CN1732746A - 海带无性繁殖系程序降温冻存法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种海带无性繁殖系程序降温冻存法，其特征是该方法包括以下步骤：材料预处理、平衡、降温、复苏和去除保护剂，本发明改进已有的继代培养保存无性系技术的不足，提供了一种用于海带无性系超低温保存，存活率高，自动化程度高，利于该技术标准化的海带无性繁殖系程序降温冻存法。
Description
一、技术领域
本发明属于海洋生物技术领域，涉及一种大型经济藻类—海带种质保存技术。
二、背景技术
海带(Laminariajaponica Aresch)是中国重要的经济藻类，海带生活史分两个明显的世代阶段：孢子体世代和配子体世代，配子体世代是海带的单倍体阶段，在该阶段将雌配子体(female gametophyte)和雄配子体(male gametophyte)单个分离培养，可形成无性繁殖系(clone)。传统的种质保存技术就是将无性系继代培养保存，传统保存技术具有明显的不足：(1)液体培养是唯一的保存途径，手段单一，限制了保存的规模和效率；(2)液体培养保存一般需要在半月内更新一次培养液，工作量大，操作繁琐，频繁操作也增加了种质污染及混杂的机会；(3)采孢子前无法对种海带进行无菌处理，整个保存过程都在有菌条件下，不能彻底杜绝微生物尤其杂藻的污染；(4)培养中细胞形态异常、单性生殖等现象时有发生，培养因子有待进一步优化。因此，目前的保种技术是一种传统的继代培养保存的方法，无法完全排除混杂、污染、变异的可能性，还不能作到种质永久保存。
藻类种质超低温保存的研究开始于20世纪60年代，80年代以后发展速度较快，从淡水藻类到海水藻类，从微藻类到大型藻类，从非经济藻类到经济藻类都给予了较多的关注。藻类超低温冷冻保存的方法主要是两步冰冻法(two-stepfreezing)，该方法首先在保存材料中加入抗冻保护剂，进行预冻，再将预冻过的材料投入液氮中快速冷冻，目前已成为藻类种质冰冻保存的常规方法；超低温两步法冻存在大型经济藻类中使用的种类有紫菜和裙带菜，目前有关海带无性系两步法超低温保存仍为一个空白。
三、发明内容
本发明的目的在于改进已有的继代培养保存无性系技术的不足，而提供一种用于海带无性系超低温保存，存活率高，自动化程度高，利于该技术标准化的海带无性繁殖系程序降温冻存法。
本发明的目的是这样实现的，海带无性繁殖系程序降温冻存法，其特点是该方法包括以下步骤：材料预处理、平衡、降温、复苏和去除保护剂。
材料预处理是将无性系用组织破碎仪切割成100-200um的小段，在光强1500±200Lux，光时L∶D 24∶0，水温10～15℃，营养盐NO3-N6-10g/m3，PO4-P1-2g/m3的条件下培养两周以上。
平衡是将丝状体置于在0-4℃冰箱预冷的10％DMSO溶液中，并在冰箱中平衡30min。
降温是平衡结束后，用医用注射器将丝状体与DMSO混合液注射到0.5ml的麦管中，插入程序降温仪冷冻腔内，开始降温，降温从0℃开始，以-2℃/min的速率降到-40℃，并在-40℃上停留30min，然后投入液氮。
复苏是超低温冰冻后，将麦管从液氮中取出，迅速移到26℃恒温水浴中快速震荡，至最后一粒冰晶消失移入冰水浴中。
去除保护剂是将混合液经500目筛绢过滤，滤出的无性系移入培养液中培养。
本发明与已有技术相比具有以下显著特点和积极效果：本发明采用超低温程序降温冻存海带无性系，将海带无性系首先按照程序逐渐降温进行预冷，然后投入液态氮中冷冻保存，使海带丝状体在超低温(-196℃)状态下代谢完全停止，生命以静止的形式可以在这种状态下长期保存，解冻后又可恢复其原有的生物活性和遗传特性，有效地解决了海带无性系种质保存中污染、混杂、变异的问题，实现海带丝状体种质的永久保存。本发明方法与无性系逐级冷冻保存法相比一是提高了成活率，二是自动化程度高，利于该技术的标准化，但对降温设备要求较高，因此适合大型科研院所使用。无性系程序降温冻存法和逐级冷冻保存法是用途、性质不同的两种方法，有同时存在的必要性。
四、具体实施方案
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例，海带无性繁殖系程序降温冻存法，包括材料预处理、平衡、降温、复苏和去除保护剂五步骤，材料预处理是将无性系用组织破碎仪切割成100-200um的小段，在光强1500±200Lux，光时L∶D24∶0，水温10～15℃，营养盐NO3-N 6-10g/m3，PO4-P 1-2g/m3的条件下培养两周；平衡是将无性系置于在0-4℃冰箱预冷的10％DMSO溶液中，并在冰箱中平衡30min；降温是平衡结束后，用医用注射器将丝状体与抗冻剂混合液注射到0.5ml的麦管(straws)中，插入程序降温仪冷冻腔内，开始降温，降温从0℃开始，以-2℃/min的速率降到-40℃，并在-40℃上停留30min，然后投入液氮；复苏是超低温冰冻后，将麦管从液氮中取出，迅速移到26℃恒温水浴中快速震荡，至最后一粒冰晶消失移入冰水浴中，超低温冻存的时间可以根据需要确定，在需要对冻存无性系复苏时结束冻存即可；去除保护剂是将混合液经500目筛绢过滤，滤出的无性系移入常规培养液中培养。
采用本发明方法保存的海带无性系，再培养法测定存活率，存活率达73％。
Claims (6)
1、海带无性繁殖系程序降温冻存法，其特征是该方法包括以下步骤：材料预处理、平衡、降温、复苏和去除保护剂。
2、根据权利要求1所述的海带丝状体程序降温冻存法，其特征材料预处理是将无性系用组织破碎仪切割成100-200um的小段，在光强1500±200Lux，光时L：D24：0，水温10～15℃，营养盐NO3-N 6-10g/m3，PO4-P 1-2g/m3的条件下培养两周以上。
3、根据权利要求1所述的海带丝状体程序降温冻存法，其特征平衡是将丝状体置于在0-4℃冰箱预冷的10％DMSO溶液中，并在冰箱中平衡30min。
4、根据权利要求1所述的海带无性繁殖系程序降温冻存法，其特征降温是平衡结束后，用医用注射器将丝状体与DMSO混合液注射到0.5ml的麦管中，插入程序降温仪冷冻腔内，开始降温，降温从0℃开始，以-2℃/min的速率降到-40℃，并在-40℃上停留30min，然后投入液氮。
5、根据权利要求1所述的海带无性繁殖系程序降温冻存法，其特征复苏是超低温冰冻后，将麦管从液氮中取出，迅速移到26℃恒温水浴中快速震荡，至最后一粒冰晶消失移入冰水浴中。
6、根据权利要求1所述的海带无性繁殖系程序降温冻存法，其特征去除保护剂是将混合液经500目筛绢过滤，滤出的无性系移入培养液中培养。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101502232B (zh) * | 2009-02-26 | 2010-09-15 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 一种海带育苗方法 |
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2005
- 2005-08-04 CN CNB2005100442012A patent/CN100340159C/zh not_active Expired - Fee Related
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