甲基丁酸叔丁酯-CA1缀合物(化合物19*)
将二氯甲烷(3ml)加到叔丁酯(化合物18*;20mg,0.018mmol)内,向在室温获得的该乳色溶液中通入氯化氢气体60分钟。将该混合物蒸发至干,将残余物与二氯甲烷(5×5ml)共蒸发,获得了产物,为灰白色固体。产量18mg(95%)。M+1=1037。
10(d){[2-(2-{2-[2-(4-{[(1-羟基氨基甲酰基-2-甲基-丙基)-4-(4-甲氧基-苯磺酰基)-氨基]-甲基}苯甲酰基氨基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)-乙基氨基甲酰基]-甲氧基}乙酸-CA1缀合物(化合物19)
将异羟肟酸通过叔丁基二甲基甲硅烷基保护的中间体连接上去。因此,将酸(化合物19*;18mg,0.017mmol)、4-甲基吗啉(8μl,0.70mmol)、[7-氮杂苯并三唑-1-基氧基三(吡咯烷子基)鏻六氟磷酸盐]PyAOP(9.4mg,0.017mmol)和O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)羟基胺(4mg,0.026mmol)在二甲基甲酰胺(2ml)中的混合物于室温搅拌,通过HPLC监测反应。2小时后停止反应,将溶剂蒸发。把残余物(化合物*)再溶解在二氯甲烷中,在室温向该混合物中通入氯化氢气体10分钟。将该混合物蒸发至干,将残余物与二氯甲烷(5×3ml)共蒸发。HPLC纯化之后获得了产物,为白色粉末,M+H,1052,产量4mg(22.35%)。
实施例11:用99mTc标记化合物10、11、12、18和19以分别生成化合物1、2、3、16和17
通过将10mg SnCl2和90mg MDP溶解在100ml氮气催扫过的盐水中来制得SnCl2/MDP溶液。向50μl 1mg/ml的一种化合物10、11或12在甲醇内的溶液中加入:(1)0.7ml甲醇,(2)0.5ml 0.1M碳酸钠缓冲液,(3)0.5ml 500MBq/ml TcO4和(4)100μlSnCl2/MDP溶液。将该反应混合物在37℃加热30分钟以分别形成一种化合物1、2和3。
实施例12:制备化合物4
图4显示了制备化合物4的合成途径。将4μl[123I]NaI在0.05NNaOH溶液中的溶液(12.04MBq)、39μl化合物13溶液(c=1.23g/lMeOH)和71μl NCS-溶液(NCS=N-氯琥珀酰亚胺)(c=0.579g/l注射用水)加到锥形瓶中。
将该混合物涡旋1分钟,任何在室温于黑暗条件下摇动60分钟。然后加入25μlNa2S2O3溶液(c=2.00g/l注射用水),将该混合物再次涡旋。
将该溶液注射到梯度HPLC色谱系统上,该装置具有γ-和UV检测器和NucleosilTM反相C-185μ250×4mm2柱,该柱具有相应的20×4mm2前柱。
HPLC-条件:
洗脱剂A:CH3CN/H2O/TFA 950/50/1
洗脱剂B:CH3CN/H2O/TFA 50/950/1
时间程序:在45分钟内洗脱剂B由92%变为50%,然后在10分钟内由50%变为92%
流速: 1.5ml/分钟
λ: 254nm
Rt(产物级分)18.50-19.80分钟
将该级分蒸发至干,再溶解在200μlPBS缓冲液内,使用相同条件再注射到梯度HPLC系统上。
Rt(化合物)17.40-18.70分钟。
该产物的质量控制(HPLC,相同条件)在γ-和UV检测中没有表现出任何杂质。放射化合物的产率为44%。
实施例13:制备化合物5
化合物5是化合物的125I变型。其是使用在实施例12中描述的相同方法制得的,但是使用[125I]NaI代替[123I]NaI。
实施例14:制备化合物6
将0.6mg 2,5-二羟基苯甲酸、0.8mg抗坏血酸、20μl注射用水和5μl CuSO4·5H2O溶液(c=3.26g/l注射用水)加到含有50μl化合物14(c=2.00g/l EtOH)的锥形瓶中。使用He气流将该冰冷的混合物脱气10分钟。加入4μl[125I]NaI在0.05N NaOH溶液中的溶液(8.68MBq),并涡旋。将该混合物在113℃加热51分钟,每5分钟摇动一次。然后将该溶液注射到HPLC色谱系统上,如实施例10所述进行HPLC。Rt(产物级分)17.18-19.54分钟。
将该级分蒸发至干,再溶解在200μl CH3CN/H2O/TFA:50/950/1内,再次注射到梯度HPLC系统上。化合物的Rt:21.05-21.36分钟。
该产物的质量控制(HPLC,相同条件)在γ-和UV检测中没有表现出任何杂质。Rt参数是通过将等份试样的化合物9(即非放射性化合物6)加到第二质量控制注射中来实现的。
平均放射化合物产率:23%(n=5)。
实施例15:制备化合物7
化合物7是通过与制备化合物6相同的方法制得的,但是使用[123I]NaI来代替[125I]NaI。
实施例16:制备化合物15
图7中显示了可用于制备化合物15的合成途径。
在合成途径A中,用氮气吹扫烧瓶,然后依次加入二氯(双三苯基膦)钯(II)(0.1equiv)和乙酸钾(3equiv)。加入N-甲基吡咯烷酮(5ml),然后依次加入化合物9(1equiv)和三丁基氢化锡(2equiv)。将该反应混合物于室温搅拌24小时。然后将该反应混合物用乙酸乙酯稀释,用水洗涤,用硫酸镁干燥。将溶剂蒸发,HPLC纯化之后,分离出了产物。
在合成途径B中,用氮气吹扫烧瓶,然后加入化合物14和无水甲苯。向该烧瓶中依次加入六丁基二锡和四(三苯基膦)钯。将该反应混合物加热回流24小时,获得了产物。
实施例17:制备化合物7
10μl 0.1mM Na127I在0.01M NaOH中的溶液加到200μl 0.2MNH4OAc(pH 4)中。然后将Na127I/NH4Oac溶液加到11.0μl Na123I在0.05M NaOH内的溶液(111MBq)中。将合并的溶液转移到硅化塑料瓶中。通过将5μl 36-40wt%的过乙酸在乙酸中溶液加到5ml H2O中来制备过乙酸溶液。然后将5μl制备的过乙酸溶液加到含有Na123/127I的瓶中。最后,将在硅化塑料瓶中的17μl 3mM三丁基锡前体(化合物15)溶液加到该反应混合物中,让该溶液静置3分钟。
使用具有γ-和UV检测器和反相Phenomenex C18(2)Luna 5μ,150×4.6mm柱的梯度HPLC色谱分析或纯化化合物7。
HPLC-条件
洗脱剂A:0.1%TFA的H2O水溶液
洗脱剂B:0.1%TFA在CH3CN中的水溶液
在20分钟的时间内洗脱剂B从20%变为80%。
20分钟80%B
20.2分钟100%B
23.2分钟100%B
23.7分钟20%B
流速:1mi/分钟
λ:254nm
Rt:7分钟
实施例18:测定MMP-2和MMP-9抑制活性
按照现有技术描述的方法[Huang等人,J.Biol.Chem.272 22086-22091(1997)]使用合成的广谱荧光底物(7-甲氧基香豆素-4-基)乙酰基pro-Leu-Gly-Leu-(3-(2,4-二硝基苯基)-L-2,3-二氨基-丙酰基)-Ala-Arg-NH2(R & D Systems)来测定MMP-2和MMP-9活性。如下所述测定CGS 27023和化合物8、9、13和14对MMP-2和MMP-9的抑制作用:将MMP-2(1nM)或MMP-9(2nM)和欲测定化合物以不同浓度(10pm-1mM)在含有0.2M NaCl、5mM CaCl2、20μM ZnSO4和0.05%Brij 35的50mM Tris-HCl,pH 7.5中于37℃预培养30分钟。然后将等份试样(10μl)的底物(5μM)加到90μM欲培养的MMP/化合物混合物内,在37℃通过产物随时间的释放来测定活性。使用Fusion UniversalMicroplate Analyzer(Packard Bioscience)以分别设定为330和390nm的激发波长和发射波长来测定关于MMP-2和MMP-9的荧光变化。由其中产物释放与时间成线性关系的反应曲线的前10分钟测定抑制比例。使用XMGRACE 5.18软件在linux下进行非线性回归分析。
下表2给出了获得的所分析化合物的IC50值。
化合物 | MMP-2[nm] | MMP-9[nm] |
化合物8 | 320 | 153 |
化合物9 | 2.5 | 4.6 |
化合物13 | 57.5 | 257 |
化合物14 | 16.2 | 76.0 |
CGS 27023A | 11.2 | 59.6 |
表2:化合物8、9、13和14对MMP-2和MMP-9活性的抑制作用与CGS 27023A的比较。
实施例19:ApoE(-/-)小鼠模型
将ApoE(-/-)小鼠(4周大小,20-28g)通过腹膜内注射赛拉嗪/氯胺酮(Bayer,Germany)来进行麻醉。使用5-0丝线(Ethicon)将左颈动脉在分歧附近结扎。在假手术对照中,让缝线在左颈动脉下面穿过而不扎紧。让动物恢复一周,然后给予高胆固醇饮食(15%椰子油,1.0%胆固醇,0.5%胆酸钠)。手术后5周,使用小鼠进行组织病理学、放射自显影和成像试验。
实施例20:组织学和免疫组织化学方法
如实施例16所述,给ApoE-/-小鼠灌注Langendorff缓冲液3分钟。取出结扎部位以及左和右颈动脉,在液氮中迅速冷冻,不用进一步解剖。以同样的空间间隔收集每组由5个切片组成的组(10μm,用于组织病理学分析)。
切结扎部位以及左和右颈动脉的手术样本以获得系列低温切片(10μm),在显微镜载物片上风干,在3.75%PFA(MMP-9)中固定10分钟,4℃,丙酮10分钟(MAC3,550292,BD Pharmingen,California,USA)。将切片在苏木精和曙红中染色。为了进行免疫组织化学分析,10分钟,抗过氧化物酶试剂(S2001,DAKO,Denmark),1%BSA 25分钟,将切片与一抗(2μg/ml兔抗-小鼠MMP-9,AB19047,Chemicon,Germany)在室温培养(30分钟)或与对照抗体(兔IgG,E0432,DAKO,Denmark)在室温培养1小时,其中培养在具有背景还原组分(S3022,DAKO,California,USA)的抗体稀释液中进行,并且按照供应商的说明进行处理。山羊抗-兔IgG(H+L)生物素缀合的(AB132B,1∶500,Chemicon,Germany)25分钟。链霉抗生物素蛋白-HRP(LSAB试剂盒,K0675,California,USA)25分钟,AEC(K0696,DAKO,California,USA)20分钟,苏木精1分钟,H2O 1-2分钟。
图8显示了免疫组织化学分析结果以及放射自显影结果,这些结果表明摄取量与MMP-9的存在相关。
实施例21:体内放射自显影
在给予放射配体之前2小时,给4只结扎的ApoE-/-小鼠在眼眶后注射0.5μCi(20MBq)在0.2ml 0.9%NaCl中的化合物5和CGS 27023(6mM,在200μl 0.9%NaCl中,用于非特异性结合)或盐水,注射之后2小时将小鼠处死。迅速取出结扎部位以及左和右颈动脉,切成冷冻切片,然后加工成60μm的切片以进行微放射自显影。
图8显示了放射自显影结果以及如在实施例17中描述的免疫组织化学分析结果。
实施例22:体内成像
将化合物4经由眼眶后静脉血管从注射,在使用超高分辨率准直仪的Siemens MULTISPECT 3γ照相机上进行平面成像。用1分钟框架的初始成框获得动态影像,加和至10分钟框架进行分析。通过环形ROt(感兴趣区域)分析斑面积,产生TAC(时间活性曲线)。
试验A:将在200μl 0.9%NaCl中的9MBq化合物4注射到各只小鼠(小鼠1-6)内,注射后在最长达120分钟拍摄动态影像。产生TAC,结果表明,在120分钟的时间内,结扎区域中标记的化合物的摄取量不断增加(见图9)。
试验B:2天后,将在200μl 0.9%NaCl中的6mM CGS 2702注射到取自上一试验的小鼠4和5内,2小时后,给小鼠4和5注射在200μl0.9%NaCl中的7.5MBq化合物4。也给小鼠1-3注射在200μl 0.9%NaCl中的7.5MBq化合物4,但是没有进行冷的预先给药。在120分钟的时间内获得动态影像(图10),并产生TAC。比较试验A中没有进行预先给药与试验B中进行预先给药的小鼠4和5中的摄取量,结果表明在预先给药的动物中有较低的摄取量(见图11)。
在试验A期间另外测定肝脏、肾、膀胱、脑和胸的ROI。对于每个ROI,计算衰减校正的TAC,标准化到10分钟p.i.活性,即每秒标准化的计数(见图12)。
Claims (34)
1.包含用γ-发射放射性核素标记的式I所示基质金属蛋白酶抑制剂的诊断造影剂:
R1选自氢、羟基、C1-6烷基、C6-14芳基、C7-20芳基烷基,或者与R5及其所连接的碳一起形成C6-8环烷基环或C4-6杂环基环,或者与R4一起形成含有5-7个原子和1或2个选自N或O的杂原子的C4-6杂环基环;
R2和R3独立地为氢、羟基、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6氨基、C6-14芳基、C7-20芳基烷基或C7-20氨基甲酰基芳基;
R4是C6-14芳基、C4-6杂芳基、C7-20芳基烷基、C7-20氨基甲酰基芳基或芳基氨基甲酰基芳基;且
R5选自氢或C1-6烷基。
2.权利要求1的诊断造影剂,其中:
R1选自C1-6烷基、C6-14芳基或C7-20芳基烷基,或者与R5及其所连接的碳一起形成C4-6杂环基环;
R2是氢、羟基、甲基、异丙基、甲氧基或卤素;
R3是氢;
R4是吡啶基或(Ar1)y-(R)z(NH)-苯基,其中Ar1是亚苯基,R是CH2或C=O,y=0或1,且z=0或1;且
R5是氢。
3.权利要求1或2的诊断造影剂,其中:
R1是甲基、异丁基、异丙基、苄基或羟基苄基;
R2是羟基、卤素或甲氧基;
R3是氢;
R4是吡啶基或(Ar1)y-(R)z(NH)-苯基,其中Ar1是1,4-亚苯基,R是CH2或C=O,y=0或1,且z=0或1;且
R5是氢。
5.权利要求1-4的诊断造影剂,其中一个R1-R4包含所述γ-发射放射性核素。
6.权利要求1-5的诊断造影剂,其中R2在磺酰胺的对位,且R3在磺酰胺的间位。
7.权利要求1-6的诊断造影剂,其中所述γ-发射放射性核素是选自99mTc、111In、113mIn、67Cu或67Ga的γ-发射放射性金属。
8.权利要求7的诊断造影剂,其中所述γ-发射放射性金属作为γ-发射放射性金属与一个或多个配体的金属络合物的一部分存在。
9.权利要求8的造影剂,其中所述金属络合物连接在式I的R1、R2或R4位上。
10.权利要求8和9的诊断造影剂,所述诊断造影剂是式II所示造影剂:
[{基质金属蛋白酶抑制剂}-(A)n]m-[金属络合物](II)其中:-(A)n-是连接基团,其中每个A独立地为CR’2、CR’=CR’、C≡C、CH2CH2O、CR’2CO2、CO2CR’2、NR’CO、CONR’、NR’(C=O)NR’、NR’(C=S)NR’、SO2NR’、NR’SO2、CR’2OCR’2、CR’2SCR’2、CR’2NRCR’2、C4-8亚环杂烷基、C4-8亚环烷基、C5-12亚芳基或C3-12亚杂芳基;
R’独立地选自H、C1-4烷基、C2-4链烯基、C2-4炔基、C1-4烷氧基烷基或C1-4羟基烷基;
n是0-50的整数;且
m是1、2或3。
11.权利要求8-10的诊断造影剂,其中所述一个或多个配体包含具有选自二胺二肟、N3S、N2S2、N4和N2O2的供体部分的鳌合剂。
12.权利要求1-6的诊断造影剂,其中所述γ-发射放射性核素是碘的γ-发射同位素。
13.权利要求12的诊断造影剂,其中所述碘的γ-发射同位素是123I。
14.权利要求12和13的诊断造影剂,其中所述碘的γ-发射同位素在式I或式Ia的芳环的3-或4-位通过直接的共价键连接。
15.包含式I或式Ia所示基质金属蛋白酶抑制剂的配体缀合物,所述抑制剂与适于配位选自99mTc、111In、113mIn、67Cu或67Ga的γ-发射放射性金属的配体缀合。
16.权利要求15的配体缀合物,其中所述缀合物是式IIa所示缀合物:
[{基质金属蛋白酶抑制剂}-(A)n]m-[配体](IIa)
其中(A)n、n和m如权利要求9中的式II所定义。
17.权利要求16的配体缀合物,其中所述配体是鳌合剂,其中在所述鳌合剂中,排列2-6个金属配位原子以形成用于金属配位的5或6元螯合剂环。
18.权利要求17的配体缀合物,其中所述鳌合剂选自二胺二肟、N3S配体、N2S2配体、N4配体和N2O2配体。
19.包含权利要求1-14任一项的诊断造影剂与生物相容载体的适于哺乳动物给药形式的药物组合物。
20.权利要求19的药物组合物,其中所述组合物包含权利要求7-11的诊断造影剂。
21.权利要求19的药物组合物,其中所述组合物包含权利要求12-14的诊断造影剂。
22.用于制备权利要求12-14的诊断造影剂的前体,所述前体包含适于与碘的γ-发射同位素反应以生成所述诊断造影剂的基团。
23.权利要求22的前体,其中所述适于与碘的γ-发射同位素反应的基团选自芳基碘、芳基溴、苯酚基团、三烷基锡衍生物、三烷基甲硅烷基衍生物、三氮烯基团或芳基重氮盐。
24.用于制备权利要求19-21的药物组合物的药盒。
25.权利要求24的药盒,其中所述药物组合物如权利要求20所限定,所述药盒包含权利要求15-18的配体缀合物。
26.权利要求25的药盒,其中所述γ-发射放射性金属是99mTc。
27.权利要求25和26的药盒,其中所述药盒还包含生物相容还原剂。
28.权利要求27的药盒,其中所述生物相容还原剂是Sn2+。
29.权利要求24的药盒,其中所述药物组合物如权利要求21所限定,所述药盒包含权利要求22和23的前体。
30.权利要求19-21的药物组合物在心血管疾病的诊断成像中的应用。
31.权利要求30的应用,其中所述心血管疾病是动脉粥样硬化。
32.权利要求30的应用,其中所述心血管疾病是充血性心力衰竭。
33.权利要求19-21的药物组合物在炎性疾病的诊断成像中的应用。
34.权利要求33的应用,其中所述炎性疾病是慢性阻塞性肺病。
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