CN1723038A - 诱导人或动物免疫应答的药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及诱导人或动物免疫应答的药物组合物，该组合物包括负载了至少由一种癌细胞系提供的至少五种癌/睾丸抗原，不负载谱系特异性分化抗原或基本上不负载谱系特异性分化抗原的树突状细胞，本发明涉及表达癌睾丸抗原而非分化抗原的多样性的分离细胞系，也涉及使用本发明的组合物诱导人或动物免疫应答的方法。

Description

诱导人或动物免疫应答的药物组合物

技术领域

本发明涉及诱导人或动物免疫应答的药物组合物。另一方面，本发明涉及一种获得负载(loaded with)至少五种癌/睾丸抗原，不负载谱系(lineage)特异性分化抗原或基本上不负载谱系特异性分化抗原的自体树突状细胞(dendritic cell)的方法。在其他方面，本发明涉及分离的黑素瘤细胞系。进一步，本发明涉及组合物作为免疫治疗疫苗的应用以及自体树突状细胞作为抗原呈递细胞在药物组合物或疫苗中的应用。更进一步，本发明涉及诱导人或动物免疫应答的方法。

背景技术

晚期癌症是人类死亡的主要原因之一。至今还没有有效的治疗方法。癌症免疫治疗目的在于通过免疫学机制破坏肿瘤细胞。免疫治疗与传统的癌症治疗方法如外科手术、放射以及化学疗法相比较，具有更小的毒性并且至今没有严重的并发症记录。此外，免疫治疗具有针对疾病不同阶段进行施治的潜能。在初期阶段，它是经手术去除早期肿瘤时的很好的补充治疗方法，其目的在于防止转移肿瘤扩散。在疾病的晚期阶段，当传统方法无效时，往往它是唯一的治疗方法。

免疫系统的主要功能是识别和破坏侵入机体的外源物质(抗原)。免疫系统能够区别“自我”和“非自我”，并且在正常情况下只对外源或“非自我”抗原产生免疫应答。尽管癌细胞起源于机体自身细胞，它们被自然免疫系统作为外来物质对待。然而，该自然免疫应答系统并没有强大到足以阻止肿瘤的出现和生长。免疫治疗的任务在于增加免疫系统识别肿瘤细胞的能力以及开发有效的肿瘤消除机制。在任何特异免疫疗法中的两个主要问题是哪些抗原用作目标以及寻找对免疫系统来说最佳的抗原呈递。

能被细胞毒性T淋巴细胞(CTL)所识别的肿瘤相关抗原(TAA)是在已知的抗肿瘤免疫效应子(effector)机制中作为目标的最有效的成分。有两种主要的TAA类型：独特抗原，仅在很少的肿瘤细胞中显现因而不能作为一般目标而起作用，共有(shared)或者普通(common)TAA存在于许多肿瘤当中。三组主要的共有抗原通常被认为是免疫疗法的潜在目标并且都已显示出可以诱导产生细胞毒性T淋巴细胞。这三组抗原是：癌/睾丸抗原(CT抗原)，肿瘤超表达抗原，以及谱系特异分化抗原。

CT抗原由肿瘤或种系(germ line)特异基因编码，代表了共有肿瘤相关抗原的最大组群之一。CT抗原最早发现在黑素瘤细胞中，但是在许多其他人类恶性肿瘤中也已被发现。在正常组织中它们仅被表达于睾丸中并且在一些病例中表达于胎盘。表达这些抗原的正常细胞由于缺少MHC分子的表达，因此这些抗原正常情况下不被T淋巴细胞所识别。

这使得CT抗原成为特异癌症免疫疗法中非常引人注目的目标。最近的临床试验显示通过靶向特异CT抗原的治疗，大量黑素瘤和膀胱癌病人的肿瘤发生了衰退(Nishiyama et al.，2001，Clin.Cancer Res.，v.7，pp.23-31；Thurner et al.，1999，J.Exp.Med.，v.190，pp.1669-1678)。只对某些CT抗原和相关肽决定表位报道了通过T细胞的CT抗原识别。然而，所有的CT抗原都可以被考虑作为免疫疗法的潜在目标。MAGE-A抗原的表达和肿瘤进展的相关性在许多的恶性肿瘤中被发现(Brasseur et al.，1995，Int.J.Cancer，v.63，pp.375-380；Eura et al.，1995，Int.J.Cancer，v.64，pp.304-308；Katano et al.，1997，J Surg.Oncol.，v.64，pp.195-201；Patard et al.，1995，Int.J.Cancer，v.64，pp.60-64)。另一组CT抗原，MAGE-B抗原，显示出比MAGE-A抗原明显低的肿瘤特异性表达。第三组，MAGE-C抗原，显示出与MAGE-A抗原相类似的表达模式。针对于MAGE-C抗原的CTL反应还没有被报道过。

被描述过的几个具有CT抗原特征的非MAGE蛋白中，NY-ESO-1是目前被识别的最具免疫原性的肿瘤抗原之一。黑素瘤病人的多肽免疫临床试验证明出疾病的稳定性和在一些病人中转移的衰退(Jgeret al.，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，v.97，pp.12198-12203)。

与CT抗原相反，肿瘤过表达抗原缺少严格的肿瘤特异表达，因为它们的表达能够在一些正常组织类型而不是睾丸中以低水平被检测到。针对这些抗原中的某些抗原的免疫疗法的进展对癌症病人来说是有利的。目前这些抗原，如CEA，p53，HER-2/Neu，MUC-1以及α-胎蛋白正在临床试验中被作为可能的目标而加紧研究。肿瘤过表达抗原组只是近来才被用作临床试验中的目标，因而还缺少引起治疗性免疫应答的有效性的数据。

谱系特异抗原，黑素瘤细胞分化抗原以及前列腺相关抗原到目前为止只被用来描述两种类型的人类癌症：黑素瘤和前列腺癌。这一组抗原在正常分化组织和两种人类癌症中都有表达。在正常分化组织中这些抗原很少诱导免疫应答，但是，这些蛋白在癌细胞中产生免疫原性，在黑素瘤病例中，有可能检测到针对黑素瘤细胞分化抗原的T杀伤细胞反应。针对黑素瘤和前列腺癌的临床试验绝大多数使用分化抗原作为目标。

在肿瘤相关抗原组中，使用TAA作为免疫疗法目标，从一些MAGE蛋白中获得了最有希望的数据。但是，尤其在黑素瘤病例中，疗效并不稳定，一些转移病灶在继续生长。这些转移对于用于免疫的MAGE抗原表达是负面的(Thurner et al.，1999，J.Exp.Med.，v.190，pp.1669-1678)。

诱导多价免疫应答的一种可能是使用完整肿瘤细胞或者源于完整细胞的物质。WO9003183，US5,840,317以及US6,187,306描述了一些以黑素瘤细胞为基础的疫苗制备过程。US4108983公开了来源于通过牛痘病毒裂解的黑素瘤细胞的第一代黑素瘤疫苗。

US5,635,188和US5,030,621公开了一种来自黑素瘤细胞表面抗原的疫苗，黑素瘤细胞通过在培养基中培养，随后被用作抗黑素瘤细胞的细胞表面抗原疫苗。类似地，US5,484,596揭示了治疗癌症的一种方法，其中受辐射过的肿瘤细胞被作为疫苗注射到病人体内。US6,187,306涉及表达共有免疫显性黑素瘤抗原的黑素瘤细胞系及其应用方法。

任何疫苗治疗的重要方面是疫苗的给药方式。最近几年人们认识到，最有效的抗原到T细胞递送方式，特别是对于初生T细胞，是通过树突状细胞递送的方式。树突状细胞(DC)是最有效的抗原呈递细胞，以DC为基础的免疫疗法已经以不同的方式用于癌症治疗(Kugler et al.，2000，Nat Met.，v.6，pp.332-336；Nestle et al.，1998，Nature(Med.)，v.4，pp.328-332；Thurner et al.，1999，J.Exp.Med.，v.190，pp.1669-1678)，显示出该免疫疗法的极大潜力。

DC的独特性质之一是它的通过细胞内吞方式摄取外源蛋白的能力，被摄取的外源蛋白然后被加工并作为多肽表位连同MHC-I类抗原一起被呈递于DC细胞表面。抗原呈递树突状细胞可以被细胞毒性T细胞识别。当肿瘤细胞抗原以肿瘤裂解物或外源加入的凋亡小体(apoptotic bodies)的形式被应用时，这一特性是极为重要的。通过对未成熟与成熟DC的比较，高的内吞活性被确信与DC分化的未成熟状态有关(Sallusto et al.，1995，J.Exp.Med.，v.182，pp.389-400)。在未成熟DC中存在内吞活性差异的可能性一直未被加以考虑。

WO0127245披露了通过标准的白细胞除去法、浮力密度梯度离心以及在缺少外加细胞因子条件下，将细胞在无血清培养基中以间接体内(ex vivo)方式培养40小时，从而从外周血中获得树突状前体细胞的方法。

WO0146389涉及通过使用缺乏非人蛋白的培养基，在封闭系统中从白细胞去除法产物中产生树突状细胞的方法。在培养基中使用临床级别的细胞因子(IL-4和GM-CSF)以及添加用于DC负载的TAA。

Thurner et al.，1999，J.of Immunological Methods 223：1-15，涉及通过一天之后加入细胞因子的两步法可再生地从CD14+单核细胞产生大量成熟DC的方法。

树突状细胞和TAA’s的结合在WO0128583中也有披露，其涉及一种提供抗原呈递细胞的免疫治疗疫苗，该抗原呈递细胞与被破碎的细胞制备物一起经受脉冲作用，其中制备物包含经编码至少一种免疫刺激分子的重组牛痘病毒浸染的癌细胞的细胞膜。也包括自体DC，它呈递来自受到编码IL-2的重组牛痘病毒浸染的黑素瘤细胞系的抗原混合物。在WO0129192中公开了诱导病人肿瘤特异免疫应答的方法，其中，来自病人的抗原呈递细胞和至少拥有一种肿瘤抗原的死亡细胞部分被孵育，并且将最终获得的负载抗原呈递细胞给病人施用。

尽管近几年对于用于治疗癌症的免疫治疗疫苗有所改进，但是用于癌症免疫治疗的更加安全、更加有效的组合物的需求依然存在。那些靶向某些CT抗原的疫苗应该是多价的以避免抗原丧失变异体的派生。它们应该更安全，没有潜在的靶向在正常组织中表达的抗原的危险。它们应针对呈递(presentation)和递送(delivery)抗原到T细胞而得到最优化，同时，也应该小心谨慎地选择最有效的TAA作为标靶。

发明内容

本发明解决了这些问题，方法是仔细选择黑素瘤细胞系以提供最有效的TAA，接着，通过随后的筛选以避免任何可能对病人的产生潜在危害的抗原。在使DC负载完整黑素瘤细胞裂解物之前，抗原呈递细胞的内吞作用活性也得到优化。

在第一方面，本发明涉及诱导人或动物免疫应答的药物组合物，包括呈递癌/睾丸抗原多样性的树突状细胞，其中

a)至少五种癌/睾丸抗原，无谱系特异分化抗原或基本上无谱系特异分化抗原通过树突状细胞呈递。

b)癌/睾丸抗原由至少一种癌细胞系所提供，所述癌细胞系表达了至少五种不同的癌/睾丸抗原，不表达谱系特异分化抗原或基本上不表达谱系特异分化抗原。

c)树突状细胞在负载癌/睾丸抗原期间是非成熟的(CD1a阳性，CD14阴性，和CD83阴性)。

在第二方面，本发明涉及一种获得负载至少五种癌/睾丸抗原，不负载谱系特异分化抗原或基本上不负载谱系特异分化抗原的人或动物自体树突状细胞的方法，包括步骤：

a)提供至少一种癌细胞系，所述癌细胞系表达至少五种癌/睾丸抗原，不表达谱系特异分化抗原或基本上不表达谱系特异分化抗原，

b)提供来自上述人或动物的自体树突状细胞，

c)使用每25cm²接种5×10⁶-20×10⁶个单核细胞的接种密度，

d)在初始生长阶段没有任何细胞因子的条件下，在生长培养基中间接体内培养上述的树突状细胞，接着在包含细胞因子的培养基中进行第二阶段培养，以及

e)使来自d)中的树突状细胞负载癌/睾丸抗原，该癌/睾丸抗原从a)中的至少一种癌细胞系的完整细胞裂解物中获得。

在第三方面，本发明涉及一种分离的黑素瘤细胞系，该黑素瘤细胞系表达至少五种癌/睾丸抗原，不表达黑素细胞分化抗原或基本上不表达黑素细胞分化抗原。

在第四方面，本发明涉及癌/睾丸抗原的多样性(multiplicity)在药物组合物或疫苗制剂中的应用，癌/睾丸抗原可从分离的权利要求28中的肿瘤细胞系中获得。

在第五方面，本发明涉及树突状细胞在药物组合物或疫苗中作为抗原呈递细胞的应用，其中的树突状细胞在它们的非成熟状态负载抗原，在所述状态时树突状细胞的CD1a呈阳性，CD14呈阴性，CD83呈阴性。其中，在初始生长阶段没有任何细胞因子的条件下在生长培养基中间接体内培养树突状细胞，接着在树突状细胞负载至少五种癌/睾丸抗原之前，在包含细胞因子的培养基中进行第二阶段培养。

在第六方面，本发明涉及一种诱导人或动物免疫应答的方法，包括以下步骤：

a)提供至少一种癌细胞系，该细胞系至少表达五种癌/睾丸抗原，不表达谱系特异分化抗原或基本上不表达谱系特异分化抗原，

b)提供来自上述人或动物的自体树突状细胞，

c)在初始生长阶段在没有任何细胞因子的条件下，在生长培养基中间接体内培养上述的树突状细胞，接着在包含细胞因子的培养基中进行第二阶段培养，以及

d)使来自c)中的树突状细胞负载癌/睾丸抗原，该癌/睾丸抗原从a)中的至少一种癌细胞系的完整细胞裂解物中获得。

e)给所述人或动物施用负载树突状细胞。

附图简述

下面对本发明有关附图作详细解释，其中，

附图1通过gp100和MART-1/Melan特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)克隆，显示了一些DDM-1黑素瘤克隆对裂解的敏感性。

附图2显示通过RT-PCR分析，黑素瘤细胞分化抗原，gp100和MART-1/Melan A在三个黑素瘤细胞克隆DDM-1.7、DDM-1.13和DDM-1.29中的表达。

附图3显示通过免疫染色测定的黑素瘤细胞分化抗原gp100在DDM-1.7、DDM-1.29细胞中的表达。

附图4显示通过RT-PCR分析，MAGE-A1、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A12、NY-ESO-1和GAPDH，在三个黑素瘤细胞克隆DDM-1.7、DDM-1.13和DDM-1.29中的表达。

附图5显示在用DNA脱甲基试剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-aza-2’-deoxycytidine)处理后，MAGE-A和NY-ESO-1在DDM-1.13细胞中的表达。

附图6显示四种未成熟树突状细胞培养物通过荧光团(fluorospheres)的内吞作用的吸收量。

附图7显示通过一个gp100特异性CTL克隆与载有DDM-1.29细胞裂解物的四种树突状细胞培养物(同附图6)相互作用之后的IFN-γ的产量。

附图8显示供体ANBI的免疫淋巴细胞针对黑素瘤细胞、EBV转化B细胞以及K562细胞的细胞裂解活性。

附图9显示供体19/00的免疫淋巴细胞针对乳房和鳞状细胞癌细胞系的细胞裂解活性。

附图10显示通过RT-PCR分析的MAGE-A和GAPDH基因在乳房癌细胞系中的表达。

实现本发明的最佳实施方式：

在讨论本发明的具体实施方案之前，首先提供涉及本发明主要方面的专业术语的定义。

定义：

细胞毒性T淋巴细胞：淋巴细胞是存在于淋巴组织、循环血液和淋巴腺的小的单核白细胞。有两种主要功能类型，B-淋巴细胞和T-淋巴细胞，在抗原特异免疫应答中起作用。T-淋巴细胞(T-细胞)是小的抗原特异性淋巴细胞，起源于胸腺(哺乳动物)和存在于次级淋巴组织(如，淋巴腺，脾)以及血液，它参与细胞免疫应答和辅助抗体产生。T淋巴细胞表面具有抗原特异性受体并且只对呈递到细胞表面的外源抗原起反应。主要的T淋巴细胞类型有：细胞毒性T淋巴细胞，它识别和杀死以某种方式产生抗原性改变的体细胞(如，通过病毒感染)；辅助T细胞，它在抗原呈递细胞表面通过外源抗原而被激活并反过来激活适当B细胞；抑制性T细胞，参与抑制免疫应答和免疫系统的一般调节。

癌/睾丸抗原(CT-抗原)：通过癌或种系特异基因编码的抗原，代表共有的肿瘤相关抗原最大组群之一。CT-抗原起初在黑素瘤中被发现，但是也被发现于很多其他人类恶性肿瘤中。在正常组织中它们仅在睾丸和某些胎盘病例中表达。表达这些抗原的正常细胞缺少MHC分子的表达，因而这些抗原正常情况下不能够被T-淋巴细胞识别。

谱系特异分化抗原：一组分化抗原，至今只对黑素瘤和前列腺癌做了描述。这些抗原仅在癌细胞中具有免疫原性，并且这一组包括黑素瘤细胞分化抗原gp100，Melan-A/MART-1，酪氨酸酶，TRP-1，TRP-2，MC1R，AIM-1和前列腺相关抗原PSA(前列腺特异抗原)，PSMA(前列腺特异膜抗原)，PAP(前列腺相关磷酸酯酶)和PSCA(前列腺干细胞抗原)。

黑素瘤细胞分化抗原：在正常分化的黑素瘤细胞和黑素瘤中表达都有表达的一组抗原。在正常分化的黑素瘤细胞中这些抗原极少诱导免疫应答，但是，这些蛋白在癌细胞中变得具有免疫原性，并且就黑素瘤来说，检测到对黑素瘤细胞分化抗原反应的T-杀伤细胞是可能的。该蛋白被认为负责黑色素合成。

树突状细胞：在某些淋巴组织中的非淋巴细胞型，外源蛋白先经过细胞的内吞作用，然后与MHC I类和II类抗原结合在一起被加工、并作为抗原决定簇被呈递到细胞表面。呈递树突状细胞的抗原能够被细胞毒性T细胞和T辅助细胞识别。树突状细胞的成熟状态对于它们的吞噬/内吞活性是非常重要的。未成熟树突状态细胞是最有效的负载抗原细胞。

未成熟树突状细胞：是其中某些细胞的表达标记CD1a、CD14和CD83，以高表达CD1a(在群体中超过50％的DC是CD1a阳性的)，不表达或低表达CD14(在群体中低于15％的DC是CD14阳性)以及低表达CD83(在群体中少于25％的DC是CD83阳性)为特征的树突状细胞。

核外体(exosome)：核外体是直径为30-100nm的膜囊，由内吞作用起源，并且通过不同起源的活细胞在体外生成和分泌。

细胞因子：作为生物反应修饰成分的免疫系统蛋白。它们协调抗体和T细胞免疫系统的相互作用，并且增强免疫应答。细胞因子包括由激活的T淋巴细胞和天然杀伤细胞产生的巨噬细胞和淋巴因子合成的单核因子。单核因子包括白细胞介素(IL)-1，肿瘤坏死因子(TNF)，α和β干扰素(IFN)和集落刺激因子。淋巴因子包括IL’s，γ-IFN，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，以及淋巴毒素。内皮细胞和纤维原细胞以及被选择的其它细胞型也可以合成细胞因子。根据本发明，合适的细胞因子例子包括IL-4，GM-CSF，IL-13，IFN-γ，Flt31，SCF，TNF-α。

黑素瘤：一种不同严重程度的恶性癌症或肿瘤，在疾病的深度阶段趋向于扩散或转移。

负载树突状细胞：通过内吞作用吸收外源蛋白和在树突状细胞表面上呈递多肽表位。有时候也称作“脉冲(pulsing)”。

与本发明相关的术语“基本上无(不表达)谱系特异性/黑素细胞分化抗原”是指用于制备完整细胞裂解物的癌/黑素瘤细胞系不会表达其含量会诱发针对谱系特异性/黑素细胞分化抗原免疫应答的谱系特异性/黑素细胞分化抗原。实际上，这意味着癌/黑素瘤细胞对于特异于谱系特异性/黑素瘤细胞分化抗原的细胞毒性T淋巴细胞导致的裂解是不敏感的(在4小时的细胞毒性试验中，裂解少于10％，尤其少于5％，更少于2％。)，并且只有1-2％的细胞通过针对谱系特异性/黑素瘤细胞分化抗原的抗体呈现阳性染色。此外，在这些细胞系里的来自编码谱系特异性/黑素瘤细胞分化抗原基因的RNA转录物的数量，当由半定量RT-PCR测定时，与在高敏感性细胞系中的RNA转录物的数量相比较至少低大约100倍。

免疫应答：脊椎动物免疫细胞具有的选择性反应，其中，特异抗体和/或细胞毒性细胞针对侵入的微生物、寄生虫，移植组织以及许多其他被机体识别为外来物的物质而产生。在血液中循环的抗体的产生被称作体液免疫应答，毒性细胞的产生被称作细胞间接或细胞免疫应答。

免疫治疗疫苗：一种用于治疗和/或防止已在宿主中被确诊疾病的进一步发展的疫苗。

自体细胞：个体自身的细胞。

同种异源(allogeneic)：遗传上相区别的，但属同一物种的。

抗原呈递细胞：专化淋巴细胞，如诱导T细胞激活的树突状细胞，B细胞以及单核细胞。

单核细胞：与巨噬细胞相关的吞噬细胞的白血细胞。单核细胞代表着另一种抗原呈递细胞类型，它重新激活原先被激活的细胞毒性T淋巴细胞。

前体树突状细胞：存在于外周血中的CD14+单核细胞或者呈现于骨髓或外周血中(尤其是在活动化之后)的CD34+细胞。

免疫显性：抗原存在于与其它抗原一起的混合物中，主要刺激针对其自身的免疫应答。

本发明涉及改进的例如作为免疫治疗疫苗的治疗组合物。抗原呈递至T细胞，特别是初生T细胞的最有效的方式是通过自体树突状细胞。来自三组不同肿瘤相关抗原：CT抗原、肿瘤过表达抗原、谱系特异抗原之一的几种肿瘤相关抗原已被应用在临床试验中并且到目前为止，最有前途的结果显现于来自癌/睾丸抗原组中的抗原。

肿瘤过表达抗原与CT抗原相比，缺少严格的肿瘤特异表达，因为它们的表达可以在某些正常组织而不是睾丸中检测到，仅管与肿瘤细胞相比处在一个明显很低的水平。这种分布防止了强烈的肿瘤排斥免疫性的发展(由于高反应性的T淋巴细胞在耐受性诱导中的消除)以及一旦反应产生，潜在的发展成自身免疫的危险性将会上升。该组中包括大量抗原并且其中一些在最近临床试验中作为靶目标。

上面所提及的限制相同也适用于包括分化抗原的谱系特异抗原，该抗原组也在相应的正常分化组织中表达，并且在健康个体中它们由于对“自我”蛋白的耐受而很少诱导攻击。由于未知的原因，这些正常蛋白在癌细胞中产生免疫原性，在黑素瘤病例中，T杀伤细胞针对黑素瘤细胞分化抗原的反应能够很容易在病人中检测到，而在健康个体中不会被检测到。绝大多数直接针对黑素瘤或前列腺癌的临床试验是利用分化抗原作为目标。

本发明的目标之一是特意的地避免在用于免疫的抗原混合物中出现过表达和谱系特异性分化抗原。就黑素瘤细胞系而言，过表达抗原组极少能够诱导免疫应答，因而排除了对抗原组进行阴性筛选的需要。至于黑素瘤细胞分化抗原，它们不应该出现，如果出现，其量应该不足以导致诱导针对它们的免疫应答(实际上，这意味着通过RT-PCR半定量测定，来自编码黑素瘤细胞分化抗原基因的RNA转录物的量与在高敏感性细胞系中的RNA转录物量相比较至少低大约100倍)。那些免疫显性蛋白的存在应该被避免，特别是不应该出现gp100，Melan A/MART-1和酪氨酸酶。

提供表达免疫显性的至少三种抗原，特别是至少五种CT抗原，更特别的是提供尽可能多的CT抗原的细胞系也是本发明的一个目标。令人惊奇的是，这些细胞系能够从移走III期或IV期肿瘤后具有长的无疾病周期(超过五年)的黑素瘤病人中获取，表明了体内肿瘤细胞的免疫原性。来自这些细胞系的个体亚克隆因为缺少任何黑素瘤细胞分化抗原，尤其是缺少gp100，Melan A/Mart-1和酪氨酸酶而被随后筛选。

除了黑素瘤免疫疗法，本发明还提供了一种诱导针对人或动物体内其他类型癌症的免疫应答的方法。要求作为靶的抗原是共有抗原并且在其他类型恶性肿瘤中出现，主要地在实体瘤中出现。尤其是这些类型肿瘤可以包含结肠直肠癌，胰腺癌，乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌，鳞状细胞癌，汗腺癌，肾细胞癌，肝细胞瘤，宫颈癌，肺癌，小细胞肺癌或膀胱癌。

因此，在本发明的一个具体实施方案中涉及一种用于诱导人或动物免疫应答的药物组合物，包括呈现癌/睾丸抗原多样性的树突状细胞，其中，

a)至少五种癌/睾丸抗原，无谱系特异分化抗原或基本上无谱系特异分化抗原通过树突状细胞呈递。

b)癌/睾丸抗原通过表达至少五种分化癌/睾丸抗原，不表达谱系特异分化抗原或基本上不表达谱系特异分化抗原的至少一种癌细胞系提供。

c)树突状细胞在负载癌/睾丸抗原期间是未成熟的(CD1a阳性，CD14阴性，和CD83阴性)。

有利的是负载的树突状细胞可以随着成熟因子的加入而成熟。

如上所讨论，树突状细胞是最有效的抗原呈递细胞。本发明的另一个目的是提供树突状细胞尤其是产生于外周血中分离的CD14+单核细胞或者是来自外周血或骨髓中的CD34+细胞的自体树突状细胞，它们的细胞内吞/吞噬活性以及CD1a表达均已被优化。该活性被确信与树突状细胞的非成熟状态有关。为了获得那些被激活的细胞，许多报道利用了Sallusto和Lanzavecchia的“GM-CSF+IL-4方法”(1994，J.Exp.Med.179：1109)。其他适合的细胞因子包括IL-4，GM-CSF，IL-13，IFN-γ，Flt-31，SCF，TNF-α(Alters et al.，1999，J.Immunother.，v.22，pp.229-236)，尤其是涉及本发明的细胞因子选自GM-CSF和IL-4。

现在我们吃惊地发现，如下面实施例2所示，这一方法能够被进一步优化，在初始生长阶段没有任何细胞因子的生长培养基中间接体内培养，接着，使树突状细胞负载之前在包含细胞因子的新鲜培养基中进行第二阶段培养，将会得到细胞内吞活性增强的DC’s。根据本发明，初始生长阶段从6-48小时，特别是从12-34小时，更特别的是从20-28小时。

以前人们认为所有非成熟树突状细胞的细胞内吞活性是同样的，与培养方法无关。现在我们发现，通过使用报道的方法来生产稳定的成熟树突状细胞以及通过在加入成熟因子之前，使树突状细胞在它们的非成熟状态负载，从而获得细胞内吞活性优化的非成熟树突状细胞是可能的。

因而，在本发明另一实施方案中涉及一种如上提及的药物组合物，其中树突状细胞在初始生长阶段没有任何细胞因子的生长培养基中间接体内培养，接着在使树突状细胞负载至少一种癌/睾丸抗原之前，通过在包含细胞因子的新鲜培养基的进行第二阶段培养。

由于要提供CT抗原的多样性，尤其是要提供超过五种的CT-抗原，在本发明的进一步实施方案中涉及如上所描述的药物组合物，其中提供来自至少一种不表达谱系特异性分化抗原或基本上不表达谱系特异性分化抗原的癌细胞系的完整细胞裂解物中的至少五种癌/睾丸抗原。完整细胞裂解物能够通过几种方式从细胞中获得，如肿瘤细胞或其他类型细胞，通过细胞裂解，再如，通过几个冷冻和解冻周期而获得。在包括可溶性物质的细胞裂解物中粒子通常通过离心和/或过滤被移走。

在本发明的一个具体实施方案中，涉及如上所描述的组合物，其中癌细胞系是黑素瘤细胞系并且谱系特异性分化抗原是黑素细胞分化抗原。

在进一步的实施方案中，黑素细胞分化抗原包括gp100，MelanA/Mart-1，和酪氨酸酶。

根据本发明体外培养的树突状细胞将在它们的内吞活性和CD1表达方面将被优化，并且它们能够方便地被用于任何用于免疫治疗的组合物或疫苗中的抗原呈递。因此在本发明的进一步实施方案中涉及一种自体树突状细胞在药物组合物或疫苗中作为抗原呈递细胞的使用方法，其中所述自体树突状细胞已经过在初始生长阶段没有任何细胞因子的生长培养基中间接体内培养，接着在使树突状细胞在它们的未成熟阶段负载至少五种癌/睾丸抗原之前，在包含细胞因子的生长培养基中进行第二阶段培养。

根据本发明其他获得呈递抗原的树突状细胞的方法也是可能的，例如完整细胞融合。这可以通过使用携带有根据本发明的细胞系的树突状细胞融合实现。

在进一步的实施方案中，抗原呈递通过核外体的使用而实现。核外体是小的细胞内吞起源的膜囊泡，它们由大部分培养细胞所分泌，并且最近在抗原呈递细胞中被描述，它们能够诱导体内免疫应答(Thery et al.，2002，Nature Reviews Immunology 2：569-579)。

更在进一步的实施方案中，本发明涉及获得负载至少五种癌/睾丸抗原，不负载谱系特异性分化细胞或者基本上不负载谱系特异性分化抗原的自体树突状细胞的方法，包括步骤：

a)提供至少一种表达至少五种癌/睾丸抗原，不表达谱系特异分化抗原或基本上不表达谱系特异分化抗原的癌细胞系，

b)提供来自于上述的人或动物的自体树突状细胞，

c)在初始生长阶段没有任何细胞因子的生长培养基中间接体内培养所述树突状细胞，接着通过在包含细胞因子的培养基的进行第二阶段培养，

d)使来自c)所述树突状细胞负载癌/睾丸抗原，该抗原获自至少一种来自a)的癌细胞系的完整细胞裂解物。

有利的是树突状细胞在步骤d)之后通过加入成熟因子，像IL-1β，IL-6，TNF-α和PGE2而成熟。

在另外一个具体实施方案中，本发明涉及通过实施步骤a)到步骤d)，接着通过成熟步骤而获得的药物组合物。

使用已知的方法从单核细胞群体中产生树突状细胞，很难获得理想的树突状细胞产量。有报道来自单核细胞起始群体的树突状细胞平均产量大约是5％(Marovitch et al.，2002，J.Infect.Dis.186：1242-1252)。为了得到一个完整接种周期所需的50×10⁶数目的树突状细胞，必需从10⁹个单核细胞开始。

假定在吸附期间细胞浓度通常是5×10⁶/ml，该细胞量需要0.2L培养基用于吸附步骤，同样量的培养基用于进一步的细胞培养。为制备树突状细胞将需要大约60μg GM-CSF和30μg的IL-4以及大量的组织培养塑料器皿。这将导致每个疫苗的净值(net price)是非常高的。此外，为了从血液中分离10⁹个单核细胞将需要1L血液，从病人中获取几乎是不可能的，考虑到病人的极差的健康状况，即使分两次单独抽取也是不可能的。一种可能性是使用准许大量单核细胞分离的白细胞去除法。该程序常常被用于生产大量的树突状细胞(例如参见Thurner et al.，1999，J.Immunol.Methods 223：1-15)但是，白细胞去除法的程序非常花费时间并且成本高，反过来它将增加疫苗制备的总成本。此外，在一台白细胞去除设备上只能处理一名病人的血样。这将限制制备程序的生产能力。

可以选择的是，从单核细胞中生产树突状细胞的效率能够增加。例如Tuyaerts等2002(J.Immunol.Methods 264：135-151)报道了Nnuc细胞生产厂生产树突状细胞的改进方法，并且报道其树突状细胞产量达到了起始单核细胞量的40％(或起始单核细胞量的13％，当平均起来单核细胞代表了单核细胞的三分之一时)。但是，产生的树突状细胞缺少可以指示其不完全分化的CD1a标记的表达。因为CD1a的表达是实现本发明目的所必需的，该方法不能被用来实现我们的目的。

因此，我们代之以优化了的从血液单核细胞中产生未成熟树突状细胞的程序，严密监测单核细胞转化为树突状细胞的增加效率以及完全感受态未成熟树突状细胞的产生，作为感受态未成熟树突状细胞产生的读出系统，我们已经选择下列标准：CD1a标记高表达(超过50％)，CD14没有或低表达(低于15％)以及CD83低表达(低于25％)。

如在下面实施例中所描述的，本发明最优化的结果已经证明延迟细胞因子的加入的重要性，特别是在CD1a标记表达方面。

我们的研究进一步揭示通过在单核细胞的接种群体中控制单核细胞起始浓度，获得大约50％带有从单核细胞产生的CD1a标记的未成熟树突状细胞产量是可能的。

因而本发明的进一步方面涉及一种优化产生自单核细胞样品的树突状细胞产量的方法，在该方法中，单核细胞的接种密度是在6-8ml培养基中接种5×10⁶-20×10⁶细胞/25cm²。当使用T25瓶时，这意味着单核细胞的起始数量在5×10⁶-20×10⁶细胞之间。在具体实施方案中密度在6×10⁶-15×10⁶细胞/25cm²之间，特别是在8×10⁶-12×10⁶细胞/25cm²之间。

在一个具体的实施方案中至少两个同种异源黑素瘤细胞系在步骤a)中被提供。同种异源细胞系的数量取决于由于缺少黑素瘤细胞分化抗原而被分离以及筛选出的适宜的亚克隆数量。提供的细胞系越多一些免疫显性癌/睾丸抗原在完整细胞裂解物中被代表的机会就越大。在一个具体实施方案中，从至少两种同种异源细胞系中提供至少五种CT-抗原。在一个具体实施方案中同种异源细胞系选自DDM1.7(ECACC 01112339)或DDM-1.13(ECACC 01112338)(两种细胞系保藏在European Collection of Animal Cell Cultures，CAMR，GB-Salisbury，Wiltshire SP40JG，(大不列颠)联合王国，2001年11月23日)。

本发明的另一方面涉及上面具体的细胞系，也涉及表达至少五种CT抗原，不表达黑素细胞分化抗原或基本上不表达黑素细胞分化抗原的其它细胞系。因此本发明涉及至少表达五种癌/睾丸抗原，不表达黑素细胞分化抗原或基本上不表达黑素细胞分化抗原分离的黑素瘤细胞系，尤其是分离的细胞系DDM1.7(ECACC 01112339)或DDM-1.13(ECACC 01112338)。因此本发明也涉及一种药物组合物或本发明的一种方法，其中至少一种黑素瘤细胞系选自同种异源细胞系DDM1.7(ECACC 01112339)或DDM-1.13(ECACC 01112338)。

当药物组合物被施用于人或动物时，将在所述人或动物中诱导免疫应答，导致刺激人或动物产生细胞毒性T淋巴细胞。因此本发明进一步的目的涉及一种在人或动物体中诱导免疫应答的方法，包括步骤：

a)提供至少一种表达了至少五种癌/睾丸抗原，不表达谱系特异分化抗原或基本上不表达谱系特异分化抗原的癌细胞系，

b)提供来自于所述人或动物的自体树突状细胞，

c)初始生长阶段在没有任何细胞因子的生长培养基中间接体内培养所述树突状细胞，接着在包含细胞因子的培养基中进行第二生长阶段培养，

d)使来自c)所述树突状细胞负载癌/睾丸抗原，该抗原来自a)的至少一个癌细胞系的完整细胞裂解物中。

e)施用所述来自d)的负载树突状细胞于人或动物。

在上述方法的一个具体实施方案中，癌细胞系是黑素细胞系，谱系特异性分化抗原是黑素细胞分化抗原。

在一些情况下从病人体内获取足够量的自体树突状细胞是困难的。这种情况下，在步骤b)之前给与诱导CD14+单核细胞动员(mobilization)的物质是可能的。所述物质包括G-CSF和/或GM-CSF。

树突状细胞前体，CD14+单核细胞或CD34+细胞能够从血液样品中获得，如从外周血中获得。它也可能但是并没有必要从剥离(apheresis)细胞开始。

也可以预期的是根据本发明该方法进一步包括施用于人或动物的步骤，在步骤e)之后诱导T淋巴细胞激活的物质。这可以通过施用例如IL-2或IL-12完成。

本发明期望在制备至少来源于一种黑素瘤细胞系的完整细胞裂解物之前，应用一种能够增加癌/睾丸抗原表达水平的试剂。建议通过DNA甲基化影响某些睾丸特异性基因的表达。已证实去甲基化试剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5azaCdR)能够在MAGE-A1阴性黑素瘤细胞中诱导MAGE-A1基因的表达(De Smet et al.，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，v.93，pp.7149-7153；Weber et al.，1994，Cance Res.，v.54，pp.1766-1771)。当5azaCdR在DNA甲基化，CpG二核苷酸靶位点掺入DNA时，5azaCdR是起到DNA转甲基酶自杀底物作用的胞嘧啶类似物。在真核细胞中去甲基化一般导致体内基因表达增加。已有建议说MAGE-A1的激活产生于启动子区的去甲基化，接着是发生在很多肿瘤中的全面的去甲基化过程。5azaCdR在基因表达方面的激活效应也在MAGE家族(Lucas et al.，1998，Cancer Res.，v.58，pp.743-752；Lurquin et al.，1997，Genomics，v.46，pp.397-408)，以及GAGE家族(DeBacker et al.，1999，Cancer Res.，v.59，pp.3157-3165；Li et al.，1996，Clin.Cancer Res.，v.2，pp.1619-1625)，以及LAGE基因家族(Li et al.，1996，Clin.Cancer Res.，v.2，pp.1619-1625))的其他成员中显现。去甲基化在肿瘤细胞的MAGE基因表达中的作用由下列事实支持：其他很多在肿瘤细胞中检测不到其存在的睾丸特异性基因的表达，不能通过5azaCdR的处理而上调节(De Smet et al.，1997，Biochem.Biophys.Res.Commun.，v.241，pp.653-657)，在MAGE-B基因中只有通过5azaCdR处理被激活的那些基因的肿瘤表达才能被检测到(Lurquin et al.，1997，Genomics，v.46，pp.397-408)。此外，MAGE-A1基因启动子区的CpG位点的去甲基化与基因表达之间的好的相关性已经被观察到(De Smetet al.，1999，Mol.Cell Biol.，v.19，pp.7327-7335)。

因此，在一个具体实施方案中，CT抗原表达的上调节能够通过编码CT抗原的DNA的去甲基化实现。尤其是该去甲基化能够通过5azaCdR的处理而诱导。但是CT抗原表达的上调节的另一个方式可以被组蛋白的脱乙酰化作用抑制。这两种处理类型可以分别或一起使用。这种处理方式只有在癌/睾丸抗原保持免疫显性时才可以被使用。

许多CT抗原能够被分成包括一些成员的亚家族(参见表1)。它们是MAGE-A，MAGE-B，MAGE-C，GAGE，LAGE和SSX亚家族。对于其它抗原至今只有一个个体成员被发现。它们是BAGE，SCP-1，TSP50，TRAG-3，SAGE，IL13Rα，CT9和CTp11抗原。所有CT抗原可以考虑作为实现本发明之目的的潜在的免疫治疗之目标。

表1.人癌/睾丸抗原

家族     成员

MAGE-A   MAGE-A1， MAGE-A2， MAGE-A3，MAGE-A4，

         MAGE-A5， MAGE-A6， MAGE-A8，MAGE-A9，

         MAGE-A10，MAGE-A11，MAGE-A12

MAGE-B   MAGE-B1，MAGE-B2，MAGE-B3，MAGE-B4，

         MAGE-B5，MAGE-B6，MAGE-B10，MAGE-B16，

         MAGE-B17

MAGE-C   MAGE-C1，MAGE-C2，MAGE-C3，MAGE-C4

GAGE     GAGE-1，GAGE-2，GAGE-3，GAGE-4，GAGE-5，

         GAGE-6，GAG E-7，GAGE-8

         PAGE-1，PAGE-2，PAGE-3，PAGE-4

         XAGE-1，XAGE-2，XAGE-3

LAGE     LAGE-1a，LAGE-1b，Ny-ESO-1

SSX      SSX-1，SSX-2，SSX-3，SSX-4，SSX-5

单独

成员：   BAGE，SCP-1，TSP50，TRAG-3，SAGE，IL13Rα，

         CT9，CTp11

CT抗原的最大组之一是MAGE蛋白组，包括三个家族，MAGE-A，MAGE-B和MAGE-C。

MAGE-A基因代表了15个位于染色体X(Xq28区)长臂的紧密相关的基因家族(Chomez et al.，2001，Cancer Res，v.61，pp.5544-5551；De Plaen et al.，1994，Immunogenetics，v.40，pp.360-369)，包括第一个被识别的编码MAGE-A1抗原的基因(原先被指定为MAGE-1)(vander Bruggen et al.，1991，Science，v.254，pp.1643-1647)。在大多数研究的肿瘤中只有MAGE-A1、-A2、-A3、-A4、-A6和-A12基因已经被证实。最近其他MAGE-A基因的表达，包括MAGE-A11(Jurk et al.，1998，Int.J，Cancer，v.75，PP.762-766)，MAGE-A10(Huang et al.，1999，J.Immunol.，v.162，pp.6849-6854)，MAGE-A5，MAGE-A8和MAGE-A9(Serrano et al.，1999，Int.J.Cancer，v.83，pp.664-669)在某些肿瘤中也已经被检测到。

呈递被细胞毒性T淋巴细胞(CTL)识别的肽表位的能力由MAGE-A1(van der Bruggen et al.，1991，Science，v.254，pp.1643-1647)，MAGE-A2(Visseren et al.，1997，Int.J.Cancer，v.73，pp.125-130)，MAGE-A3(Gaugler et al.，1994，J.Exp.Med.，v.179，pp.921-930)，MAGE-A4(Duffour et al.，1999，Eur.J.Immunol.，v.29，pp.3329-3337)，MAGE-A6(Tanzarella et al.，1999，Cancer Res.，v.59，pp.2668-2674)，MAGE-A10((Huang et al.，1999，J.Immunol.，v.162，pp.6849-6854))和MAGE-A12((Panelli et al.，2000，J.Immunol.，v.164，pp.4382-4392))表现。T-辅助细胞也能够识别MAGE抗原，并且MAGE-A1和MAGE-A3抗原的相关表位也已被识别出来(Chaux et al.，1999，J.Exp.Med.，v.189，pp.767-778；Chaux et al.，2001，Eur J Immunol，v.31，pp.1910-1916；Manici et al.，1999，J.Exp.Med.，v.189，pp.871-876)。

MAGE表达在很多类型的人恶性肿瘤中被检测到。皮肤黑素瘤具有最高水平的MAGE表达(MAGE-A3达到65％的水平)(De Planenet al.，1994，Immunogenetics，v.40，pp360-369)，尽管眼黑素瘤对于MAGE表达是阴性的(Mulcahy et at.，1996，Int.J.Cancer，v.66，pp.738-742)。MAGE抗原在其它肿瘤中以相对较低的程度表达，如乳腺癌，头颈肿瘤，肺癌，恶性肿瘤和膀胱癌(其综述参见(van Pel et al.，1995，Immunol.Rev.，v.145，pp.229-250))。MAGE-A1的高表达(80％)在肝癌中被发现((Yamashita et al.，1996，Hepatology，v.24，pp.1437-1440))。与其它MAGE抗原相比，MAGE-A4在大部分淋巴细胞中表达，包括Hodgkin淋巴细胞，其中它的表达被限制在Reed-Sternberg细胞中(Chambost et al.，2000，Blood，v.95，PP.3530-3533)。当发现肿瘤样品是MAGE-A4阳性时，基因通常以非常高的水平表达。

MAGE-B基因代表X染色体上位于p21.3和p22区的17个基因家族，其中的8个是假基因(Chomez et al.，2001，Cancer Res，v.61，pp.5544-5551；Lucas et al.，2000，Int.J.Cancer，V87，pp.55-60；Lurquinet al.，1997，Genomics，v.46，pp.397-408)。只有两个基因MAGE-B1和MAGE-B2在各种组织学类型肿瘤的重要部分中表达。MAGE-B5和MAGE-B6的表达在有限的肿瘤样品数量中被检测到(Lucas et al.，2000，Int.J.Carcer，v.87，pp.55-60)。

MAGE-C家族中的七个成员位于Xq26-q27区。MAGE-C1基因通过在睾丸和黑素瘤中的选择性基因表达分析而被识别(Lucas et al.，1998，Cancer Res.，v58，pp743-752)。它们的表达模式与MAGE-A基因的表达模式极为相像。另一条基因CT7(Chen et al.，1998，Proc.Natl.Acas.Sci.U.S.A.，v.95，pp6919-6923)有可能代表不同的MAGE-Cl等位基因。MAGE-C2/CT10局限于Xq27区，但是与MAGE-Cl相比，该蛋白没有重复部分。第三和第四个成员MAGE-C3和MAGE-C4，通过数据库搜索而得以识别(chomez et al.，2001，cancer Res，v.61，pp.5544-5551；Lucas et al.，2000，Int.J.Cancer，v.87，pp.55-60)。

一些具有癌/睾丸抗原特征的非MAGE蛋白已经被描述。其中一个是BAGE抗原(

et al.，1995，Immunity，v.2，pp.167-175)。它们在肿瘤样品中的表达模式非常近似于MAGE抗原的表达模式，具有更低的表达率(在黑素瘤中22％，在膀胱癌中15％，在乳腺癌中10％，在头颈鳞状细胞癌中8％)，至于MAGE抗原，BAGE的表达与肿瘤进展的阶段相关联。BAGE抗原能够被CTL识别，并且抗原的肽表位被识别。

另外一个抗原被作为HLA-Cw6-限定的由GAGE-1基因编码的表位得以识别(Van den Eynde et al.，1995，J.Exp.Med.，v.182，pp.689-698)。该基因属于大的基因家族，包括：GAGE-1至GAGE-8基因(Chenet al.，1998，J.Bjol.Chem.，v.273，pp.17618-17652；De Backer et al.，1999，Cancer Res.，v.59，pp.3157-3165；Van den EVnde et al.，1995，J.Exp.Med.，v.182，pp.689-698)，PAGE-1到PAGE-4基因((Brinkmann eta1.，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，v.95，pp.10757-10762；Chen et al.，1998，J.Biol.Chem.，v.273，pp.17618-17625)，和XAGE-1至XAGE-3基因(Brinkmann et al.，1999，Cancer Res.，v.59，pp.1445-1448)。编码蛋白的GAGE家族的两个基因GAGE-1和GAGE-2在大部分黑素瘤(24％)，肉瘤(25％)，非小肺癌(19％)，头颈肿瘤(19％)和膀胱肿瘤(12％)中表达。

一些CT抗原最近通过使用SEREX方法得以识别(人类肿瘤重组cDNA文库血清表达克隆)(Sahin et al.，1995，Proc.Natl.Acad，Sci.U.S.A.，v.92，pp.11810-11813)。其中之一，NY-ESO-1，由CTAG基因编码(Chen et al.，1997，Cytogenet.Cell Genet.，v.79，pp.237-240)，表达于67个黑素瘤样本中的23个样本中，33个乳腺癌样本中的10个样本中，16个前列腺癌样本的4个样本中，5个膀胱癌样本中的4个样本中，同样在其他一部分肿瘤类型中也有表达，但是在11个培养的黑素瘤细胞系中仅有两个表达(Chen et al.，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，v.94，pp.1914-1918)。在黑素瘤病人中，CTL反应受限于HLA-A2，并且由黑素瘤特异CTL系识别的三种肽已经被鉴别。也已发现该抗原在一例黑素瘤病人中诱导HLA-A31-限制的CTL反应(Wang et al.，1998，J.Immunol.，v.161，pp.3596-3606)。此外，随着三种肽表位的鉴别，通过CD4+T淋巴细胞的MHC II类限制已经得到描述(Jger et al.，2000，J.Exp.Med.，v.191，pp.625-630)。最近针对于CTAG的基因同源性已经得到了描述。这一基因LAGE-1(Lehtéet al.，1998，Int.J.Cancer，v.76，pp.903-908)在类似于NY-ESO-1的不同肿瘤中分布。两个基因都位于X染色体的q28带，接近于MAGE基因(Lehtéet al.，1998，Int.J.Cancer，v.76，pp.903-908)。NY-ESO-1是目前被鉴别的最具免疫原性的肿瘤抗原之一。

由此本发明进一步的实施方案中癌/睾丸抗原包括选自MAGE-A，MAGE-B，MAGE-C，GAGE，LAGE，SSX亚家族的抗原。

在一个具体实施方案中CT抗原中包括的抗原选自MAGE-A1，MAGE-A2，MAGE-A3，MAGE-A4，MAGE-A5，MAGE-A6，MAGE-A8，MAGE-A9，MAGE-A10，MAGE-A11，MAGE-A12，MAGE-B1，MAGE-B2，MAGE-B3，MAGE-B4，MAGE-B5，MAGE-B6，MAGE-B10，MAGE-B16，MAGE-B17，MAGE-C1，MAGE-C2，MAGE-C3，MAGE-C4，BAGE，GAGE-1，GAGE-2，GAGE-3，GAGE-4，GAGE-5，GAGE-6，GAGE-7，GAGE-8，NY-ESO-1，LAGE，PAGE-1，PAGE-2，PAGE-3，PAGE-4，XAGE-1，XAGE-2，XAGE-3，SSX-1，SSX-2，SSX-3，SSX-4，SSX-5。在另一个具体的实施方案中，CT抗原所包括的抗原选自SCP-1，TSP-50，TRAG-3，SAGE，IL-13Rα，CTp11。

在更进一步的具体实施方案中，CT抗原中所包括的抗原选自MAGE-A1，MAGE-A3，MAGE-A4，MAGE-A6，MAGE-A10，MAGE-A12和NY-ESO-1。

以上抗原代表了被认为是本发明内容中特别有用的抗原，但是，其它没有被专门提及的抗原只要其癌/睾丸抗原多样性得到应用，则也可以被使用，并且特别为至少五种，更特别为至少六种，更进一步为至少七种CT抗原。

本发明进一步的实施方案涉及上述组合物作为癌症免疫治疗疫苗的应用。

使用以黑素瘤细胞为基础的组合物或疫苗的一个情形是黑素瘤存在于疾病的晚期阶段。另一种情形是原发肿瘤的存在，在这种情况下，治疗的目的不仅仅是诱导对原发肿瘤的排斥，也防止转移，因为一组CT抗原主要在转移中表达。还有一种情形是通过其他方式(外科手术，放射)移走原发或转移性肿瘤，在这种情况下，治疗的目的是防止肿瘤复发。

表达几个CT抗原的肿瘤比没有或仅有一种CT抗原的肿瘤有更多的机会被抑制或限制生长。因此，肿瘤活体组织中的CT抗原表达测定在预测使用通用的以黑素瘤细胞为基础的疫苗效力上具有重要意义。

实施例

接下来将进一步通过某些非限制性实施方案阐述本发明。

实施例1

DDM-1黑素瘤细胞系的黑素细胞分化抗原缺陷克隆的分离

DDM-1黑素瘤细胞系获自疾病长期未发作的病人。克隆DDM-1黑素瘤细胞，筛选出酪氨酸酶表达阴性的8个克隆。酪氨酸酶是已知的黑素瘤细胞分化抗原之一。进一步对这些克隆(DDM-1.5，DDM-1.6，DDM-1.7，DDM-1.10，DDM-1.11，DDM-1.13，DDM-1.24和DDM-1.25)进行了表达两种免疫显性黑素细胞分化抗原，gp100和MelanA/MART-1的检测。

在T75组织培养瓶中用补充了10％胎牛血清的20ml RPMI 1640培养基(BioWhittaker)进行黑素瘤细胞常规培养。为了在诱导针对负载黑素瘤细胞裂解物的树突状细胞免疫应答的实验中使用，用包含2％的人血清(HuS)培养基调节细胞生长。在培养瓶中移走培养基，在Ca、Mg缺失的PBS(Bio Whittaker)中加入5ml 0.02％EDTA，在CO₂培养箱中培养10-20分钟，加入10ml PBS并且转移分离细胞至离心管从而收集细胞。以200g离心5分钟之后，丢弃上清液，粒状沉淀重新悬浮于培养基中，进行细胞计数，将1.5×10⁶个细胞放入含有20ml培养基的T75培养瓶中。

Gp100和Melan-A/MART-1抗原的表达通过测定黑素瘤细胞对于由细胞毒性T淋巴细胞(CTL)克隆引起的裂解敏感性而得以检测，其细胞毒性T淋巴细胞是特异性针对这些抗原的。我们以前描述了这些CTL克隆的性质(Kirkin et al.，1999，Cancer Immunol.Immunother.，v.48，pp.239-246)，其完整内容因此被并入作为参考。如上描述，收集黑素瘤细胞，重悬于培养基中，进行细胞计数，每个克隆的0.5×10⁶个细胞被转移至11ml圆锥试管(Nunc)。细胞以200g离心5分钟，丢弃上清液，粒状沉淀重新悬浮在0.1ml的培养基中。加入0.1mlNa₂CrO₄溶液(0.1mCi，Amersham)，细胞以37℃水浴60分钟。用RPMI-1640洗涤三次之后，使目标物在含有10％FCS的RPMI-1640中浓度调节至5×10⁴细胞/ml。使用浓度为5×10⁵细胞/ml的毒性淋巴细胞。CTLs和目标黑素瘤细胞以100μl等分试样一式三份接种在96U型底的微量滴定板中(Nunc)，以200g离心2分钟，随后在5％CO₂，37℃条件下温育。4小时后铺板以250g离心3分钟，收集100μl上清液，测定放射能(Cobra 5005，Packard Instruments，Meriden，Conn.，USA)。根据标准公式计算特异性裂解。一个代表性的实验结果在附图1中表示。这些结果显示被研究的黑素瘤克隆中只有两种黑，DDM1.7和DDM1.13对于CTLs引起的溶胞攻击是完全耐性的，表明在这些黑素瘤克隆中有可能缺少所指出的黑素瘤细胞分化抗原的表达。

为了获得缺少抗原表达的其他证据，我们通过RT-PCR对这些蛋白的RNA译码的表达进行了分析。离心2×10⁶个细胞，丢弃上清液，粒子沉淀溶解在0.3ml细胞裂解液中(Purescript^RRNA isolation kit，Gentra)。根据厂商说明书分离RNA，加入两体积的100％异丙醇至裂解液中使之沉淀，用70％乙醇洗涤并且在10μl无RNAase蒸馏水中再水化。分离的RNA用DNAase处理以破坏任何制备中的痕量DNA。为了实现这一目的，使用了DNA-free^TM试剂盒中的试剂(Ambion)。1μl 10×DNAase缓冲液和μl DNAase(2个单位)被加入样品中，混合物以37℃温育30分钟，加入1.2μl DNAase钝化试剂终止反应。在20μl总体积中使用10μl RNA进行反转录从而完成cDNA合成。为了这一目的，根据厂商方案使用含有oligo(dT)引物的Super Script II RT(Gibco BRL)。42℃温育30分钟，接着以45℃温育30分钟，72℃温育2分钟。1μl cDNA用于PCR扩增，该扩增的1xPCR缓冲液中含有：50mM KCL，10mM Tris/HCL(pH9.0)，1.5mMMgCl₂,0.2mM甲酚，12％蔗糖，0.005％牛血清白蛋白胨，每一引物2.5pmol，40μM dNTPs(Pharmacia LKB)，以及1.25U(1μl)AmpliTaq聚合酶(Perkin-Elmer)。通过下述方式选择引物：扩增的产物能够在同样反应条件下被有效地累积，使我们能够在同时进行的反应条件下比较各种被选择的抗原在肿瘤细胞中的表达。这些实验以及下面要描述的试验中使用的引物序列列于表2。在所有反应中，使用“热启动”程序，其中在第一循环周期中的变性和退火步骤之间，80℃温度下加入Taq聚合酶和dNTP至反应试管中。用于扩增的参数是30-38个循环(94℃，30秒；60℃，30秒；72℃，40秒)，接下来72℃，10分钟并且冷却至4℃。扩增在Perkin-Elmer GeneAmp PCR系统9600中完成。阴性对照含有代替了cDNA的水的等分试样。GAPDH作为反应的阳性对照被扩增，同时也给出了对于持家基因相关抗原表达率的评价。对于阴性结果随着循环次数的增加至少重复两次。扩增产物使用2％琼脂糖胶以100v电泳分离，使用溴乙啶染色，在UV照射下显现，并由图像报告系统记录。当进行半定量RT-PCR时，循环的次数降低到22次以确保被筛选序列的量随着扩增循环次数呈线性增加。PCR反应通过使用3或5倍cDNA模板稀释液来进行。结果产物的条带强度在电泳分离之后通过图像进行分析，通过使用同样模板和同样稀释液而获得的GAPDH产物的强度来进行标准化，与RNA转录相关的水平在不同细胞系中得以比较。

表2寡核苷酸序列5’-3’

基因                    引物

GADPH           有义    AGGGGGGAGCCAAAAGGG

                反义    GAGGAGTGGGTGTCGCTGT

Gp100           有义    GGCTGGTGAAGAGACAAGTCC

                反义    AGAGATGCAAGGACCACAGCC

Mart-1          有义    GAAGGTGTCCTGTGCCCTGACCC

                反义    GGCTTGCATTTTTCCTACACCATTCC

MAGE-A1         有义    GATTCCCTGGAGGCCACAG

                反义    CCTCACTGGGTTGCCTCTGTC

MAGE-A3         有义    ACCAGAGGCCCCCGGAGGAG

                反义    CTGCCAATTTCCGACGACACTCC

MAGE-A4         有义    GAGCAGACAGGCCAACCG

                反义    AAGGACTCTGCGTCAGGC

MAGE-A6         有义    AGGACCAGAGGCCCCC

                反义    GGATGATTATCAGGAAGCCTGT

MAGE-A10        有义    CACAGAGCAGCACTGAAGGAG

                反义    CTGGGTAAAGACTCACTGTCTGG

MAGE-A12        有义    TGGAAGTGGTCCGCATCG

                反义    GCCCTCCACTGATCTTTAGCAA

NY-ESO-1        有义    GGCACAGGGGGTTC

                反义    GCTTAGCGGCCTCTGCCCT

在3个黑素瘤细胞克隆DDM-1.7，DDM-1.13和DDM-1.29中的黑素细胞分化抗原gp100，MART-1表达测定的结果显示如图2，清楚地证实在生长于10％FCS中的DDM-1.7，DDM-1.13黑素瘤克隆的RNA转录水平也大大低于DDM-1.29中的水平，并且与DDM-1.29相比DDM-1.7，DDM-1.13相关产物的条带强度随着cDNA模板连续稀释降低得更快。根据半定量RT-PCR分析结果以及通过持家GAPDH转录水平标准化之后数据表明，在DDM-1.7，DDM-1.13中黑素细胞抗原的RNA转录水平与DDM-1.29中与之相关的抗原转录水平相比较低1％。在调整细胞生长至2％人血清中之后，黑素细胞分化抗原表达的微弱增加(未列出)能够通过RT-PCR分析显示，其不超过DDM-1.29中相关抗原转录水平1％。

调整至2％人血清中生长的细胞中的gp100表达也通过免疫染色进行研究。对此，细胞被培养在置于皮氏培养皿中的玻璃盖片上。用冷PBS漂洗后，细胞用冰冷的甲醇-丙酮混合物(1∶1)固定15分钟。干燥之后，盖片在PBS中孵育1分钟并且根据现有技术已知的标准程序使用作为第一抗体的HMB45和HMB50抗体混合物(NeoMarkers)，作为第二抗体的生物素化的绵羊抗鼠Ig抗体(Amersham)，作为第三试剂的链霉亲和素-Texas红(Amersham)染色。如附图3中所示，与在DDM-1.29细胞中检测到的强烈染色相比较，在DDM-1.7细胞中未见染色。大量细胞的显色表明在DDM-1.7培养物中非常少量的细胞群体(少于1％)是阳性的(未列出)。在生长于同样条件下的DDM-1.13细胞之中，大约细胞的1％是gp100染色阳性的(未列出)。

为确定MAGE-A和NY-ESO-1抗原的表达水平，我们使用用于这些抗原的引物(引物序列列于表2)进行RT-PCR反应。MAGE-A1，MAGE-A3，MAGE-A4，MAGE-A6，MAGE-A10，MAGE-A12和NY-ESO-1蛋白的mRNA译码表达的比较结果列于图4中。DDM-1.29表达了所有被检测的抗原，而DDM-1.7，DDM-1.13仅表达它们之中的4-5个。

已知CT抗原表达可以通过用DNA脱甲基试剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷对细胞处理而呈现上调节。我们决定进行检测DDM-1.13黑素瘤细胞克隆中MAGE-A和NY-ESO-1蛋白的表达是否也能够通过这种处理方式而上调节。细胞被接种于T25培养瓶中，24小时后，以1μM终浓度加入5-氮杂-2’-脱氧胞苷。培养细胞3天，然后改变培养基，再次培养两天之后，通过如上所描述的方法收集细胞。通过如上所描述的方法确定抗原表达。结果显示于附图5，证实在用5-氮杂-2’-脱氧胞苷处理细胞之后，所有被检测的CT抗原的表达增加了。

实施例2

产生呈递外源蛋白能力提高的树突状细胞

树突状细胞的独特性质是它们能够呈递被CD8⁺CTLs识别的外源蛋白。吸收外源蛋白的最大能力与DC分化的未成熟阶段相关，但是，在表明DC吞噬活性和它们呈递已吸收抗原的能力之间直接联系的有关数据是缺失的，其中已吸收抗原由特异性针对这些抗原的CTLs识别。因此我们进行了如下目的实验：a)优化产生具有高吸收外源蛋白能力的未成熟的树突状细胞，b)证实树突状细胞的吞噬活性和其呈递抗原的能力之间的相关性，其中抗原来自外源黑素瘤裂解物。

在第一批实验中，我们通过改变细胞因子加入的时间以及使用TGF-β1从而使具有吞噬活性的树突状细胞的生产得到优化，其显示出来自于外周血单核细胞的树突状细胞的产生得到改进(Yang et al.，1999，J.Immunol.，V.163，pp.1737-1741)。树突状细胞典型地产生自具有25IU/ml肝素的HLA-A2阳性供体的50ml外周血中。血液被分在两个含有12.5ml的钙、镁缺失的PBS(以下称为PBS)的50ml试管中，并且在淋巴准备中使用(12.5ml被放置在两个50ml的试管中)。在离心(800g，25分钟)之后，10ml的上层物质被导入注射器，通过0.2μm滤纸后作为血浆的来源。单核细胞被从中间相层中收集，并且在用PBS稀释至少两倍之后，离心6次，首先为650g，10分钟，然后450g，7分钟，以后250g，5分钟，每次离心之后，丢弃上清液。粒子沉淀被重悬于5ml的PBS中，直至细胞聚集完全消失。加入新鲜的PBS至试管顶部，重复离心。最后一次离心之后，粒子沉淀被重悬于5ml包含了加入2％血浆的RPMI 1640培养基的粘附培养基中。细胞计数之后，细胞浓度调整到5×10⁶/ml。将3ml的细胞上清液置入6孔板的加样孔中(Falcon，非TC处理的)，总共4个加样孔加样，然后在CO₂培养箱中培养1.5小时，培养之后收集非粘附细胞，用温RPMI 1640培养基以及3ml包含添加了1％血浆的RPMI培养基(DC培养基)洗涤两次单层粘附细胞。重组人GM-CSF和IL-4，以1000U/ml的浓度加入到两个加样孔中(培养物1和3)。过夜培养之后，在两个加样孔中培养基被完全改变(培养物2和4)。对此，培养基被收集在一个离心管中，2.5ml新的预热DC培养基被加入到每一个加样孔中，离心收集的细胞(250g，5分钟)。丢弃上清液，沉淀粒子重悬于1ml的预热DC培养基。0.5ml的细胞上清液放回至培养物2和4，对于培养物3和4，以100ng/ml的终浓度加入TGF-β1。

再经过5天之后，检测产生的树突状细胞吞噬活性。含有10％FCS(胎牛血清)的RPMI 1640培养基被放入平底非TC处理过的96孔板(Faccon)的加样孔以及离心管中30-60分钟，每0.5ml DC培养物被转移到预处理的离心管中，离心(200g，5分钟)之后丢弃上清液，粒子沉淀被重悬于0.5ml DC培养基中。从96孔板加样孔中移走培养基，加入每种细胞上清液0.2ml于加样孔中，每种类型的培养使用两个加样孔。加入10μl FluoSpheres储备液至每个试管，将平板放入CO₂培养箱。4小时之后，培养物收集至如上所描述的预处理离心管中，通过在含有10％FCS的RPMI 1640培养基中以200g，5分钟离心洗涤两次后，粒子沉淀被重悬于25μl的RPMI培养基。放置试管于冰上。5μl细胞上清液被置于显微镜载玻片上，载玻片置于潮湿房间内(通常使用覆有潮湿纸的大型皮氏培养皿)并且在CO₂培养箱培养10-15分钟。之后，用13mm的盖玻片覆盖一滴细胞上清液，在荧光显微镜下观察细胞。使用Leica DC100数字相机，将图像转换到计算机中并储存为位图文件。

一个测定在研究条件下产生的树突状细胞的吞噬活性的试验结果列于附图6中。可清楚地看到在培养起始之后第二天与完全培养基改变一起添加GM-CSF和IL-4同从培养一开始就添加GM-CSF和IL-4的培养相比具有显著的好处。应该注意到在大部分描述有关构建与肿瘤细胞裂解物相结合并应用于免疫的树突状细胞方面的文章中，细胞因子是从培养的一开始就被加入的(参见例如(Chakraborty et al.，1998.Cancer Immunol.Immunother.，v.47，pp.58-64；Nestle et al.，1998，NatureMed.，v.4，pp.328-332))。

附图6的结果也证实在产生树突状细胞期间被研究人员作为另一种细胞因子使用的TGF-β1(Yang et al.，1999，J.Immunol.，v.163，pp.1737-1741)对树突状细胞的吞噬活性没有加强的效果，并且事实上，在一些实验中降低了吞噬活性(未列出)。

通过使用负载高水平表达黑素瘤细胞分化抗原gp100的DDM1.29细胞裂解物的树突状细胞识别模式，借助我们建立的(Kirkin et al.，1999，Cancer Immunol.Immunother.，v.48，pp.239-246)并且在实施例1中被用于检测在不同黑素瘤细胞克隆中gp100抗原表达的gp100特异性CTLs，对于呈递来自外源加入蛋白的抗原多肽的能力进行了研究。

DDM1.29细胞的裂解物通过如下描述的方法制备。如实施例1中所描述的方式培养黑素瘤细胞，并用PBS洗涤两次，然后以10⁷细胞/ml重悬于RPMI1640培养基(Gibco)中。细胞经受5个冷冻(液氮)-解冻周期，在超声浴中超声破碎15分钟(Metason 200，Struer)，然后离心，首先在800g，4℃条件下离心15分钟，然后4℃条件下，以13000g，离心60分钟。收集上清液，通过0.2μm的滤纸过滤，根据厂商提供的程序使用bicinchoninic acid蛋白分析试剂(Pierce)检测蛋白浓度。该蛋白浓度在3.5-5mg/ml之间。上清液等分试样被冷冻保藏在-80℃条件下。

为使树突状细胞负载肿瘤裂解物，不同的树突状细胞培养物被转移到离心管中，经离心，丢弃上清液后，粒子沉淀被重悬于2ml DC培养基中，细胞计数，然后将细胞上清液稀释到5×10⁵/ml。1.8ml细胞上清液被置于非TC处理的Falcon 24孔板，0.2ml肿瘤裂解物连同GM-CSF和IL-4(1000U/ml)被同时加入。过夜培养之后，加入20ng/ml的TNF-α。经过另一个24小时培养之后，通过强烈抽吸后收集培养物，培养物被转移至预处理的离心管，然后以200g离心5分钟，轻轻倒出上清液，粒子沉淀重悬于2ml DC培养基。细胞计数之后，细胞上清液被稀释至3×10⁵细胞/ml，将1ml上清液置于24孔TC板(Nunc)的加样孔中，每种类型的树突状细胞培养物使用两个加样孔。其中一个加样孔添加1ml培养基，另一个加样孔添加1ml CTL上清液(10⁶/ml)。培养物经培养24小时之后，将1ml的上清液被转移到eppendorf管，经离心后，上清液被转移到另一个eppendof管，通过如下的ELASA方法分析产生的γ-干扰素(IFN-γ)量。在包被缓冲液(PBS，pH7.4)中，免疫平板MaxiSorp板(Nunc)被周稀释至2μg/ml的100μl抗人IFN-γ的纯化单克隆抗体(Endogen)包被，室温过夜。移走包被溶液，加入200μl封闭液(在PBS中4％BSA)，室温培养1小时，用补加了0.05％Tween-20(洗涤缓冲液)的PBS冲洗平板4次，并且在培养基中加入50μl、浓度范围从15-1000pg/ml的重组INF-γ(Engogen)的两倍标准稀释液作为副本。收集的上清液以3000g离心5分钟，50μl样品和两个两倍稀释液作为三份使用。平板在4℃条件下培养过夜。不洗涤平板，在封闭液中加入50μl稀释至0.5μl/ml的生物素标记的检测抗体(抗INF-γ生物素标记的，Endogen)，在室温下继续培养2小时。用洗涤缓冲液洗涤4次之后，以每个加样孔100μl的量在封闭液中加入按1∶1000稀释的HRP偶联链霉亲和素(Genzyme)，然后平板在室温培养1小时。平板用洗涤缓冲液洗涤四次，并用纸巾擦吸。100μl底物溶液(5mg OPD溶解于11ml柠檬酸盐缓冲液中并补充5μl的过氧化氢)被加入至每个加样孔中。该反应在室温下进行15-40分钟，然后通过添加50μl的10％硫酸终止反应。有差别的吸收值随着ELASA读数器上490-650nm之间不同的读数值而得以测定。扣除仅加入细胞培养基代替INF-γ的对照值，在实验中释放的INF-γ浓度通过使用绘自于同一试验并以pg/ml表示的INF-γ制图曲线而加以测定。

附图7显示了这些实验中一个试验的数据。可以看到树突状细胞培养物1和3的特异性INF-γ的产量是最大的，该产量表示出负载了裂解物的树突状细胞与“空”树突状细胞面前的INF-γ产量的不同，同样也是这两种培养物具有最大吞噬活性。

概括讲，树突状细胞用摄取自肿瘤裂解物的抗原特异性地刺激CTL的能力与树突状细胞的吞噬活性相关，并不依赖DC分化期间TNF-α的存在，该能力达到最大化是在DC培养物中，其中GM-CSF和IL-4的添加推迟一天并且该添加与完全培养基改变相结合。

实施例3

经负载黑素瘤细胞衍生裂解物的自体树突状细胞对正常供体的外 周血淋巴细胞刺激之后，具有广泛抗肿瘤活性的细胞毒性T淋巴细 胞的形成(development)。

负载黑素瘤细胞裂解物的树突状细胞刺激针对于肿瘤抗原的毒性T淋巴细胞形成的能力，在体外混合的淋巴细胞树突状细胞培养物中进行检测。树突状细胞来自于如实施例2中所描述HLA-A2呈阳性的正常供体的外周血。经过单核细胞吸附的起始步骤之后，收集没有被吸附的淋巴细胞冷冻于加有10％DMSO的自体血浆中待用。收集负载有肿瘤裂解物的树突状细胞，辐射照射(6000Rad)，洗涤，以3×10⁵/ml重悬于补充有1％自体血浆的X-VIVO15培养基(完全培养基)中，然后放入24孔板中的5个加样孔，每个加样孔1ml。其余的树突状细胞冷冻于含有10％DMSO的总体人血清中。解冻被冷冻的自体非粘附淋巴细胞，洗涤一次，细胞计数，15×10⁶细胞经另外洗涤之后被重悬于5ml含有IL-7(20ng/ml)和IL-12(100pg/ml)的完全培养基中。1ml淋巴细胞悬浮液被加入至含有树突状细胞的加样孔中。7天之后，移走1ml培养基，加入1ml含有IL-7(20ng/ml)的新鲜培养基，5天之后，收集细胞，活细胞在Lymphoprep(NycomedNorway)上被分离，洗涤之后以1.5×10⁶/ml的浓度重悬于完全培养基中。1ml淋巴细胞悬浮液置于24孔板的加样孔中。被冷冻、受辐射且负载有裂解物的树突状细胞被解冻，洗涤一次，以10⁵/ml的浓度重悬于完全培养基中。将1ml加入至含有淋巴细胞的加样孔中。两天之后，移走1ml培养基，加入1ml含有IL-2(20IU/ml)的新鲜培养基。每周重复一次再刺激的步骤，每次培养需要刺激2-4次。

淋巴细胞的裂解活性在3-5轮刺激之后得以测定。此时，在第4-5轮的刺激之后的一周里每一次达到70-90％的再刺激之后，随着增加的CD8⁺细胞比例，增值的淋巴细胞代表了几乎是纯的CD3阳性细胞群体(细胞的表型通过现有技术已知的FACS分析法使用特异于某些表面标记的抗体测定)。

除了上面提到的黑素瘤细胞培养物之外，下面的黑素瘤细胞系被使用：FM28，FM55p，FM60，(HLA-A2阳性)，FM45，FM48(HLA-A2阴性)。这些细胞系在其他地方被描述(Bartkova et.al.，1996，CancerRes.，v.56，pp 5475-5483；Kirkin et al，1995，Caner Immunol.Immunother.，v.41.pp71-81)其内容因此被引入作为参考。DDB-1和ANBI-EBV是我们实验室通过现有技术已知的标准方法构建的被EBV转化的类淋巴母细胞系。K-562红白血病细胞用作NK介导的裂解的目标。乳腺癌细胞系MCF-7，CAMA-1，HBL-100，MDA-MB-231(HLA-A2阳性)和BT-20(HLA-A2阴性)是由丹麦癌症协会(Danishcancer society)的Per Briand博士馈赠的礼物。SCC4和SCC9HLA-A2阳性鳞状细胞癌细胞系获自ATCC。所有细胞系在补充了10％FCS的RPMI-1640的培养基中培养。细胞毒素的活性由实施例1所述的方法测定。在封闭抗体试验中，特异性针对HLA I类分子共同决定簇的W6/32单克隆抗体以10μg/ml的浓度被加入到加样孔中。

在第一实验中，细胞毒性通过针对一组黑素瘤细胞，以及被EBV转化的B细胞和K562红白血病细胞得以检测。NK样细胞裂解酶活性，当通过K562红白血病细胞裂解所测定时，在两轮刺激之后表现明显，但是在随后的刺激之后逐渐下降。为了检测起初的特异CTL介导的裂解，所有裂解活性方面的试验在存在20倍过剩的未标记K562细胞中进行。在用负载DDM1.13细胞裂解物的树突状细胞刺激四轮之后，来自ANBI供体的淋巴细胞的细胞毒性方面的代表性试验结果显示于附图8。HLA-A2阳性黑素瘤细胞被裂解至不同的程度，而K562，ANBI-EBV(从同样的供体构建的EBV-B细胞)，DDB-1(对于DDM-1黑素瘤细胞来说是自体同源的)，黑素瘤细胞系FM45和FM48(与ANBI供体的细胞没有共同的MHC I类抗原)是相对裂解耐性的。值得注意的是除了与ANBI供体共有的HLA-A1(未列出)外，FM9、HLA-A2阴性黑素瘤细胞系也是对裂解敏感的，表明HLA裂解的限制是复杂的，不仅仅受到HLA-A2抗原的限制。使用未处理的树突状细胞也会诱导淋巴细胞增殖，尽管处于较低强度下，但是只有非特异性细胞毒性的形成在这些培养物中可见(未列出)。针对产生自黑素瘤病人的PBMCs(外周血单核细胞)的DDM-1黑素瘤细胞的细胞毒性的缺失显示有可能存在于裂解制备物中的同种抗原不能诱导有意义的免疫应答，作为结果的免疫应答主要是肿瘤特异性的。针对MHC I类分子的W6/32抗体明显的抑制显示出细胞毒性的MHCI类受限的本质。类似的结果从分离自DDM1.7黑素瘤克隆(未列出)的裂解物中获得。

为检测识别属于在不同类型的人恶性肿瘤之间共有的一组癌/睾丸抗原的抗原，我们研究了许多乳腺癌和鳞状细胞癌细胞系对于由产生的CTLs引发的裂解作用的敏感性。一个实验的结果显示于附图9。四种HLA-A2阳性乳腺癌细胞系中的三个具有对裂解作用中度至高度的敏感性，而一种HLA-A2阴性细胞系是完全耐裂解的。两个被研究的鳞状细胞癌细胞系中的一个也是裂解敏感性的。乳腺癌细胞系的裂解作用对于HLA I类特异性抗体W6/32的抑制作用是敏感的。这些数据证实用负载DDM1.7DDM或1.13黑素瘤细胞系的自体树突状细胞体外免疫正常供体的PBLs(外周血淋巴细胞)，诱导产生了CTL，该CTL能够特异识别在几种类型的人类肿瘤中都存在的肿瘤相关抗原。

一种可能的可以由以这种方法产生的CTLs来识别的抗原组是MAGE-A抗原。要使这些抗原的表达与靶细胞对于产生的CTLs的敏感性相关，我们比较了在三种显示不同裂解敏感性的乳腺癌细胞系中这些抗原的表达水平。结果显示于附图10。在HBL-100细胞中表达的被研究抗原最多，而在MCF-7细胞中表达的被研究抗原最少。这些结果证实在被表达的MAGE-A组基因数量与对于裂解作用的敏感性之间确实存在相关性，指示这些或者相类似的被调节抗原可能是这种免疫类型的主要目标。

实施例4

分化抗原免疫显性的检测

根据Herin et al.，1987，Int，J.Cancer，v.39，pp390-396描述的方法，通过体外刺激带有自体肿瘤细胞的体外周血淋巴细胞，两种黑素瘤细胞系，表达高水平分化抗原的DDM1.29和表达低水平分化抗原细胞系DDM1.P(DDM-1细胞系的变体)，被使用在有关产生细胞毒性T淋巴细胞的实验中。用受辐射的肿瘤细胞(10,000Rad)经过三轮每周一次的淋巴细胞刺激之后，细胞培养物通过限制性稀释被克隆，生长克隆的裂解活性首先通过在Cr⁵¹释放试验中的原始黑素瘤细胞系被测定。如果它们具有比之原始黑素瘤细胞超过20％的裂解活性，则细胞克隆被认为具有细胞毒性。细胞毒性T淋巴细胞的特异性然后用T2细胞检测，T2细胞负载来自gp100和MART-1抗原的不同的HLA-A2限制性多肽。不用多肽处理的T2细胞作为对照。使用大约100个克隆对每种黑素细胞系进行分析分析。裂解物被负载到如原先所描述的树突状细胞，赋予自体淋巴细胞免疫性。在免疫方面识别分化抗原gp100和MART-1的CTL克隆的比例已经被计算出来并将结果列于下表3。

表3识别分化抗原的CTL克隆比例(产生克隆总数的％)

黑素瘤细胞系	分化抗原的表达	识别Gp100和MART-1的CTL克隆比例％(占产生的克隆总数的百分比)
				Gp100	MART-1
		DDM-1.29	高			51	44
DDM-1.P	低(低于DDM-1.29中水平的5％)			0	0

数据显示分化抗原是免疫显性的。就高水平表达的分化抗原来说，免疫应答主要针对分化抗原gp100和MART-1，而当表达低水平分化抗原的细胞系被用于免疫时未有可见的免疫应答诱导。值得注意的是随着大量细胞毒性T细胞克隆的产生，两种细胞系都会诱导自体淋巴细胞强烈的增殖。

实施例5

在不同的培养条件下产生的树突状细胞的表型

为了研究与第一天中的培养基改变相结合的不同的淋巴因子加入特征如何影响产生的未成熟树突状细胞的表型特征，研究了四种不同的生长条件：

1)终止吸附步骤之后在第0天的时候迅速加入细胞因子(GM-CSF和IL-4)并且在第1天的时候在没有培养基改变情况下添加另外的细胞因子；

2)类似于组1，除了在第1天的时候在完全培养基改变情况下添加另外的细胞因子；

3)细胞因子的添加被推迟至没有培养基改变的第1天；

4)同组3，除了添加细胞因子是在完全培养基改变的第1天。

组4的条件与Turner et al.，1999描述的从白细胞除去法中产生成熟树突状细胞的条件一致(根据Turner，最优化结果仅来自从白细胞除去法产物而来的树突状细胞，而不是来自提取的新鲜血液样品中)。

培养5天之后，收集细胞，大量细胞通过Coulter计数器计数(Beckmen，Z2型)，然后细胞被冷冻于添加了10％DMSO的自体血浆中以进一步通过FACS分析表面标记的表达。下面的单克隆抗体被使用(所有来自BD Biosciences)：CD1a-PE，CD14-FITC，CD83-PE，与之匹配的对照抗体。

细胞计数证实，在细胞产量方面没有差别(在数量和尺寸上)，这与Turner et al.，1999的数据有很好的相关性(J.Immunol，Methods，223：1-15)，因为它们仅使用了形态学的标准并且以产量作为生长最优化的指标。相比之下，在本研究中，当测定表面标记时(其中的一个试验结果列于表4)，其差异明显可见。

表4：在不同培养条件下产生的树突状细胞表型

细胞因子加入起始	培养基在第一天中的改变	DC表型(％)
					CD1a	CD14	CD83
		0天	否	20,6				12,9	26,1
0天	是				18,3	9,0	34,2
		1天	否	51,0				15,4	24,9
1天	是				52,0	10,9	32,8

从添加细胞因子开始的第1天起，CD1a标记的表达就呈现明显的上调节，而并不明显影响其它标记的表达。也能够看到，在第一天培养基的改变，如原先Turner et al.，1999建议的，事实上并没有必要，因为同样的效果在有培养基改变和没有培养基改变的两种情形下同样获得。事实上，在第1天培养基的改变明显地降低了未成熟阶段树突状细胞的内吞活性。细胞因子被拖延加入一天并且没有任何培养基改变的这些条件被选用在进一步的试验中。

实施例6

可产自单核细胞的树突状细胞的产量的最优化

在如上所描述的最优化过程中，我们惊讶地发现获自单核细胞的群体的树突状细胞产量取决于吸附过程中的单核细胞的密度。尽管在早先大多数公开的方法中注意到，当进行吸附步骤时，要考虑单核细胞浓度而不是单核细胞浓度。但是，单核细胞代表了两种群体的混合物，淋巴细胞和单核细胞，并且每一群体的比例明显的不同，吸附至塑料制品的以单核细胞为主。

为评价单核细胞在单核细胞群体中的浓度，我们使用Coulter计数器计算细胞数量，因为这也可以用来观察细胞大小分布(BeckmenZ2型)。可以看到两种主要细胞群体，具有7nm(淋巴细胞)和9nm(单核细胞)的平均大小。用适当的方法可以评价这两种群体的比例。

我们原先发现以大约15×10⁶密度在每个T25瓶中接种单核细胞，单核细胞的吸附几乎是完全的(超过90％)。因此，在我们的实验中使用在12×10⁶至20×10⁶之间变化的细胞密度。观察到树突状细胞产量上的明显变化，在试图理解那种变化的原因中，我们决定将在不同试验中的树突状细胞的产量与单核细胞的原始密度相联系，5个产生自不同供体的培养物分析结果清楚地表明在树突状细胞产生效率和单核细胞接种密度之间呈现相反的相关性。

设计试验以评价这种相关性，以不同密度接种同一供体的单核细胞。通过在Lymphoprep梯度上离心，单核细胞被从淡黄层分离(从健康供体血液中制备)出来。分离界面层细胞之后，强烈洗涤以移走血小板，单核细胞悬浮于包含添加了1％自体肝素化血浆的RPMI 1640培养基的培养基上，然后以每瓶不同的单核细胞数量(从每瓶10×10⁶至20×10⁶单核细胞)接种单核细胞于每瓶含7ml培养基的T25瓶中(25cm²的表面积)。1小时吸附之后，通过使用预热的培养基洗涤两次移走未吸附的细胞。加入7ml新鲜培养基至每瓶中。第二天，GM-CSF(100ng/ml)和IL-4(50ng/ml)被加入培养基中，在第三天，细胞因子被重复加入。在第五天，一半的培养基被改变，加入新的GM-CSF和IL-4，在第六天加入浓度为20ng/ml的TNF-α。在第七天收集培养物，计算了所有细胞数之后，将它们冷冻在10％DMSO的自体血清中直至使用FACS进行分析。FACS分析通过使用CD1和CD14抗体进行。

一些与树突状细胞(大量具有在14nm-16nm之间的中等大小的细胞)产量相关的实验结果列于表5。

表5在具有不同单核细胞起始密度的培养物中树突状细胞的产量和表型

每个T25瓶中的单核细胞数量(×106)	每个T25瓶中的DC’s数量(×106)	DC’s的产量，占单核细胞的百分比	DC表型，占门限细胞(gated cells)的百分比
					CD1a	CD14
			10	5.28			52.8	54.9	11.0
12.5	5.43	43.4			44.9	16.9
			15	4.67			31.1	46.4	14.9
17.5	4.47	25.5			46.2	14.5
			20	4.69			23.4	44.2	7.4

随着单核细胞接种密度的增加树突状细胞的产量明显下降，为最低细胞密度的50％。在同样树突状细胞上进行的FACS分析结果列于表中，指示没有观察到在单核细胞的初始密度不同的情况下产生的树突状细胞的性状有明显的不同。

降低单核细胞的初始细胞密度至每个T25瓶中10×10⁶个细胞以下导致CD1标记表达的降低(数据未列出)。因此，要获得具有最大感受态(这通过主要的DC标记表达来判断)的树突状细胞产量的最大效率，初始单核细胞群体的最佳细胞密度是大约每25cm²培养表面10×10⁶个细胞。

在这些数据基础上，现在有可能计算出采血所需要的血液的体积。如果所希望的树突状细胞的产量是初始单核细胞数量的大约50％，那麽获得50×10⁶个树突状细胞将只需要300ml的血液。这意味着，单一的300ml的血液样品将足够制备用于接种两轮疫苗的疫苗。细胞因子的需要量(GM-CSF 21ng，IL-410.5ng)以及其他物质的需要量低于标准的，非最优化方法的三倍。

因此，DC生产所需要的物质成本也降至少三倍，此外，将不需要进行昂贵的白细胞去除法程序。

实施例7

以树突状细胞为基础的疫苗的应用

用负载有根据本发明制备的两种黑素瘤细胞系裂解物的树突状细胞给癌症病人接种的周期将优选地设计为下述方式：病人接受第一周期的五次皮下免疫接种，每次间隔三周，每次使用5×10⁶个树突状细胞。如果在初次免疫接种周期之后可见临床反应，进行第二个相似周期的免疫。整个试验周期总共需要50×10⁶个细胞。考虑到病人的状况(大部分病人处于疾病的晚期阶段，没有任何其他治疗在进行)，使抽取血液的次数降到最低，限制在一次或两次是重要的。

尽管本发明描述了某些专门的实施方案作为参考，涉及其他癌/睾丸抗原以及其他谱系特异性分化抗原的对于本领域技术人员来说显而易见的其他实施方案也在本发明的范围内。

Claims (62)

1.一种诱导人或动物免疫应答的药物组合物，包括呈递癌/睾丸抗原多样性的树突状细胞，其特征在于：

a)至少五种癌/睾丸抗原，无谱系特异性分化抗原或基本上无谱系特异性分化抗原被树突状细胞呈递，

b)癌/睾丸抗原来自至少一种癌细胞系，该癌细胞系表达至少五种不同的癌/睾丸抗原，不表达谱系特异性分化抗原或基本上不表达谱系特异性分化抗原，和

c)树突状细胞在负载癌/睾丸抗原期间是未成熟的(CD1a阳性，CD14阴性，CD83阴性)。

2.根据权利要求1的药物组合物，其中树突状细胞负载抗原后通过添加成熟因子而成熟。

3.根据权利要求1的药物组合物，其中树突状细胞在初始生长阶段被间接体内培养在不含任何细胞因子的生长培养基中，接着，在使树突状细胞负载至少五种癌/睾丸抗原之前，在含有细胞因子的培养基中进行第二阶段生长。

4.根据上述任一权利要求的药物组合物，其中树突状细胞是自体树突状细胞。

5.根据权利要求1的药物组合物，其中至少一种不表达谱系特异性分化抗原或基本上不表达谱系特异性分化抗原的癌细胞系的完整细胞裂解物被用于负载树突状细胞。

6.根据权利要求1的药物组合物，其中树突状细胞上的至少五种癌/睾丸抗原的呈递是通过完整细胞融合完成的。

7.根据权利要求1的药物组合物，其中至少五种癌/睾丸抗原的呈递是通过使用核外体实现的。

8.根据上述任一权利要求的药物组合物，其中癌细胞系是黑素瘤细胞系，谱系特异性分化抗原是黑素细胞分化抗原。

9.根据权利要求3的药物组合物，其中黑素细胞分化抗原包括gp100，Melan A/Mart-1和酪氨酸酶。

10.根据权利要求1-9任一项的药物组合物，其中以单核细胞的形式存在的树突状细胞前体从人或动物的外周血中获取。

11.根据权利要求1-9任一项的药物组合物，其中以单核细胞的形式存在的树突状细胞前体从人或动物的骨髓中获取。

12.根据权利要求1-11任一项的药物组合物，其中没有白细胞去除产物作为树突状细胞或单核细胞的来源。

13.根据权利要求1-10任一项的药物组合物，其中树突状细胞来源于CD14+单核细胞。

14.根据权利要求1-11任一项的药物组合物，其中树突状细胞来源于CD34+细胞。

15.根据上述任一权利要求的药物组合物，其中癌/睾丸抗原包括选自MAGE-A，MAGE-B，MAGE-C，GAGE，LAGE，SSX亚家族的抗原。

16.根据权利要求15的药物组合物，其中癌/睾丸抗原包括选自MAGE-A1，MAGE-A2，MAGE-A3，MAGE-A4，MAGE-A5，MAGE-A6，MAGE-A8，MAGE-A9，MAGE-A10，MAGE-A11，MAGE-A12，MAGE-B1，MAGE-B2，MAGE-B3，MAGE-B4，MAGE-B5，MAGE-B6，MAGE-B10，MAGE-B16，MAGE-B17，MAGE-C1，MAGE-C2，MAGE-C3，MAGE-C4，BAGE，GAGE-1，GAGE-2，GAGE-3，GAGE-4，GAGE-5，GAGE-6，GAGE-7，GAGE-8，NY-ESO-1，LAGE，PAGE-1，PAGE-2，PAGE-3，PAGE-4，XAGE-1，XAGE-2，XAGE-3，SSX-1，SSX-2，SSX-3，SSX-4，SSX-5的抗原。

17.根据权利要求1-14任一项的药物组合物，其中癌/睾丸抗原包括选自SCP-1，TSP-50，TRAG-3，SAGE，IL-13Rα，CTp11的抗原。

18.根据权利要求16的药物组合物，其中癌/睾丸抗原包括选自MAGE-A1，MAGE-A3，MAGE-A4，MAGE-A6，MAGE-A10，MAGE-A12和NY-ESO-1的抗原。

19.根据上述任一权利要求的药物组合物，其中至少五种癌/睾丸抗原来自至少两种同种异源黑素瘤细胞系。

20.根据权利要求19的药物组合物，其中同种异源黑素瘤细胞系选自DDM-1.7(ECACC 01112339)或DDM-1.13(ECACC01112338)。

21.根据权利要求5-20任一项的药物组合物，其中在提供至少一种癌细胞系的完整细胞裂解物之前，在所述至少一种癌细胞系中至少五种癌/睾丸抗原的表达得到进一步增加。

22.根据权利要求21的药物组合物，其中至少一种癌/睾丸抗原的表达通过DNA脱甲基化而增加。

23.根据权利要求22的药物组合物，其中，所述脱甲基化通过5-氮杂-2’-脱氧胞苷处理完成。

24.根据上述任一权利要求的药物组合物，其中细胞因子选自IL-4，GM-CSF，IL-13，IFN-γ，Flt-31，SCF，TNF-α。

25.根据权利要求24的药物组合物，其中细胞因子包括IL-4和GM-CSF。

26.根据上述任一权利要求的药物组合物，其中初始生长阶段是6-48小时，特别是12-34小时，更特别是20-28小时。

27.根据权利要求2-26任一项的药物组合物，其中成熟因子包括IL-1β，IL-6，TNF-α和PGE2。

28.一种获得负载至少五种癌/睾丸抗原，不负载谱系特异性分化抗原或基本上不负载谱系特异性分化抗原的人或动物自体树突状细胞的方法，包括以下步骤：

a)提供表达至少五种癌/睾丸抗原，不表达谱系特异分化抗原或基本上不表达谱系特异分化抗原的至少一种癌细胞系，

b)提供来自于所述人或动物的自体单核细胞/树突状细胞，

c)使用5×10⁶-20×10⁶细胞/25cm²的单核细胞接种密度，

d)在初始生长阶段，在没有任何细胞因子的生长培养基中间接体内培养所述树突状细胞，接着在包含细胞因子的培养基中进行第二阶段培养，

e)使来自d)中的树突状细胞负载癌/睾丸抗原，该癌/睾丸抗原从a)中的至少一种癌细胞系的完整细胞裂解物中获得。

29.一种分离的黑素瘤细胞系，其表达至少五种癌/睾丸抗原，不表达黑素细胞分化抗原或基本上不表达黑素细胞分化抗原。

30.根据权利要求29的分离的黑素瘤细胞系，其选自细胞系DDM1.7(ECACC 01112339)或DDM-1.13(ECACC 01112338)。

31.来源于根据权利要求28或29的分离的细胞系的核外体。

32.树突状细胞在药物组合物或疫苗中作为抗原呈递细胞的应用，其中所述树突状细胞在它们的未成熟阶段负载抗原，此时树突状细胞是CD1a阳性，CD14阴性，CD83阴性，其中，树突状细胞在初始生长阶段在没有任何细胞因子的生长培养基中间接体内培养，接着在使树突状细胞负载至少五种癌/睾丸抗原之前在包含细胞因子的培养基中进行第二阶段培养。

33.根据权利要求32的应用，其中树突状细胞是自体树突状细胞。

34.根据权利要求33的应用，其中自体树突状细胞从新鲜血液中获得。

35.癌/睾丸抗原多样性在药物组合物或疫苗制剂中的应用，所述癌/睾丸抗原可以从权利要求29或30的分离的癌细胞系中获得。

36.根据权利要求35的应用，其中分离的癌细胞系至少是权利要求30的细胞系之一。

37.用于制备治疗癌症的药物组合物的分离的细胞系DDM-1.7(ECACC 01112339)或DDM-1.13(ECACC 01112338)。

38.诱导人或动物免疫应答的方法，包括以下步骤：

a)提供至少一种表达至少五种癌/睾丸抗原，不表达谱系特异分化抗原或基本上不表达谱系特异分化抗原的癌细胞系，

b)提供来自于所述人或动物的自体树突状细胞，

c)在初始生长阶段在没有任何细胞因子的生长培养基中间接体内培养所述树突状细胞，接着在包含细胞因子的新鲜培养基中进行第二阶段培养，

d)使来自c)的树突状细胞负载癌/睾丸抗原，该癌/睾丸抗原得自a)的至少一种癌细胞系的完整细胞裂解物，和

e)给所述人或动物施用来自d)的负载树突状细胞。

39.根据权利要求38的方法，其中在给所述人或动物施用树突状细胞以前，负载了癌/睾丸抗原之后的树突状细胞通过加入如IL-1β，IL-6，TNF-α，PGE2的成熟因子而成熟。

40.根据权利要求38-39任一项的方法，其中免疫应答刺激人或动物中的细胞毒性T淋巴细胞的产生。

41.根据权利要求38-40任一项的方法，其中至少一种癌细胞系是黑素瘤细胞系，谱系特异性分化抗原是黑素细胞分化抗原。

42.根据权利要求41的方法，其中黑素细胞分化抗原包括gp100、Melan A/Mart-1和酪氨酸酶。

43.根据权利要求38-42任一项的方法，其中自体树突状细胞从人或动物的外周血中获取。

44.根据权利要求38-42任一项的方法，其中自体树突状细胞从人或动物的骨髓中获取。

45.根据权利要求43的方法，其中自体树突状细胞来源于CD14+单核细胞。

46.根据权利要求43或44的方法，其中自体树突状细胞来源于CD34+细胞。

47.根据权利要求38-46任一项的方法，其中癌/睾丸抗原包括选自MAGE-A，MAGE-B，MAGE-C，GAGE，LAGE，SSX亚家族的抗原。

48.根据权利要求38-47任一项的方法，其中癌/睾丸抗原包括选自MAGE-A1，MAGE-A2，MAGE-A3，MAGE-A4，MAGE-A5，MAGE-A6，MAGE-A8，MAGE-A9，MAGE-A10，MAGE-A11，MAGE-A12，MAGE-B1，MAGE-B2，MAGE-B3，MAGE-B4，MAGE-B5，MAGE-B6，MAGE-B10，MAGE-B16，MAGE-B17，MAGE-C1，MAGE-C2，MAGE-C3，MAGE-C4，BAGE，GAGE-1，GAGE-2，GAGE-3，GAGE-4，GAGE-5，GAGE-6，GAGE-7，GAGE-8，NY-ESO-1，LAGE，PAGE-1，PAGE-2，PAGE-3，PAGE-4，XAGE-1，XAGE-2，XAGE-3，SSX-1，SSX-2，SSX-3，SSX-4，SSX-5的抗原。

49.根据权利要求38-46任一项的方法，其中癌/睾丸抗原包括选自SCP-1，TSP-50，TRAG-3，SAGE，IL-13Rα，CTp11的抗原。

50.根据权利要求38-46任一项的方法，其中癌/睾丸抗原包括选自MAGE-A1，MAGE-A3，MAGE-A4，MAGE-A6，MAGE-A10，MAGE-A12和NY-ESO-1的抗原。

51.根据权利要求38-50任一项的方法，其中在至少一种癌细胞系中至少五种癌/睾丸抗原的表达在裂解前被进一步增加。

52.根据权利要求51的方法，其中至少一种癌/睾丸抗原的表达通过DNA脱甲基化增加。

53.根据权利要求52的方法，其中所述脱甲基化是通过5-氮杂-2’-脱氧胞苷处理来完成。

54.根据权利要求38-53任一项的方法，其中步骤a)中提供至少两种同种异源癌细胞系。

55.根据权利要求38-54任一项的方法，其中同种异源黑素瘤细胞系选自DDM-1.7(ECACC 01112339)或DDM-1.13(ECACC01112338)。

56.根据权利要求38-55任一项的方法，其中细胞因子选自IL-4，GM-CSF，IL-13，IFN-γ，Flt-31，SCF，TNF-α。

57.根据权利要求56的方法，其中细胞因子包括IL-4和GM-CSF。

58.根据权利要求38-57任一项的方法，其中初始生长阶段是6-48小时，特别是12-34小时，更特别是20-28小时。

59.根据权利要求38-58任一项的方法，进一步包括在步骤b)之前给人或动物施用诱导CD14+单核细胞动员的物质的步骤。

60.根据权利要求59的方法，其中所述诱导CD14+单核细胞动员的物质包括G-CSF和/或GM-CSF。

61.根据权利要求38-60任一项的方法，进一步包括在步骤e)之后给人或动物施用诱导T淋巴细胞激活的物质的步骤。

62.根据权利要求61的方法，其中所述诱导T淋巴细胞激活的物质包括IL-2或IL-12。

Images