CN1696683A - 一种尿酸酶生物传感器及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种纳米二氧化硅颗粒增强的尿酸酶生物传感器及其制备方法。其技术方案是，以工作电极－尿酸酶电极、对电极和参比电极组成三电极体系；其中，工作电极－尿酸酶电极的制备方法是：将禽蛋膜从蛋壳剥离、清洗后，平铺于洁净的玻璃片上，在膜上依次滴加10～25μl尿酸酶—牛血清白蛋白混合液、5～10μl改性纳米二氧化硅凝胶液、5～10μl 2％戊二醛溶液，室温放置3～4h，在4℃静置8～14h，将膜经漂洗后紧贴在工作电极的表面，再将透气膜覆盖在膜上。本发明工艺简单、成本低廉；所制备尿酸酶生物传感器，具有快捷准确、重复性好、操作简单的特点。
Description
一、技术领域
本发明属于生物传感器技术领域，尤其涉及一种纳米二氧化硅颗粒增强的尿酸酶生物传感器及其制备方法。
二、背景技术
目前，国内外对生物传感器展开了深入的研究，已经研制出了葡萄糖生物传感器、乳糖生物传感器、尿酸酶生物传感器、DNA生物传感器、BOD生物传感器、测酚生物传感器等多种类别的生物传感器，以满足人们在临床检验、环境监测和生化分析等领域中的需求。
尿酸浓度过高或过低，都会引发急慢性肾炎、肾结核、痛风、慢性白血病、真性红细胞增多症、多发性骨髓瘤等尿酸综合症。长期研究表明，如果将尿酸浓度严格控制在正常生理范围内，尿酸综合症就可得到控制。因此，一系列适用于测量体内、外生理溶液中尿酸浓度的检测装置和方法应运而生，如高效液相色谱法、化学发光分析法、酶电极分析法等。应用尿酸酶电极测定人体血和尿中尿酸的浓度，是一种准确、快速、简便的方法，可帮助快速诊断肾炎、白血病和肿瘤等疾病。
国外对尿酸酶的传感器研究较多。如研制在ZnO纳米棒上固定尿酸酶的无试剂尿酸生物传感器的方法(Zhang F F，Wang X L，Ai S Y，et al.Immobilization of uricase on ZnO nanorods fora reagentless uric acid biosensor[J].Analytica Chimica Acta，2004，2(519)：155～160)，虽然ZnO纳米棒制得的电极较高地保留了酶的生物活性，提高了电子在酶与电极之间的电子传递，但是ZnO纳米棒的制备工艺复杂且成本较高；用溶胶—凝胶法制得无试剂荧光生物传感器以检测生物流体中的尿酸的方法(David M P，Maria L F，Mateo C R.A reagentless fluorescent sol-gelbiosensor for uric acid detection in biological fluids[J].Analytical Biochemistry，2003，2(322)：238～242)，将尿酸酶—过氧化物酶包埋在SiO2溶胶凝胶中制得，所需试剂种类较多，制备工艺复杂，成本高；以刚性模板程序制备聚苯胺—尿酸酶生物传感器的方法(Kan J Q，Pan X H，Chen C.Polyaniline-uricase biosensor prepared with template process[J].Biosensors andBioelectronics，2004，19(12)：1635～1640)，稳定性好，但是灵敏度低；以聚苯胺和聚N-甲基丙烯丁酯化合物制备尿酸和尿素生物传感器的方法(Castillo O M M，Rodriguez D E，Encinas JC，et al.Conductometric uric acid and urea biosensor prepared from electroconductivepolyaniline-poly(n-butyl methacrylate)composites[J].Sensors and Actuators B：Chemical，2002，85(1～2)：19～25)，抗干扰能力差；基于高分子电解质多层膜的安培型尿酸生物传感器(HoshiT，Saiki H，Anzai J.Amperometric uric acid sensors based on polyelectrolyte multilayer films[J].Talanta，2003，3(61)：363～368)，它是由聚丙烯胺(PAA)和乙烯基硫酸盐(PVS)自组装在铂电极上制成，响应速度慢。
三、发明内容
本发明的目的是提供一种操作简单、成本低廉、重复性好、灵敏度高、快捷准确的尿酸酶生物传感器及其制备方法。该传感器用于临床肾炎、白血病和肿瘤等疾病的诊断。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：以工作电极—尿酸酶电极、对电极和参比电极组成三电极体系；其中，工作电极—尿酸酶电极的制备方法是：
将禽蛋膜从蛋壳剥离、清洗后，平铺于洁净的玻璃片上，在膜上依次滴加10～25μL尿酸酶—牛血清白蛋白混合液、5～10μL改性纳米二氧化硅凝胶液、5～10μL 2％戊二醛溶液，室温放置3～4h，在4℃静置8～14h，将静置后的膜经漂洗后紧贴在工作电极的表面，再将透气膜覆盖在膜上。
所述的工作电极或为铂电极、或为玻碳电极、或为氧电极；对电极或为铂电极、或为玻碳电极、或为氧电极；参比电极或为甘汞电极、或为Ag/AgCl电极。
所述的尿酸酶—牛血清白蛋白混合液的配制方法是，称取5～25mg牛血清白蛋白，溶于100～350μL 10g·L-1尿酸酶溶液中。
所述的清洗是依次用NaCl溶液、蒸馏水为清洗液清洗；漂洗是用磷酸缓冲液漂洗。
所述的禽蛋或为鸡蛋、或为鸭蛋、或为鹅蛋、或为鹌鹑蛋。
由于采用上述技术方案，本发明所用的膜为禽蛋膜，材料易得，制备时只需简单处理，故工艺简单、成本低廉；以牛血清白蛋白和戊二醛为交联剂，将纳米二氧化硅凝胶与尿酸酶固定于鸡蛋膜上，紧贴于电极表面，制成以工作电极—尿酸酶电极、对电极和参比电极组成三电极体系；由于纳米颗粒的微观特征及其与电极表面的相互作用，能增强酶生物传感器的灵敏度、响应区间，具有快捷准确、重复性好、操作简单的特点。
本发明可用于临床肾炎、白血病和肿瘤等疾病的诊断。用于尿酸的检测方法是：底液为0.1mol·L-1的KCl磷酸盐缓冲溶液，在常温下进行检测。测量时，先将三电极置于缓冲溶液中，加0.4VvsSCE的电压于工作电极，当背景电流值减小至一恒定值时，将电极放至被测尿酸溶液中，分别记录不同时间的电流响应值，扣除初始背景电流值，即为被测尿酸离子浓度的电极电流响应值。
四、附图说明
图1为本发明的工作电极—尿酸酶电极的示意图。
五、具体实施方式
下面结合附图，对本发明作进一步的描述。
实施例1
一种制备尿酸酶生物传感器的方法。该传感器由工作电极—尿酸酶电极、对电极和参比电极组成三电极体系；其中，工作电极—尿酸酶电极的制备方法是：
取新鲜鸡蛋壳小心剥离蛋膜，依次用NaCl溶液、蒸馏水进行清洗；将蛋膜平铺于洁净的玻片上，小心裁取直径为1cm的圆形膜。在膜上依次滴加10～15μL尿酸酶—牛血清白蛋白混合液、5～8μL改性纳米二氧化硅凝胶液、5～8μL 2％戊二醛溶液，室温放置3h后，置4℃冰箱冷藏过夜。其中，尿酸酶—牛血清白蛋白混合液的配制方法是：称取12.5～15mg牛血清白蛋白，溶于100～150μL 10g·L-1尿酸酶溶液中。
本实施例的传感器如图1所示，将过夜后的膜[2]经漂洗后紧贴于玻碳电极[1]表面，覆盖透气膜[3]，即制成工作电极—尿酸酶电极。所述的对电极为铂电极、参比电极为甘汞电极。
本实施例应用于尿酸的检测方法是：底液为0.1mol·L-1的KCl磷酸盐缓冲溶液，在常温下进行检测。测量时，先将三电极置于缓冲溶液中，加0.4VvsSCE的电压于工作电极，当背景电流值减小至一恒定值时，将电极放至被测尿酸溶液中，分别记录不同时间的电流响应值，扣除初始背景电流值，即为被测尿酸离子浓度的电极电流响应值。
实施例2
一种制备尿酸酶生物传感器的方法。该传感器由工作电极—尿酸酶电极、对电极和参比电极组成三电极体系，工作电极—尿酸酶电极的制备方法是：
取新鲜鸭蛋壳小心剥离蛋膜，依次用NaCl溶液、蒸馏水进行清洗；将蛋膜平铺于洁净的玻片上，小心裁取直径为1cm的圆形膜。在膜上依次滴加15～20μL尿酸酶—牛血清白蛋白混合液、8～10μL改性纳米二氧化硅凝胶液、8～10μL 2％戊二醛溶液，室温放置4h后，置4℃冰箱冷藏过夜。其中，尿酸酶—牛血清白蛋白混合液的配制方法是：称取15～20mg牛血清白蛋白，溶于200～250μL 10g·L-1尿酸酶溶液中。
本实施例的传感器如图1所示，将过夜后的膜[2]经漂洗后紧贴于铂电极[1]表面，覆盖透气膜[3]，即制成工作电极—尿酸酶电极。所述的对电极为玻碳电极、参比电极为Ag/AgCl电极。
本实施例用于尿酸的检测方法同实施例1所述。
实施例3
一种制备尿酸酶生物传感器的方法。该传感器由工作电极—尿酸酶电极、对电极和参比电极组成三电极体系，工作电极—尿酸酶电极的制备方法是：
取新鲜鹌鹑蛋壳小心剥离蛋膜，将蛋膜依次用NaCl溶液、蒸馏水清洗；将蛋膜平铺于玻片上，小心裁取直径为1cm的圆形膜。在膜上依次滴加20～25μL尿酸酶—牛血清白蛋白混合液、5～8μL改性纳米二氧化硅凝胶液、8～10μL 2％戊二醛溶液，室温放置3h后，置4℃冰箱冷藏过夜。其中，尿酸酶—牛血清白蛋白混合液的配制方法是：称取20～25mg牛血清白蛋白，溶于300～350μL 10g·L-1尿酸酶溶液中。
本实施例的传感器如图1所示，将过夜后的膜[2]经漂洗后紧贴于氧电极[1]表面，覆盖透气膜[3]，即制成工作电极—尿酸酶电极。所述的对电极为氧电极、参比电极为甘汞电极。
本实施例用于尿酸的检测方法同实施例1所述。
Claims (9)
1、一种尿酸酶生物传感器的制备方法，其特征在于其由工作电极—尿酸酶电极、对电极和参比电极组成三电极体系；其中，工作电极—尿酸酶电极的制备方法是：
将禽蛋膜[2]从蛋壳剥离、清洗后，平铺于洁净的玻璃片上，在膜上依次滴加10～25μL尿酸酶—牛血清白蛋白混合液、5～10μL改性纳米二氧化硅凝胶液、5～10μL 2％戊二醛溶液，室温放置3～4h，在4℃静置8～14h；将静置后的膜[2]经漂洗后紧贴在工作电极[1]的表面，再将透气膜[3]覆盖在膜[2]上。
2、根据权利要求1所述的尿酸酶生物传感器的制备方法，其特征在于所述的工作电极[1]或为铂电极、或为玻碳电极、或为氧电极。
3、根据权利要求1所述的尿酸酶生物传感器的制备方法，其特征在于所述的对电极或为铂电极、或为玻碳电极、或为氧电极。
4、根据权利要求1所述的尿酸酶生物传感器的制备方法，其特征在于所述的参比电极或为甘汞电极、或为Ag/AgCl电极。
5、根据权利要求1所述的尿酸酶生物传感器的制备方法，其特征在于所述的清洗是依次用NaCl溶液、蒸馏水为清洗液清洗。
6、根据权利要求1所述的尿酸酶生物传感器的制备方法，其特征在于所述的尿酸酶一牛血清白蛋白混合液的配制方法是，称取5～25mg牛血清白蛋白，溶于100～350μL 10g·L-1尿酸酶溶液中。
7、根据权利要求1所述的尿酸酶生物传感器的制备方法，其特征在于所述的漂洗是用磷酸缓冲液漂洗。
8、根据权利要求1所述的尿酸酶生物传感器的制备方法，其特征在于所述的禽蛋或为鸡蛋、或为鸭蛋、或为鹅蛋、或为鹌鹑蛋。
9、根据权利要求1～8中所述的尿酸酶生物传感器的制备方法所制备的尿酸酶生物传感器。
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|---|---|---|---|---|
| CN100427941C (zh) * | 2006-04-06 | 2008-10-22 | 复旦大学 | 一种基于牛血清白蛋白的手性传感器及其制备方法 |
| CN100439914C (zh) * | 2006-04-06 | 2008-12-03 | 复旦大学 | 一种检测手性异构体的方法 |
| CN113106143A (zh) * | 2021-04-01 | 2021-07-13 | 广州南雪医疗器械有限公司 | 一种检测尿酸的试纸 |
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