CN1688248A - 痴呆相关神经疾病的诊断方法 - Google Patents

痴呆相关神经疾病的诊断方法 Download PDF

Info

Publication number
CN1688248A
CN1688248A CN03824558.2A CN03824558A CN1688248A CN 1688248 A CN1688248 A CN 1688248A CN 03824558 A CN03824558 A CN 03824558A CN 1688248 A CN1688248 A CN 1688248A
Authority
CN
China
Prior art keywords
dementia
ncam
level
patient
neurological disorder
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN03824558.2A
Other languages
English (en)
Inventor
H·斯特里卡罗瓦
R·克里尼
J·亨佩里
C·布曼
T·穆勒－汤姆森
M·沙奇纳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Becton Dickinson and Co
Original Assignee
Becton Dickinson and Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Becton Dickinson and Co filed Critical Becton Dickinson and Co
Publication of CN1688248A publication Critical patent/CN1688248A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G01N2800/2821—Alzheimer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/285—Demyelinating diseases; Multipel sclerosis

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及对痴呆相关神经疾病的可疑患者，通过测定至少一种细胞粘附分子的水平，而诊断该病和监测该病进展的方法。本发明还涉及针对神经细胞粘附分子的抗体。

Description

痴呆相关神经疾病的诊断方法
                       发明背景
发明领域
[0001]本发明涉及对痴呆相关神经疾病的可疑患者，通过测定至少一种细胞粘附分子的水平，而诊断该病和监测该病进展的方法。
发明背景
[0002]阿尔茨海默氏病及其它痴呆性疾病患者数量的增长，部分是由于人口整体老龄化引起的，这种增长对于患病个体、护理人员和公共卫生系统都是一个重要的健康难题。目前这些疾病是由有经验的临床医生诊断和治疗的，但是对于它们的发病和严重程度，几乎没有死前的生化测量。显然，了解这些疾病更客观的工具将会是很重要的。
[0003]细胞粘附和识别分子对于神经系统正常发育和行使机能是很重要的。在所有脊椎动物中均可发现它们，而且它们是高度保守的。这些分子中的两种，L1和NCAM是在许多类型神经元和神经胶质细胞上发现的细胞表面糖蛋白。这两种分子均包括多种同种型，它们例如在细胞表面附着方式、细胞内结构域的结构和信使RNA可变剪接所致特定氨基酸序列的存在与否方面是不同的。另外，这两种分子在共价结合碳水化合物的数量上可发生变化，这些碳水化合物反过来可影响这些分子的结合活性和与细胞表面上其它分子的相互作用。例如，一些NCAM分子含有高水平的一种罕见碳水化合物-聚唾液酸(polysialic acid)，它们被称为PSA NCAM。除了介导细胞结合外，L1和NCAM均可将外部影响的信号传递至细胞内信号途径中。
[0004]由于它们具有生物学重要性，L1和NCAM的数量和类型尤其可能与人类神经疾病有关。例如，L1中的突变与一种常见类型的发育缺陷和精神发育迟缓(称为MASA综合征，它是一种与L1中突变相关的遗传性疾病，标志是精神发育迟缓、拇指内收、suffling步态和失语症)相关，而且可能是收容入院患者中“特发性”精神发育迟缓最普遍的原因。已经发现L1、NCAM和NCAM的可变剪接的VASE(可变剪接外显子)同种型的水平在精神分裂症患者个体中是不同的。在脑脊液(CSF)和尸检组织中这些水平均可不同。由于存在这些发现，我们已经研发了测定CSF中L1和NCAM的敏感、特异和定量的分析方法，并测定了多种神经疾病中它们的浓度。阿尔茨海默氏病和某些类型痴呆中这两种分子的水平是升高的，而在多发性硬化症患者中它们是降低的。
                       发明概述
[0005]本发明提供了在表现痴呆相关神经疾病症状并怀疑患有此病的患者中诊断该病和/或监测该病进展的方法。所述方法包括获得患者的标本；测定至少一种细胞粘附分子的水平，所述分子选自L1和神经细胞粘附分子(NCAM)；与正常患者相比，根据这些测定的水平作出诊断。
                   附图简要说明
[0006]附图1A的图表举例说明被诊断患有不同类型痴呆患者个体中测定的L1浓度的范围，测定方法是采用此处所述的方法。具体而言，这些值(圆圈)代表下列患者脑脊液(CSF)中的L1浓度：阿尔茨海默氏病(AD)、血管性痴呆(VD)、混合型痴呆(MT)、多系统萎缩症(MSA)、帕金森氏病(PD)、弥漫性雷维小体痴呆(DLBD)、癫痫、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、多神经病(PNP)、多发性硬化症(MS)和正常对照(NC)。每条水平线代表L1浓度的均值。附图1B为L1浓度的均值±标准误差。
[0007]附图2A的图表举例说明被诊断患有不同类型痴呆患者个体中测定的NCAM浓度的范围，测定方法是采用此处所述的方法。具体而言，这些值(圆圈)代表下列患者脑脊液(CSF)中的NCAM浓度：阿尔茨海默氏病(AD)、血管性痴呆(VD)、混合型痴呆(MT)、多系统萎缩症(MSA)、帕金森氏病(PD)、弥漫性雷维小体痴呆(DLBD)、癫痫、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、多神经病(PNP)、多发性硬化症(MS)和正常对照(NC)。每条水平线代表NCAM浓度的均值。附图2B为NCAM浓度的均值±标准误差。
[0008]附图3A的图表举例说明被诊断患有不同类型痴呆患者个体中测定的PSA-NCAM浓度的范围，测定方法是采用此处所述的方法。具体而言，这些值(圆圈)代表下列患者脑脊液(CSF)中的PSA-NCAM浓度：阿尔茨海默氏病(AD)、血管性痴呆(VD)、混合型痴呆(MT)、多系统萎缩症(MSA)、帕金森氏病(PD)、弥漫性雷维小体痴呆(DLBD)、癫痫、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、多神经病(PNP)、多发性硬化症(MS)和正常对照(NC)。每条水平线代表PSA-NCAM浓度的均值。附图3B为PSA-NCAM浓度的均值±标准误差。
[0009]附图4A描述痴呆和非痴呆组的L1浓度均值±标准误差。附图4B描述痴呆和非痴呆组的NCAM浓度均值±标准误差。附图4C描述痴呆和非痴呆组的PSA-NCAM浓度均值±标准误差。
[0010]附图5A描述神经变性疾病和非变性疾病患者的L1浓度均值±标准误差。附图5B描述神经变性疾病和非变性疾病患者的NCAM浓度均值±标准误差。附图5C描述有或无神经变性的患者中PSA-NCAM浓度均值±标准误差。
                   发明的详细描述
[0011]本发明提供了在表现痴呆相关神经疾病症状并怀疑患有此病的患者中诊断该病的方法。所述方法包括获得患者的标本；测定至少一种细胞粘附分子的水平，所述分子选自L1和神经细胞粘附分子(NCAM)；与正常患者相比，根据这些测定水平作出诊断。
[0012]在此应用时，痴呆相关神经疾病是特征在于存在痴呆的疾病。在此应用时，“痴呆”是使用标准临床规程确定的，并通过简易智能状态检查(MMSE)评分确定痴呆的程度，此评分法详见Folstein M.F.、Folstein S.E.和McHugh P.R.，J Psychiatry Res.，12：189-198(1975)。在此应用时，痴呆包括所有程度的临床痴呆，从轻度至中度再至严重痴呆。例如，MMSE评分为30至27被判定为无痴呆，评分为26至20被判定为轻度痴呆，评分为19至10被判定为中度痴呆，评分为9至0被判定为重度痴呆。在此应用时，痴呆包括所有范围的MMSE评分，当然除外被判定为无痴呆的那些评分。但是，在此应用时，“痴呆”并不限于有无MMSE评分。
[0013]被诊断或监测的痴呆相关神经疾病为任何累及中枢或周围神经系统或被其累及的疾病或病症。此神经疾病可为变性或非变性疾病。变性神经疾病用于指中枢或周围神经系统的任何细胞的变性。中枢或周围神经系统的细胞类型包括但不限于神经元和神经胶质细胞。神经元类型包括但不限于背根神经节细胞、两极神经细胞、锥体细胞、脊髓运动细胞和浦肯野细胞。神经胶质细胞的类型包括但不限于少突神经胶质细胞、许旺氏细胞和星形胶质细胞。另外，神经系统细胞的变性包括细胞代谢活动的完全停止(细胞死亡)或部分停止。这种停止在本质上可为凋亡，即编程性细胞死亡，或者变性在本质上可为坏死，诸如对细胞的毒性或生物学损害引起的。神经变性疾病的实例包括但不限于阿尔茨海默氏病、混合型痴呆、帕金森氏病、弥漫性雷维小体痴呆、多系统萎缩症、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、进行性核上性麻痹和皮克病。非变性神经疾病的实例包括但不限于血管性痴呆、多发性硬化症、癫痫、多神经病、正常压力性脑积水、精神病、酒精中毒、严重抑郁症、副肿瘤性脑病、类风湿性关节病、硬膜外血肿、水痘带状疱疹性神经炎和脊肌萎缩症。
[0014]在此应用时，术语“对象”或者“患者”可以互换使用，是要指一种动物，优选为哺乳动物，包括人。另外，“患者”还要包括一种对象，其表现出痴呆相关神经疾病的症状。可在遗传上、表型上和/或行为上表达这些症状。例如，怀疑有痴呆相关神经疾病的对象可具有基因突变或紊乱，它在遗传学上与痴呆相关神经疾病相关。类似地，患者可具有异常水平的特定蛋白或其它化合物，所述蛋白或化合物是神经疾病的指标，或者经常用于此病的诊断。同样，患者可表现出确定的行为症状，这些症状是神经疾病的指标，或者经常用于此病的诊断。
[0015]本发明的方法包括获得患者的标本。此标本应当包括脑脊液(CSF)。因此，此标本可包括附加的成分或者添加物，它们是自然存在的或是合成的，或者此标本可为纯CSF。在获得CSF后，可对其进行处理。这类处理的实例包括但不限于浓缩、稀释、提纯或混和所获得的CSF。
[0016]在此使用时，“获得”可为拥有标本的任何方法。因此，获得用于指从患者采集和/或取出标本。获得患者标本的实例是很明显的，包括但不限于腰穿术(腰椎穿刺)。另外，“获得”还用于指从先前拥有标本的另一个人处接收该标本。
[0017]本发明包括测定至少一种细胞粘附分子的水平。在此应用时，细胞粘附分子是影响细胞与其它细胞之间粘附性的分子，即细胞-细胞粘附分子(CAM)，或者是影响细胞与底物或表面之间粘附性的分子，即细胞-底物粘附分子(SAM)。主要的细胞粘附分子种类包括整联蛋白、选择蛋白、钙粘着蛋白和免疫球蛋白(Ig)超家族的成员。每类细胞粘附分子包括几个本领域已广泛公认熟知的成员。另外，可通过几种方法中的一种来鉴定新的细胞粘附分子，这几种方法包括但不限于，与已知可破坏细胞粘附的抗体的相互作用、免疫沉淀、从表达文库克隆推定的CAM或SAM、结合或竞争分析方法、推定细胞粘附分子与微球体的缀合、附着分析、离心力测定和转染试验。已知的细胞粘附分子的实例包括但不限于E-钙粘着蛋白、P-钙粘着蛋白、N-钙粘着蛋白、B-钙粘着蛋白、R-钙粘着蛋白、EP-钙粘着蛋白、OB-钙粘着蛋白、M-钙粘着蛋白、钙粘着蛋白-5、钙粘着蛋白-12、原钙粘着蛋白4 3、桥粒胶粘蛋白1、桥粒芯糖蛋白1、α1β1整联蛋白、α2β1整联蛋白、α3β1整联蛋白、α4β1整联蛋白、α5β1整联蛋白、αvβ1整联蛋白、αlβ2整联蛋白、αMβ2整联蛋白、αVβ3整联蛋白、P-选择蛋白、E-选择蛋白、细胞间粘附分子1(ICAM1)、ICAM 2、神经细胞粘附分子(NCAM)、血小板-内皮细胞粘附分子(PECAM)、血管粘附分子(VCAM)、癌胚粘附分子和L1。
[0018]在本发明的一个实施方式中，测定L1的水平，以诊断痴呆相关神经疾病。在另一个实施方式中，测定神经细胞粘附分子(NCAM)的水平，以诊断痴呆相关神经疾病。本发明包括测定所有NCAM同种型，这些NCAM同种型包括但不限于NCAM 105-115、NCAM-120、NCAM-140和NCAM-180。在再一个实施方式中，测定L1和NCAM两者的水平，以诊断痴呆相关神经疾病。
[0019]在本发明的方法中测定至少一种细胞粘附分子的水平。在此应用时，“测定水平”用于指进行定量检测，以显示被测定的特定细胞粘附分子的量。这种量可为原始数字，绝对量或相对量，细胞粘附分子的测定量和另一测定值之间的比率，这种测定值诸如内标或者另一种细胞粘附分子或该检测标本中的其它成分。另外，原始数据可用于更复杂的算法，以得出“测定水平”。而且，测定水平可为数据点的平均数(算术平均、中位数、众数)或者测定水平可得自n＝1。
[0020]本发明的方法需要对测定水平与另一组数据进行比较。这一另外的数据组通常来自至少一名“正常”个体，其不表现出此处所述的痴呆相关神经疾病任何方面的症状或者怀疑有其任何方面。这种另外的数据组可来自现在怀疑有痴呆相关神经疾病的相同个体，或者所述另外的数据可来自不同的正常个体。这种另外的数据可代表一名正常个体或者两名或多名正常个体的群体测定水平的平均数(算术平均、中位数、众数)。
[0021]为了应用此处所述方法对怀疑有痴呆相关神经疾病的对象进行诊断，细胞粘附分子的测定水平必须大于正常个体中所见的水平。
[0022]本发明还提供了监测患者痴呆相关神经疾病进展的方法，此患者表现出这种疾病的症状，或者怀疑有这种疾病。此方法包括获得痴呆相关神经疾病疑似患者的至少两份标本，测定所述至少两份标本中每一份中的至少一种细胞粘附分子的水平，该细胞粘附分子选自L1和神经细胞粘附分子(NCAM)。这些测定水平彼此相互比较，至少两个测定水平之间的任何差异将提示痴呆相关神经疾病的进展。
[0023]在此应用时，“进展”用于指痴呆相关神经疾病症状的恶化，或者它可指痴呆相关神经疾病症状的减轻。换句话说，“进展”是暂时性的，因此与患者症状的改善以及患者症状的恶化或维持结合使用。
[0024]因此，这里所述监测痴呆相关神经疾病进展的方法可用于监测特定治疗方案的效果，所设计的这种方案是用于对抗痴呆相关神经疾病的症状或原因，或者所述监测方法也可用于监测未接受治疗的患者的进展。
[0025]监测痴呆相关神经疾病的进展包括比较至少两份获得的标本中细胞粘附分子的测定水平。细胞粘附分子测定水平间没有差异，这提示患者的情况或症状自上次测定以来可能没有恶化。但是，细胞粘附分子测定水平随时间增长提示患者的情况或症状可能随时间而恶化。或者，细胞粘附分子测定水平随时间下降提示患者的情况或症状可能随时间而改善。
[0026]可通过各种方法进行测定水平的比较，这些方法包括但不限于算术减法、产生测定水平的比率或者将测定水平用于更复杂的算法。比较方法仅仅需要突出显示测定水平之间存在的任何差异。
[0027]在至少一个实施方式中，本发明涉及单克隆抗体NCAM 14.2的应用，此抗体是针对人NCAM的抗体，它可用于本发明的任何方法。NCAM 14.2抗体可识别NCAM所有已知的同种型，包括NCAM 105-115、NCAM-120、NCAM-140、NCAM-180，以及含α2，8-聚唾液酸的NCAM(PSA-NCAM)的多肽。
[0028]在至少一个实施方式中，本发明涉及单克隆抗体neuro 4.1的应用，它是针对人L1的抗体，可用于本发明的任何方法。neuro 4.1抗体可识别L1及其普通蛋白水解切割的片段。
[0029]NCAM 14.2和/或neuro 4.1抗体可为完整的单克隆抗体或其功能片段。抗体的功能片段包括该抗体能够与靶抗原结合的任意部分。在此应用时，“抗体片段”用于指功能片段。抗体片段特别包括F(ab′)2、Fab、Fab′和Fv片段。这些片段可产生于任何类型的抗体，但通常由IgG或IgM制得。可通过常规的重组DNA技术，或者应用经典的方法通过用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶进行蛋白水解消化，来生产它们。参见Current Protocols In Immunology，Chapter2，Coligan et al.，eds.，(John Wiley & Sons 1991-92)。
[0030]在此应用时，NCAM 14.2抗体为抗体或其片段，它具有完整单克隆NCAM 14.2抗体的至少一个VL和至少一个VH链。换句话说，“NCAM 14.2抗体”包括完整抗体及其片段，而且如果多特异性或多价抗体的至少一个结合位点包括全长NCAM 14.2抗体的VL和VH链，则“NCAM14.2抗体”还包括这些多特异性和多价抗体。
[0031]在此应用时，neuro 4.1抗体为抗体或其片段，它具有完整单克隆neuro 4.1抗体的至少一个VL和至少一个VH链。换句话说，“neuro 4.1抗体”包括完整抗体及其片段，而且如果多特异性或多价抗体的至少一个结合位点包括全长neuro 4.1抗体的VL和VH链，则“neuro 4.1抗体”还包括这些多特异性和多价抗体。
[0032]“多特异性”是指抗体或其片段可同时与至少两个不同的靶结合，这些靶具有两种不同的结构。 “多价”是指抗体或其片段可同时与一个以上的靶结合，这些靶可具有相同或不同的结构。因此，例如本发明的抗体包括可同时结合NCAM和L1的抗体或其片段。
[0033]F(ab′)2片段典型约为110kDa(IgG)或约为150kDa(IgM)，而且含有两个抗原结合区，它们在绞链区通过二硫键结合。几乎(如果不是所有)所有Fc片段不具有这些抗原结合位点。Fab′片段典型约为55kDa(IgG)或约为75kDa(IgM)，而且例如可通过还原F(ab′)2片段的二硫键而形成。所得游离巯基可用于使Fab′片段与其它分子结合，诸如检测试剂(例如酶)，其它Fab′或Fab片段。
[0034]Fab片段是单价的，通常约为50kDa(任何来源)。Fab片段包括轻链(L)和重链(H)，抗体的抗原结合部分的可变区(分别为VL和VH)和恒定区(分别为CL和CH)。分子内二硫键联接H和L部分。
[0035]FV片段典型约为25kDa(不管来源如何)，而且含有轻链和重链的可变区(分别为VL和VH)。通常仅仅通过非共价相互作用将VL和VH链保持在一起，因此它们容易分离。但是VL和VH链具有小尺寸的优势，并且它们能够保持与较大的Fab片段相似(如果不是相同的)的结合特性。因此，已经开发了交联VL和VH链的方法，例如使用戊二醛(或其它化学交联剂)、分子间二硫键(通过引入半胱氨酸)和肽接头。所得FV现为单链FV片段(即SCFV)。
[0036]或者，可通过重组方法产生SCFV，通过混合和配对不同抗体来源的可变链而产生具有新特异性的FV。在典型方法中，将提供重组载体，它包括适当的调节元件，驱动盒式区的表达。盒式区将含有编码肽接头的DNA，在接头的5’和3’末端均具有便利的位点供产生融合蛋白。可在载体中克隆编码感兴趣可变区的DNA，以与接头形成融合蛋白，这样产生SCFV。
[0037]在一个实施方式中，可将编码两个FV的DNA与编码接头的DNA进行连接，而且可将所得三联融合体直接连接到常规表达载体中。根据所选择的载体，可在原核细胞或真核细胞中表达通过这些方法中任何一种而产生的SCFVDNA。
[0038]这里提出的实施例是要举例说明本发明的一些实施方式，而不是要对权利要求的范围进行任何限制。
实施例
[0039]实施例1-患者和脑脊液的采集
[0040]本研究中对不同神经疾病的218患者进行检查，这些疾病包括阿尔茨海默氏病(AD)、血管性痴呆(VD)、混合型痴呆(MT)、弥漫性雷维小体痴呆(DLBD)、多系统萎缩症(MSA)、帕金森氏病(PD)、重度和轻度抑郁症、多发性硬化症(MS)、癫痫、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、多神经病(PNP)、进行性核上性麻痹(PSP)、皮克病、脑积水、精神分裂症、偏执狂、硬膜外血肿、颈骨软骨病、带状疱疹感染、脊肌萎缩症和副肿瘤性脑病。另外，还对没有任何经证实的神经疾病或神经精神疾病的正常对照进行研究。
[0041]按照已公布的标准进行临床诊断：阿尔茨海默氏病和混合型痴呆1、血管性痴呆16、多发性硬化症17、多系统萎缩症18、帕金森氏病19、弥漫性雷维小体痴呆20，或者按照一般神经病学医疗实践进行诊断，例如癫痫、肌萎缩性侧索硬化症或多神经病。
[0042]通过标准临床规程诊断痴呆并通过简易智能状态检查(MMSE)21评分确定其程度。评分30至27被判定为无痴呆，评分26至20被判定为轻度痴呆，评分为19至10被判定为中度痴呆，评分为9至0被判定为重度痴呆。
[0043]对正常对照进行腰穿术采集脑脊液(CSF)用于诊断，例如排除蛛网膜下腔出血，并且表明没有中枢神经系统或周围神经系统任何疾病的征象，同时蛋白水平、白蛋白商、细胞计数、寡克隆带、免疫球蛋白、葡萄糖、乳酸、溶菌酶、神经元特异性烯醇化酶和铜无异常。
[0044]在L4和L5之间通过腰穿采集CSF。在穿刺前患者仰卧2小时。将1ml CSF采集在聚丙烯管中，立即冷冻，并且在进行生化分析之前将其保存在-80℃下。按照赫尔辛基宣言，在腰穿前获得患者的知情同意，而且该研究得到汉堡市伦理委员会的批准。
[0045]实施例2-测定L1和NCAM水平
[0046]按照下面所述我们研发并优化了一种灵敏的捕捉ELISA：分别将针对L1、NCAM或PSA的纯化单克隆“捕捉”抗体(10μg/ml)neuro4.1.1.3.3、14.2或735移液至96孔微量滴定板(NUNC Immuno MaxisorpFB，Roskilde，丹麦)的每个孔中，并在4℃下孵育过夜。然后用pH7.4含0.05％Tween 20的磷酸盐缓冲盐水(PBS)将滴定板冲洗5遍，并于37℃下用在pH7.4的PBS中的5％脱脂奶粉溶液(Fluka，Deisenhofen，德国)封闭1.5小时。蛋白标准为人L1-Fc(2至64ng/ml)、人NCAM-Fc(9至300ng/ml)和小鼠PSA-NCAM(1至50ng/ml)，并以连续2倍稀释由冷冻原液新鲜制备用于每个试验。然后在每个孔中装填标准或CSF试验样品(对于L1、NCAM或PSA分别为未稀释、1∶8稀释或者1∶15稀释)，并在室温下孵育1.5小时。在每个孔中装填“检测”抗体(1.5μg/ml)(如果为L1，则为多克隆抗人L1；或者为多克隆抗人NCAM 3731，以检测NCAM和PSA-NCAM)，并在室温下孵育20小时。冲洗后，将过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体(0.16μg/ml)加入每个孔中，在室温下孵育1.5小时。加入ABTS(Roche Diagnostics，Mannheim，德国)，以进行比色检测。用1.25％氟化钠停止酶反应，并在405nm下测定吸光度的值。采用盲法对每份CSF标本检测三次。每个微量滴定板上都包括对照系列的标准蛋白(L1-Fc、NCAM-Fc和PSA-NCAM)。所有CSF标本均检测每种抗原。
[0047]此ELISA中所用的捕捉抗体为单克隆抗人L1抗体neuro4.1.1.3、单克隆抗人NCAM抗体NCAM 14.2，以及多克隆抗人NCAM抗体3731，它们是由BD Technologies，Research Triangle Park，NorthCarolina，USA提供的。在兔中针对人L1-Fc制备多克隆抗人L1抗体(Lab As Ltd，Tartu，爱沙尼亚)。通过在人IgG琼脂糖柱上吸收，从兔血清中分离抗Fc抗体22。按照先前所述23，24制备人L1-Fc蛋白和人NCAM-Fc蛋白。Dr.Rita Gerardy-Schahn(Medizinische Hochschule，Hannover，德国)赠予了抗α2，8-聚唾液酸(PSA)的小鼠单克隆抗体73525。应用稳定转染的TE671细胞系制备鼠的PSA-NCAM-Fc26，此细胞系由Dr.G.Rougon提供(Laboratoire de Genetique et Physiologiedu Developement，CNRS，Marseille，法国)。过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体来自Dianova(汉堡，德国)。
[0048]实施例3-统计学分析
[0049]应用非参数Kruskal-Wallis检验，在不同组间进行比较。统计学显著的水平设定为p＜0.05。应用Kolmogorov-Smirnov检验确认痴呆/非痴呆和神经变性/非神经变性组CSF参数的正态分布。通过Student’s t检验分析独立组的非连续变量的组间差异。通过Pearson积矩相关分析相关性。应用以年龄作为共变量的ANOVA探究值受到年龄特异性影响的程度。应用Scheff é检验进行此后的分析。另外，我们通过多重回归分析估计痴呆的存在、神经变性、性别和年龄对L1、NCAM和聚唾液酸的影响，此分析包括测定自变量的偏相关。结果表示为均值±标准误差。
结果
[0050]统计学分析显示，与正常对照组(12.2±0.6ng/ml，n＝46)比较，阿尔茨海默氏病(AD)患者脑脊液(CSF)中L1的平均水平(18.2±0.7ng/ml，n＝76)升高(p＜0.0001)(附图1)。在附图1A中，每条水平线代表L1浓度的平均值。附图1B描述L1浓度均值±标准误差。统计学分析(含年龄相关)显示，与正常对照组水平比较，AD患者CSF中的L1水平较高(***p＜0.0001)。与正常对照组比较，血管性痴呆(VD)(19.6±2.7ng/ml，n＝9)和混合型痴呆(MT)(17.8±1.8ng/ml，n＝8)患者的L1水平也升高(分别为p＜0.01和p＜0.05)。发现这些组CSF中L1水平的升高与年龄和性别无关。其它组：多系统萎缩症(n＝4)、帕金森氏病(n＝6)、弥漫性雷维小体痴呆(n＝4)、癫痫(n＝15)、肌萎缩性侧索硬化症(n＝7)、多神经病(n＝10)、多发性硬化症(n＝9)，它们与正常对照组比较没有显示出任何差异。
[0051]统计学分析显示，与正常对照组(551.3±33.3ng/ml，n＝46)比较，AD患者CSF中NCAM平均水平(845.4±39.7ng/ml，n＝76)升高(p＜0.0001)。而且，与正常对照组比较，血管性痴呆(852.1±146.2，n＝9)和混合型痴呆(937.5±177.4，n＝8)患者的NCAM水平较高(p＜0.05)(附图2)。在附图2A中，每条水平线代表NCAM浓度的均值。附图2B描述NCAM浓度均值±标准误差。NCAM浓度与性别无关，但与年龄相关。当对年龄作为共变量进行校正时，AD患者中较高的NCAM浓度的关联性仍是显著的(p＜0.05)。但是，对年龄进行校正，血管性痴呆(VD)和混合型痴呆(MT)患者与正常对照组比较时，差异不再显著。与正常对照组比较，多发性硬化症患者CSF中的NCAM水平(342.2±16.7ng/ml，n＝9)下降(p＜0.05)，而且进行年龄校正后，差异仍然显著。
[0052]CSF中PSA-NCAM水平在各组间没有差异(附图3)。在附图3A中，每条水平线代表PSA-NCAM浓度的均值。附图3B描述PSA-NCAM浓度均值±标准误差。正常对照组中PSA-NCAM的平均浓度为56.9±2.8ng/ml(n＝46)。
[0053]为了研究粘附分子水平是否与所有类型痴呆都相关，在将患者分为痴呆和非痴呆组后，我们进一步分析了其L1、NCAM和PSA-NCAM的浓度。统计学分析显示，与非痴呆组(13.2±0.5ng/ml，n＝101)比较，痴呆患者CSF中的L1平均水平(17.2±0.5ng/ml，n＝117)升高(p＜0.000001)(附图4A)。这些组中的L1浓度与性别无关，但与年龄相关(r＝0.28；p＜0.05)。然而，当对年龄作为共变量进行校正时，所有类型痴呆患者中较高L1浓度保持关联性(p＜0.00001)。
[0054]在痴呆患者组内对年龄进行校正时，简易智能状态检查(MMSE)定义的痴呆严重性作为不连续变量(逐步回归)，或者将患者分为轻度痴呆患者组(n＝68)、中度痴呆患者组(n＝42)和重度痴呆患者组(n＝7)，所述严重性或分组与L1浓度不相关(数据未给出)。
[0055]但是，与非痴呆组(603.5±26.0ng/ml，n＝101)比较，NCAM浓度在痴呆患者CSF中(830.3±33.3ng/ml，n＝117)较高(p＜0.00001)(附图4B)。NCAM浓度与性别无关，但与年龄相关(r＝0.37；p＜0.05)。当对年龄作为共变量进行校正时，较高的NCAM浓度与痴呆的关联仍然存在(p＜0.05)。
[0056]在痴呆患者组内对年龄进行校正时，MMSE定义的痴呆程度作为不连续变量(逐步回归)，或者将患者分为轻度痴呆组(n＝71)、中度痴呆组(n＝42)和重度痴呆组(n＝7)，所述程度或分组与NCAM浓度不相关。
[0057]统计学分析未发现痴呆患者和非痴呆患者CSF中PSA-NCAM浓度存在任何差异(附图4C)。无痴呆患者的PSA-NCAM的平均浓度为57.3±1.9ng/ml(n＝102)，而痴呆患者的PSA-NCAM的平均浓度为55.7±1.3ng/ml(n＝116)。PSA-NCAM浓度与性别无关，而且与年龄不相关。
[0058]在大多数患者中，痴呆与神经变性关联。因此，我们探究了中枢神经系统中神经变性过程是否可与L1和NCAM浓度的升高相关。在这个研究中归入神经变性的疾病组包括AD(n＝76)、混合型痴呆(n＝8)、帕金森氏病(n＝6)、弥漫性雷维小体痴呆(n＝4)、多系统萎缩症(n＝4)、肌萎缩性侧索硬化症(n＝7)、进行性核上性麻痹(n＝1)和皮克病(n＝2)。在这个研究中归入非神经变性的疾病组包括血管性痴呆(n＝9)、多发性硬化症(n＝9)、癫痫(n＝15)、多神经病(n＝10)、正常压力脑积水(n＝2)、精神病(n＝3)、酒精中毒(n＝3)、重度抑郁症(n＝6)、副肿瘤性脑病(n＝1)、类风湿性关节病(n＝1)、硬膜外血肿(n＝2)、水痘带状疱疹性神经炎(n＝2)、脊肌萎缩症(n＝1)和正常对照(n＝46)。与非变性疾病患者组(13.5±0.5ng/ml，n＝110)比较，神经变性疾病患者CSF中L1浓度(17.3±0.5ng/ml，n＝108)显著较高(p＜0.000001)(附图5A)。当对年龄进行校正时，这种差异仍然显著(p＜0.001)。但是，当仅是神经变性疾病患者与无痴呆的非变性疾病患者的组比较时，此差异不再显著(数据未给出)。
[0059]与包括正常对照的非变性疾病患者(606.9±26.3ng/ml，n＝110)比较，神经变性疾病患者CSF中NCAM水平(837.8±33.1ng/ml，n＝108)较高(p＜0.000001)(附图5B)。当对年龄进行校正时，这种差异仍然显著(p＜0.05)。如对L1所示，患有神经变性疾病的非痴呆患者和患有非变性疾病的非痴呆患者之间的NCAM值没有差异(数据未给出)。
[0060]神经变性疾病患者PSA-NCAM的平均浓度(57.3±1.4ng/ml)在统计学上与包括对照的非变性疾病患者(55.8±1.9ng/ml)没有差异(附图5C)。
[0061]另外，我们还进行了逐步多元回归分析，以L1作为因变量，年龄、性别、痴呆和神经变性病因作为自变量。此逐步分析证实痴呆(β0.175，相关0.30)和神经变性(β0.165，相关0.29)对L1水平具有显著影响(数据未给出)。但是，此分析也表明年龄(β0.085，相关0.26)和性别(β-0.01，相关0.05)对L1水平没有显著影响(数据未给出)。偏相关显示痴呆(β0.14，p＝0.049)和神经变性(β0.14，p＝0.047)对L1的影响几乎相等，而年龄(β0.07，p＝0.34)和性别(β-0.01，相关0.05，p＝0.9)对其无影响(数据未给出)。
[0062]对NCAM的逐步多元回归分析证实年龄(β0.23，相关0.35)和神经变性(β0.18，相关0.33)对其具有显著影响(数据未给出)。但是，这种逐步分析揭示痴呆(β0.112，相关0.30)和性别(β-0.07，相关0.01)对NCAM水平无影响(数据未给出)。偏相关表明年龄(β0.21，p＝0.004)和神经变性(β0.17，p＝0.02)对NCAM的影响比痴呆(β0.10，p＝0.18)和性别(β-0.07，p＝0.32)的影响更大(数据未给出)。
[0063]逐步多元回归分析未发现年龄、性别、痴呆或神经变性对PSA-NCAM水平具有任何影响(数据未给出)。
[0064]实施例4-NCAM 14.2抗体的制备
[0065]Leu19为一种抗NCAM单克隆抗体(Becton DickinsonAdvanced Cellular Biology，San Jose，Calif.)，应用它制备免疫亲和柱。通过标准技术，应用这种Leul9亲和柱纯化来自成人脑的NCAM。应用制备单克隆抗体的常规技术，用这种免疫亲和纯化的NCAM对小鼠进行免疫，然后纯化其脾细胞并与鼠骨髓瘤细胞融合。在ELISA法中筛选所得杂交瘤与NCAM的反应性，并用代表NCAM的各种不同免疫球蛋白结构域的合成肽进行再筛选。根据其与免疫原的强烈反应性，选择产生NCAM 14.2的杂交瘤，以进一步表征。NCAM 14.2抗体描述于Lanier，L.L.，et al.，J.Immunology，146：4421-4426(1991)，此文献在此收录为参考文献。
[0066]实施例5-neuro 41抗体的制备
[0067]应用制备单克隆抗体的常规技术，用粗制人脑提取物对小鼠进行免疫，然后纯化其脾细胞并与鼠骨髓瘤细胞融合。在ELISA法中筛选所得杂交瘤与L1的反应性，并用代表L1的各种不同免疫球蛋白结构域的合成肽进行再筛选。根据其与免疫原的强烈反应性，选择产生neuro 4.1的杂交瘤，以进一步表征。neuro 4.1抗体描述于Poltorak，M.，et al.，Experimental Neurology，131：266-272(1995)，此文献在此收录为参考文献。

Claims (18)

1、在表现痴呆相关神经疾病症状并怀疑患有所述痴呆相关神经疾病的患者中诊断痴呆相关神经疾病的方法，包括
a)获得该患者的标本；
b)测定至少一种细胞粘附分子的水平，所述分子选自L1和神经细胞粘附分子(NCAM)；和
c)在表现所述症状的所述患者中诊断所述痴呆相关神经疾病，
其中该诊断的根据是在b)中所述至少一种细胞粘附分子的测定水平大于不表现所述痴呆相关神经疾病症状并且不怀疑有所述痴呆相关神经疾病的患者中所述至少一种细胞粘附分子的水平。
2、权利要求1的方法，其中测定L1的水平。
3、权利要求2的方法，其中所述痴呆相关神经疾病选自血管性痴呆和混合型痴呆。
4、权利要求1的方法，其中测定NCAM的水平。
5、权利要求4的方法，其中所述痴呆相关神经疾病选自阿尔茨海默氏病(AD)和多发性硬化症(MS)。
6、权利要求1的方法，其中测定L1和NCAM两者的水平。
7、权利要求6的方法，其中所述痴呆相关神经疾病选自阿尔茨海默氏病(AD)和多发性硬化症(MS)。
8、权利要求1、4或6的方法，其中所述测定所述NCAM水平包括NCAM 14.2抗体。
9、权利要求1、2或6的方法，其中所述测定L1水平包括neuro 4.1抗体。
10、在诊断患有痴呆相关神经疾病的患者中监测所述痴呆相关神经疾病的进展的方法，包括：
a)获得该患者的第一份标本；
b)测定所述第一份标本中至少一种细胞粘附分子的水平，所述分子选自L1和神经细胞粘附分子(NCAM)；
c)获得该患者的第二份标本；和
d)测定所述第二份标本中至少一种细胞粘附分子的水平，所述分子选自L1和神经细胞粘附分子(NCAM)；和
e)将b)中的测定水平与d)中的测定水平进行比较，显示所述测定水平的差异；
其中所述差异表明该患者所述痴呆相关神经疾病的进展。
11、权利要求10的方法，其中测定L1的水平。
12、权利要求11的方法，其中所述痴呆相关神经疾病选自血管性痴呆和混合型痴呆。
13、权利要求10的方法，其中测定NCAM的水平。
14、权利要求13的方法，其中所述痴呆相关神经疾病选自阿尔茨海默氏病(AD)和多发性硬化症(MS)。
15、权利要求10的方法，其中测定L1和NCAM两者的水平。
16、权利要求15的方法，其中所述痴呆相关神经疾病选自阿尔茨海默氏病(AD)和多发性硬化症(MS)。
17、权利要求10、13或15的方法，其中所述测定NCAM水平包括NCAM 14.2抗体。
18、权利要求10、11或15的方法，其中所述测定L1水平包括neuro4.1抗体。
CN03824558.2A 2002-08-22 2003-08-22 痴呆相关神经疾病的诊断方法 Pending CN1688248A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US40520602P 2002-08-22 2002-08-22
US60/405,206 2002-08-22

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1688248A true CN1688248A (zh) 2005-10-26

Family

ID=31946826

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN03824558.2A Pending CN1688248A (zh) 2002-08-22 2003-08-22 痴呆相关神经疾病的诊断方法

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20050019781A1 (zh)
EP (1) EP1534129A2 (zh)
JP (1) JP2005536723A (zh)
KR (1) KR20050053627A (zh)
CN (1) CN1688248A (zh)
AU (1) AU2003262774A1 (zh)
BR (1) BR0313667A (zh)
CA (1) CA2496429A1 (zh)
WO (1) WO2004017816A2 (zh)
ZA (1) ZA200501670B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007140971A2 (en) * 2006-06-06 2007-12-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Cell adhesion proteins as biomarker for alzheimer's disease
WO2008148491A1 (en) * 2007-06-04 2008-12-11 F. Hoffmann-La Roche Ag Neural cell adhesion molecule 1 as biomarker for alzheimer's disease
AU2012255066B2 (en) * 2011-05-18 2016-06-02 Takeda Pharmaceutical Company Limited Modification-dependent activity assays

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8326917D0 (en) * 1983-10-07 1983-11-09 Telektron Ltd Valve actuator
US4874694A (en) * 1987-04-07 1989-10-17 The Rockefeller University Use of phosphoprotein patterns for diagnosis of neurological and psychiatric disorders
US5059415A (en) * 1989-02-21 1991-10-22 The State Of Oregon Acting By And Through The Oregon State Board Of Higher Education On Behalf Of Oregon Health Method for diagnostically imaging lesions in the brain inside a blood-brain barrier
US7408027B1 (en) * 1991-12-06 2008-08-05 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenchaften Tools for the diagnosis and treatment of Alzheimer's disease
US5591432A (en) * 1993-02-17 1997-01-07 Becton, Dickinson And Company Antibody to the neural cell adhesion molecule and methods of use
US6017695A (en) * 1993-03-26 2000-01-25 Becton Dickinson And Company Nucleic acids encoding human cell adhesion molecule

Also Published As

Publication number Publication date
AU2003262774A1 (en) 2004-03-11
WO2004017816A2 (en) 2004-03-04
WO2004017816A3 (en) 2005-02-24
CA2496429A1 (en) 2004-03-04
JP2005536723A (ja) 2005-12-02
ZA200501670B (en) 2005-09-06
BR0313667A (pt) 2005-06-14
KR20050053627A (ko) 2005-06-08
US20050019781A1 (en) 2005-01-27
EP1534129A2 (en) 2005-06-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Dambinova et al. Blood test detecting autoantibodies to N-methyl-D-aspartate neuroreceptors for evaluation of patients with transient ischemic attack and stroke
US7820398B2 (en) Immunosorbent blood tests for assessing paroxysmal cerebral discharges
JP2021505843A (ja) グリア原線維性酸性タンパク質（ｇｆａｐ）及び／又はユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼｌ１（ｕｃｈ−ｌ１）を使用する、整形外科損傷を負っており、軽度外傷性脳損傷（ｔｂｉ）などの頭部への損傷を負ったか又は負った可能性がある対象についての診断及び査定の一助となるための方法
ATE348843T1 (de) Nachweis von tsh-rezeptor-autoantikörpern mit affinitätsgereinigten antikörpern
EP3254106A1 (en) Methods and compositions for diagnosing brain injury or neurodegeneration
US9823248B2 (en) Methods and kits for detecting IgE-expressing B cells
TW201339578A (zh) 在低傳導率下具有增加之靈敏度的自體抗體測量
US20100003694A1 (en) Biomarkers and Uses Thereof
EP2672266A3 (en) Method for screening a lung transplant candidate for an elevated risk of rejection
AU2017325022A1 (en) Identification and monitoring of cleaved immunoglobulins by molecular mass
JP5866198B2 (ja) 膜貫通タンパク質の分断された外部ドメインを検出するための方法および診断キット
US11946937B2 (en) Identification and monitoring of apoptosis inhibitor of macrophage
WO2012076000A2 (de) Verfahren zum nachweis von anti-nmda-rezeptor autoantikörpern zum einsatz in diagnoseverfahren
CN1688248A (zh) 痴呆相关神经疾病的诊断方法
Tholance et al. Anti-FGFR3 antibody epitopes are functional sites and correlate with the neuropathy pattern
US8182998B2 (en) Blood biomarkers for bone fracture and cartilage injury
WO2019055631A1 (en) IDENTIFICATION AND MONITORING OF ACID HYDROLYSIS PRODUCTS OF IMMUNOGLOBULIN HEAVY CHAINS
JP5553525B2 (ja) 生体負荷の指標剤および生体負荷の測定方法
WO2012104624A2 (en) Biomarkers for osteoarthritis
JP5710666B2 (ja) 生体負荷の指標剤および生体負荷の測定方法
US10408829B2 (en) Diagnostic reagent kit for detecting chronic brain pathologies of ischemic genesis
Chen et al. Transfer of IgG from Long COVID patients induces symptomology in mice
US12038446B2 (en) Methods and compositions for diagnosing brain injury or neurodegeneration
WO2006085122A2 (en) Biomarkers and uses thereof
JP4264469B2 (ja) 痴呆症の検査方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication