CN1743455B

CN1743455B - 人载脂蛋白ai米兰突变体基因及其表达方法

Info

Publication number: CN1743455B
Application number: CN 200410073662
Authority: CN
Inventors: 刘志敏; 黎明; 赵洪亮; 薛冲; 张伟; 熊向华
Original assignee: Institute of Bioengineering Chinese Academy of Military Medical Sciences
Current assignee: Institute of Bioengineering Chinese Academy of Military Medical Sciences
Priority date: 2004-09-02
Filing date: 2004-09-02
Publication date: 2010-04-14
Anticipated expiration: 2024-09-02
Also published as: CN1743455A

Abstract

本发明公开了一种人载质蛋白AI米兰突变体基因及其表达方法。本发明所提供的人载质蛋白AI米兰突变体基因，其核苷酸序列如序列表中序列3所示。将含有该人载脂蛋白AI米兰突变体基因的重组表达载体导入大肠杆菌中，培养所得到的重组大肠杆菌，表达得到人载脂蛋白AI米兰突变体。本发明为proAIM和AIM的功能研究和应用研究奠定了物质基础。

Description

人载脂蛋白AI米兰突变体基因及其表达方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域中一种人载质蛋白AI米兰突变体基因及其表达方法。

背景技术

载脂蛋白AI米兰突变体(apolipoprotein A-I-Milano，AIM)是载脂蛋白AI(apolipoprotein AI，apoAI)的天然突变体。具有比apoA-I更强的抗动脉粥样硬化症的功能。

apoA-I是高密度脂蛋白(High-density lipoprotein，HDL)最主要的蛋白成分，与HDL颗粒的形成和代谢有关。它作为胆固醇的受体与动脉管壁细胞上胆固醇结合，将胆固醇从动脉管壁排出到HDL表面；它还是卵磷脂-胆固醇酰基转移酶(Lecithin-cholesterol acyltransferase，LCAT)的主要激活剂，激活LCAT将胆固醇变成胆固醇酯并进入HDL的内部；它还作为肝细胞上HDL受体的配体与肝细胞结合，将胆固醇转移至肝进行代谢。因此，apoA-I在胆固醇的逆向转运(Reversecholesterol transport，RCT)和HDL代谢中中起关键作用。胆固醇的逆向转运是将散布、沉积在周围组织中未脂化的胆固醇经LCAT的催化转化成胆固醇酯进入HDL，然后转运到肝脏，在肝脏进行代谢，排入胆囊。

研究证明，血浆中HDL的含量与冠状动脉疾病(Coronary artery disease，CAD)的发生呈负相关性，即HDL含量越高，CAD的发病率越低。流行病学调查表明，人群中HDL-胆固醇水平低于0.907mmol/L(＜35mg/dL)者，冠心病发病的危险性为HDL-胆固醇(HDL-cholesterol，HDL-C)高于1.68mmol/L者的8倍。HDL-C水平每上升0.026mmol/L(1mg/dL)，患冠心病的危险性则下降2％-3％。研究认为，HDL的这种功能主要是由于apoA-I的作用，通过RCT，将动脉管壁中的胆固醇转运到肝的缘故；并表明，血浆中apoA-I的水平与CAD和冠状动脉损伤呈负相关(Sedlis SP，et al(1986)Circula tion 73：978-984)。

AIM是第一个被发现的apoAI的天然变体(Franceschini G，et al(1980).A-I_Milanoapoprotein.Decreased high density lipoprotein cholesterol levels withSignificant lipoprotein modifications and without clinical atherosclerosisin an Italian family.J Clin Invest 66：892-900)，AIM与apoA-I的主要区别在于apoAI的Arg¹⁷³突变成Cys¹⁷³，70％的AIM通过Cys¹⁷³之间的二硫键形成二聚体，30％的AIM仍以单体形式存在。AIM二聚体的每条单链由243个氨基酸组成。在生理状态下，AIM是在肝脏和小肠合成的，合成时经蛋白质翻译后加工，每条单链的N端都保留了6个氨基酸的前肽序列；AIM分泌入血后在血浆中这6个氨基酸被特异性的蛋白酶酶解而形成成熟的AIM，进而发挥生理功能。

AIM主要存在于意大利一个村庄的部分居民中。携带有AIM的居民血浆中高密度脂蛋白胆固醇的含量比正常人低，甘油三脂的含量却比正常人高，尽管存在这些危险因素，但是这些居民却很少患冠状动脉疾病，而且长寿。研究表明，这是由于AIM具有独特的结构和功能特性，而AIM单体和apoA-I却具有非常相似的性质。与apoAI相比较，AIM的构象更稳定，在血浆中的半衰期延长(Calabresi L，et al(1991)..JBiol Chem 269：32168-74)；而且，链间二硫键使AIM形成了一个新的结构域，结合脂的能力大大增强，能更有效地排出细胞中的胆固醇，且较少的底物就可激活LCAT；同时，AIM单体游离的巯基还可以防止脂类物质的氧化，因此，AIM比apoAI的抗动脉粥样硬化的能力更强。

Franceschini等用含AIM的sHDL多次注射用胆固醇喂养的载脂蛋白E缺陷鼠，可明显减轻动脉粥样硬化症的进程，减少斑块中脂和巨噬细胞的含量，降低炎症反应(Shah PK，et al(1998).Circulation 97：780-785)。用类似的方法，Soma等在周围颈动脉伤害动物模型上也观察到了相似的结果。这些结果都证明AIM可治疗和预防动脉粥样硬化症。此外，Ameli等用含AIM的sHDL多次注射用胆固醇喂养的兔，还有效地抑制了血管成形术后的再狭窄70％。基于大量的实验依据，Esperion公司以治疗动脉粥样硬化症作为适应症，在临床前的动物试验中，采用高剂量的重组AIM注射载脂蛋白E缺陷鼠，能迅速排出周围组织细胞中的胆固醇，减少斑块中的脂质和巨噬细胞的含量，使斑块达到稳定的表型(Soma MR，et al(1995).Recombinantapolipoprotein A-I Milano dimmer inhibits carotid intimal thickening inducedby perivascular manipulation in rabbits.Cir Res 76：405-411)。据源自美国FDA生物制品研究与开发公告，Esperion公司研制的重组AIM以动脉粥样硬化症为适应症，已完成I期临床试验，目前已进入II期临床研究阶段。因此，重组AIM有可能成为理想的治疗和预防动脉粥样硬化症的新药。

动脉粥样硬化斑块形成是动脉粥样硬化心血管病和动脉粥样硬化脑血管病的主要病因。该病症现在尚无良药可治，美国和欧州有1/3的人口患有动脉粥样硬化心脑血管疾病，我国也有近一亿人患有动脉粥样硬化心脑血管疾病，该病是全世界发病率最高、预防和治疗花费最多的病种之一。因而，抗动脉粥样硬化药(ant iatherosclerotic drugs)的研究目益受到重视，世界各大制药公司都在全力开发治疗该病的药物，但现在尚是空白。AIM和apoA-I对治疗动脉粥样硬化疾病药物的研制具有特别重要的意义，为防病治病带来十分诱人的前景。

AIM的临床用量很大，临床剂量在克级水平，因此，AIM用于临床治疗不可能从血液中提取，必须依赖基因工程技术进行重组产品的大规模生产。

近年来，随着apoA-I分子生理功能的发现，已有人尝试用基因工程技术来表达apoA-I，已有apoA-I在CHO细胞和杆状病毒昆虫表达系统获得表达的报道。据报道，apoA-I在CHO细胞中的表达水平很低；在杆状病毒昆虫表达系统中最高可达到80mg/L。但由于目前国际上用杆状病毒昆虫细胞表达系统生产重组产品其技术体系尚不成熟；再则，apoA-I是一种非糖基化蛋白，因而用原核表达系统表达apoA-I是一种较为理想的选择。

大肠杆菌表达系统是最早被用来生产重组蛋白质的，其大规模高密度的发酵工艺比较成熟。缺点是缺乏内质网、高尔基体等细胞器，不能对蛋白质进行有效的折叠和翻译后的修饰与加工。AIM是一个非糖基化蛋白，不必进行糖基化修饰，而且仅有一对二硫键。若能在大肠杆菌中获得高表达，也是一种较为理想的选择。

发明创造内容

本发明的一个目的是提供一种在大肠杆菌中具有较高表达量的人载脂蛋白AI米兰突变体基因。

本发明所提供的人载脂蛋白AI米兰突变体基因，名称为proAIME，具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中序列3的核苷酸序列；

2)与序列表中序列3限定的核苷酸序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

3)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID №：3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件为0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS，65℃。

本发明的人载脂蛋白AI米兰突变体基因含有由6个氨基酸残基组成的前肽的编码基因序列，即序列表中序列3的自5′端第1-18位碱基。序列表中序列3的自5′端第19-747位碱基为成熟肽AIM的编码基因。

含有上述人载脂蛋白AI米兰突变体基因的重组表达载体、细胞系和工程菌均属于本发明的保护范围，如重组表达载体pET22b-proAIME、pTIG-Trx-proAIME或pQE30-proAIME等，工程菌pET22b-proAIME/BL21(DE3)、pTIG-Trx-proAIME/BL2l(DE3)或pQE30-proAIME/JM109等。

本发明的另一个目的是提供一种表达上述人载脂蛋白AI米兰突变体基因的方法。

本发明所提供的表达上述人载脂蛋白AI米兰突变体基因的方法，是将含有上述人载脂蛋白AI米兰突变体基因的重组表达载体导入大肠杆菌中，培养所得到的重组大肠杆菌，表达得到人载脂蛋白AI米兰突变体。

所述大肠杆菌可为菌株BL21(DE3)、JM109、DH5α或HB101等。

用于构建所述含有上述人载脂蛋白AI米兰突变体基因的重组表达载的出发载体可为在能菌株BL21(DE3)中表达目的基因的pET系列载体(如pET22b)或pTIG-Trx；能在菌株JM109中表达目的基因的pQE30。

所述重组表达载体优选为pET22b-proAIME、pT IG-Trx-proAIME和pQE30-proAIME。

所述重组大肠杆菌可在碳源为葡萄糖型碳源、pH可为6-7的培养基中37℃培养至对数生长期，然后以0.5-1mmol/L的IPTG诱导表达3-8小时。

所述葡萄糖型碳源可为葡萄糖、甘露糖或甘油。

在本发明的方法中，将proAIME插入质粒、转化大肠杆菌宿主菌、大肠杆菌工程菌的筛选、工程菌的发酵以及产物的分离等技术基本上按本领域已知的常规方法进行(例如Sambrook等人，分子克隆：实验指南(第三版)(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，2001)。

为了提高proAIM(带有前肽的AIM基因)在大肠杆菌中的表达量、防止其降解，本发明将proAIM的N-末端的氨基酸密码子优化后得到基因proAIME，并构建了三种原核表达载体pET22b-proAIME、pTIG-Trx-proAIME和pQE30-proAIME，分别转化相应的宿主菌株BL21(DE3)和JM109，实验结果表明proAIM在pQE30-proAIM/JM109中表达量最高(请提供表达量的具体数值)，但存在部分包涵体；proAIM在pET22b-proAIM/BL21(DE3)中的表达量其次，其中在摇瓶里的表达量约为100mg/L，约占菌体总蛋的38％，在5升发酵罐上的表达量约为1-2g/L。proAIM在大肠杆菌里主要以单体的形式表达。表达产物经Butyl Sepharose 4F.F疏水层析和Q 5epharose HP阴离子交换层析后，再用Vivaspin20(30,000MW)进行超滤，proAIM单体的纯度达95％以上。

本发明表达的proAIM单体与脂结合活性表明，proAIM单体结合脂的速度比proapoA-I慢，但结合脂的量比proapoA-I高。N-末端氨基酸序列测定结果和理论序列一致。分子量测定结果与理论值相符。Western印迹表明，本发明表达的proAIM单体和二聚体都可以与apoA-I多克隆抗体发生反应。

据研究表明，在大肠杆菌表达系统中直接表达成熟的apoA-I时，由于apoA-I分子在宿主细胞内易降解，不稳定，因此表达量较低。而表达带有6个氨基酸前肽的apoA-I，不仅使表达水平显著提高，而且还能有效地防止apoA-I分子在宿主细胞内被降解，增加其分子结构的稳定性；另外，由于其前肽需要在血液中用特异性的蛋白酶酶解而形成成熟的apoA-I，因而还能断定，如果作为生物制品直接静脉注射proapoA-I和apoA-I二种蛋白分子，在血液中药物代谢的半衰期前者应该更长。在本发明中还发现，apoA-I和AIM的N端结构基因的密码子对目的基因的表达影响很大；且考虑上述apoA-I的前肽影响蛋白质结构的稳定性和增加表达量，故在本发明中，组合了保留6个氨基酸前肽和优化结构基因N端的密码子二项创新措施，直接表达带有前肽的N端密码子的proAIM结构基因。在本发明中，将proAIM结构基因的N端8个氨基酸和前肽的氨基酸密码子用大肠杆菌偏爱密码子作了同义突变，并用DNA Star软件对proAIM mRNA 5’端的基因序列进行优化，消除其DNA二级结构，进而将proAIME基因克隆到大肠杆菌表达载体上，结果表明，proAIM在大肠杆菌表达系统获得了高水平的表达，且目的蛋白分子稳定性好，在5L发酵罐中诱导表达16h，没有发现proAIM降解条带。另据蛋白质化学和生物大分子结构特性，由于proAIM同样需要在血液中用特异性的蛋白酶酶解而形成成熟的AIM，因而同样能够推断，proAIM在血液中代谢的半衰期应该较AIM更长。

本发明在大肠杆菌中获得可溶性表达的proAIM，表达产物直接分泌到细胞周质，发酵液内分泌表达的水平高达1-2g/L，且分离工艺简便。如果通过发酵生产工艺的优化，大肠杆菌工程菌还有进一步提高表达量的潜力。

本发明的基因及表达方法为proAIM和AIM的功能研究和应用研究奠定了物质基础。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

附图说明

图1a为PCR鉴定重组质粒pET22b-proAIME的电泳图谱

图1b为PCR鉴定重组质粒pTIG-Trx-proAIME的电泳图谱

图1c为PCR鉴定重组质粒pQE30-proAIME的电泳图谱

图2a为pET22b-proAIME/BL21(DE3)表达产物的SDS-PAGE分析图谱

图2b为pTIG-Trx-proAIME/BL21(DE3)表达产物的SDS-PAGE分析图谱

图2c为pQE30-proAIME/JM109表达产物的SDS-PAGE分析图谱

图2d为pET22b-proAIME/BL21(DE3)，pTIG-Trx-proAIME/BL21(DE3)和pQE30-proAIME/JM109表达的proAIM的百分含量比较柱状图

图3为pET22b-proAIME/BL21(DE3)表达的proAIM经Butyl柱和Q柱纯化后的SDS-PAGE分析图谱

图4为pET22b-proAIME/BL21(DE3)表达的proAIM与DMPC的结合曲线

图5为proAIM的Western印迹图谱

具体实施方式

质粒及培养条件

质粒pET22b(购买自Novagen公司)；质粒pTIG-Trx(质粒pTIG-Trx由质粒pET22b衍生而来，在T7启动子下游增加了硫氧还蛋白Trx基因)；质粒pQE30(刘纯杰等：幽门螺杆菌尿素梅B基因的克隆与高效表达。细胞与分子免疫学杂志2001；17(5)：464)。大肠杆菌用LB培养基培养。

工具酶和试剂

Pfx DNA聚合酶购自Invitrogen公司，限制性内切酶NdeI和EcoRI购自TaKaRa公司。T₄DNA连接酶购自华美公司。DMPC和从血浆中提取的人proApoA-I购自Sigma公司。Butyl Sepharose 4F.F.16×100mm为自装柱，其填料和Q Sepharose HighPerformance 16/100购自Pharmacia公司。

引物设计与合成

为了克隆AIM基因，先设计一对内部引物，通过RT-PCR从胎肝的总RNA文库中克隆出带有前肽的proapoA-I基因片段，再设计一对突变引物，将proapoA-I基因片段的Arg¹⁷⁹突变成Cys¹⁷⁹，即带有前肽的proAIM基因片段。最后，根据不同的目的设计不同的引物。所有设计引物如下：

引物1：5’-CGGCATTTCTGGCAGCAAGATG-3’

引物2：5’-CTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTG-3’

引物3：5’-GACGAGCTGCGCCAG

GCTTGGCCGCGCGCC-3’

引物4：5’-GGCGCGCGGCCAAGC

CTGGCGCAGCTCGTC-3’

引物5：5’-GG

TAATGAGACATTTCTGGCAGCAAGA-3’

引物6：5’-GGGCTATTACTGGGTGTTGAGCTTCTTAGT-3’

引物7：5’-AA ATTAAAGAGGAGAAATTAACTATGAGACACTTCTGGCAACAGGA-3’

其中引物1和2是一对内部引物。引物3和4是Arg¹⁷⁹→Cys¹⁷⁹突变引物，将CGC突变成TGC。引物5和6为给proAIME片段加上EcoRI和HindIII酶切位点，以便将其连接到pTIG-Trx载体上。引物7和6是将proAIME片段连接到pQE30载体上的上下游引物，酶切位点为EcoRI和HindIII。

根椐大肠杆菌的偏爱性密码子，再结合pET22b、pTIG-Trx和pQE30载体上核糖体结合位点附近的序列，用DNA Star软件将AIM基因片段的N-末端的前8个氨基酸和其前肽氨基酸的密码子进行序列优化。用作序列优化的同义突变的引物为M1和M2，

M1：5’-CAAGACGAGCCACCGCAGAGTCCATGGGATCGAGTGAAGGACCTG-3’

M2：5’-AGACATTTCTGGCAGCAAGACGAGCCACCGCAGAGT-3’。

再设计一对上下游引物将目的基因连接到pET22b载体上

上游引物P1：

5’-TTTAGACATTTCTGGCAGCAAGA-3’，

下游引物P2：

5’-CC

CTATTACTGGGTGTTGAGCTTCTTAG-3’。其中上游引物引入NdeI酶切位点；下游引物引入了EocRI酶切位点和两个终止密码子。

实施例1、proAIM基因的克隆

通过RT-PCR从胎肝的总RNA文库中钓取proapoA-I基因(带有前肽的apoA-I基因)的cDNA，再用特异性的内部引物通过PCR扩增出proapoA-I基因，最后通过重叠PCR将proapoA-I基因第535位的Arg密码子CGC突变成Cys的密码子TGC，即proAIM基因(带有前肽的AIM基因)。具体步骤如下：

1、RT-PCR钓取proapoA-I基因的cDNA

将1μl引物2、11μl总RNA、1μl dNTP混匀，65℃加热5min，冰浴5min，再加入4μl缓冲液、2μl DTT、1μl Rnasin并混匀，42℃2加热2min，然后加入1μlSuperscritII逆转录酶，42℃加热50min，45℃加热10min，72℃加热15min，最后加入1μl RNase H，37℃加热20min。这就是proapoA-I基因的cDNA，放4℃保存。

2、PCR克隆proapoA-I基因

Pfx DNA聚合酶反应体系：

proapoA-I cDNA 1μl

引物1 2μl

引物2 2μl

dNTP 1μl

10×Pfx扩增缓冲液 5μl

10×PCRx增强液(Enhancer Solution) 5μl

50mmol/L MgSO₄ 1μl

Pfx DNA聚合酶 0.4μl

ddH₂O 32.6μl

总体积 50μl

PCR循环条件：94℃变性15sec，55℃退火30sec，68℃延伸50sec，30个循环。

3、PCR产物电泳回收

对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，用博大泰克公司的DNA片段玻璃奶快速回收试剂盒回收750bp的条带，步骤如下：

从凝胶上切下目的DNA片段，放在1.5ml Eppendorf管中，用Tip吸头轻柔地将其捣碎；加入3倍体积的溶胶液，室温放置5min，其间轻摇几次，使胶完全融化；加入10μl玻璃奶，颠倒混匀，冰浴放置10min，间隔2-3min混匀一次；加入250μl漂洗液，将玻璃奶混匀，12000rpm离心30sec，吸弃上清；再重复洗涤一次，离心后将漂洗液吸干净，放入37℃的温箱干燥15-20min；最后加入适量的蒸馏水，混匀，60℃水浴5min，12000rpm离心1min，回收上清，即回收的DNA片段。

4、通过重叠PCR将proapoA-I基因突变成proAIM基因

通过三次PCR将proapoA-I基因突变成AIM基因。第一次PCR扩增突变位点第535位的5’端片段，模板为步骤3中回收的DNA片段，引物为引物1和4，其余反应体系同步骤3，循环条件除延伸时间为40sec外，也同步骤3；第二次PCR扩增突变位点第535位的3’端片段，模板为步骤3中回收的DNA片段，引物为引物3和2，其余反应体系同步骤3，循环条件除延伸时间为15sec外，也同步骤3。第三次PCR将前两次PCR扩增的片段连接在一起，模板是前两次PCR扩增的片段，引物为引物1和2，除Pfx DNA聚合酶反应体系中的模板为0.5μl第一次PCR扩增的片段和0.5μ

1第二次PCR扩增的片段外，反应体系和循环条件同步骤3。对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，按照步骤3中的方法用博大泰克公司的DNA片段玻璃奶快速回收试剂盒回收750bp的条带，将回收的片段克隆到pPIC9载体上，然后送军事医学科学院生物工程研究所DNA合成和序列分析实验室测序，测序结果与NCBI基因库中的人proAIM基因序列完全一致，表明本发明克隆的proAIM基因正确。proAIM基因及其所编码的蛋白序列如序列表中的序列1和序列2所示，序列1中自5′端第535-537位碱基TGC由CGC突变而来，使proAIM氨基酸序列即序列2的自氨基端第179位为Cys¹⁷⁹(由Arg¹⁷⁹突变成)。

本实施例用特异性的内部引物通过RT-PCR和PCR从胎肝的总RNA文库中钓取proapoA-I基因，再用一对突变引物通过重叠PCR将proapoA-I基因第535位的Arg密码子CGC突变成Cys密码子TGC，即成为带有前肽的AIM基因，也就是proAIM基因。proAIM基因全长747bp，共编码249个氨基酸，其中前6个氨基酸为AIM的前肽，后243个氨基酸为AIM的成熟肽。

实施例2、proAIM基因N-末端氨基酸密码子优化

根椐大肠杆菌的偏爱性密码子，再结合pET22b、pTIG-Trx和pQE30载体上核糖体结合位点附近的序列，用DNA Star软件将AIM基因片段的N一末端的前8个氨基酸和其前肽氨基酸的密码子进行序列优化。优化是通过用序列优化的同义突变的引物、进行两次PCR来完成的：第一次PCR的模板是测序正确的proAIM基因，引物是引物M1和2，第二次PCR的模板是第一次PCR的产物，引物是引物M2和2，用Pfx DNA聚合酶反应体系和循环条件(同实施例1的步骤3)。经过两次PCR后，proAIM基因N-末端氨基酸密码子优化前后的序列如下：

突变前：CGG CAT TTC TGG CAG CAA GAT GAA CCC CCC CAG AGC CCC TGG GAT

突变后：AGA CAT TTC TGG CAG CAA GAC GAG CCA CCG CAG AGT CCT TGG GAT

氨基酸： R H F R Q Q D E P P Q S P W D

其中前六个氨基酸RHFRQQ是AIM的前肽，DEPPQSPW才是成孰的AIM蛋白的前8个氨基酸，划有横线的部分为已作同义突变的氨基酸密码子，proAIM基因N-末端氨基酸密码子优化后得到的proAIME如序列表中的序列3。

实施例3、proAIME的表达

1、表达载体的构建

1)表达载体pET22b-proAIME的构建

以proAIME为模板，用引物P1和P2进行PCR扩增，将扩增的PCR产物纯化后进行NdeI和EocRI酶切反应，然后连接到经同样酶切的pET22b载体上，构建成pET22b-proAIME重组质粒，此重组质粒不含pET22b载体上的PelB信号序列。将重组质粒转化DH5α，铺板，挑选单克隆、摇菌，用菌液PCR筛选阳性克隆，筛选出含重组质粒pET22b-proAIME阳性克隆(图1a)，图1a中，M为DNA分子量标准DL2000；1、4、5为阳性克隆，2，3为阴性结果。将阳性克隆的重组质粒进行测序，测序结果用BLAST比较，表明克隆到pET22b载体的proAIME基因片段序列正确，起始密码子和翻译框架与预先设计相一致，说明表达载体pET22b-proAIME构建成功。

2)构建pTIG-Trx-proAIME表达载体

除所用的引物是引物5和6，酶切位点是EcoRI和HindIII，质粒是pTIG-Trx外，其余方法同步骤1)。其中，阳性克隆的筛选结果如图1b所示，图中，1为DNA分子量标准DL2000，4、5为阳性克隆，2、3、6为非阳性克隆。送4号菌质粒测序，测序结果表明，proAIME基因片段序列正确，起始密码子和翻译框架与预先设计相一致。表明pTIG-Trx-proAIME表达载体构建成功。

3)构建pQE30-proAIME表达载体

除所用的引物是引物6和7，酶切位点是EcoRI和HindIII，质粒是pQE30外，其余方法同步骤1)。其中，阳性克隆的筛选结果如图1c所示，图中，1为DNA分子量标准DL2000，3为阳性克隆，2、4、5、6为非阳性克隆。送3号菌质粒测序，测序结果表明，proAIME基因片段序列正确，起始密码子和翻译框架与预先设计相一致。表明pQE30-proAIME表达载体构建成功。

2、大肠杆菌工程菌的诱导表达

将测序正确的表达载体pET22b-proAIME和pTIG-Trx-proAIME转化宿主菌株BL21(DE3)，pQE30-proAIME转化宿主菌株JM109。挑单菌落制备种子液，按1％的比例接种于装有20ml pH为6的LB培养基(含氰霉素60μg/ml)的100ml摇瓶中，37℃培养至OD₆₀₀约为0.8，加入IPTG至终浓度为1mM继续诱导5h。收集发酵菌体，完全超声破碎后离心，分成上清和沉淀两部分，沉淀洗涤两次，分别进行15％SDS-PAGE，pET22b-proAIME/BL21(DE3)的表达结果如图2a所示，pTIG-Trx-proAIME/BL21(DE3)的表达结果如图2b所示，pQE30-proAIME/JM109的表达结果如图2c所示，表明在29KD处均有一特异性的目的蛋白表达条带，与分子量理论值相符，空载质粒诱导菌无此条带，表明有目的蛋白表达，除pQE30-proAIME/JM109转化菌表达的AIM存在部分包函体、主要以可溶形式表达外，其余的都获得了可溶性表达。图2a-2c中，1为蛋白质分子量标准，2为表达proAIM的全菌裂解液，3为裂解液的上清部分，4裂解液的沉淀部分。沉淀镜检全部为细胞碎片。

然后将电泳凝胶送军事医学科学院生物工程研究所DNA合成和序列分析实验室进行凝胶扫描，测定proAIM占菌体总蛋白的百分含量，比较proAIM表达量的高低。结果如图2d所示，表明在相同条件下，表达proAIM从高到低的顺序依次是pQE30-proAIME/JM109，proAIM约占菌体总蛋白的55％；pET22b-proAIME/BL21(DE3)，AIM约占菌体总蛋白的42％；pTIG-Trx-proAIME/BL21(DE3)，proAIM约占菌体总蛋白的5％。其中pET22b-proAIME/BL21(DE3)工程菌在摇瓶中表达proAIM约100mg/L。图2d中，1为pTIG-Trx-proAIME/BL21(DE3)，2为pQE30-proAIME/JM109，3为pET22b-proAIME/BL21(DE3)。

3、proAIM的纯化和纯度分析

分别取20g步骤2中得到的pET22b-proAIME/BL21(DE3)、pTIG-Trx-proAIME/BL21(DE3)、pQE30-proAIME/JM109湿菌体，用缓冲液A(20mM Tris-HCl、100mM NaCl、1mM EDTA，pH8.1)洗涤一次，离心，弃上清，菌体再用150ml的缓冲液A重悬，超声破碎30min，离心后取上清，过滤后进行Butyl Sepharose 4F.F疏水层析。分别用10×缓冲液A、缓冲液B(80％缓冲液A+20％乙二醇)、缓冲液C(60％缓冲液A+40％乙二醇)和缓冲液D(20mM Tris-HCl、1mM EDTA，pH8.1)；缓冲液E(40％缓冲液D+60％乙二醇)洗脱至基线。收集个蛋白峰进行SDS-PAGE分析。

然后将60％乙二醇的洗脱液(含proAIM的样品)用3×体积的缓冲液F(20mMTris-HCl、1mM EDTA、pH7.9)稀释后，进行Q Sepharose High Performancel6/100离子交换层析。用缓冲液G(20mM Tris-HCl、400mM NaCl、1mM EDTA，pH7.9)进行线性梯度洗脱。洗脱缓冲液G的梯度为20个柱体积内从0％-100％。收集各蛋白峰进行SDS-PAGE分析。将Q柱纯化后的proAIM经Vivaspin20(30,000MW)超滤管超滤后，进行15％SDS-PAGE(SDS-PAGE还原电泳)，然后通过凝胶扫描来检测样品的纯度。pET22b-proAIME/BL21(DE3)、pTIG-Trx-proAIME/BL21(DE3)和pQE30-proAIME/JM109表达的proAIM的纯化结果如图3所示，表明Q柱纯化后的proAIM单体中混有少量的proAIM二聚体，proAIM单体的纯度达99％。图3中，1为分子量标准，2为未经层析纯化的菌体破碎上清液，3为Butyl Sepharose 4F.F.纯化后的proAIM，4为QSepharose H.P.纯化后的proAIM(还原型)，5Q Sepharose H.P.纯化后的proAIM(非还原型)。

实施例4、重组proAIM的生化特性及活性

1、N-末端氨基酸残基分析

pET22b-proAIME//BL21(DE3)、pTIG-Trx-proAIME/BL21(DE3)和pQE30-proAIME/JM109诱导表达的菌液样本进行SDS-PAGE还原电泳后，通过电转移的方法将蛋白转移到PVDF膜上。PVDF膜经染色和脱色后，送军事医学科学院仪器分析中心色谱室测序。本发明表达的proAIM的N-末端测序结果表明，N-末端的六个氨基酸为Arg-His-Phe-Trp-Gln-Gln，与理论序列一致。

2、本发明表达的proAIM的分子量测定

采用反相HPLC色谱对实施例3中经部分纯化的pET22b-proAIME/BL21(DE3)、pTIG-Trx-proAIME/BL21(DE3)和pQE30-proAIME/JM109诱导表达的proAIM样品进行进一步纯化，纯化样品冻干后送军事医学科学院仪器分析中心质谱室进行质谱分析，测定proAIM的分子量。纯化柱为C8反相HPLC柱，A液为H₂O+TFA，B液为乙腈+TFA，流速为0.5ml/min，洗脱梯度为在60min内B液从0％到100％。结果表明本发明表达的proAIM单体和二聚体的分子量分别为29031KD和58045KD，与理论值29037和58074非常接近，在误差允许的范围之内，说明本发明表达的proAIM单体和二聚体都未发生降解。

3、本发明表达的proAIM单体的活性测定

proAIM单体的活性可通过测定proAIM与脂质DMPC的结合能力来测定。当proAIM与脂质DMPC结合后，将脂质分子DMPC有机地排列起来，A₃₂₅nm的吸光值会下降。具体方法如下：

将10mg DMPC溶解在1ml氯仿里，用氮气吹干后，在真空中干燥2h。加入3.2ml的STB，充分振荡后，在4℃超声破碎30min。取三个Eppendorf管，每管加入800μl超声破碎后的DMPC脂质体，然后分别加入200μl STB、200μl含1mg proapoA-I(从血浆中提取的标准品)的STB和200μl含1mg本发明表达的proAIM的STB，使DMPC/本发明表达的proAIM的质量比为2.5比1。前两管分别是空白对照和标准对照。迅速振荡混匀，室温下测定325nm的光吸收值A₃₂₅。每2min测定一次，测60min。观察A₃₂₅值的变化。结果如图4所示，表明不加载脂蛋白的空白对照A₃₂₅nm的吸光值仅有极少量的下降，对照人血浆proapoA-I的A₃₂₅nm的吸光值下降速度快，迅速达到平衡，本发明表达的proAIM单体的A₃₂₅nm的吸光值下降速度比proapoA-I慢，但A₃₂₅nm的吸光值下降的幅度比proapoA-I大。说明本发明表达的proAIM单体结合脂的速度比proapoA-I慢，但结合脂的量比proapoA-I多。这表明本发明表达的proAIM单体具有脂结合活性。

实施例5、利用pET22b-proAIME/BL21(DE3)生产proAIM

1、发酵pET22b-proAIME/BL21(DE3)生产proAIM

pET22b-pro4IME/BL21(DE3)大肠杆菌工程菌高密度发酵所用的培养基的成分为(g/L)：KH₂PO₄4，K₂HPO₄4，Na₂HPO₄·12H₂O 7，(NH₄)₂SO₄1.2，NH4Cl 0.2，MgSO₄·7H₂O2.4，酵母抽提物10，葡萄糖10，1ml微量元素溶液。

其中，微量元素溶液的组成如下(mg/L)：FeSO₄·7H₂O 40，CaCl₂·2H₂O 40，AlCl₃·6H₂O 10，MnSO₄·H₂O 10，CoCl₂·6H₂O4，Na₂MoO₄·2H₂O 2，ZnSO₄·7H₂O 2，CuCl₂·2H₂O 1，H₃BO₃0.5。

pET22b-pro4IME/BL21(DE3)大肠杆菌工程菌培养模式采用补料分批培养方式，在5升发酵罐进行发酵实验。其中，生长期与诱导期培养温度为37℃，pH值控制在pH6.5-7.0，在培养过程中控制发酵液中溶解氧(DO)大于10％。生长培养4-6h后，加入1mM IPTG，诱导表达3-5h。结果表明在5升发酵罐上的表达量约为2g/L。

实施例6、Western印迹实验

将经实施例3步骤3纯化后的proAIM单体和二聚体混合物进行15％SDS-PAGE非还原电泳后，按照如下方法进行Western印迹分析：

通过电转移的方法将AIM转移到PVDF膜上。

将PVDF膜放在一平皿中，加入封闭液，室温下轻轻振荡2-3h。

封闭结束后，将PVDF膜浸泡在一抗(人抗Apolipoprotein AI多克隆抗体(Serotec公司))溶液中，4℃下轻轻振荡2h。

将PVDF膜用PBS洗3次，每次10min。

将膜从PBS中转入150mmol/L NaCl，50mmol/L Tris-Cl(pH7.5)的溶液中，室温下轻轻振荡10min。

将膜浸泡在二抗(HRP标记兔抗绵羊抗体(KPL公司))溶液中，在室温下轻轻振荡1h。

取出PVDF膜，用150mmol/L NaCl，50mmol/L Tris-Cl(pH7.5)溶液冲洗3-5次，每次10min。

将膜放入显色液中，室温下轻轻摇动。观察显色反应，当条带达到所需深度时，立刻用水洗膜，然后将膜转入PBS中。

结果如图5所示，表明本发明的proAIM单体和二聚体都可与人apoA-I多克隆抗体发生免疫反应。图中，1为蛋白质分子量标准，2为proAIM单体非还原电泳，3为proAIM单体和二聚体混合物非还原电泳，4为proAIM单体的Western印迹，5为proAIM单体和二聚体混合物的Western印迹。

序列表

<160>3

<210>1

<211>747

<212>DNA

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>1

cggcatttct ggcagcaaga tgaacccccc cagagcccct gggatcgagt gaaggacctg 60

gccactgtgt acgtggatgt gctcaaagac agcggcagag actatgtgtc ccagtttgaa 120

ggctccgcct tgggaaaaca gctaaaccta aagctccttg acaactggga cagcgtgacc 180

tccaccttca gcaagctgcg cgaacagctc ggccctgtga cccaggagtt ctgggataac 240

ctggaaaagg agacagaggg cctgaggcag gagatgagca aggatctgga ggaggtgaag 300

gccaaggtgc agccctacct ggacgacttc cagaagaagt ggcaggagga gatggagctc 360

taccgccaga aggtggagcc gctgcgcgca gagctccaag agggcgcgcg ccagaagctg 420

cacgagctgc aagagaagct gagcccactg ggcgaggaga tgcgcgaccg cgcgcgcgcc 480

catgtggacg cgctgcgcac gcatctggcc ccctacagcg acgagctgcg ccagtgcttg 540

gccgcgcgcc ttgaggctct caaggagaac ggcggcgcca gactggccga gtaccacgcc 600

aaggccaccg agcatctgag cacgctcagc gagaaggcca agcccgcgct cgaggacctc 660

cgccaaggcc tgctgcccgt gctggagagc ttcaaggtca gcttcctgag cgctctcgag 720

gagtacacta agaagctcaa cacccag 747

<210>2

<211>249

<212>PRT

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>2

Arg His Phe Trp Gln Gln Asp Glu Pro Pro Gln Ser Pro Trp Asp Arg

1 5 10 15

Val Lys Asp Leu Ala Thr Val Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp Ser Gly

20 25 30

Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys Gln Leu

35 40 45

Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser

50 55 60

Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn

65 70 75 80

Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu

85 90 95

Glu Glu Val Lys Ala Lys Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys

100 105 110

Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu

115 120 125

Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly Ala Arg Gln Lys Leu His Glu Leu Gln

130 135 140

Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala Arg Ala

145 150 155 160

His Val Asp Ala Leu Arg Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu

165 170 175

Arg Gln Cys Leu Ala Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly

180 185 190

Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser Thr

195 200 205

Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu

210 215 220

Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu

225 230 235 240

Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn Thr Gln

245

<210>3

<211>747

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

agacatttct ggcagcaaga cgagccaccg cagagtcctt gggatcgagt gaaggacctg 60

gccactgtgt acgtggatgt gctcaaagac agcggcagag actatgtgtc ccagtttgaa 120

ggctccgcct tgggaaaaca gctaaaccta aagctccttg acaactggga cagcgtgacc 180

tccaccttca gcaagctgcg cgaacagctc ggccctgtga cccaggagtt ctgggataac 240

ctggaaaagg agacagaggg cctgaggcag gagatgagca aggatctgga ggaggtgaag 300

gccaaggtgc agccctacct ggacgacttc cagaagaagt ggcaggagga gatggagctc 360

taccgccaga aggtggagcc gctgcgcgca gagctccaag agggcgcgcg ccagaagctg 420

cacgagctgc aagagaagct gagcccactg ggcgaggaga tgcgcgaccg cgcgcgcgcc 480

catgtggacg cgctgcgcac gcatctggcc ccctacagcg acgagctgcg ccagtgcttg 540

gccgcgcgcc ttgaggctct caaggagaac ggcggcgcca gactggccga gtaccacgcc 600

aaggccaccg agcatctgag cacgctcagc gagaaggcca agcccgcgct cgaggacctc 660

cgccaaggcc tgctgcccgt gctggagagc ttcaaggtca gcttcctgag cgctctcgag 720

gagtacacta agaagctcaa cacccag 747

Claims

1.人载脂蛋白AI米兰突变体基因，其核苷酸序列如序列表中序列3所示。

2.含有权利要求1所述的人载脂蛋白AI米兰突变体基因的重组表达载体。

3.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为pET22b-proAIME、pTIG-Trx-proAIME或pQE30-proAIME。

4.含有权利要求1所述的人载脂蛋白AI米兰突变体基因的细胞系。

5.含有权利要求1所述的人载脂蛋白AI米兰突变体基因的工程菌。

6.根据权利要求5所述的工程菌，其特征在于：所述工程菌为pET22b-proAIME/BL21(DE3)、pTIG-Trx-proAIME/BL21(DE3)或pQE30-proAIME/JM109。

7.一种表达权利要求1所述的人载脂蛋白AI米兰突变体基因的方法，是将含有所述人载脂蛋白AI米兰突变体基因的重组表达载体导入大肠杆菌中，培养所得到的重组大肠杆菌，表达得到人载脂蛋白AI米兰突变体。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述大肠杆菌为菌株BL21(DE3)、JM109、DH5α或HB101。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：用于构建所述重组表达载体的出发载体为pET系列载体、pQE30或pTIG-Trx。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述重组表达载体为pET22b-proAIME、pTIG-Trx-proAIME或pQE30-proAIME。

11.根据权利要求7、8、9或10所述的方法，其特征在于：所述重组大肠杆菌在碳源为葡萄糖型碳源、pH为6-7的培养基中37℃培养至对数生长期，然后以0.5-1mM的IPTG诱导表达3-8小时，得到人载脂蛋白AI米兰突变体。

12.权利要求1所述载脂蛋白AI米兰突变体基因在生产人载脂蛋白AI米兰突变体中的应用。