CN1691889A - 治疗和预防方法 - Google Patents

Abstract

本发明总体上涉及用于治疗或预防或改善炎性状态的影响的方法，例如，但不局限于慢性免疫介导的炎性疾病。本发明还提供了含有能抑制一种或多种炎性细胞因子和/或能下调编码炎性细胞因子的基因表达的试剂的药用组合物。所述组合物可用于治疗和预防炎性状态，如炎性关节炎，以及其他慢性免疫介导的炎性疾病。本发明还提供了用于研究用于治疗或预防炎性状态的试剂的动力学和/或筛选该试剂的动物模型。

Description

治疗和预防方法

发明领域

本发明总体上涉及用于治疗或预防或改善炎性状态的影响的方法，例如，但不局限于慢性免疫介导的炎性疾病。本发明还提供了含有能抑制一种或多种炎性细胞因子和/或能下调编码炎性细胞因子的基因表达的试剂的药用组合物。所述组合物可用于治疗和预防炎性状况，如炎性关节炎，以及其他慢性免疫介导的炎性疾病。本发明还提供了用于研究用于治疗或预防炎性状况的试剂的动力学和/或筛选该试剂的动物模型。

发明背景

在本说明书中提供的参考文献的书目的细节在本说明书的结尾部分列出。

在本说明书中，对任何现有技术的引用都不是，并且不应当被视为承认或以任何形式暗示该现有技术构成了任何国家的普通公知常识的一部分。

粒细胞集落刺激因子(G-CSF，由CSF-3基因编码)是造血生长因子，它能调控粒细胞的生产(Nicola等，Nature 314：625，1985；Metcalf，International Journal of Cancer 25：225，1980；Nicola等，Journal of Biological Chemistry 258：9017，1983)。G-CSF通过与粒细胞集落刺激因子受体(G-CSFR，由CSFR-3基因编码)-I型细胞因子受体超家族的成员的相互作用介导它的作用(Demetri等，Blood 78：2791-2808，1991)。G-CSF在人和小鼠体内的主要生物学作用，包括增加骨髓的嗜中性粒细胞的生产和释放(Souza等，Science232：61，1986；Lord等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：9499-9503，1989)，将造血祖细胞从骨髓中转移到外周血液中(Bungart等，BritishJournal of Haematology 22：1156，1990；de Haan等，Blood 86：2986-2992，1995；Roberts等，Blood 89：2736-2744，1997)并且调节成熟的嗜中性粒细胞的分化和效应子功能(Yong等，EuropeanJournal of Haematology 49：251-259，1992；Colotta等，Blood 80：2012-2020，1992；Rex等，Transfusion 35：605-611，1995；Gericke等，Journal of Leukocyte Biology 57：455-461，1995；Xu等，British Journal of Haematology 93：558-568，1996；Yong，BritishJournal of Haematology 94：40-46，1996；Jacob等，Blood 92：353-36l，1998)。将G-CSF用于治疗嗜中性白细胞减少症，并且用于转移造血干细胞(HSC)，以便进行自体和异源干细胞移植(Welter等，Blood 88：1907-1929，1996)。

将G-CSF用于HSC转移，可能导致类风湿关节炎(RA)的加重(Snowden等，Bone Marrow Transplantation 22：1035-1041，1998)。G-CSF和集落刺激因子GM-CSF和M-CSF是在体外针对IL-1和TNF的反应由人的滑膜成纤维细胞和软骨细胞产生的(Leizer等，Blood 76：1989-1996，1990；Hamilton等，Blood 79：1413-1419，1992)，并且业已在RA患者的血清和滑液中发现了G-CSF(Tanabe等，Rheumatology International 16：67-76，1996；Nakamura等，Clinical and Experimental Rheumatology 18：713-718，2000)。业已证实了全身施用G-CSF能加重鼠类胶原诱导的关节炎(CIA)，在DBA/1小鼠(Campbell等，Journal of Leukocyte Biology 68：144-150，2000)以及大鼠CIA的被动转移模型中(Miyahara等，ClinicalImmunology and Immunopathology 69：69-76，1993)的严重性和发病率增加。G-CSF转基因小鼠具有增强了的骨髓再吸收和减弱了的骨形成(Takahashi等，Laboratory Investigation 74：827-834，1996)，表明了G-CSF可能在骨周转中发挥作用。

G-CSF能够扩大单核细胞/巨噬细胞亚群，并且诱导抗炎细胞因子，该因子能防止小鼠患内毒素血症(Gorgen等，Journal of Immunology149：918，1992)。还报道了G-CSF能够在人和小鼠体内减弱异源和促有丝分裂的T细胞反应(Foster等，Transplantation 59：1557，1995；Pan等，Blood 86：4422，1995)，并且导致T细胞细胞因子曲线偏向Th2细胞因子生产，相应减弱了Th1 IFN-γ表达(Pan等，1995，同上；Franzke等，Blood 102：734-739)。在鼠类研究中，业已将这种背离Th2细胞因子生产与对急性移植物抗宿主疾病，实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)和自发性系统性红斑狼疮的保护作用联系在一起(Pan等，1995，同上；Zavala等，Journal of Immunology 163：5125-5132，1999；Zavala等，Journal of Immunology l68：2011-2019，2000)。小鼠的G-CSF缺陷型不会发生嗜中性粒细胞-介导的肾小球性肾炎，但是不能防止T细胞/巨噬细胞-介导的肾小球性肾炎(Kitching等，Journal of the American Society of Nephrologh 13：350-358，2000)。

因此，G-CSF是具有多种功能的多效性分子。有必要更完整的表征这些功能，并且阐述对这些功能的调控是否会导致对健康的好处。

发明概述

在本说明书中，除非情况有特殊需要，单词″包含″或变化形式，如″包含(comprises)″或″包含(comprising)″被理解成暗示包括所指明的要素或整数或要素或整数的组，但是，不排除任何其他要素或整数或要素或整数的组。

在关节炎的鼠类模型中研究了嗜中性粒细胞的作用。所述鼠类模型包括使用抗体消除嗜中性粒细胞，以及使用G-CSF敲除的小鼠。业已确定了，所述小鼠是高度抗急性关节炎诱导的，但是这种作用似乎不能通过较少的嗜中性粒细胞计数解释。类似地发现，通过局部施用G-CSF能够直接诱导关节发炎，且全身施用G-CSF可以取代所述急性关节炎模型中的IL-1。

胶原诱导的关节炎(CIA)是慢性自身免疫模型，它被广泛用于研究类风湿关节炎(RA)发病机理，并且用于评估预期的治疗。为了检查慢性关节疾病中对内源G-CSF的需求，用存在于弗氏完全佐剂(CFA)中的鸡II型胶原(CII)对G-CSF^-/-和野生型(WT)小鼠进行免疫，以便诱导CIA。在G-CSF缺陷型小鼠中，对疾病具有显著的防护作用，从而可确定G-CSF在CIA中的主要作用。在G-CSF敲除的小鼠中，对CII的T细胞反应是正常的。

总之，这意味着内源G-CSF在炎性关节炎中起着主要作用。局部或全身地下调G-CSF活性，或降低G-CSF水平或抑制或下调G-CSF受体(G-CSFR)，被推荐用作治疗或减轻炎性状况的严重性的机制，如慢性炎性关节炎和类风湿关节炎，或其他慢性免疫介导的炎性疾病状况。

因此，本发明涉及用于预防和/或治疗炎性状况的方法，包括给被试者施用能抑制所述炎性细胞因子活性，或降低其含量，该细胞因子例如，但不局限于G-CSF或它的功能性等同物或同系物或它的受体(G-CSFR)。

用所述急性关节炎模型测试了施用G-CSF的中和性单克隆抗体(mAb)的治疗效力。在急性关节炎期间抑制G-CSF在BM中导致了骨髓谱系细胞的剂量依赖性减弱，在外周血中导致了嗜中性白细胞减少症，并且减少了相关关节的细胞浸润。

本发明还提供了试剂和含有所述试剂的药用组合物，它能抑制编码G-CSF和/或其他炎性细胞因子和/或它们的受体的基因的活性或下调其表达。

本发明还提供了用于研究慢性炎症的动物模型，以及将它用于筛选用来治疗和/或预防炎性状况，如炎性关节炎的试剂的用途。

在表1中提供了本文所使用的缩略语列表。

                      表1

                     缩略语

缩略语	说明
		急性关节炎	甲基化牛血清清蛋白/IL-1--诱导的关节炎
Ab	抗体
		B6	C57BL/6
BM	骨髓
		BSA	牛血清清蛋白
CFA	弗氏完全佐剂
		CIA	胶原--诱导的关节炎
CII	II型胶原
		CSF3/Csf3	集落刺激因子3基因(人/小鼠)
CSF3R	集落刺激因子3受体基因(人)
		DNP	[二硝基苯基]乙酰基
EAE	实验性自身免疫性脑脊髓炎
		FACS	荧光激活细胞分类术
FCS	胎牛血清
		FITC	异硫氰酸荧光素
G-CSF	粒细胞集落刺激因子

缩略语	说明
		G-CSF-/-	粒细胞集落刺激因子-缺陷型
G-CSFR	粒细胞集落刺激因子受体
		GM-CSF	粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子
H&E	苏木精和曙红
		HRP	辣根过氧化物酶
HSC	造血干细胞
		i.a.	关节内(地)
i.d.	皮内(地)
		Ig	免疫球蛋白
IL-	白细胞介素-
		IFN-γ	干扰素-γ
i.p.	腹膜内(地)
		i.v.	静脉内
KLH	匙孔血蓝蛋白(keyhole limper cyanin)
		LN	淋巴结
mAb	单克隆抗体
		mBSA	甲基化牛血清清蛋白
mBSA/IL-1-诱导的关节炎	甲基化牛血清清蛋白-诱导的关节炎
		M-CSF	巨噬细胞集落刺激因子
M-CSFR	巨噬细胞集落刺激因子受体
		NMS	正常小鼠血清
NP-	[4-羟基-3-硝基苯基]乙酰基
		PBS	磷酸缓冲盐水
PE	藻红蛋白
		RA	类风湿关节炎
rHuG-CSF(非格司亭)	重组人G-CSF
		s.c.	皮下(地)

缩略语	说明
		TdR	胸苷
TNF	肿瘤坏死因子
		TNP	三硝基苯基
WEHI	The Walter and Eliza Hall Instituteof Medical Research
		WT	野生型

附图简述

图1是表示G-CSF的关节内作用的图。A.用非格司亭(G-CSF；0.1，0.5，或1μg)，IL-1(25ng)或盐水(媒介物)对小鼠连续3天进行关节内处理，并且在第3天进行组织学检查。与盐水对照相比*P＜0.05；P＜0.005。B.对G-CSF(0.5，1.5μg)或IL-1注射的关节的关节渗出液细胞进行定量。在G-CSF-注射的关节中存在大量的单核细胞/巨噬细胞渗出液。n＞12关节/组。

图2A和B是表示G-CSF是局部IL-1诱导的关节发炎所必需的，而不是IL-1诱导的蛋白聚糖减少所必需的图。在第0，1和2天，用IL-1(25ng)对B6和G-CSF-/-小鼠进行关节内注射，并且在第3天进行组织学评估，评估A.炎性特征和破坏特征的严重性，以及B.关节软骨蛋白聚糖的减少。结果表示为平均值±SEM(来自5次试验的得分)。数据来自2次试验中的1次；n＝14关节/组；*p＜0.05。

图3A和3B是表示在急性mBSA/IL-1-诱导的模型中，用非格司亭代替IL-1的全身性作用的图。用mBSA关节内注射B6小鼠，并且在第0，1，2天用盐水[黑色棒]，IL-1(250ng)[灰色棒]或非格司亭(15μg)[白色棒]进行皮下注射。示出了A.在第2天的外周血计数，和B.在第7天的腘淋巴结(LN)和脾重量。数据代表3次试验，n＞5小鼠/组。与mBSA/盐水对照组相比，*P＜0.05；P＜0.01。

图4A和4B是表示在急性关节炎模型中用全身性G-CSF代替IL-1的作用的图。用mBSA对小鼠进行关节内注射，并且用盐水媒介物，IL-1，或G-CSF进行皮下注射，并且在第7天对注射过的膝盖进行组织学检查。A.总的平均组织学得分±SEM。B代表性的组织学，表示i.用mBSA/盐水处理的关节，在关节间隙中具有最低限度的渗出液细胞(100X)，ii.mBSA/IL-1-处理的关节具有中度至显著渗出液和滑膜炎，以及iii.mBSA/G-CSF-处理的关节具有中度炎性特征(200X)。n≥10关节/组/试验；三次代表性试验。与mBSA/盐水对照相比，*p＜0.05。

图5A-C G-CSF-/-小鼠相对抗mBSA/IL-1-诱导的关节炎。用mBSA对B6和G-CSF-/-小鼠进行关节内处理，并且用IL-1或盐水进行皮下注射，并且在第7天进行组织学评估。柱状图表示A总的组织学严重性得分，以及B软骨蛋白聚糖减少(通过番红O染色)。C表示来自mBSA/IL-1-处理的(i，iii)B6和(ii，iv)G-CSF-/-小鼠的H&E(上部图片)和番红O(下部图片)切片的代表性切片，n＞6关节/组/实验；3次代表性试验。

图6表示来自用B6 mBSA/盐水，B6 mBSA/IL-1和G-CSF-/-mBSA/IL-1处理的小鼠的第3天和第7天的浸润滑膜组织的白细胞群体的代表性FACS曲线。在A第3天和B第7天，从超过6关节/组中解剖滑膜，在酶混合物中解离，然后对特殊标记进行染色。在A和B中，通过用CD45.2染色确定总的浸润白细胞(A，B；上部图片)。仅将CD45.2+群体用于随后的分析。C将来自B6 mBSA/盐水，B6 mBSA/IL-1和G-CSF-/-mBSA/IL-1处理的小鼠的滑膜消化液同样贴壁过夜，并且对非贴壁细胞进行染色，确定CD4表达。数据代表2次试验。

图7A和7B是在WT B6和G-CSF-/-小鼠的急性关节炎中，消耗嗜中性粒细胞的作用的图。在mBSA/IL-1-诱导的关节炎诱导之前，用嗜中性粒细胞的消耗性mAb或同种型对照处理小鼠。A在第0，2和7天，对WT和G-CSF-/-小鼠的急性关节炎模型进行外周血分析，所述小鼠是用嗜中性粒细胞-消耗性mAb或同种型对照mAb进行处理的。B用抗-嗜中性粒细胞mAb或同种型对照处理的WT和G-CSF-/-小鼠的总的组织学得分。n＞5关节/组，与WT同种型对照mAb-处理的小鼠嗜中性粒细胞水平相比，*P＜0.05。与WT同种型对照和抗-嗜中性粒细胞mAb-处理的对照组总得分相比，P＜0.05。

图8是表示与B6小鼠比较的在G-CSF-/-小鼠中削弱了的CIA的图。用溶解在CFA中的CII在尾巴根部位对小鼠进行皮内注射，并且在第21天进行加强。从第21天开始对小鼠进行疾病的临床评估，为每一只爪子评出从0(正常)到3(严重)的得分；最大得分是12(有关细节参见实施例8)。A.表示疾病的累积发病率。B.B6和G-CSF-/-小鼠中的CIA的临床严重程度。数据是从3次试验中收集的；n＞30小鼠/组。与G-CSF-1-相比，*P＜0.001。

图9表示在B6和G-CSF-/-小鼠中CIA的组织学评估结果。来自四个临床上最严重的B6和G-CSF-/-小鼠有关组织病理学严重性的关节的得分为0-3。A是正常，轻微，中等和严重病变关节的百分比的图。B表示代表性的H&E切片，所述切片来自i.非关节炎B6关节，ii.严重发炎的B6 CIA关节，以及iii.没有表现出炎症的一般的G-CSF-/-关节。

图10是B6和G-CSF-/-小鼠在体外对CII的T细胞反应的图。对单独的腹股沟LN悬浮液进行铺平板，并且用变性的CII刺激。用[³H]TdR对细胞进行8小时的脉冲，并且测定放射性吸收，以便评估T细胞增殖。A.B6和G-CSF-/-LN细胞的增殖性刺激指数。B.在第64小时通过ELISA分析了来自培养物的上清液中的(i)IFN-γ和(ii)IL-2的水平。n＞6孔/样品。

图11A和B表示CIA-免疫的B6和G-CSF-/-小鼠的抗-CII Abs。血清是在A.第30天和B.第62天采集的，并且通过ELISA分析抗-CIIAb-总的IgG，IgM和同种型IgG2b，IgG2c，IgG1和IgG3。数据是从3次试验中收集的；n＞30样品/组。*P＜0.05，P＜0.005。

图12是表示未接触过抗原的和CII/CFA-免疫的B6和G-CSF-/-小鼠中的基础Ig水平和非特异性总的IgG水平的图。A.对未接触过抗原的B6和G-CSF-/-小鼠(n＝6小鼠/组)进行放血，并且通过ELISA检测血清中的循环的总的IgG，IgM和同种型(IgG2b，IgG2c，IgG1，IgG3和IgA)的水平。B.分析了第62天的来自CIA-免疫的B6和G-CSF-/-小鼠的血清的非特异性总的IgG。包括了来自3次独立试验的小鼠；n≥16小鼠/组；*P＜0.05。

图13表示与B6小鼠相比，在G-CSF-/-小鼠中对T-依赖型和T-不依赖型抗原的Ab反应。用在明矾中沉淀的T-依赖型Ag NP-KLH或用存在于PBS中的T-不依赖型抗原DNP-葡聚糖对B6和G-CSF-/-小鼠进行刺激，并且在规定的日期放血。在第42天对NP-KLH组进行强化免疫。通过ELISA分析血清，以便评估A.T-依赖型NP-KLH反应，它是通过i.NP₂(总的)和ii.NP₂₀(高亲和力)-特异性IgG1，iii.NP₂₀ Ig2b的效价评估的，以及B.T不依赖型DNP-葡聚糖抗-NP IgM。n＞4小鼠/组。

图14表示在所述急性关节炎模型中G-CSF中和的作用。在第0，1，2，3和5天用中和性抗-G-CSF(50和250μg)或同种型对照mAb处理B6小鼠。图A.在第4天和第7天的外周血嗜中性粒细胞计数(n＝5)。B.每个关节的平均临床肉眼可见的得分(来自4个)(n＝10)。C.每个小鼠关节的平均滑膜组织细胞性(n＝3)。D.表示渗出的嗜中性粒细胞(GR1hi CD11bhi)和单核细胞/巨噬细胞(CD11bhi GR1lo)的斑点图。数据代表1次试验的结果；*P＜0.01。

优选实施方案的详细说明

部分根据炎性细胞因子在发炎过程中的作用的进一步阐述，推测了本发明。更具体地讲，假定G-CSF的作用对炎性状况有影响，如慢性免疫-介导的炎症。因此，有人提出根据本发明，局部或全身地抑制炎性细胞因子的活性，和/或下调编码炎性细胞因子的基因的表达可以治疗或预防炎性状况。

因此，本发明的一个方面涉及用于在动物或鸟类物种中治疗或预防炎性状况的方法，该方法包括给所述动物或鸟类物种施用有效量的试剂，该试剂能抑制炎性细胞因子或它的受体的活性和/或降低编码所述炎性细胞因子或它的受体的基因的表达水平。

本发明具体涉及G-CSF以及它的同系物和衍生物。所说的″G-CSF″或它的全名称″粒细胞集落刺激因子″包括它的同系物和衍生物。“同系物”或“衍生物”包括G-CSF的多态性变体。本文对G-CSF的引用还可以被视为可应用于其他炎性细胞因子。

因此，本发明的另一方面提供了用于在动物或鸟类物种中治疗和/或预防炎性状况的方法，该方法包括给所述动物施用试剂，这种试剂能抑制G-CSF的活性和/或能降低编码G-CSF或G-CSFR的基因的表达水平。

正如上面所提出的，所提到的″G-CSF″包括它的同系物和它的衍生物。

施用可以是全身性的或局部的。局部施用特别适用于局部或炎性状态如关节炎的治疗。不过G-CSF有可能对造血细胞产生作用，所以全身施用可用于从总体上调节免疫系统。所提到的“全身的”包括关节内，静脉内，腹膜内，皮下和鞘内施用，以及通过口腔，直肠和鼻腔途径施用。

术语″炎性状况″是以它的最广义的含义使用的，不过，特别包括免疫系统介导的炎性状况。在特别优选的实施方案中，炎性状况是炎性关节炎，包括类风湿关节炎(RA)。

因此，在优选实施方案中，本发明涉及用于在动物或鸟类物种中治疗和/或预防炎性关节炎或其他慢性免疫介导的炎性状况的方法，该方法包括给所述动物或鸟类物种施用试剂，该试剂能抑制G-CSF或G-CSFR的活性和/或能降低编码G-CSF或G-CSFR的基因的表达水平。

优选的动物是哺乳动物，如人和其他灵长类动物，家畜(例如，绵羊，母牛，马，驴，猪)，实验动物(例如，兔子，小鼠，仓鼠，豚鼠)，伴侣动物(例如，狗，猫)，以及被捕获的野生动物。鸟类物种包括家鸟(例如，鸡，鸭，鹅，火鸡，矮脚鸡)，猎鸟(例如，鸭子，鸸鹋，雉)以及笼养的鸟类。人是灵长类动物的最优选的动物。马是特别优选的家畜。

因此，在优选实施方案中，本发明提供了用于治疗和/或预防人的炎性状况的方法，该方法包括给所述人施用试剂，该试剂能抑制G-CSF或G-CSFR的活性和/或能降低编码G-CSF或G-CSFR的基因的表达水平。

所述试剂可以是蛋白类，非蛋白类(例如化学个体)或核酸分子。

蛋白类和非蛋白类分子包括肽，多肽和蛋白，小型的，中等的或大型的化学分子，以及通过天然产物筛选或筛选化学文库鉴定的分子。天然产物筛选包括筛选来自植物，微生物，河床土壤，珊瑚，水生环境和地球外环境的提取物或样品，以获得对G-CSF活性或G-CSF基因表达水平有影响的分子或分子组。所述分子还可能影响G-CSF/G-CSFR相互作用。

试剂的一种例子是G-CSF或G-CSFR或它的表位的抗体。这种抗体可以全身性地使用或局部使用。

单克隆抗体的使用是特别优选的，因为具有大量生产它们的能力，以及所述产物的同质性。通过融合无限增殖细胞系和对免疫原性制剂敏化的淋巴细胞得到的用于生产单克隆抗体的杂交瘤细胞系的制备，可以通过本领域技术人员所熟知的技术完成(例如，参见Douillard和Hoffman，Basic Facts about Hybridomas，in Compendium ofImmunology Vol.II，Schwartz编辑，1981；Kohler和Milstein，Nature 256：495-499，1975；Kohler和Milstein，European Journalof Immunology 6：511-519，1976)。

有用试剂的另一个例子是可溶性形式的G-CSFR，它与G-CSF竞争与膜相关的G-CSFR相互作用。

另外，可以筛选试剂与G-CSF或G-CSFR-遗传材料结合的能力。在一种实施方案中，G-CSF-或G-CSFR-编码性cDNA或基因组DNA或mRNA转录物或它的部分，如EST或SAGE标记，被固定在固体支持物上，如纳米颗粒或小球体。然后让潜在的试剂与固定的核酸分子接触，并且通过辐射，发射，原子激发，质量和/或密度的改变检测结合。

一旦鉴定之后，即可将所述试剂从核酸分子上洗脱，并且作更详细的表征。例如，与G-CSF/G-CSFR遗传材料结合的试剂可以抑制表达(转录和/或翻译)。

本发明还涉及将G-CSF或G-CSFR的化学类似物用作G-CSF或它的受体的拮抗剂。正如上文所指出的，还可以使用可溶性G-CSF受体。

本发明所涉及的化学类似物包括，但不局限于侧链修饰，在肽，多肽或蛋白合成期间，非天然氨基酸和/或它们的衍生物的整合，以及交联剂的使用，以及对蛋白类分子或它们的类似物构成构象约束的其他方法。

本发明所涉及的侧链修饰的例子包括氨基的修饰，如通过与醛起反应进行还原性烷基化，然后用NaBH₄还原；用甲基亚氨逐乙酸酯(methylacetimidate)进行酰胺化；用乙酸酐酰化；用氰酸盐对氨基进行甲氨酰化；用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)对氨基进行三硝基苯基化；用琥珀酐和四氢化邻苯二甲酸酐对氨基进行酰化；以及用吡哆醛-5-磷酸对赖氨酸进行吡多酸化，然后通过用NaBH₄还原。

可以通过用诸如2，3-丁二酮，苯甲酰甲醛和乙二醛的试剂形成杂环缩合产物，修饰精氨酸残基的胍基基团。

可以通过碳二亚胺激活对羧基进行修饰，该激活通过O-酰基异脲形成随后进行衍生化，例如，形成相应的酰胺。

可以通过如下方法修饰巯基基团，诸如用碘乙酸或碘乙酰胺羧甲基化；将过甲酸氧化成磺基丙氨酸；与其他硫醇化合物形成混合的二硫化物；与马来酰亚胺，马来酐或其他取代过的马来酰亚胺起反应；用4-氯汞苯甲酸，4-氯汞苯基磺酸，苯基氯化汞，2-氯汞-4-硝基苯酚和其他汞试剂形成含汞的衍生物；用氰酸盐在碱性pH下进行甲氨酰化。

例如，可以通过用N-溴代琥珀酰亚胺氧化或用2-羟基-5-硝基苄基溴或氧硫基卤对吲哚环进行烷基化，对色氨酸残基进行修饰。另一方面，可以通过用四硝基甲烷硝化改变酪氨酸残基，以便形成3-硝基酪氨酸衍生物。

可以通过用碘乙酸衍生物烷基化或用焦碳酸二乙酯进行N-乙酯基化实现对组氨酸残基的咪唑环的修饰。

在肽合成期间掺入的非天然氨基酸和衍生物的例子包括，但不局限于使用正亮氨酸，4-氨基丁酸，4-氨基-3-羟基-5-苯基戊酸，6-氨基己酸，叔丁基甘氨酸，正缬氨酸，苯基甘氨酸，鸟氨酸，肌氨酸，4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸，2-噻吩基丙氨酸和/或氨基酸的D-异构体。在表2中示出了本发明所涉及到的非天然氨基酸的列表。

                               表2

非常规氨基酸	代码	非常规氨基酸	代码
				α-氨基丁酸	Abu	L-N-甲基丙氨酸	Nmala
α-氨基-α-丁酸甲酯	Mgabu	L-N-甲基精氨酸	Nmarg
				氨基环丙烷羧酸酯	Cpro	L-N-甲基天冬酰胺	Nmasn
		L-N-甲基天冬氨酸	Nmasp
				氨基异丁酸	Aib	L-N-甲基半胱氨酸	Nmcys
氨基降冰片基羧酸酯	Norb	L-N-甲基谷氨酰胺	Nmgln
						L-N-甲基谷氨酸	Nmglu
环己基丙氨酸	Chexa	L-N甲基组氨酸	Nmhis
				环戊基丙氨酸	Cpen	L-N-甲基异亮氨酸	Nmile
D-丙氨酸	Dal	L-N-甲基亮氨酸	Nmleu
				D-精氨酸	Darg	L-N-甲基赖氨酸	Nmlys
D-天冬氨酸	Dasp	L-N-甲基甲硫氨酸	Nmmet

非常规氨基酸	代码	非常规氨基酸	代码
				D-半胱氨酸	Dcys	L-N-甲基正亮氨酸	Nmnle
D-谷氨酰胺	Dgln	L-N-甲基正缬氨酸	Nmnva
				D-谷氨酸	Dglu	L-N-甲基鸟氨酸	Nmorn
D-组氨酸	Dhis	L-N-甲基苯丙氨酸	Nmphe
				D-异亮氨酸	Dile	L-N-甲基脯氨酸	Nmpro
D-亮氨酸	Dleu	L-N-甲基丝氨酸	Nmser
				D-赖氨酸	Dlys	L-N-甲基苏氨酸	Nmthr
D-甲硫氨酸	Dmet	L-N-甲基色氨酸	Nmtrp
				D-鸟氨酸	Dorn	L-N-甲基酪氨酸	Nmtyr
D-苯丙氨酸	Dphe	L-N-甲基缬氨酸	Nmval
				D-脯氨酸	Dpro	L-N-甲基乙基甘氨酸	Nmetg
D-丝氨酸	Dser	L-N-甲基叔丁基甘氨酸	Nmtbug
				D-苏氨酸	Dthr	L-正亮氨酸	Nle
D-色氨酸	Dtrp	L-正缬氨酸	Nva
				D-酪氨酸	Dtyr	α-甲基-氨基异丁酸酯	Maib
D-缬氨酸	Dval	α-甲基-γ-氨基丁酸酯	Mgabu
				D-α-甲基丙氨酸	Dmala	α-甲基环己基丙氨酸	Mchexa
D-α-甲基精氨酸	Dmarg	α-甲基环戊基丙氨酸	Mcpen
				D-α-甲基天冬酰胺	Dmasn	α-甲基-α-萘丙氨酸	Manap
D-α-甲基天冬氨酸	Dmasp	α-甲基青霉胺	Mpen
				D-α-甲基半胱氨酸	Dmcys	N-(4-氨基丁基)甘氨酸	Nglu
D-α-甲基谷氨酰胺	Dmgln	N-(2-氨基乙基)甘氨酸	Naeg
				D-α-甲基组氨酸	Dmhis	N-(3-氨基丙基)甘氨酸	Norn

非常规氨基酸	代码	非常规氨基酸	代码
				D-α-甲基异亮氨酸	Dmile	N-氨基-α-甲基丁酸酯	Nmaabu
D-α-甲基亮氨酸	Dmleu	α-萘丙氨酸	Anap
				D-α-甲基赖氨酸	Dmlys	N-苄基甘氨酸	Nphe
D-α-甲基甲硫氨酸	Dmmet	N-(2-氨基甲酰乙基)甘氨酸	Ngln
				D-α-甲基鸟氨酸	Dmorn	N-(氨基甲酰甲基)甘氨酸	Nasn
D-α-甲基苯丙氨酸	Dmphe	N-(2-羧乙基)甘氨酸	Nglu
				D-α-甲基脯氨酸	Dmpro	N-(羧甲基)甘氨酸	Nasp
D-α-甲基丝氨酸	Dmser	N-环丁基甘氨酸	Ncbut
				D-α-甲基苏氨酸	Dmthr	N-环庚基甘氨酸	Nchep
D-α-甲基色氨酸	Dmtrp	N-环己基甘氨酸	Nchex
				D-α-甲基酪氨酸	Dmty	N-环癸基甘氨酸	Ncdec
D-α-甲基缬氨酸	Dmval	N-环十二基甘氨酸	Ncdod
				D-N-甲基丙氨酸	Dnmala	N-环辛基甘氨酸	Ncoct
D-N-甲基精氨酸	Dnmarg	N-环丙基甘氨酸	Ncpro
				D-N-甲基天冬酰胺	Dnmasn	N-环十一烷基甘氨酸	Ncund
D-N-甲基天冬氨酸	Dnmasp	N-(2，2-二苯乙基)甘氨酸	Nbhm
				D-N-甲基半胱氨酸	Dnmcys	N-(3，3-二苯基丙基)甘氨酸	Nbhe
D-N-甲基谷氨酰胺	Dnmgln	N-(3-胍基丙基)甘氨酸	Narg
				D-N-甲基谷氨酸	Dnmglu	N-(1-羟乙基)甘氨酸	Nthr
D-N-甲基组氨酸	Dnmhis	N-(羟乙基))甘氨酸	Nser

非常规氨基酸	代码	非常规氨基酸	代码
				D-N-甲基异亮氨酸	Dnmile	N-(咪唑基乙基))甘氨酸	Nhis
D-N-甲基亮氨酸	Dnmleu	N-(3-吲哚乙基)甘氨酸	Nhtrp
				D-N-甲基赖氨酸	Dnmlys	N-甲基-γ-氨基丁酸酯	Nmgabu
N-甲基环己基丙氨酸	Nmchexa	D-N-甲基甲硫氨酸	Dnmmet
				D-N-甲基鸟氨酸	Dnmorn	N-甲基环戊基丙氨酸	Nmcpen
N-甲基甘氨酸	Nala	D-N-甲基苯丙氨酸	Dnmphe
				N-甲基氨基异丁酸酯	Nmaib	D-N-甲基脯氨酸	Dnmpro
N-(1-甲基丙基)甘氨酸	Nile	D-N-甲基丝氨酸	Dnmser
				N-(2-甲基丙基)甘氨酸	Nleu	D-N-甲基苏氨酸	Dnmthr
D-N-甲基色氨酸	Dnmtrp	N-(1-甲基乙基)甘氨酸	Nval
				D-N-甲基酪氨酸	Dnmtyr	N-甲基-α-萘丙氨酸	Nmanap
D-N-甲基缬氨酸	Dnmval	N-甲基青霉胺	Nmpen
				γ-氨基丁酸	Gabu	N-(对羟基苯基)甘氨酸	Nhtyr
L-叔丁基甘氨酸	Tbug	N-(硫甲基)甘氨酸	Ncys
				L-乙基丙氨酸	Etg	青霉胺	Pen
L-高苯丙氨酸	Hphe	L-α-甲基丙氨酸	Mala
				L-α-甲基精氨酸	Marg	L-α-甲基天冬酰胺	Maon
L-α-甲基天冬氨酸	Masp	L-α-甲基叔丁基甘氨酸	Mtbug
				L-α-甲基半胱氨酸	Mcys	L-甲基乙基甘氨酸	Metg
L-α-甲基谷氨酰胺	Mgln	N-α-甲基谷氨酸	Mglu

非常规氨基酸	代码	非常规氨基酸	代码
				L-α-甲基组氨酸	Mhis	N-α-甲基高苯丙氨酸	Mhphe
L-α-甲基异亮氨酸	Mile	N-(2-甲基硫乙基)甘氨酸	Nmet
				L-α-甲基亮氨酸	Mleu	L-α-甲基赖氨酸	Mlys
L-α-甲基甲硫氨酸	Mmet	L-α-甲基正亮氨酸	Mnle
				L-α-甲基缬氨酸	Mnva	L-α-甲基鸟氨酸	Morn
L-α-甲基苯丙氨酸	Mphe	L-α-甲基脯氨酸	Mpro
				L-α-甲基丝氨酸	Mser	L-α-甲基苏氨酸	Mthr
L-α-甲基色氨酸	Mtrp	L-α-甲基酪氨酸	Mtyr
				L-α-甲基缬氨酸	Mval	L-N-甲基高苯丙氨酸	Nmhphe
N-(N-(2，2-二苯乙基)氨甲酰甲基)甘氨酸	Nnbhm	N-(N-(3，3-二苯基丙基)氨甲酰甲基)甘氨酸	Nnbhe
				1-羧基-1-(2，2-二苯乙基氨基)环丙烷	Nmbc

例如，可以使用交联剂以稳定3D构象，使用同双功能交联剂，如具有(CH₂)_n间隔基团的双功能酰亚氨酸酯，其中n＝1- n＝6，戊二醛，N-羟基琥珀酰亚胺酯，以及异双功能试剂，它通常包括氨基活性部分，如N-羟基琥珀酰亚胺，以及其他基团特异性活性部分，如马来酰亚胺或二硫代部分(SH)或碳二亚胺(COOH)。另外，可以对肽进行构象约束，例如，通过整合C_α和N_α-甲基氨基酸，在氨基酸的C_α和C_β原子之间导入双键，并且通过导入共价键形成环状肽或类似物，如在N和C末端之间，在两个侧链之间或在侧链和N或C末端之间形成酰胺键。

诸如RNA或DNA的核酸分子特别适用于通过反义-或有义-介导的机制诱导基因沉默。有义-介导的基因沉默又被称作共抑制，并且涉及多种机制，包括RNAi的诱导。

术语″核酸″，″核苷酸″和″多核苷酸″包括RNA，cDNA，基因组DNA，合成形式和混合的聚合物，包括有义和反义链，并且可以是化学或生物化学修饰过的或可以包括非天然的或衍生化的核苷酸碱基，正如本领域技术人员很容易理解的。例如，所述修饰包括标记，甲基化，用类似物(如吗啉环)取代一个或多个天然存在的核苷酸，核苷酸间修饰，如不带电荷的键(例如，磷酸甲酯，磷酸三酯，磷酰胺(phosphoamidate)，氨基甲酸酯等)，带电荷的键(例如，硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯等)，侧基部分(例如，多肽)，嵌入剂(例如，吖啶，补骨脂素等)，螯合剂，烷基化剂和修饰过的键(例如，α-异头核酸等)。还包括合成分子，它能模拟多核苷酸通过氢结合和其他化学相互作用与指定的序列结合的能力。这种分子为本领域所公知，并且，包括，例如用肽键取代了所述分子主链上的磷酸键的分子。

例如，可以将反义多核苷酸序列用于使G-CSF遗传序列或G-CSFR遗传序列的转录物沉默。另外，可以将包括G-CSF基因座的全部或一部分的多核苷酸载体沿有义或反义方向置于启动子的控制之下，并且导入细胞。所述有义或反义构建体在细胞中的表达，能干扰目标转录和/或翻译。另外，还可以采用共抑制(即，使用有义-抑制)和诱导RNAi或siRNA的机制。另外，可以直接施用反义或有义分子。在后一种实施方案中，可以将反义或有义分子制备在组合物中，然后通过多种方式给目标T细胞施用。

反义和有义分子的变化形式涉及使用吗啉基，它是由吗啉核苷酸衍生物和二氨基磷酸盐(phosphoradiamidate)键组成的寡核苷酸(例如，Summerton和Weller，Antisense and Nucleic Acid Drug Development7：187-195，1997)。例如，将所述化合物注射到胚胎中，并且观察对mRNA的干扰作用。

在一种实施方案中，本发明将诸如寡核苷酸和类似物的化合物用于调节编码G-CSF或G-CSFR的核酸分子的功能或作用，即所述寡核苷酸能诱导转录时或转录后基因沉默。这一目的是通过提供能与一种或多种编码所述抑制剂的核酸分子特异性杂交的寡核苷酸实现的。可以给细胞直接提供所述寡核苷酸，或者在所述细胞内产生所述寡核苷酸。在本文中，术语″靶核酸″和″编码G-CSF或G-CSFR的核酸分子″被方便地用于包括所述编码性DNA，由所述DNA转录的RNA(包括前-mRNA和mRNA或它的部分)，并且还包括来自所述RNA的cDNA。本发明的化合物与它的靶核酸的杂交通常被称作″反义″。因此，被认为在实施本发明的一些优选实施方案时所包括的优选机制，在这里被称作″反义抑制″。所述反义抑制通常是基于寡核苷酸链或片段的基于氢键的杂交，以便对至少一条链或片段进行裂解，降解或其他形式的修饰，以便使它不可操作。就此而言，目前优选的是，导向特殊的核酸分子以及它们的有关所述反义试剂的功能。

要干扰的DNA的功能可以包括复制和转录。例如，复制和转录可以是来自内源细胞模板，载体，质粒构建体或其他分子的。要干扰的RNA的功能可以包括诸如以下的功能：RNA转运到蛋白翻译位点，RNA转运到细胞内远离RNA合成位点的位点，由所述RNA翻译成蛋白，剪接所述RNA，以便产生一种或多种类型的RNA，以及催化活性或复合物形成，其涉及有可能参与或受到所述RNA促进的RNA。

在本发明中，“杂交”寡聚化合物的互补链的配对。在本发明中，配对的优选机制涉及氢键结合，它可以是寡聚化合物的链的互补的核苷或核苷酸碱基(核碱基)之间的Watson-Crick，Hoogsteen或反Hoogsteen氢键结合。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是互补的核碱基，它们通过形成氢键而配对。杂交可以在各种环境下进行。

在所述化合物与所述靶核酸结合干扰所述靶核酸的正常功能，导致活性减弱，并且具有足够的互补程度，以便避免所述反义化合物与非靶核酸序列在特异性结合需要的条件下的非特异性结合的情况下，这样的反义化合物是能特异性杂交的。

本文所说的“互补的”表示寡聚化合物的核碱基之间的精确配对。例如，如果在寡核苷酸(寡聚化合物)的特定位置上的核碱基能够与位于靶核酸的特定位置上的核碱基进行氢键结合，所述靶核酸是DNA，RNA，或寡核苷酸分子的话，所述寡核苷酸和所述靶核酸之间的氢键结合的位置就被称为互补的位置。在以下情况下所述寡核苷酸和其他DNA，RNA，或寡核苷酸分子是彼此互补的，即当每一个分子上的足够数量的互补位置被能彼此形成氢键的核碱基所占据时。因此，“可特异性杂交的”和“互补的”是被用于表示在足够数量的核碱基上进行足够程度的精确配对或互补的术语，以便在寡核苷酸和靶核酸之间形成稳定的和特异性的结合。

根据本发明，化合物包括反义寡聚化合物，反义寡核苷酸，核酶，外部指导序列(EGS)寡核苷酸，可变剪接子(splicer)，引物，探针，以及能够至少与靶核酸的一部分杂交的其他寡聚化合物。因此，可以导入单链，双链，环状或发夹形式的寡聚化合物，并且该化合物可以包括结构元件，如内部或末端突出部分或环。一旦导入系统，本发明的化合物就能诱导一种或多种酶或结构蛋白起作用，以便实施对靶核酸的修饰。所述酶的一种非限定性例子是RNAse H，即能裂解RNA:DNA双链体的RNA链的细胞内切核酸酶。本领域众所周知的是，″DNA-样″的单链反义化合物能诱导RNAse H。因此RNase H的激活能导致RNA靶分子的裂解，从而大大增强寡核苷酸-介导的基因表达抑制的效力。业已推测了其他核糖核酸酶的类似的作用，如酶的RNase III和核糖核酸酶L家族的成员。

尽管反义化合物的优选形式是单链反义寡核苷酸，但在很多物种中，双链结构，例如双链RNA(dsRNA)分子的导入业已被证实能诱导有效的和特异性的反义-介导的基因或它的相关的基因产物功能的减弱。

在本发明范围内，术语″寡聚化合物″表示包括多个单体单位的聚合物或寡聚体。在本发明中，术语″寡核苷酸″表示核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)的寡聚体或聚合物，或它的模拟物，嵌合体，类似物和同系物。该术语包括由天然存在的核碱基，糖和共价核苷间(主链)键组成的寡核苷酸，以及具有非天然存在的部分的寡核苷酸，它能发挥类似的作用。所述修饰或取代过的寡核苷酸通常优于天然形式的核苷酸，因为它具有需要的特性，例如，增强了的细胞吸收，增强了的对靶核酸的亲和力，以及增强了在存在核酸酶的条件下的稳定性。

尽管寡核苷酸是本发明优选形式的化合物，本发明还涉及其他家族的化合物，包括，但不局限于寡核苷酸类似物和模拟物，如本文所描述的分子。

本领域所公知的可读框(ORF)或“编码区”表示翻译起始密码子和翻译终止密码子之间的区域，它是能够有效导向的区域。在本发明范围内，区域是包括基因的可读框(ORF)的翻译起始或终止密码子的基因内区域。

其他目标区包括5′非翻译区(5′UTR)，在本领域中指位于翻译起始密码子的5′方向的mRNA一部分，并因此包括位于mRNA的5′加帽位点和翻译起始密码子之间的核苷酸(或该基因上相应的核苷酸)，以及3′非翻译区(3′UTR)，在本领域中指位于翻译终止密码于3′方向的mRNA的部分，并因此包括位于mRNA的翻译终止密码子和3′末端之间的核苷酸(或该基因上相应的核苷酸)。mRNA的5′加帽位点包含N7-甲基化鸟苷残基，它通过5′-5′三磷酸键与mRNA的5′-最外侧的残基结合。mRNA的5′加帽区域被认为包括5′加帽结构本身，以及靠近所述加帽位点的前50个核苷酸。优选导向5′加帽区域。

尽管某些真核生物mRNA转录物是直接翻译的，很多转录物包括一个或多个被称为″内含子″的区，在它翻译之前，这些区被从转录物上切除。其余的(并因此是翻译的)区被称为″外显子″，并且被剪接在一起，以便形成连续的mRNA序列。导向剪接位点，即内含子-外显子接点或外显子-内含子接点还可特别应用于异常的剪接与疾病相关的场合，或应用于与特殊剪接产物的超量产生与疾病相关的场合。由于重排或缺失造成的异常融合接点同样是优选的目标位点。通过来自不同的基因来源的两种(或两种以上)mRNAs的剪接过程产生的mRNA转录物被称为“融合转录物”。同样已知的是，可以使用导向于例如DNA或前-mRNA的反义化合物有效导向内含子。

正如本领域所公知的，核苷是碱基-糖的组合物。核苷的碱基部分通常是杂环碱基。这种杂环碱基的两种最常见的类型是嘌呤和嘧啶。核苷酸是在核苷上还包括与糖部分共价连接的磷酸基团上的核苷。对于包括呋喃戊糖基糖的核苷来说，磷酸基团可以连接在糖的2′，3′或5′羟基部分。在形成寡核苷酸时，所述磷酸基团将相邻的核苷与另一个核苷共价连接在一起，以便形成线性聚合化合物。反过来，这种线性聚合化合物的各个末端可进一步结合，以便形成环状化合物，不过，线性化合物通常是优选的。另外，线性化合物可以具有内部核碱基互补性，并因此以某种方式折叠，以便产生完整的或部分双链化合物。在寡核苷酸内，所述磷酸基团通常被称作形成了所述寡核苷酸的核苷间主链。RNA和DNA的正常的键或主链是3′→5′磷酸二酯键。

为了局部输送反义化合物，所述寡核苷酸可以包括修饰过的主链或非天然核苷间键。正如在本说明书中所定义的，具有修饰过的主链的核苷酸包括在主链上保留了磷原子的寡核苷酸，以及在主链上没有磷原子的寡核苷酸。对于本说明书来说，并且正如在本领域中有时候所提到的，在它们的核苷间主链上没有磷原子的修饰过的寡核苷酸还可以被称为寡聚核苷。

优选的包括磷原子的修饰过的寡核苷酸主链包括，例如，硫代磷酸酯，手性硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，磷酸三酯，氨基烷基磷酸三酯，甲基和其他烷基磷酸酯(包括3′-亚烷基磷酸酯，5′-亚烷基磷酸酯和手性磷酸酯)，次膦酸酯，氨基磷酸酯(包括3′-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯)，硫羰基氨基磷酸酯，硫羰基烷基磷酸酯，硫羰基烷基磷酸三酯，硒代磷酸酯和硼代磷酸酯，具有正常的3′-5′键，它们的2′-5′连接类似物，以及具有颠倒极性的化合物，其中，一个或多个核苷酸间键是3′-3′，5′-5′或2′-2′键。具有颠倒极性的优选的寡核苷酸包含位于3′-最外侧核苷酸间键上的单一的3′-3′键，即单一的颠倒的核苷残基，它可以是碱性的(缺少了所述核碱基，或在它的位置上具有羟基基团)。还包括各种盐，混合的盐和游离酸形式。

在另一种实施方案中，将包括DNA″疫苗″的遗传构建体用于制备反义或有义分子哺乳动物细胞。另外，上述很多优选的特征适用于有义核酸分子。

按照本发明方法鉴定的试剂是以药用组合物形式方便地提供的。

本发明还涉及包含G-CSF活性或G-CSF和G-CSFR之间的相互作用的调节剂或G-CSF/G-CSFR表达的调节剂的组合物，该组合物还包含一种或多种可以药用的载体和/或稀释剂。

适用注射用途的组合物形式包括无菌水溶液(水溶性的)和用于临时制备无菌注射溶液的无菌粉末。在生产和保存条件下，它必须是稳定的，并且必须能防止诸如细菌和真菌的微生物的污染作用。所述载体可以是溶剂或稀释介质，包含，例如水，乙醇，多元醇(例如甘油，丙二醇和液体聚乙二醇等)，它们的合适的混合物以及植物油。可以保持适当的流动性，例如通过使用表面活性剂。对微生物作用的预防可以通过各种抗细菌和抗真菌试剂实现，例如，对羟基苯甲酸酯类，氯代丁醇，苯酚，山梨酸和硫柳汞等。在很多场合下，优选包括等渗试剂，例如，糖或氯化钠。可注射组合物的长期吸收可以通过将延缓吸收的试剂，例如，单硬脂酸铝和凝胶应用在所述组合物中实现。

无菌可注射溶液是通过将需要数量的活性化合物掺入合适的溶剂中，同时掺入需要的活性成分和任选地掺入其他活性成分，然后进行过滤灭菌或其他合适的灭菌方式制备的。对于用于制备无菌注射溶液的无菌粉末来说，合适的制备方法包括真空干燥和冷冻干燥技术，由此产生了活性成分加上任何其他需要的成分的粉末。

当所述调节剂受到适当的保护时，它可以口服使用，例如，使用惰性稀释剂或使用可同化的可食用的载体，或将它包在硬的或软的壳状明胶胶囊中，或者将它压缩成片剂，或者将它直接掺入饮食中，或通过母乳施用。对于口服治疗施用来说，所述活性成分可以与赋形剂结合，并且以可摄入的片剂，口腔片剂，药片，胶囊，酏剂，悬浮液，糖浆，和薄片等形式使用。所述组合物和制剂应当包括重量至少为1％的调节剂。当然，所述组合物和制剂的百分比可以改变，并且方便地占大约5-大约80％的重量单位。调节剂在这种用于治疗的组合物中的用量是这样的，以便能够获得适合的剂量。制备了本发明的优选的组合物或制剂，以便口服剂量单位形式包括大约0.1μg-200mg的调节剂。其他剂量包括大约1μg-大约1000mg，和大约10μg-大约500mg。这些剂量可以是每个个体或每千克体重的。施用可以每小时，每天，每周，周月或每年一次。

所述片剂，药片，药丸，胶囊，和乳膏等还可以包括下面所列举的成分。粘合剂，如树胶，阿拉伯树胶，玉米淀粉，或明胶；赋形剂，如磷酸二钙；崩解剂，如玉米淀粉，马铃薯淀粉，和藻酸等；润滑剂，如硬脂酸镁；以及增甜剂，如蔗糖，乳糖或糖精都可以添加，或调味剂，如胡椒薄荷，鹿蹄草油或樱桃调味剂。当所述剂量单位形式是胶囊时，除了上述类型的材料之外，它可以包括液体载体。可以存在各种其他材料用作涂层或以其他形式改变所述剂量单位的外形。例如，可以用虫胶，糖或这两者对片剂，药丸或胶囊进行包衣。糖精或酏剂可以包括活性化合物，作为增甜剂的蔗糖，作为防腐剂的甲基和丙基对羟基苯甲酸酯类，染料和调味剂，如樱桃或橙调味剂。当然，用于制备任何单位剂量形式的任何材料都应当是药物学上纯的，并且在使用的量下基本上无毒的。另外，可以将所述活性化合物掺入持续释放制剂或配方中。

可以药用的载体和/或稀释剂包括任何以及所有溶剂，分散介质，涂层，抗细菌和抗真菌剂，等渗和吸收延迟剂等。所述介质和试剂在药用活性物质上的使用是在本领域众所周知的，任何与所述调节剂不相容的常规介质或试剂除外，它们在所述治疗组合物中的应用都是可以想到的。还可以将补充的活性化合物掺入所述组合物中。

正如上文所指出的，施用可以通过任何方式进行。为了治疗关节炎或局部炎症，关节内或皮下施用是特别优选的。

所述组合物还可以包含遗传分子，如能够转化靶细胞的载体，其中，所述载体具有能编码调节剂的核酸分子，此时，所述调节剂是蛋白类分子。例如，所述载体可以是病毒载体。就此而言，本发明涉及多种基因治疗，包括分离特定细胞，进行遗传操作，并且将所述细胞送回相同的被试者，或送回遗传学上相关的或类似的被试者。

本发明还提供了炎症的动物模型，可用于筛选能够抑制G-CSF或G-CSFR，并因此能改善炎症作用的试剂。涉及能产生高或低水平G-CSF或G-CSFR的动物模型。可以将所述动物用于筛选能改善炎症症状或预防炎症出现的试剂。另外，在具有较低水平G-CSF的动物中，可能出现其他细胞因子或内源分子，以便补充G-CSF的缺乏。它们成为了其他治疗分子的目标。

因此，本发明的另一方面提供了遗传学修饰过的动物，其中，所述动物与相同物种的未遗传学修饰过的动物相比，能产生较少量的G-CSF或G-CSFR。

优选的是，所述遗传学修饰过的动物是小鼠，大鼠，豚鼠，兔子，猪，绵羊或山羊。更优选的是，所述遗传学修饰过的动物是小鼠或大鼠。在优选的是，所述遗传学修饰过的动物是小鼠。

因此，本发明的优选方面提供了遗传学修饰过的小鼠，其中，所述小鼠与相同品系的未遗传学修饰过的小鼠相比产生较少量的G-CSF或G-CSFR。

本发明的动物模型可以是动物形式的，或者可以是，例如用于移植的胚胎形式的。所述胚胎优选是在冷冻状态下保存的，并且任选与使用说明书一起出售。

本发明的另一方面提供了可用于使编码G-CSF或G-CSFR的基因失活的导向载体，所述导向载体包含编码所述在阳性选择标记侧面的G-CSF或G-CSFR的遗传材料的两个区段，其中，在将所述导向载体转染到胚胎干(ES)细胞，并且选择所述标记时，产生了ES细胞，其中，通过同源重组使编码G-CSF或G-CSFR的基因失活。

所述ES优选来自小鼠，大鼠，豚鼠，猪，绵羊或山羊，最优选的是所述ES细胞来自小鼠。

本发明的另一方面涉及将上述导向载体用于生产基本上不能产生G-CSF或G-CSFR的遗传学修饰过的动物。

本发明的另一方面涉及将上述导向载体用于生产基本上不能产生G-CSF或G-CSFR的遗传学修饰过的小鼠。

所述载体优选是DNA。所述导向载体上的选择标记使得能够选择业已稳定地整合了所述导向DNA的靶细胞。在使用较低效率的转化技术时，这一点是尤其有用的，例如电穿孔，磷酸钙沉淀和脂质体融合，其中，通常在1000个细胞中只有不到1个细胞稳定地整合了所述外源DNA。使用高效的方法，如显微注射到核中，通常有5-25％的细胞整合了所述导向DNA；因此，可以直接筛选所述目标细胞，而不必首先筛选选择标记的稳定整合。可以使用等基因的或非等基因的DNA。

选择标记的例子包括产生对诸如抗生素的化合物的抗性的基因，赋予在选择的底物上生长的能力的基因，编码产生可检测信号，如发光的蛋白的基因。有多种这样的标记是已知的并且可以获得，例如，包括抗生素抗性基因，如新霉素抗性基因(neo)和潮霉素抗性基因(hyg)。选择标记还包括赋予在某些培养基底物上生长的能力的基因，如tk基因(胸苷激酶)或hprt基因(次黄嘌呤磷酸核糖转移酶)，它能赋予在HAT培养基上生长的能力(次黄嘌呤，氨基蝶呤和胸苷)；和细菌gpt基因(鸟嘌呤/黄嘌呤磷酸核糖转移酶)，它允许在MAX培养基(霉酚酸，腺嘌呤和黄嘌呤)上生长。用于哺乳动物细胞的其他选择标记和携带多种选择标记的质粒描述于以下文献中：Sambrook等，Molecular Cloning-ALaboratory Manual，Cold Spring Harbour，New York，USA，1990。

所述标记基因在导向构建体上的优选位置取决于基因导向的目的。例如，如果目的是破坏靶基因表达的话，可以将所述选择标记克隆到相当于所述目标DNA上的编码序列的导向DNA上。另外，如果目的是由所述靶基因表达改变了的产物，例如具有氨基酸替代的蛋白，就可以对所述编码序列进行修饰，以便编码所述替代，并且可以将选择标记放置在所述编码区外面，例如，放置在附近的内含子上。

所述选择标记可取决于它自身的用于表达的启动子，并且所述标记基因可来自与要导向的生物差别很大的生物(例如，将原核标记基因用于导向哺乳动物细胞)。不过，优选用已知在受体细胞中起作用的转录机制取代所述原始启动子。有大量转录起始区可用于这种目的，例如，包括金属硫蛋白启动子，胸苷激酶启动子，β-肌动蛋白启动子，免疫球蛋白启动子，SV40启动子和人巨细胞病毒启动子。普遍使用的例子是pSV2-neo质粒，它具有受SV40早期启动子控制的细菌新霉素磷酸转移酶基因，并且能赋予哺乳动物细胞对G418(与新霉素相关的抗生素)的抗性。可以将多种其他变化形式用于增强所述选择标记在动物细胞中的表达，如添加poly(A)序列，以及添加合成的翻译起始序列。组成型和诱导型启动子都可以使用。

优选通过同源重组修饰所述DNA。靶DNA可存在于动物细胞的任何细胞器中，包括核和线粒体，并且可以是完整的基因，外显子或内含子，调控序列或基因间的任何区。

同源DNA是与参考DNA序列具有至少70％相同性的DNA序列。两种序列的同源的标志是，它们能够在严格条件下彼此杂交(Sambrook等，1990，同上)。

本发明还涉及共抑制(即有义抑制)和反义抑制，以便下调G-CSF或G-CSFR的表达。这种现象通常出现在目标试验动物中，如用于制备疾病模型。

遗传学修饰的动物也可产生大量G-CSF或G-CSFR。例如，正常G-CSF或G-CSFR的超量表达可产生显性的负作用，且可变为有用的疾病模型。

因此，本发明的另一方面涉及能超量表达编码G-CSF或G-CSFR的遗传序列的遗传学修饰过的动物。

遗传学修饰过的动物包括转基因动物，或“敲除”或“敲入(knock-in)”动物。

通过以下非限定性实施例对本发明作进一步说明。

                     实施例1

                       小鼠

C57BL/6(B6；野生型，[WT])小鼠是从Walter and Eliza HallInstitute(WEHI)Animal Supplies(Victoria，澳大利亚)获得的。G-CSF-缺陷型(G-CSF^-/-)小鼠是从Ludwig Institute for CancerResearch，Victoria，澳大利亚获得的，并且是通过导向地破坏129/OLA胚胎干(ES)细胞上的Cysf3基因生产的，将所述基因注射到B6胚泡(Lieschke等，Blood 84：1737-1746，1994)。让小鼠与B6背景回交超过20代。所有小鼠是：在实验时为≥8周龄，喂食标准啮齿类动物饲料，并且随意饮水，并且圈养(≤6小鼠/笼)在盛装锯屑的笼子中。所有动物方法得到了Institutional Ethics Committee的许可。

                      实施例2

      mBSA/IL-1-诱导的关节炎(急性关节炎)的诱导

该方法基于以前描述的技术(Lawlor等，Arthritis andRheumatism 44：442-450，2001)。对小鼠进行麻醉，并且将10μl的20mg/ml mBSA(Sigma，St Louis，MO)通过关节内途径注射到膝关节中。对照关节接受相同体积的媒介物(普通盐水)。然后通过皮下(s.c.)注射将存在于普通盐水/0.5％(v/v)正常小鼠血清(媒介物)中的20μl的12.5μg/ml重组人IL-1β(比活性5×10⁸U/mg；Amgen，Thousand Oaks，CA)注射到小鼠的后爪垫上，并且在第2天重复所述注射。

在第7天(或在标明的时间点上)宰杀小鼠，并且切除膝关节，并且在10％(v/v)中性缓冲的福尔马林溶液中固定至少2天，脱钙并且进行石蜡处理。以间隔大约100μm的四种深度切割正面组织切片(4μm)，并且用苏木精和曙红(H&E)染色，以便评估关节病理学。

对所述实验组进行盲试关节炎评估。评估了关节炎的五种成分，即关节间隙渗出液，滑膜炎，血管翳形成，软骨和骨降解。将严重程度分成从0(正常)到5(严重)的等级。根据组织学得分对关节进行分类，如果渗出液给出1或超过1的得分，并且滑膜炎的得分为2或2以上，则将关节分类为炎性关节炎。破坏性关节炎分类为血管翳的得分为2或2以上，软骨和/或骨降解的得分为1或1以上。还计算了总的平均组织学严重性得分，每个关节的最大可能的得分为25(Lawlor等，2001，同上)。制备番红O染色的切片，并且对软骨蛋白聚糖减少进行盲试评估。

                   实施例3

         胶原诱导的关节炎(CIA)的诱导

将鸡II型胶原(CII；Sigma)以2mg/ml的浓度在10mM乙酸中，在4℃下溶解过夜，在等体积的弗氏完全佐剂(CFA)中进行乳化，该弗氏气全佐剂通过向弗氏不完全佐剂(Difco)中添加加热灭活的结核分枝杆菌(Mycobacterium taberculosis)(菌株H37 Ra；DifcoLaboratories，Detroit，MI，美国)制备为5mg/ml的浓度。通过皮内(i.d.)注射将100μl的所述乳剂注射到小鼠尾巴根的若干部位，并且在21天之后重复上述注射。

监控动物红斑和肢体肿胀，并且每周3次对每一只小鼠进行临床评分，直到40天。评分系统如上文所述(Campbell等，European Journalof Immunology 30：1568-1575)，其中0＝正常，1＝轻微肿胀，2＝严重肿胀，而3＝关节变形和/或僵硬，并且每只小鼠的最大得分为12。临床评估是由不了解所述实验组的两个独立的研究人员完成的。在宰杀时，取出爪子，固定，脱钙并且加工进行石蜡包埋，如上文所述。具有最高的临床得分的四只小鼠的前爪和后爪的H&E染色切片(5μm)按上述方法进行评估(Campbell等，2000，同上)。在第30天以及在宰杀当天(第62天)，采集血液，以便测定血清抗-CII Ab。

                    实施例4

                   施用G-CSF

              关节内G-CSF和IL-1

在第0，1和2天每天用10μl的IL-1(25ng)或重组人G-CSF(rHuG-CSF；0.1，0.5，1和1.5μg)或媒介物(盐水，生理盐水/0.5％(v/v)正常小鼠血清(媒介物))对小鼠进行关节内注射。在第3天宰杀小鼠，并且对H&E染色的关节切片进行组织学评估。

在急性关节炎中皮下注射G-CSF代替IL-1β

用mBSA对小鼠进行关节内注射，并且在第0-2天在爪垫上皮下注射IL-1(250ng)或rHuG-CSF[非格司亭](15μg)或媒介物对照。

按上述方法在第7天宰杀小鼠。

消耗WT和G-CSF^-/-小鼠体内的嗜中性粒细胞

在疾病诱导之前2天通过腹膜内注射处理WT(B6)和G-CSF^-/-小鼠，并且在第0-2天，用0.6mg嗜中性粒细胞消耗性单克隆抗体(mAb)，RB6.8C5或同种型对照mAb GL121处理。然后，从第3到第6天，每天用0.5mg的mAb处理小鼠。在第0，2和7天，通过细胞分类计数分析，分析外周血的嗜中性粒细胞计数。

                       实施例6

                    T细胞增殖测定

在初次注射52-62天之后，从CIA免疫的小鼠(n＞5小鼠/实验)中收获腹股沟淋巴结(LN)。在含有2-巯基乙醇1(50μM)和5％(vol/vol)胎牛血清(FCS)的RPMI中制备单细胞悬浮液。将存在于200μl体积中的LN细胞(2×10⁵细胞)铺平板到圆底96孔平板(Becton DickinsonLabware，Franklin Lakes，New Jersey，美国)上，并且用0-100μg/ml变性的CII(煮沸10分钟)刺激。在37℃(5％CO₂)下培养细胞72小时，在第20和48小时取出上清液，并且用1μCi[³H]胸苷进行最后的脉冲8小时。用Inotech Cell Harvester(Inotech)收获细胞，并且使用小平板闪烁计数器(Canberra Packard，Victoria，澳大利亚)测定[³H]胸苷整合作为T细胞增殖的指标。在第20和48小时采集细胞上清液的等分试样。

浸润白细胞的流式细胞分析

在第3天和第7天解剖来自mBSA/盐水-处理的B6小鼠和mBSA/IL-1-处理的B6和G-CSF^-/-小鼠的膝盖骨和与它连接的软组织。去掉骨骼，脂肪和肌肉片段，将滑膜切成2-mm的碎片，并且用存在于RPMI1640中的2.4mg/ml分散酶II(Boehringer，Mannheim，德国)，1mg/ml II型胶原酶(Sigma)，和100μg/ml DNAse I(BoehringerMannheim，Indianapolis，美国)消化成单细胞悬浮液。在37℃下轻柔搅拌所述悬浮液45分钟，然后使用存在于RPMI中的10％[v/v]FCS通过70μM尼龙细胞滤过器(Falcon)洗涤。在细胞染色之前进行细胞计数。使用大鼠抗-小鼠FcγRIIb/III(CD16/CD32；克隆2.4G2；AmericanType Culture Collection(ATCC)，Manassas，Virginia，美国)阻断非特异性染色。用生物素化的大鼠抗-小鼠CD45.2(PharMingen，SanDiego，California，美国)和荧光染料链亲和素三色(SA-TRI)(Caltag)以及在下面的例12中列举的Ab的组合对白细胞进行染色。还在37℃，5％CO₂中使滑膜消化细胞贴壁，以便恢复被分散酶裂解的诸如CD4标记的表达。将非贴壁细胞收集到存在于PBS中的2％v/v FCS中，并且染色，进行荧光激活细胞分类术(FACS)。

                         实施例7

              细胞因子分析和白细胞形态学定量

按照生产商的说明(Pharmingen)，使用配对的单克隆抗体通过捕获ELISAs测定T细胞上清液中的IFN-γ，IL-4和IL-2。

关节渗出液白细胞形态学定量

在高倍放大(1000x)下，通过对5个焦点上载网区的关节间隙渗出液中的多形核白细胞，单核细胞/巨噬细胞和淋巴细胞进行定量，分析H&E染色的关节切片(n＝2切片深度/关节)进行渗出液组成分析。

                        实施例8

                血清抗-CII抗体(Ab)的测定

按上述方法进行ELISAs，以便检测CII的Abs(Campbell等，2000，同上)。将辣根过氧物酶-缀合的山羊抗-小鼠IgG(Signa ChemicalCo.)，IgG2b，IgG2c，IgG1，IgG3或IgM(Southern BiotechnologyAssociates，Birmingham，Alabama，美国)抗血清用作检测Abs。使用任意单位，用合并的超免疫DBA/1小鼠的血清制作标准曲线。

测定血清Ig水平

用总的IgG，IgM，IgG2c，IgG2b，IgG1，IgG3和IgA的相关的Abs捕获来自未接触过抗原的和CII/CFA-免疫的小鼠的后眼窝窦出血血清Abs，并且用辣根过氧物酶(HRP)缀合的Abs(Southern BiotechnologyAssociates，Birmingham，Alabama，美国)检测。

                       实施例9

                   外周血白细胞计数

在第0，3和7天，通过后眼窝丛静脉切开术从急性关节炎模型中获得外周血，并且收集在EDTA包衣的试管中。将每只小鼠的一个股骨中的BM冲洗到3％[v/v]胎牛血清(FCS)/磷酸缓冲盐水(PBS)中。使用Advia120 Hematology System(Bayer Diagnostics，Tarrytown，New York，美国)进行总白细胞计数和示差分析。还在cytospins上进行手工BM计数(以1200rpm的速度用7分钟时间将1×10⁵细胞离心到显微镜载玻片上)。

                       实施例10

       因为直接在关节内使用G-CSF造成的关节发炎

首先通过关节内注射将rHuG-CSF(0.1，0.5，和1μg)注射到野生型(WT)C57BL/6小鼠的膝关节中，连续注射3天，研究粒细胞集落刺激因子(G-CSF)在关节中是否具有促炎特性。对照包括关节内注射IL-1(IL-1；25ng)和媒介物(0.5％[v/v]存在于生理盐水中的(正常小鼠血清)。在第3天，取出关节进行组织学评估。发现G-CSF诱导的炎症是剂量-依赖型形式的(图1)，不过，所述反应明显比用IL-1诱导的反应弱。这一结果表明，外源G-CSF在正常关节内具有促炎作用。

                        实施例11

      G-CSF-缺陷型小鼠出现了较弱的IL-1诱导的关节发炎

为了研究G-CSF在调节局部IL-1-诱导的炎性影响中的作用，通过用IL-1对G-CSF缺陷型小鼠(G-CSF-/-)和B6小鼠进行关节内注射。IL-1能在G-CSF-/-小鼠中诱导关节发炎，而与正常B6小鼠相比具有较轻的程度(图2A)，表明G-CSF在关节区室中是IL-1的下游介质。尽管在G-CSF-/-小鼠中存在这种炎性特征的减弱，在关节软骨蛋白聚糖减少方面没有差别(图2B)，表明IL-1可能直接破坏软骨。

外周血，BM和滑膜浸润液分析

为了检查G-CSF缺陷对由mBSA和IL-1诱导的炎性反应的影响，从B6和G-CSF-/-小鼠中取出外周血，BM和滑膜，所述小鼠是通过关节内注射mBSA并且在该模型第0，3和7天用IL-1或盐水媒介物进行皮下注射处理过的。结果如表2和3以及图6所示。G-CSF缺陷导致了对mBSA/IL-1的迟钝的嗜中性反应。通过施用IL-1，B6和G-CSF-/-小鼠中的BM细胞性都减少了(表2)，表明BM细胞转移到血液中。与B6小鼠相比，G-CSF-/-小鼠在BM区室中具有显著减少了的数量的晚幼粒细胞和多形性，以及更少的早幼粒细胞和中幼粒细胞(表2)，以上结果是基础性的以及针对IL-1的反应的。在急性关节炎发作期间，B6小鼠产生了显著的外周中性的细胞增多症。形成鲜明对比的是，在所述模型过程中，G-CSF-/-小鼠表现出显著的嗜中性白细胞减少症(表3)，表明通过IL-1诱导的中性白细胞增多症是G-CSF依赖型的。

对mBSA/IL-1-处理的G-CSF-/-小鼠的发炎的滑膜进行的细胞组成研究发现，在第3和第7天浸润的白细胞的减少(图6A-C)。与来自B6小鼠的mBSA/IL-1-处理的滑膜组织相比，滑膜组织消化液的细胞计数在mBSA/IL-1-处理的G-CSF-/-关节滑膜组织中，在第7天表现出总细胞性减少了大约2倍(1.87±0.07×10⁵细胞/B6 mBSA/盐水关节对3.13±0.10×10⁵细胞/B6 mBSA/IL-1关节对1.66±0.05×10⁵细胞/G-CSF-/-mBSA/IL-1关节)。具体地讲，在这两个时间点上，嗜中性粒细胞的百分比和数量都显著减少(GR1hi CD11bhi)，并且浸润巨噬细胞/单核细胞(GR1lo CD11bhi)的百分比和数量也显著减少。其他表型改变包括在患有急性关节炎的G-CSF-/-小鼠的滑膜组织中具有较低百分比的M-CSFR⁺CD16/CD32+和CD44⁺细胞，表明G-CSF可能是在滑膜细胞上全面诱导这种激活标记所需要的。

在培养过夜之后对非贴壁白细胞进行的染色还发现了第7天CD44⁺淋巴细胞浸润的减少，表明G-CSF不仅是嗜中性粒细胞和巨噬细胞转移到关节中所需要的，而且还是CD4⁺ T淋巴细胞所需要的(图6C)。

                        实施例12

  在急性炎性关节炎的G-CSF^-/-和WT小鼠中消耗嗜中性粒细胞

为了研究在G-CSF^-/-小鼠中mBSA/IL-1-诱导的关节炎减轻是否是仅仅是嗜中性白细胞减少症的结果(Lieschke等，1994，同上)，使用单克隆抗体(mAb)RB6.8C5消耗嗜中性粒细胞。用抗-嗜中性粒细胞mAb(RB6.8C5)或同种型对照mAb(GL121)对WT和G-CSF^-/-小鼠进行腹膜内注射(i.p.)。在第0，2和7天，通过细胞分类计数分析分析外周血的嗜中性粒细胞水平(图7A)。与同种型对照mAb处理的动物相比(它产生了显著的嗜中性粒细胞增多症)，在用抗-嗜中性粒细胞mAb处理过的WT动物中，观察到了＞90％的消耗。WT小鼠的嗜中性粒细胞消耗没有消除关节炎的产生(图7B)，不过它的确显著减少了关节间隙渗出液。相反，G-CSF^-/-小鼠对疾病的抗性较强，并且进一步的嗜中性粒细胞消耗未能进一步减轻疾病严重程度。这表明在G-CSF^-/-小鼠中嗜中性粒细胞的减少不仅决定对mBSA/IL-1-诱导的关节炎的防护。

                       实施例13

      在急性炎性关节炎中外源G-CSF可部分代替IL-1

用mBSA和G-CSF(mBSA/G-CSF)处理的小鼠的关节产生了炎性和破坏性关节炎，尽管其严重程度低于mBSA/IL-1-处理的动物(图4A-B)。与mBSA/IL-1-诱导的关节炎中主要为粒细胞浸润液相比，浸润mBSA/G-CSF-处理的动物的关节的主要细胞是单核细胞/巨噬细胞。这一结果表明，全身性地施用外源G-CSF，至少能部分代替全身的IL-1，用于启动该急性关节炎模型，并且G-CSF导致了单核细胞/巨噬细胞补充到所述关节中。

                        实施例14

         G-CSF缺陷能减弱胶原--诱导的关节炎(CIA)

         G-CSF-缺陷型小鼠具有较弱的急性炎性关节炎

考虑到关节内注射和全身使用非格司亭对关节疾病的促炎作用，我们试图使用G-CSF-/-小鼠确定所述急性关节炎模型对G-CSF的绝对依赖性。用mBSA对G-CSF-/-和B6小鼠进行关节内注射(第0天)，并且在第0，1和2天用IL-1在爪垫上进行皮下注射。在第7天进行的疾病组织学评估，发现了炎性和破坏性特征的显著减弱(图5A和B)。对软骨蛋白聚糖含量的番红O染色，与B6小鼠相比，发现了在G-CSF-/-小鼠中软骨蛋白聚糖减少的显著减弱(图5C)。因此，内源G-CSF是在这种急性关节炎模型中炎症和破坏的重要介质。

G-CSF缺陷能减弱CIA发病率和严重性

CIA是慢性自身免疫关节炎，它被广泛用于研究RA。为了检查G-CSF对CIA的作用，用存在于CFA中的CII对B6 WT和G-CSF-/-小鼠进行免疫，然后在21天后进行强化免疫注射(Lieschke等，Blood 84：1737-46，1994)，并且比较疾病的发病率和严重性。CIA在G-CSF-/-小鼠中的发作被推迟，并且与WT小鼠相比，G-CSF-/-小鼠的发病率以及严重程度显著减弱(图8A和B)。在G-CSF-/-小鼠中疾病的发病率和严重性的减弱，暗示了内源G-CSF在慢性自身免疫关节炎中的重要作用。

                    实施例15

           CIA在G-CSF^-/-小鼠中的组织学分析

对来自在CIA期间具有最高临床得分的四个B6和G-CSF-/-小鼠的爪子的H&E染色的切片进行组织学评估。为每一个关节打出0正常到3(参见例18)的得分，并且测定正常和关节炎性关节的百分比。与WT小鼠相比，在G-CSF-/-小鼠中存在显著更高百分比的正常关节(图9A)，并且在G-CSF-/-小鼠中具有少量的受影响的爪子，其中没有一例是严重的(图9B)。相反，来自WT小鼠的关节，具有表明存在轻度至重度关节炎的多种组织学特征(图9A和B)。所述组织学观察与本文所提出的临床评估吻合。

                        实施例16

           针对CII的体外T细胞增殖和细胞因子生产

为了评估对CII的细胞免疫反应，在G-CSF-/-小鼠中测定了体外T细胞增殖反应和T细胞细胞因子(IFNγ和IL-2)生产，并且与WT比较。用来自小鼠的腹股沟LN制备单细胞悬浮液，所述小鼠是用存在于CFA中的CII免疫的，并且在体外用0-100μg/ml的变性CII刺激72小时。通过在培养的最后8小时内测定氚化TdR吸收测定T细胞反应。图10A表示在G-CSF-/-和WT小鼠中观察到的刺激指数，它们是相当的。由G-CSF-/-LN细胞产生T细胞细胞因子IFN-γ和IL-2似乎比较正常(图10B)。

                       实施例17

   在G-CSF-/-小鼠中抗-CII同种型从IgM向IgG的转换减弱

CIA的诱导是依赖于对CII的体液和细胞免疫反应的(Campbell等，2000，同上)。检查了在CIA期间G-CSF缺陷是否会改变抗-CII Ab生产的血清水平(第30和62天)。尽管在第30和62天，在WT和G-CSF-/-小鼠中具有相当水平的抗-CII IgM，但存在总的抗-CII IgG的减少(图11)。对抗-CII IgG同种型进行的分析，发现了所有同种型-IgG2b，IgG2c，IgG3和IgG1的生产减少。这表明在G-CSF-/-小鼠中存在同种型转换缺陷，这可能导致对CIA的防护作用。这一发现表明，内源G-CSF在B细胞产生的Ab方面发挥作用，至少对存在于CFA中的抗原进行的免疫有反应。

                      实施例18

在未接触过抗原的G-CSF-/-小鼠中增加的Ig基础水平以及在CII/CFA-免疫的小鼠中增加的总的IgG

研究对CII的体液免疫反应，发现G-CSF-/-小鼠具有从IgM向IgG反应转换缺陷。为了确定这种缺陷是否体现了在循环Ab中预先存在的缺陷，分析了来自未接触过抗原的小鼠的血清的总的IgG，IgM和IgG同种型。对血清Ab水平的分析发现了与未接触过抗原的B6小鼠相比，在未接触过抗原的G-CSF-/-小鼠中总的IgG和同种型IgG2b和IgG2c的产量显著更高，并且具有正常的基础产量的IgM，IgG1，IgG3和IgA(图12A)。另外，在CII/CFA-免疫的G-CSF-/-小鼠中，非特异性总的IgG的水平显著提高(图12B)。上述观察表明，G-CSF在B细胞成熟，抗体生产和同种型转换中发挥作用，至少对存在于CFA中的抗原进行的免疫有反应。

                      实施例19

在G-CSF-/-小鼠中正常的T-依赖型和T-不依赖型Ag B细胞反应

为了研究针对CII/CFA造成的Ab生产的减弱是否是由于缺乏T-依赖型或T-不依赖型Ag反应，用存在于明矾中的T-依赖型抗原NP-KLH，或用存在于PBS中的T-不依赖型抗原DNP-葡聚糖刺激B6和G-CSF-/-小鼠。G-CSF-/-小鼠产生了对T-依赖型和T-不依赖型Ag的正常反应(图13)，表明在CIA中减弱了的B细胞反应对于用存在于CFA中的CII进行的攻击是特异的。

                     实施例20

G-CSF消耗导致了外周血中性白细胞减少症，并且减轻了急性(mBSA/IL-1)关节炎的炎症

为了评估G-CSF封闭在WT小鼠中的治疗作用，在诱导急性关节炎之前(第0天)，用50或250μg的大鼠抗-G-CSF mAb(克隆67604；R&D systems，Minneapolis，Minnesota，美国)或同种型对照(GL113)mAb注射B6小鼠。还在第1，2，3和5天施用mAb。在第4和7天采集外周血，并且进行示差分析(图14A)。在这两天上，与同种型对照mAb mBSA/IL-1-处理的小鼠相比，接受高剂量(250μg)抗-G-CSF mAb的小鼠具有外周血嗜中性粒细胞的显著减少。接受较低剂量的抗-G-CSF mAb的小鼠只在第7天出现嗜中性粒细胞的显著减少。对BM群体进行分析，还发现在G-CSF-消耗的mBSA/IL-1-处理的小鼠中骨髓谱系细胞的显著减少(数据未发表)。对用抗-G-CSF或同种型对照mAb处理的小鼠的关节炎性关节进行的肉眼评估，发现了在抗-G-CSF mAb(250μg)处理的小鼠中疾病的减轻(图14B)。在接受较高剂量的抗-G-CSF mAb的小鼠中，存在减少了的滑膜组织细胞性(图14C)，以及降低了的浸润白细胞百分比，尤是嗜中性粒细胞(GR1hiCD11bhi；图14D)。以上结果表明在野生型小鼠中针对G-CSF抑制的急性关节炎的疾病特征具有剂量依赖型减弱。

                                                   表2

                                  在mBSA/IL-1-诱导的关节炎期间的骨髓群体

基因型	研究日	Cells×104/股骨
										总细胞性	Blast	早幼粒细胞/中幼粒细胞	晚幼粒细胞/多形性	淋巴细胞	单核细胞	嗜酸性粒细胞	具核类红细胞
		B6G-CSF-/-	0(2)0(2)	2134±1031902±402	72±216±0	102±458±0	777±4142±2	409±18342±2	92±2100±1									92±758±1	501±2336±1
B6G-CSF-/-	3(5)3(5)									1456±791216±97	23±441±6	150±680±7	601±38229±21	173±27263±18	152±7110±13	40±232±4	299±24324±28
		B6G-CSF-/-	7(6)7(6)	1710±2271458±147	21±434±2	49±434±2	750±14343±36	92±12279±18	99±7121±10									54±223±6	213±10460±44

用Advia计数器进行细胞计数。在diff-quik染色的cytospins上对从每只小鼠的一个股骨中回收的细胞进行人工白细胞示差。所给出的值是平均值±SD。

^*在第0天进行的研究是预处理；括号中的值是该组中用于研究的小鼠的数量。

在相同研究日上B6和G-CSF-/-小鼠之间的比较P＜0.05

相同基因型的小鼠在基线和在标明的研究日之间的P＜0.05

                                        表3

                  在mBSA/IL-1-诱导的关节炎期间G-CSF^-/-小鼠的外周血分析

基因型	模型日*	细胞×103/μl外周血
						总WBC	淋巴细胞	嗜中性粒细胞	单核细胞
		B6G-CSF-/-B6G-CSF-/-B6G-CSF-/-	0(5)0(4)3(9)3(9)7(9)7(9)	3.77±1.007.51±0.492.55±0.303.15±0.243.68±0.803.28±0.38	3.17±0.836.88±0.381.89±0.262.75±0.182.68±0.662.93±0.33					0.33±0.060.19±0.030.40±0.050.12±0.030.63±0.110.20±0.04	0.04±0.020.03±0.010.02±0.000.03±0.010.06±0.020.03±0.00

用Advia计数器分析外周血，并且测定了每微升的细胞计数×10³。数据表示为平均值±SD。

*第0天的研究是预处理基线数量；括号中的数字是该组用于检查的小鼠的数量。

在检查的时间点上各组之间的P＜0.05。

本领域技术人员可以理解的是，本文所描述的发明可以进行除了具体描述形式以外的变化和更改。可以理解的是，本发明包括所有这样的变化和更改。本发明还包括在本说明书中单独或统一提到或指出的所有步骤，特征，组合物和化合物，以及所述步骤或特征中任意两种或两种以上的任何以及所有组合。

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Claims (62)

1.一种用于治疗或预防被试者的炎性状况的方法，该方法包括给所述被试者施用有效量的能抑制炎性细胞因子或它的受体的活性和/或能降低编码所述炎性细胞因子或它的受体的基因的表达水平的试剂。

2.如权利要求1的方法，其中，所述炎性细胞因子是粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或它的功能或结构同系物。

3.如权利要求1或2的方法，其中，所述受体是粒细胞集落刺激因子受体(G-CSFR)或它的结构或功能同系物。

4.如权利要求1-3中任意一项的方法，其中，所述炎性症状是关节炎或状况上相关的疾病。

5.如权利要求4的方法，其中，所述状况是类风湿关节炎(RA)。

6.如权利要求4的方法，其中，所述状况是胶原诱导的关节炎(CIA)。

7.如权利要求1中任意一项的方法，其中，所述被试者是动物或鸟类物种。

8.如权利要求7的方法，其中，所述动物哺乳动物。

9.如权利要求8的方法，其中，所述哺乳动物动物是灵长类动物。

10.如权利要求9的方法，其中，所述灵长类动物是人。

11.如权利要求8的方法，其中，所述哺乳动物是啮齿类动物。

12.如权利要求11的方法，其中，所述啮齿类动物是小鼠。

13.如权利要求1中任意一项的方法，其中，所述试剂是抗所述细胞因子或它的受体的抗体。

14.如权利要求13的方法，其中，所述试剂是抗G-CSF，G-CSFR或它的一部分或免疫学上相关部分的抗体。

15.如权利要求13或14的方法，其中，所述抗体是单克隆抗体。

16.如权利要求13或14的方法，其中，所述抗体是多克隆抗体。

17.如权利要求1的方法，其中，所述试剂是可溶性G-CSFR或它的功能同系物，类似物或衍生物。

18.如权利要求1的方法，其中，所述试剂是G-CSF的化学类似物。

19.如权利要求1的方法，其中，所述试剂是G-CSFR的化学类似物。

20.如权利要求17-19中任意一项的方法，其中，所述试剂是蛋白。

21.如权利要求1的方法，其中，所述试剂是核酸。

22.如权利要求21的方法，其中，所述核酸是DNA或RNA，并且包含编码G-CSF或G-CSFR或它的一部分或转录物的有义或反义多核苷酸序列或遗传序列。

23.一种用于鉴定能抑制炎性细胞因子或它的受体的活性的试剂的方法，该方法包括让推测的抑制剂与所述炎性细胞因子或它的受体接触，其中，通过与所述细胞因子或细胞因子受体的结合或其他形式的联系鉴定所述试剂为抑制剂。

24.一种用于鉴定能调控编码炎性细胞因子或它的受体的遗传序列的表达的试剂的方法，该方法包括让推测的调控剂与编码炎性细胞因子或它的受体的遗传序列接触，其中，通过与所述编码细胞因子或细胞因子受体的遗传序列的结合或其他形式的联系确定所述试剂为调控剂。

25.如权利要求23或24的方法，其中，所述炎性细胞因子是G-GSF或它的功能或结构同系物。

26.如权利要求23或24的方法，其中，所述受体是G-CSFR或它的功能或结构同系物。

27.如权利要求24的方法，其中，所述遗传序列是包含编码G-CSF的外显子和/或内含子的遗传序列或包含编码G-CSFR的外显子和/或内含子的遗传序列，或它的启动子或增强子区。

28.一种药用组合物，包含能够抑制炎性细胞因子或它的受体在被试者体内的活性和/或能够降低编码所述炎性细胞因子或它的受体的基因在被试者体内的表达水平的试剂，以及可以药用的载体或稀释剂。

29.如权利要求28的药用组合物，其中，所述炎性细胞因子是粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或它的功能或结构同系物。

30.如权利要求28或29的药用组合物，其中，所述受体是粒细胞集落刺激因子受体(G-CSFR)或它的结构或功能同系物。

31.如权利要求28-30中任意一项的药用组合物，其中，所述炎性症状是关节炎或状况上相关的疾病。

32.如权利要求31的药用组合物，其中，所述状况是类风湿关节炎(RA)。

33.如权利要求32的药用组合物，其中，所述状况是胶原诱导的关节炎(CIA)。

34.如权利要求28的药用组合物，其中，所述被试者是动物或鸟类物种。

35.如权利要求34的药用组合物，其中，所述动物是哺乳动物。

36.如权利要求35的药用组合物，其中，所述哺乳动物是灵长类动物。

37.如权利要求36的药用组合物，其中，所述灵长类动物是人。

38.如权利要求34的药用组合物，其中，所述哺乳动物是啮齿类动物。

39.如权利要求38的药用组合物，其中，所述啮齿类动物是小鼠。

40.如权利要求28的药用组合物，其中，所述试剂是抗所述细胞因子或它的受体的抗体。

41.如权利要求40的药用组合物，其中，所述试剂是抗G-CSF，G-CSFR或它的一部分或免疫学上相关部分的抗体。

42.如权利要求40或41的药用组合物，其中，所述抗体是单克隆抗体。

43.如权利要求40或41的药用组合物，其中，所述抗体是多克隆抗体。

44.如权利要求28的药用组合物，其中，所述试剂是可溶性G-CSFR或它的功能同系物，类似物或衍生物。

45.如权利要求28的药用组合物，其中，所述试剂是G-CSF的化学类似物。

46.如权利要求28的药用组合物，其中，所述试剂是G-CSFR的化学类似物。

47.如权利要求44-46中任意一项的药用组合物，其中，所述试剂是蛋白。

48.如权利要求28的药用组合物，其中，所述试剂是核酸。

49.如权利要求48的药用组合物，其中，所述核酸是DNA或RNA，并且包含编码G-CSF或G-CSFR或它的一部分或它的转录物的有义或反义多核苷酸序列或遗传序列。

50.一种载体，包含编码权利要求20-22中任意一项的试剂的遗传序列，其中，所述遗传序列可操作地连接在动物可操纵的启动子序列上。

51.一种动物细胞，包含权利要求50的载体。

52.一种动物，包含权利要求51的细胞。

53.如权利要求51或52的动物或动物细胞，其中，所述动物或动物细胞是小鼠或小鼠细胞。

54.如权利要求51或52的动物或动物细胞，其中，所述动物或动物细胞是人或人细胞。

55.一种用于使细胞中编码G-CSF或G-CSFR的基因失活的导向或标记交换诱变载体，所述载体包含编码G-CSF或G-CSFR的两段遗传材料，或它们的片段，其旁侧为阳性或阴性标记。

56.一种遗传修饰过的动物细胞，包含权利要求30的载体或所述载体的一部分。

57.如权利要求30或31的遗传修饰过的细胞，其中，所述细胞是胚胎干细胞。

58.一种遗传学修饰过的动物或胚胎，它包含，或者源于权利要求31或32的一个或多个细胞，其中，与相同物种的未进行遗传修饰的动物相比，所述动物产生少量的G-CSF或G-CSFR。

59.如权利要求33的遗传修饰过的动物或如权利要求31或32的细胞，其中，所述动物是小鼠。

60.如权利要求33的遗传修饰过的动物或如权利要求31或32的细胞，其中，所述动物是人。

61.一种用于生产权利要求31或32的遗传修饰过的细胞的方法，该方法包含将权利要求30的载体导入胚胎干(ES)细胞，并且筛选所述选择标记基因的表达，其中，通过与所述载体同源重组，使所得到的转化细胞中的G-CSF和/或G-CSFR基因失活。

62.一种用于鉴定能够抑制G-CSF活性和/或抑制G-CSF与G-CSFR的相互作用，并因此改善炎症影响的试剂的体内方法，该方法包括给权利要求33-35中任意一项的动物施用推测的抑制剂，其中，所述试剂被鉴定为具有与G-CSF或G-CSFR的相互反应性，因为，所述试剂在相同物种的野生型动物中具有可检测的生理学作用，但是在权利要求33-35中任意一项的动物中具有减弱的作用，所述动物表现出G-CSF和/或G-CSFR的减弱了的表达。

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