CN1739806A

CN1739806A - 高分子聚合材料声学造影剂及其制备方法

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Publication number: CN1739806A
Application number: CN 200410081529
Authority: CN
Inventors: 冉海涛; 王志刚; 任红; 郑元义; 张群霞; 凌智渝
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2004-12-16
Filing date: 2004-12-16
Publication date: 2006-03-01
Anticipated expiration: 2024-12-16
Also published as: CN100500223C

Abstract

本发明涉及一种能在体内自然降解的新型高分子材料微泡声学造影剂，本发明还涉及该造影剂及其包裹药物或基因的造影剂的制备方法。所述高分子聚合材料声学造影剂的制备方法，是采用人工合成高分子可生物降解材料，通过乳化并首先制备高分子聚合材料为外壳内含易挥发有机溶剂或水溶液的微球，通过喷雾、冷冻干燥等方法，使微球内包裹的有机溶剂挥发或水升华，从而制作微泡声学造影剂。本发明的优点：外壳材料在体内可自然降解；颗粒大小均匀可控；显影效果好、持续时间长；后方衰减弱；具有可包裹药物或基因的能力，可实现体内药物的无创性定位释放或基因的定位转染。造影剂性能稳定，可长期保存，方便运输。

Description

高分子聚合材料声学造影剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种声学造影剂，具体是指一种能在体内自然降解的新型高分子材料微泡声学造影剂，本发明还涉及该造影剂以及包裹药物或基因造影剂的制备方法。

背景技术

组织声学造影是近年随着声学造影剂制备技术和图像显影技术的不断完善才逐步发展起来的新技术。声学造影剂能增强组织的灰阶显像、增强彩色多普勒血流信号，提高病灶及多普勒血流信号检出率，在疾病的超声诊断与鉴别诊断方面将发挥巨大的作用，具有广阔的应用前景，是目前医学超声影像学领域研究的重点和发展方向。

微泡声学造影剂是在经历了第一代游离微气泡造影剂、第二代包裹空气微气泡造影剂之后的第三代声学造影剂，其采用了在血液中弥散性极差的高分子氟碳气体作为包裹微气泡内的气体，使造影剂在稳定性和有效性方面均有很大提高，经外周静脉注射后可以使血液产生强散射，并可以使实质性器官(如肝脏、肾脏等)显影。然而，目前所用的声学造影剂均为内含不同气体成分的微气泡，且均采用将气体与成膜材料混合声振的方法制备。微泡外壳材料大多为生物制品如白蛋白、脂质等。此类声学造影剂由于受制备方法和外壳材料等的限制，均不同程度存在粒径分布范围广、性质不够稳定、在体内持续时间短、后方声衰减明显等缺点，而且生物制品的价格昂贵，应用受到很大限制。

理想的微泡声学造影剂需满足以下条件：

①无毒性，无副作用；

②能经外周静脉注射；

③能通过肺及全身毛细血管床；

④性能稳定，持续时间足够长；

⑤不影响全身或某一系统的血流动力学；

⑥显像效果好，声衰减不明显。

随着高分子化学的发展，医用高分子材料，尤其是生物可降解材料，被广泛开发用作药物、基因传递和控释的载体。这些高分子载体材料以合成的可生物降解的聚合物体系和天然的大分子体系为主，在体内能自然降解，对人体无任何毒、副作用。

发明内容

为了解决上述背景技术中的造影剂所存在的众多不足或缺点，本发明人经过长期的研究，发明了一种能在体内自然降解的新型高分子材料微泡声学造影剂及其制备方法，该制备方法完全不同于常规的将成膜材料(蛋白质、脂质等)与包裹气体混合声振制备微泡声学造影剂方法，而是采用新型人工合成高分子可生物降解材料，通过乳化技术，首先制备高分子聚合材料为外壳内含易挥发有机溶剂或水溶液的微球，然后通过喷雾干燥、冷冻干燥等方法，使微球内包裹的的有机溶剂挥发或水升华，从而制作微泡声学造影剂。

本发明的目的在于提供一种高分子聚合材料声学造影剂，其由内含空气或氟碳气体、外壳为人工合成可生物降解的高分子聚合材料微泡与适量普通医用赋形剂组成。其中生物可降解高分子聚合材料可选用人工化学合成可生物降解聚合物，包括脂肪族聚酯、聚氰基、丙烯酸酯、聚原酸酯、聚ε-己内酯、聚脲烷、聚氨基酸等。高分子聚合材料声学造影剂内所含气体为普通空气或氟碳类气体，氟碳类气体选自三氟甲烷、四氟甲烷、六氟乙烷、六氟丙烯、八氟丙烷(全氟丙烷)、八氟环丁烷、八氟-2-丁烯、八氟异丁烯等。赋形剂为甘露醇、山梨醇等

优选的，本发明提供的高分子聚合材料声学造影剂，其中生物可降解高分子聚合材料为聚乳酸、不同聚合度的乳酸/羟基乙酸共聚物(PLGA)以及聚乙醇酸(PVA)。

更优选的，本发明提供的高分子聚合材料声学造影剂，其中生物可降解高分子聚合材料PLGA(65∶35)和PVA(分子量为5000-50000)。氟碳气体为八氟丙烷(全氟丙烷)。赋形剂为甘露醇。

本发明的另一目的还在于提供上述高分子聚合材料声学造影剂的制备方法，其中的一种制备方法包括：首先采用普通乳化法：将亲油性人工化学合成可生物降解聚合物(即上述的生物可降解高分子聚合材料)作为乳化剂和成膜材料溶于有机溶剂中，浓度为3％-7％，优选为5％。按油∶水比例为1-4∶10份，优选为1.5∶10份的比例将上述溶液加入水中，通过超声震荡或机械震荡制备成O/W型微球；然后再(1)采用喷雾干燥法使微球内包裹的有机溶剂挥发，从而形成内含空气的高分子聚合材料微泡造影剂；(2)采用真空冷冻干燥法使微球内包裹的水升华，使微球内形成空隙，然后停止抽气，将八氟丙烷(全氟丙烷)缓慢注入冷冻干燥室内，从而形成内含氟碳气体的高分子聚合材料微泡造影剂。

本发明提供的另一种制备方法，其包括：采用双乳化法，将亲油性人工化学合成可生物降解聚合物(即上述的生物可降解高分子聚合材料)作为乳化剂和成膜材料按3％-7％，优选为5％的浓度溶于有机溶剂中作为有机溶剂(分散相)，在其中加入适量(水与有机溶剂体积之比为1-4∶10，优选为1.5∶10)水，通过超声震荡或机械震荡首先制备W/O型微球，再将初乳加入适量(初乳与之的体积比为1-3∶6)含有2％-6％，优选4％的亲水性人工化学合成可生物降解聚合物的水溶液中制备W/O/W型微球；经多次洗涤、离心后，收集微球，加入1-6ml 2-8％的甘露醇溶液稀释，然后(1)采用真空冷冻干燥法使微球内包裹的水升华，使微球内形成空隙，然后停止抽气，将空气缓慢注入冷冻干燥室内，从而形成内含空气的高分子聚合材料微泡造影剂；或(2)采用真空冷冻干燥法使微球内包裹的水升华，使微球内形成空隙，然后停止抽气，将八氟丙烷(全氟丙烷)缓慢注入冷冻干燥室内，从而形成内含氟碳气体的高分子聚合材料微泡造影剂。

另外，本发明还提供包裹药物或基因的高分子聚合材料微泡造影剂的制备技术：材料和方法同上述高分子聚合材料声学造影剂的制备方法，只是在制备的过程中将药物事先溶于有机溶剂或水中，或将基因溶于水中，首先通过乳化技术制备包裹有药物或基因的微球，然后通过喷雾干燥法或真空冷冻干燥法制备包裹有药物或基因的高分子聚合材料微泡造影剂。

按照本发明的方法制备的新型高分子聚合材料声学造影剂，与目前普通声学造影剂相比，具有以下优点：

①外壳材料在体内可自然降解为水和二氧化碳，对人体无任何毒、副作用；

②颗粒大小均匀且可控，经外周静脉注射后能通过肺及全身毛细血管床，实现组织声学显影；

③微泡抗压性能可根据不同目的，通过改变高分子材料聚合比例、声振条件而设计；

④显影效果好、持续时间长；动物实验显示高分子聚合材料声学造影剂增强组织灰阶显像效果明显，特别是增强能量多谱勒显像效果；显像时间较其它类型的微泡声学造影剂明显延长；

⑤后方衰减弱；即使在较高浓度时其后方亦无明显声影；

⑥具有可包裹药物或基因的能力，经静脉注射后，在体外特定部位给予一定能量的超声幅照，使微泡破裂，在局部高浓度释放出所包裹的药物或基因，从而实现体内药物的无创性定位释放或基因的定位转染。

⑦造影剂性能稳定，可长期保存，方便运输，有利于实现商品化。

由于本发明的造影剂具有上述众多优点，因而具有广泛的应用前景和推广应用价值。

具体的，本发明的高分子聚合材料声学造影剂的制备步骤包括：

①首先采用双乳化(W/O/W)方法，将新型高分子聚合材料(如PLGA、PLA等)作为乳化剂和成膜材料，按2％-8％的比例加入二氯甲烷等有机溶剂中搅拌直至完全溶解，然后在其中加入适量水(水与油的体积之比例为1-4∶1)，经声振乳化形成W/O微球(其粒径在0.4-5μm之间可根据需要通过改变声振条件控制)。

②将W/O乳球微粒倒入2％-6％PVA溶液中(初乳与PVA水溶液的体积之比为为1-3∶6)，均质机均质数分钟，形成W/O/W乳球微粒。

③通过自然挥发、离心洗涤等方法去除二氯甲烷等有机溶剂，收集微球。

④将多次离心洗涤后收集的微球溶解于1-6ml，2％-8％的甘露醇溶液中，充分混匀，-45℃冷冻干燥24h-48h，成白色粉末即高分子聚合材料声学造影剂-。

高分子聚合材料声学造影剂冻干粉在4℃冰箱中能长期保存，应用时用适量生理盐水或蒸馏水溶解即可经静脉注射进行声学造影。

为了增加微球内的空隙数量和含气量、增强显影效果，在制备过程中还可在油相和/或水相中加入适量易挥发物质(如樟脑、氯化铵等)，以增加微球中的含气量，增强显影效果。

如果在制备过程中，冷冻干燥结束时，将氟碳气体缓慢注入冷冻干燥室内至常压，并保持1-6小时即可形成内含氟碳气体的高分子聚合材料微泡造影剂，进一步增强微泡的稳定性。

本发明所述的生物可降解高分子聚合材料，应该具有良好的生物相容性，其降解物在体内被代谢不残留，在人体内代谢的最终产物是水和二氧化碳，其中生物可降解高分子聚合材料可选用人工化学合成可生物降解聚合物，包括脂肪族聚酯、聚氰基、丙烯酸酯、聚原酸酯、聚ε-己内酯、聚脲烷、聚氨基酸等。优选的高分子聚合材料为聚乳酸、不同聚合度的乳酸/羟基乙酸共聚物(PLGA)以及聚乙醇酸(PVA)。更优选的高分子聚合材料PLGA(65∶35)和PVA(分子量为5000-50000)，其在体内的中间产物乳酸是体内糖代谢的产物，所以不会在重要器官聚集，对人体无任何毒、副作用，是最有前景的药用纳米材料之一。

本发明所述的有机溶剂包括常用点较低的医用有机溶剂，优选的有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷等，更优选的有机溶剂为二氯甲烷。

本发明所述的赋形剂为常用药用赋形剂，优选的为甘露醇、山梨醇等，更优选的为甘露醇。

本发明所述的氟碳气体可选自三氟甲烷、四氟甲烷、六氟乙烷、六氟丙烯、八氟丙烷(全氟丙烷)、八氟环丁烷、八氟-2-丁烯、八氟异丁烯等，优选为八氟丙烷(全氟丙烷)。

本发明所述的水为蒸馏水或纯净水，或三蒸水等可用于医学的水。

本发明所述的超声震荡采用常规实验用超声震荡仪(XL2020)，频率为20KH，输出功率可选择范围1-10档；机械震荡采用高速分散均质机，其转速选择范围为300-23000r/min。

附图说明

附图1：为高分子聚合材料声学造影剂微泡结构示意图。图中黑色部分为高分子聚合材料形成的外壳，小圆形和椭圆型空白为水以及樟脑等升华后形成的空隙。

附图2、3：分别为高分子聚合材料声学造影剂成品外观与粒径分布图。高分子聚合材料声学造影剂为白色粉针剂，激光测径仪显示其粒径大小均匀，约600nm左右。

附图4：高分子聚合材料声学造影剂光学显微镜(×400)下形态。显示其粒径大小均匀，形态规则，大小约1-3μm左右。

附图5：高分子聚合材料声学造影剂扫描电镜下(×1000)形态。显示其形态规则，粒径大小均匀。

附图6：高分子聚合材料声学造影剂体外增强显影情况。图中右侧水囊内为脱汽水，左侧水囊内为高分子聚合材料声学造影剂水溶液，可见右侧水囊为无回声，左侧水囊内因含有高分子聚合材料声学造影剂而回声明显增强。

附图7：经静脉注射高分子聚合材料声学造影剂前后，兔肝脏实质灰阶显像明显增强，远场回声无衰减(图中左侧为静脉注射高分子聚合材料声学造影剂前，右侧为注射后)。

附图8：经静脉注射高分子聚合材料声学造影剂前后，兔肾脏能量多谱勒显像增强情况。图-8A为注射高分子聚合材料声学造影剂前兔肾脏能量多普勒显影情况，图-8B为经耳缘静脉注射高分子聚合材料声学造影剂后，可见兔肾脏能量多普勒信号较注射前明显增强。

具体实施方式

实施例1：

1.高分子聚合材料声学造影剂的合成

试剂：聚乳酸/羟基乙酸(PLGA)：聚乙烯醇(PVA)、二氯甲烷、异丙醇、樟脑、氯化铵。购自重庆市医药公司。

设备：电子天平、声振仪(XL2020)、高速分散均质机、磁力搅拌器、高速离心机、-45℃冰箱、冷冻干燥机、血细胞计数仪等

方法步骤：

(1)将0.1g樟脑加入20ml二氯甲烷中，充分搅拌使其完全溶解(溶液-A)。

(2)将1.0g高分子聚合材料PLGA加入溶液-A中，充分搅拌至其完全溶解(溶液-B)。

(3)将5％氯化铵3ml加入溶液-B中，立即声振(XL2020声振仪，4-10档)40s，成乳白色乳化液(W/O微球，其粒径在0.4-5μm之间可根据需要通过改变声振档数控制，档数越高，粒径越小、越均匀)。

(4)将声振后的乳化液倒入4％PVA溶液中，均质机均质5min。然后加入2％异丙醇溶液中，室温下磁力搅拌器搅拌2-5h。使微球表面固化、二氯甲烷尽量自然挥发。

(5)将其分装入10ml离心管中高速离心5min(速度3000-5000转)，弃上清液。

(6)吸去离子水适量加入离心管中，用吸管反复冲洗离心管底部白色沉淀物使其充分混匀，并平均收集入二支离心管中，加去离子水至8ml，高速离心5min(速度2000-3000转)。弃上清液。重复上述步骤，洗涤、离心3次。

(7)加入5％甘露醇2-5ml，用吸管反复冲洗离心管底部白色沉淀物使其充分混匀成乳白色溶液。

(8)将乳白色溶液放入-70℃冰箱中冷冻30min，然后-45℃冷冻干燥24h-48h，成白色粉末即高分子聚合材料声学造影剂。

(9)将高分子聚合材料声学造影剂冻干粉分装入容器内，放入4℃冰箱中保存、备用。

结果：参见附图2-5

2：高分子聚合材料声学造影剂体外增强显影实验

将上述制备的高分子聚合材料声学造影剂声学造影剂0.5g溶于10ml生理盐水中，形成溶液，再将脱气水10ml与上述高分子聚合材料声学造影剂溶液分别装入小水囊内并密封，将其同时放入盛有脱气水的容器中，用高频探头进行显影实验，观察高分子聚合材料声学造影剂增强显影情况，并进行量化分析。

结果：参见附图6

3：高分子聚合材料声学造影剂增强肾实质显影和能量多谱勒显像实验仪器设备：Logic 9彩色超声诊断仪，探头频率7.5MHz。

动物准备：健康家兔6只，雌雄不限，体重3kg，在超声检查前用8％的硫化钠脱去肾区体毛，然后用“速眠新”肌肉注射麻醉实验动物，用5号头皮针经耳缘静脉建立静脉通道。

方法：取0.5g上述制备的高分子聚合材料声学造影剂粉末溶于0.9％生理盐水5ml中，按0.2ml/kg的剂量经兔耳缘静脉注射，取兔肾断面满意图像进行能量多普勒观察。其它条件如增益、取样深度、TGC、压缩、聚焦范围等参数在实验中保持不变，用S2VHS录像带记录造影的全过程。

结果：参见附图8

4、高分子聚合材料声学造影剂影像学特点观察

对上述制备的高分子聚合材料声学造影剂，采用普通光学显微镜和扫描电镜进行形态学观察、测定其粒径大小及分布情况；进行体外显影实验；进行动物显影增强实验(兔)，观察其实现最佳组织显影的剂量、显影效果、持续显影时间等特点，并用“组织定征仪”进行定量分析。

结果：参见附图7、8

5、高分子聚合材料声学造影剂在体内的代谢、各种生物学作用研究经静脉注射后，研究高分子聚合材料声学造影剂在体内的存留时间、组织分布等情况；采用不同频率、强度、照射时间及高分子聚合材料声学造影剂浓度对培养细胞、活体组织进行超声辐照，应用光镜、电镜观察培养细胞、活体组织的光镜及超微结构改变。

Claims

1.一种高分子聚合材料声学造影剂，为通过特殊工艺制备的以生物可降解高分子聚合材料为外壳、内含空气或氟碳气体的微气泡与适量赋形剂组成的粉针剂。

2.根据权利要求1所述的高分子聚合材料声学造影剂，其特征是：其中生物可降解高分子聚合材料可选用人工化学合成可生物降解聚合物，包括脂肪族聚酯、聚氰基、丙烯酸酯、聚原酸酯、聚ε-己内酯、聚脲烷、聚氨基酸等；高分子聚合材料声学造影剂内所含气体为普通空气或氟碳类气体，氟碳类气体选自常用医用氟碳类气体；赋形剂为常用药用粉针剂型赋形剂。

3.根据权利要求2所述的高分子聚合材料声学造影剂，其中生物可降解高分子聚合材料为聚乳酸、不同聚合度的乳酸/羟基乙酸共聚物(PLGA)以及聚乙醇酸(PVA)；具体的优选的物质为PLGA(65∶35)和PVA(分子量为5000-50000)；所述的氟碳气体为八氟丙烷(全氟丙烷)；所述赋形剂为甘露醇。

4.一种制备如权利要求1所述的高分子聚合材料声学造影剂的方法，其特征是：方法包括：采用普通乳化法：将亲油性人工化学合成可生物降解聚合物作为乳化剂和成膜材料溶于有机溶剂中，浓度为3％-7％，优选为5％；按油：水比例为1-4∶10份，优选为1.5∶10份的比例将上述溶液加入水中，通过超声震荡或机械震荡制备成O/W型微球乳液；室温搅拌0.5-2小时，待聚集在微球表面的高分子聚合材料固化成膜后再采用喷雾干燥法使微球内包裹的有机溶剂挥发，从而形成内含空气的高分子聚合材料微泡造影剂。

5.一种制备如权利要求1所述的高分子聚合材料声学造影剂的方法，其特征是，方法包括：首先采用普通乳化法：将亲油性人工化学合成可生物降解聚合物(即上述的生物可降解高分子聚合材料)作为乳化剂和成膜材料溶于有机溶剂中，浓度为3％-7％，优选为5％。按油：水比例为1-4∶10份，优选为1.5∶10份的比例将上述溶液加入水中，通过超声震荡或机械震荡制备成O/W型微球乳液；室温搅拌0.5-2小时，待聚集在微球表面的高分子聚合材料固化成膜后，经多次洗涤、离心后，收集微球，加入1-6ml 2-8％的甘露醇溶液稀释，然后再采用真空冷冻干燥法使微球内包裹的水升华，使微球内形成空隙，然后停止抽气，将八氟丙烷(全氟丙烷)缓慢注入真空冷冻干燥室内，从而形成内含氟碳气体的高分子聚合材料微泡造影剂。

6.一种制备如权利要求1所述的高分子聚合材料声学造影剂的方法，其包括：采用双乳化法，将亲油性人工化学合成可生物降解聚合物(即上述的生物可降解高分子聚合材料)作为乳化剂和成膜材料按3％-7％，优选为5％的浓度溶于有机溶剂中作为有机溶剂(分散相)，在其中加入适量水(水与有机溶剂体积之比为1-4∶10，优选为1.5∶10)，通过超声震荡或机械震荡首先制备W/O型微球，再将初乳加入适量(初乳与之的体积比为1-3∶6)含有2％-6％，优选4％的亲水性人工化学合成可生物降解聚合物的水溶液中制备W/O/W型微球；经多次洗涤、离心后，收集微球，加入1-6ml 2-8％的甘露醇溶液稀释，然后(1)采用真空冷冻干燥法使微球内包裹的水升华，使微球内形成空隙，然后停止抽气，将空气缓慢注入真空冷冻干燥室内，从而形成内含空气的高分子聚合材料微泡造影剂；或(2)采用真空冷冻干燥法使微球内包裹的水升华，使微球内形成空隙，然后停止抽气，将八氟丙烷(全氟丙烷)缓慢注入真空冷冻干燥室内，从而形成内含氟碳气体的高分子聚合材料微泡造影剂。

7.根据权利要求4-6中任一所述的高分子聚合材料声学造影剂的制备方法，其特征是：其中生物可降解高分子聚合材料可选用人工化学合成可生物降解聚合物，包括脂肪族聚酯、聚氰基、丙烯酸酯、聚原酸酯、聚ε-己内酯、聚脲烷、聚氨基酸等。高分子聚合材料声学造影剂内所含气体为普通空气或氟碳类气体，氟碳类气体选自三氟甲烷、四氟甲烷、六氟乙烷、六氟丙烯、八氟丙烷、八氟环丁烷、八氟-2-丁烯、八氟异丁烯；赋形剂为甘露醇、山梨醇及常用药用赋形剂。

8.根据权利要求4-6中任一所述的高分子聚合材料声学造影剂的制备方法，其特征是：其中生物可降解高分子聚合材料为聚乳酸、不同聚合度的乳酸/羟基乙酸共聚物(PLGA)以及聚乙醇酸(PVA)；具体的优选物质为PLGA(65∶35)和PVA(分子量为5000-50000)；所述的氟碳气体为八氟丙烷(全氟丙烷)；所述赋形剂为甘露醇。

9.一种包裹药物或基因的高分子聚合材料微泡造影剂的制备方法，其特征是：方法包括先将水溶性药物或目的基因加入水中或将脂溶性药物加入有机溶剂中，然后按在权利要求4-6中所述的材料和方法，即可制作内部包裹药物或基因的高分子聚合材料微泡造影剂。