CN1694880A - 6－甲基吡啶衍生物及其制备方法以及含有该衍生物的抗病毒药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用作抗病毒剂的6－甲基吡啶衍生物。更具体地说，本发明涉及对丙型肝炎病毒(HCV)的复制具有优异抑制作用的、如化学式(I)所示的新的6－甲基吡啶衍生物或其药用盐，并涉及其制备方法和含有该化合物作为活性成分的抗病毒药物组合物。本发明的6－甲基吡啶衍生物对丙型肝炎病毒(HCV)的复制具有优异的抑制作用，因而可有利地用作丙型肝炎的治疗剂或预防剂。

Description

6-甲基吡啶衍生物及其制备方法以及含有该衍生物的抗病毒药物组合物
技术领域
本发明涉及用作抗病毒剂的6-甲基吡啶衍生物。更具体地说，本发明涉及对丙型肝炎病毒(HCV)的复制具有优异的抑制作用、结构如下式I所示的新的6-甲基吡啶衍生物：
或其药用盐，并涉及其制备方法和含有该化合物作为活性成分的抗病毒药物组合物。
背景技术
丙型肝炎病毒(HCV)是非甲非乙型病毒肝炎的主要致病因素，主要为输血后丙型肝炎及社区获得性丙型肝炎。一旦感染了HCV，受感染的人群(表现出明显的症状)中约有80％发展为慢性肝炎，其余的20％受感染人群则发展为导致肝硬化的急性肝炎，最终转化为肝癌。根据最新公开报道，全球有2亿以上的人口感染了HCV。例如，美国有450万(该数字最大可能为1500万)以上的人口感染了这种病毒，在欧洲则有5百万以上的HCV患者。
HCV是黄病毒科(Flaviviridae)家族的成员之一。更具体的说，HCV在其包膜内具有大小约为9.5kb的(+)-RNA(单链正义RNA)基因组。RNA基因组由5′末端和3′末端的非翻译区(UTR)和一段长的开放阅读框架(ORF)构成。该ORF通过宿主细胞的酶表达出包括3100～3040个氨基酸的多蛋白，并通过宿主细胞的酶和其自身的蛋白酶将其分成3个结构蛋白和6个非结构蛋白。而且，基因组的5′末端和3′末端分别具有相同的保守区。据信此区域在病毒的蛋白形成和RNA复制中起重要作用。
该长链ORF表达出多蛋白，并通过共翻译加工或翻译后加工而形成结构蛋白即核心抗原蛋白(核心)和表面抗原蛋白(E1、E2)，以及非结构蛋白即NS2(蛋白酶)、NS3(丝氨酸蛋白酶、解旋酶)、NS4A(丝氨酸蛋白酶辅因子)、NS4B(蛋白酶辅因子，参与抗性)、NS5A和NS5B(依赖RNA的RNA聚合酶，RdRp)，每一蛋白均有助于病毒的增殖。结构蛋白被宿主细胞的信号肽酶分成核心、E1和E2。同时，病毒的丝氨酸酶(NS3)和辅因子(NS2、NS4A和NS4B)对非结构蛋白进行加工。结构蛋白中的核心抗原蛋白与表面抗原蛋白一起组成了病毒的衣壳，诸如NS3和NS5B等非结构蛋白在病毒的RNA复制中起重要作用(参见Bartenschager，R.，1997，Molecular targets in inhibition of hepatitis C virusreplication(抑制丙型肝炎病毒复制中的分子靶点)，Antivir.Chem.Chemother.8：281～301)。
与其他黄病毒相似，该病毒RNA的5′末端和3′末端具有相同的保守非翻译区(UTR)。通常认为该区域在病毒的复制中起非常重要的作用。5′末端具有由341个核苷酸构成的5′-UTR，此部分含有4个茎环结构(I、II、III和IV)。实际上，它的功能是充当内部核糖体进入位点(IRES)，该位点是用以表达蛋白质的翻译加工所必需的。尤其是茎III，它含有具有保守序列的最大、最稳定的结构，已有报道其是核糖体结合的最必须部分。另外，最近的一项研究报道，通过从AUG起始翻译加工来表达该病毒的蛋白质，所述AUG位于茎IV的单链RNA内(参见Stanley，M.Lemon and Masao Honda，1997，Internal ribosome entry sites within theRNA genomes of hepatitis C virus and other Flaviviruses(丙型肝炎病毒和其他黄病毒的RNA基因组中的内部核糖体进入位点)，Virology中的讨论文章，8：274～288)。
此外，3′末端具有由318个核苷酸构成的3′-UTR。已知此部分在NS5B的起始结合步骤中起很重要的作用，NS5B是RNA复制的必须酶。根据序列和三级结构，3′-UTR由三个不同的部分组成：从5′末端开始到第98个核苷酸(98 nt)的X-尾-5′，含有连续UTP的聚(U)和余下的3′-UTR。更具体地说，X-尾-5′部分由具有高度保守序列的98个核苷酸构成，并具有三个茎环结构，从而形成非常稳定的三级结构。这可能是为什么认为X-尾-5′为NS5B结合所必须的原因。此外，聚(U)部分具有嘧啶束的功能，从而促进RNA聚合酶发挥作用。最后，余下的3′-UTR部分具有环的三级结构，并在NS5B结合时起重要作用。但是，其结构有些不稳定。总而言之，已知HCV RNA的3′末端区具有NS5B结合所必须的结构(参见Yamada等，1996，Genetic organization and diversity of the hepatitis Cvirus genome(丙型肝炎病毒基因组的遗传学结构及其多样性)，Virology，223：255～281)。
在HCV的其他酶中，NS5B是直接参与RNA复制的酶，因而非常重要。NS5B由591个氨基酸构成，分子量约为68kDa。根据其氨基酸序列，NS5B可分为包括1a和1b在内的6种基因型，激活后具有RNA聚合和末端转移酶作用。NS5B酶中有两个RNA结合域，即RBD1和RBD2。RBD1位于第83位和194位氨基酸之间，RBD2位于第196位和298位氨基酸之间。同时，RNA结合及其活性所必须的基序氨基酸是‘Asp’(第220位氨基酸)、‘Gly’(第283位氨基酸)、‘Gly’(第317位氨基酸)、‘Asp’(第318位氨基酸)、‘Asp’(第319位氨基酸)、‘Lys’(第346位氨基酸)。而且，只要存在该病毒自身的RNA模板，该酶就可以引导聚合反应而不需要其他引物(参见Lohmann，V.等，1997，Biochemical properties ofhepatitis C virus NS5B RNA dependent RNA polymerase and identificationof amino acid sequence motifs essential for enzymatic activity(丙型肝炎病毒NS5B依赖RNA的RNA聚合酶的生化性质及其酶活性所必须氨基酸序列基序的鉴定)，J.viral.71：8416～8428)。
HCV的RNA基因组早在1989年就通过分子克隆分离出来了(参见Choo，Q-L，等，1989，Isolation of a cDNA clone derived from a blood-bornenon-A，non-B viral hepatitis genome(经血液传播的非甲非乙型肝炎病毒基因组的cDNA克隆的分离)，Science 244：359～362)。此后尽管已对HCV进行了大量的分子生物学研究，但由于缺乏更有效的细胞培养系统和动物模型，仍然存在很多局限。幸运的是，通过引入肝细胞瘤的细胞系，可以更稳定地复制HCV，从而使得上述问题得到一定程度上的解决(参见Lohmann，V.，F.Korner，J-O Koch，U.Herian，L.Theilmann，R.Bartenschlarger，1999，Replication of subgenomic hepatitis c virus RNAs in ahepatoma cell line(丙型肝炎病毒亚基因组RNA在肝细胞瘤细胞系中的复制)，Science 285：110～113)。
到目前为止，没有人真正找到对HCV非常有效的疫苗或疗法。因此，目前全球的许多制药公司和研究院都在致力于研究丙型肝炎的治疗和预防。HCV患者在全世界均非常普遍，而且其进展成肝硬化及/或肝癌的频率比HBV(乙型肝炎病毒)患者高得多。同样，尽管其进展成慢性肝炎的频率非常高，病毒感染机制的研究却仍在发展中。人群可以因输血或通过静脉输液或针刺进行的药物治疗而感染HCV，但是大部分的HCV感染通过直接的血液接触发生。然而，HCV患者中有40％～50％仍无法确切知道他们是如何被感染的。不幸的是，当人群通过上述渠道之外的渠道感染HCV时，他们更有可能进展成慢性肝炎和肝硬化，最终进展成肝癌。在这样的形势下，研制新的疫苗和疗法来治疗这些疾病是非常紧迫的事情。通常，HCV因病毒株和突变之间不同的基因型而被发现。一旦人由HCV进展为慢性肝炎之后，就不难发现因遗传变异体而产生的再感染或共感染。因此，几乎没人能成功地研制出HCV的有效疫苗。治疗HCV的另一实例是使用alpha-干扰素(α-干扰素)。但是，现已证明这种途径并不是那么好，因为α-干扰素对不同的HCV基因型的作用差异非常大，而且当停用后大部分的患者均复发丙型肝炎。因此，研制仅与特定HCV蛋白结合以控制HCV复制的抑制剂就非常重要了。这类研究的最佳靶点是HCV的NS3蛋白酶/解旋酶和HCV的NS5B RNA聚合酶。由于这些酶不是宿主细胞所必须但对于病毒自我复制来说却是必须的，所以这些酶对于研制抗HCV制剂来说非常有用。也就是说，HCV的NS5B(依赖RNA的RNA聚合酶(复制酶))是HCV的必需基序，这样该酶就成为抑制HCV复制的优良靶点。
由于用疫苗不易治疗HCV，所以目前引入了一种使用α-干扰素和利巴韦林的新治疗方法。但是，这种方法也会产生副作用，并且不能有效治疗丙型肝炎。例如，HCV患者中约25％对干扰素治疗不产生应答，约25％仅产生暂时的应答并会复发丙型肝炎。其余的50％患者在治疗完成后其ALT(丙氨酸转氨酶)维持在正常的水平，HCV RNA转为阴性。但是，他们之中有50％在3～6个月内会复发丙型肝炎。也就是说，只有25％的HCV患者可以具有持续超过6个月的应答。同时，全世界患者中发现的HCV亚型大部分是1型(1a、1b)，与第2亚型和第3亚型相比，这种亚型不易用干扰素治疗。当使用干扰素和利巴韦林的联合治疗时，其治疗效果加倍。对于利巴韦林来说，已知单独使用时对HCV几乎无效，反而会产生象红细胞破碎性贫血这样的副作用。因此，只有在干扰素治疗无效或是丙型肝炎再次复发时才使用利巴韦林的处方。到目前为止，没有人能真正研制出通过抑制HCV复制来治疗丙型肝炎的抗病毒剂。
因此本发明涉及通过对任何可能抑制重组HCV RNA聚合酶(NS5B，RNA聚合酶)活性的化合物进行研究，来研制几乎无毒副作用但表现出优异的抗HCV病毒活性的非核苷化合物。
经过对具有优异抗HCV病毒活性的化合物进行大量研究以试图研发出几乎无毒副作用的新的HCV治疗剂，发明人最终成功地制备出上述化学式I所示的新的6-甲基吡啶衍生物，并证明这些化合物确实对抑制HCV的复制非常有效。
发明内容
因此，本发明的目的之一是提供有效抑制丙型肝炎病毒(HCV)复制的6-甲基吡啶衍生物及其药用盐，以及制备这些化合物的方法。
本发明的另一目的是提供预防和治疗丙型肝炎的药物组合物，该药物组合物含有上述化合物作为有效成分、几乎无副作用而且经济实惠。
为了达到上述目的，提供了下式1所示的新的6-甲基吡啶及其药用盐。
如前所述，上述化合物可采用药用盐的形式使用。对于这些盐来说，用药用游离酸来制备酸加成盐。具有化学式1的化合物可按相关领域内的常规方法来制备药用酸加成盐。对于游离酸来说，有机酸和无机酸均可使用。例如，无机酸包括盐酸、氢溴酸、硫酸和磷酸。有机酸包括柠檬酸、乙酸、乳酸、酒石酸、马来酸、延胡索酸、甲酸、丙酸、草酸、4-三氟乙酸、苯甲酸、葡糖酸、甲磺酸、羟乙酸、琥珀酸、4-甲苯磺酸、谷氨酸或天冬氨酸。
本发明的另一方面是提供由以下流程图I所示的制备6-甲基吡啶衍生物的方法：
如上述流程图(I)所示，将化学式2所示的2-氯-6-甲基烟酸与化学式3所示的4-(4-吗啉代)苯胺反应，从而制备化学式I所示的6-甲基吡啶衍生物。原料，即化学式II所示的2-氯-6-甲基烟酸，和反应剂，即化学式III所示的4-(4-吗啉代)苯胺，均为任何人皆可通过商购获得的化学品。
为了更具体地说明上述制备方法，将弱有机碱如吡啶、2，6-二甲基吡啶、4-二甲氨基吡啶、N，N-二甲基苯胺等与有机溶剂在40℃～80℃的温度范围内缓慢地反应相对长的一段时间，即1～6天，所述有机溶剂如甲醇、乙醇、异丙醇、二氯甲烷、氯仿、乙腈、N，N-二甲基甲酰胺、丙酮等。
本发明还提供了用于治疗和预防丙型肝炎的药物组合物，所述药物组合物含有作为活性成分的化学式1所示的6-甲基吡啶衍生物和/或其药用盐。
作为丙型肝炎的治疗剂，化学式1的化合物可以口服，也可用临床应用的其他途径给药，也可以采用常用药物的方式使用。如果制备时需要，可以使用常用的稀释剂，包括填充剂、增效剂(builder)、粘合剂、湿润剂、崩解剂、或去污剂(或表面活性剂)或赋形剂。同时，口服的固体制剂包括片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂或胶囊剂。此固体制剂包含不止一种化学式1所示的化合物和不止一种赋形剂，该赋形剂例如淀粉、碳酸钙、蔗糖或乳糖、或明胶。对于口服的液体制剂来说，可以采用悬液、溶液、油性药品或糖浆，但也可使用简单的稀释剂，即水、液体石蜡或其他赋形剂，如湿润剂、甜味剂、香味剂或防腐剂。对于非口服的液体制剂来说，可采用无菌水溶液、非水性溶剂、悬液或油性药品。优选使用的非水性溶剂和悬液是丙二醇、聚乙二醇、诸如橄榄油等的植物油，以及诸如油酸乙酯等的注射用酯类。
化学式1所示化合物的有效剂量根据患者的性别、年龄和病情来控制。通常，成年人的剂量为10mg/天～1000mg/天，更优选20mg/天～500mg/天，或每天分1到3次给药。
具体实施方式
现通过下列实施例对本发明进行详细的说明。但是实施例只是用于对本发明进行说明，而不对其构成任何限制。
实施例：6-甲基-2-[4-(4-吗啉代)苯胺基]烟酸的制备
将5g的2-氯-6-甲基烟酸、5.45g的4-(4-吗啉代)苯胺和7.2mL的吡啶加入100mL氯仿中，于60℃加热5天。反应完成后，将反应混合物冷却至室温，对反应物中释出的少量固体进行过滤，用10mL氯仿洗涤以除去其中的任何杂质。溶剂氯仿用60mL甲醇在减压下浓缩并搅拌1小时。然后，过滤有机层并用10mL甲醇洗涤两次，得到固体产物。将该产物于35℃～45℃真空干燥，得到7.31g所需的化合物(产率为89％)。
m.p.(熔点)：220℃～221℃
1H-NMR(DMSO-d6)(1H核磁共振谱，二甲基亚砜-d6)，ppm：δ2.39(s，3H)，3.04(t，4H)，3.73(t，4H)，6.61(dd，1H)，6.89(d，2H)，7.57(dd，2H)，8.05(dd，1H)，10.21(s，1H)
试验例1：体外检测对HCV RNA聚合酶(依赖RNA的RNA聚合酶，NS5B)活性的抑制作用
进行下面的体外实验以揭示本发明化合物对HCV RNA聚合酶(依赖RNA的RNA聚合酶，NS5B)的抑制活性的效果。
重组HCV RNA聚合酶的构建
HCV RNA聚合酶按如下方法制备。
从HCV-1b型HCV患者的血液获取HCV的cDNA，用PCR扩增NS5B区(1773bps(碱基对))，并克隆入杆状病毒转移载体pVLHIS中，以制备重组转移载体。所制备的转移载体和野生型AcNPV载体用Sf 9细胞系进行共转染，获得含有由组氨酸标记的重组载体pVLHIS-NS5B的重组杆状病毒。用所得重组杆状病毒感染充分培养的昆虫细胞，并在含10％FBS(胎牛血清)的Grace’培养基中培养3～4天。将培养液离心以单独获得感染的细胞。用PBS(磷酸盐缓冲液)将细胞洗涤三次，重悬于结合缓冲液[50mM磷酸钠(pH8.0)、30mM NaCl、10mM咪唑、1mMDTT(二硫苏糖醇)、10％甘油和1％NP-40]中，超声，得到澄清裂解液。用Ni-NTA His结合树脂(Novagen)通过亲和柱层析纯化重组NS5B，得到纯化的NS5B蛋白。使(His)6标记的NS5B与Ni-NTA树脂结合，用含50mM咪唑的结合缓冲液洗涤。用含咪唑的结合缓冲液以步进梯度(100mM～300mM)的方式洗脱所结合的NS5B。NS5B蛋白级分用缓冲液(50mM Tris-HCl、50mM NaCl、1mM DTT、5mg MgCl2、10％甘油)进行透析，然后在-70℃于小量等分液中保存。
含HCV 3′末端(3′-UTR)的RNA模板的构建
含HCV 3′末端(3′-UTR)的RNA模板按以下方法构建。
用PCR从丙型肝炎患者血液中的1b HCV RNA获得HCV的3′UTRcDNA(220bp)，并克隆入pcDNA3载体中。用限制酶即Eco RI制备含3′-UTR的线型化的DNA片段，并作为使用T7 RNA聚合酶进行体外转录的模板，以此制备含3′-UTR的RNA片段。
本发明化合物对重组HCV RNA聚合酶的体外抑制活性的测定
本发明化合物对HCV RNA聚合酶的体外抑制活性按如下方法测定。
制备用链霉抗生物素蛋白包被的微孔板，以适于检验样品。将25μl的2×测定缓冲液[50mM Tris-Cl(pH7.5)、100mM NaCl、10mM MgCl2、20mM KCl、1mM EDTA、1mM DTT]、10μl的纯化HCV RNA聚合酶200ng和3′-UTR模板RNA加到各个孔中。然后在孔内加入5μl的待测样品，使最终浓度为10、1、0.1和0.01μg/mL。最后向各孔中加入含DIG-(洋地黄毒苷)-UTP、生物素-UTP、ATP、CTP、GTP和UTP作为聚合酶反应所用核苷酸的10μl反应溶液，所述聚合酶反应以HCV 3’-UTRRNA为RNA模板。将反应混合物于22℃温育60分钟。经过HCV聚合酶的作用，含有与生物素和DIG(地高辛)偶联的UTP的新生成RNA得以复制，而且这些新RNA可通过偶联有生物素的UTP与包被在孔上的链霉抗生物素蛋白结合。反应完成后，将该板用200μl的洗涤缓冲液(pH7.0，罗氏公司)洗涤3次以除去未反应的物质和杂质。然后，向各个孔中加入100μl的二抗，即抗DIG-POD(过氧化物酶，罗氏公司)，于37℃温育1小时。再用洗涤液洗涤微孔板。最后向各个孔中加入作为POD底物的ABTS(罗氏公司)100μl，反应15分钟～30分钟。用ELISA(酶联免疫吸附试验)读数器(Bio-Tek instrument Co.)于405nm测定光密度(OD)。通过减去不含样品的阳性对照的OD值来计算对HCV聚合酶活性的抑制作用。结果如下表1所示。
                         表1
待测化合物            对HCV RNA聚合酶活性的抑制(％)
10μg/mL  1μg/mL  0.1μg/mL  0.01μg/mL
实施例1 99  82  65  46
从上表中可看出，已证明本发明的化合物对HCV RNA聚合酶的活性表现出优异的抑制作用，而该酶在HCV的复制中起重要作用，因而所述化合物可以通过此性质抑制HCV的复制。并且，本发明的化合物可以有利地用作丙型肝炎的治疗剂或预防剂。
试验例2：细胞毒性试验
为了研究化学式1所示的6-甲基吡啶衍生物的细胞毒性，进行以通常已知的MTT(噻唑蓝)分析为基础的体外实验。结果表明，实验所用每一化合物的CC50值高于100μg/mL，说明它们是细胞毒性极低的安全化合物。
工业适用性
如上所述，化学式I所示的新的6-甲基吡啶衍生物对丙型肝炎病毒的复制具有优异的抑制作用且毒性低。因此，它们可有利地用作丙型肝炎的治疗剂或预防剂。

Claims (3)

1.一种6-甲基吡啶衍生物或其药用盐，所述6-甲基吡啶衍生物如下式I所示：
Figure A2003801007480002C1
2.一种制备6-甲基吡啶衍生物的方法，所述方法如以下流程图所示，通过将化学式II所示的2-氯-6-甲基烟酸与化学式III所示的4-(4-吗啉代)苯胺进行反应来制备6-甲基吡啶衍生物：
3.一种治疗和预防丙型肝炎的药物组合物，该药物组合物含有作为活性成分的下式I所示的6-甲基吡啶衍生物或其药用盐
Figure A2003801007480002C3
CNB2003801007489A 2002-10-11 2003-10-02 6－甲基吡啶衍生物及其制备方法以及含有该衍生物的抗病毒药物组合物 Expired - Fee Related CN100355752C (zh)

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